色。
[0035] (B)小动物超声检测小鼠升主动脉（距离主动脉根部1_)和头臂干分叉（距离主 动脉分叉〇.5mm)处血管壁厚度，发现Ang II诱导血管壁增厚明显，**p〈0. 01实验重复五 遍。
[0036] (C)Masson染色发现AngII导致主动脉中胶原含量增加，同时免疫荧光染色发现 血管壁中CREG和ACE2表达较正常对照组明显减少。
[0037] 数据采用均数土标准误（土SE)表示。
[0038] 图2.AngII呈时间/计量依赖效应下调小鼠原代VSMCs中CREG表达
[0039] ⑷细胞免疫荧光染色观察小鼠原代VSMCs表达⑶31、a-SMA、desmin、ACE2、 Angl-7和Masl表达情况。
[0040] (B)不同浓度AngII(0、ΙΟηΜ、ΙΟΟηΜ、1μΜ和 10μΜ)刺激VSMCs24h后， Western-blot结果显示随着AngII浓度增大，Ι/ΙΙI型胶原表达逐渐增多，而CREG和ACE2 蛋白表达水平却逐渐减少。0浓度组与不同浓度AngII处理组比较。
[0041] (〇1μΜAngII刺激VSMCs不同时间后（0、12h、24h、48h、72h)，Western-blot结 果显示随着AngII作用时间的延长，I/III型胶原表达逐渐增多，而CREG和ACE2蛋白表达 水平却逐渐减少。0小时组与不同时间AngII处理组比较。
[0042] 图3.CREG基因表达下调加重AngII诱导的血压升高和血管重塑
[0043] (A)免疫荧光染色和RT-PCR检测野生型（CREG+/+)小鼠和CREG杂合子（CREG+/) 小鼠主动脉中CREG表达情况
[0044] (B)CREG+/+小鼠和CREG+/小鼠给予AngII刺激0d、3d、7d和14d后血压变化情况。
[0045] (C)HE染色观察CREG+/+小鼠和CREG+/小鼠给予AngII刺激0d、3d、7d和14d后主 动脉血管壁厚度变化情况。
[0046] (D)Masson染色观察CREG+/+ 小鼠和CREG+/ 小鼠给予AngII刺激 0d、3d、7d和 14d 后主动脉血管壁中胶原含量变化情况。
[0047] 图4.CREG基因过表达抑制VSMCs合成ECM蛋白
[0048]Westernblot检测CREG基因过表达对AngII诱导的I/III型胶原表达的影响， **p〈0. 01实验重复五遍。
[0049] 图5.CREG基因过表达上调VSMCs中ACE2mRNA和蛋白表达
[0050]㈧用腺病毒载体介导CREG基因在VSMCs中过表达，然后应用AngII刺激 VSMCs24h，RT-PCR检测VSMCs中CREG、ACE2 和MaslmRNA表达变化，**p〈0. 01 实验重复五 遍。
[0051] ⑶用腺病毒载体介导CREG基因在VSMCs中过表达，然后应用AngII刺激 VSMCs24h，Western-blot检测VSMCs中CREG、ACE2 和Masl蛋白表达变化，#ρ〈0· 01 实验 重复五遍。
[0052] 图6.CREG基因过表达通过上调ACE2/Angl-7抑制细胞外基质蛋白合成
[0053]Westernblot检测在Angl-7拮抗剂A779存在的情况下，CREG基因过表达对Ang II诱导的I/III型胶原表达的影响，**p〈0. 01实验重复五遍。
[0054] 图7.重组CREG蛋白干预对抗AngII诱导的小鼠血压升高和血管重塑
[0055] (A)给予小鼠不同浓度重组CREG蛋白（15μg/(kg·d)、30μg/(kg·d)、60μg/ (kg·(!)、300μg/(kg·(!))或血管紧张素受体措抗剂氯沙坦（6g溶于500ml水中，小鼠通过 饮水摄取氯沙坦）处理，同时给予小鼠AngII(1.5mgAkg*d))刺激0d、ld、2d、3d、7d、10d、 12d和14d后血压变化情况。
[0056] (B)HE和Masson染色观察正常对照组、重组CREG蛋白处理组（300μgAkg·d)) 和氯沙坦处理组小鼠给予AngII刺激14d后主动脉血管壁厚度和胶原含量变化情况。
【具体实施方式】
[0057] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规产品。
[0058] 本发明实验数据均为百分数。两样本率的比较应用卡方检验，统计学处理均应用 SPSS17. 0软件包处理。P〈0. 05为有统计学差异。
[0059] 实施例1.AngII诱导小鼠血压升高和血管重塑，同时下调血管壁中CREG表达 [0060] ①小鼠高血压血管重塑模型的建立
[0061]在无菌条件下称取AngII(以1. 5mg/(kg?day)的剂量计算），并溶于0· 9%的生 理盐水，注入ALZET微渗透泵中。将注有试剂的微渗透泵于37°C生理盐水孵育过夜。腹腔 注射水合氯醛麻醉C57BL/6小鼠，无菌条件下，分别将含AngII的ALZET微渗透泵埋入皮 下，对照组皮下埋植仅灌注有生理盐水的ALZET微渗透泵，并用缝合线缝合切口。待小鼠清 醒后，洁净条件下喂养3、7和14d。由此获得了小鼠高血压血管重构模型。
[0062] ②小鼠血压监测
[0063] 采用Softron BP2100进行鼠尾无创血压测定，首先对加热箱进行加热，默认温度 为38°C。将小鼠放入鼠笼内固定，固定好后将其整体放入加热箱内。将小鼠鼠尾穿过传感 器，并尽可能将传感器置于鼠尾根部。保持环境安静，待小鼠稳定后开始测量。测量重复3 次，每次间隔约lmin，以均值作为收缩压（结果见图1)。
[0064] 结果显示，AngII刺激3d后小鼠血压开始升高，7d时血压显著升高。
[0065] ③HE染色观察血管壁形态
[0066] a.取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，5μm切片；
[0067] b.切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯⑴5min-二甲苯 (II) 5min- 100% 乙醇 2min- 95% 的乙醇lmin- 80% 乙醇lmin- 75% 乙醇lmin-蒸 馈水洗2min;
[0068]c.苏木素染色5min，自来水冲洗；
[0069]d.盐酸乙醇分化30s;
[0070]e.自来水浸泡15min ;
[0071] f.置伊红液2min;
[0072] 8.常规脱水，透明，封片：95%乙醇（1)1!1^11 - 95%乙醇（11)11^11-100%乙醇 (I)lmin- 100% 乙醇（II)lmin-二甲苯（I)lmin-二甲苯（II)lmin-中性树脂封固。
[0073] 结果显示，AngII刺激14d后，血管中膜明显增厚（结果见图1)。
[0074] ④小动物超声检测血管壁厚度
[0075] 米用加拿大VisualSonics公司的Vevo2100超声生物显微镜成像系统，探头中心 频率30MHz。2%异氟烷对小鼠进行麻醉后，剔除胸腹部毛发。将小鼠仰卧位固定于恒温检 查台，温度保持37°C，同步记录小鼠心电、呼吸等生理参数，心率维持在450次/min左右，心 率稳定lmin后前胸涂抹稱合剂行超声生物显微镜检查。检查台向左侧倾斜约30°，探头与 小鼠身体长轴平行并侧倾，置于小鼠胸骨右缘，探头与小鼠右胸壁呈45°角扫描，调整X、Y 方向旋钮，获得升主动脉长轴、主动脉弓及其分支以及降主动脉长轴切面。以主动脉根部和 头臂干作为解剖标志，收缩期测量小鼠主动脉根部上1mm，以及头臂干分叉上0. 5mm处的管 壁厚度。
[0076] 结果显示，AngII刺激14d后，小鼠主动脉根部和头臂干管壁厚度明显增加（结 果见图1)。
[0077] ⑤Masson染色观察血管壁中胶原含量
[0078] a.石蜡切片脱蜡至水；
[0079] b.依次自来水和蒸馏水洗；
[0080]c.用Weigert铁苏木素液染核5-10min ;
[0081]d.充分水洗，如过染可盐酸乙醇分化；
[0082] e.蒸馏水洗；
[0083] f.用Masson而春红酸性复红液5-lOmin;
[0084] g.以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；
[0085]h. 1 %磷钥酸水溶液分化3-5min;
[0086] i.不经水洗，直接用苯胺蓝液染5min;
[0087] j.以0· 2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；
[0088] k. 95%乙醇、无水乙醇、二甲苯透明、中性树胶封固。
[0089] 结果显示，AngII刺激14d后，小鼠主动脉中胶原含量明显增加（结果见图1)。
[0090] ⑥免疫荧光染色观察血管壁中CREG和ACE2表达变化
[0091]a.冰冻切片室温晾干15min;
[0092]b.用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡lOmin，以去除OCT ;
[0093] c.用含10%正常血清的PBS室温封闭切片lh，此步不洗涤，把封闭液吸干即可；
[0094] d.加入兔抗小鼠CREG或ACE2单抗（1:100)(分别购自英国Abeam公司、美国Novus Biological公司），4°C孵育过夜；
[0095]e.PBS洗3 次，每次 10min;
[0096]f.加入突光标记二抗（1:100)(驴抗兔Alex488标记，美国Invitrogen公司），室 温孵育2h;
[0097]g.PBS洗3 次，每次 15min;
[0098]h.封片后，荧光显微镜观察结果