在化、1化、 24hS个时间检测点均能显著诱导RIMVECs产生IFN-丫（P<0.05);黄巧Img/mL组在化、1化检 测点均能显著诱导RIMVECs产生IFN-丫（P<0.05)，在24h检测点极显著诱导RIMVECs产生 IFN-丫（P<0.01);黄巧6mg/mL组在运S个时间检测点均能极显著诱导RIMVECs产生IFN-丫 (P<0.0 l);在所检测时间范围内随着解育时间的延长，细胞上清液中IFN- 丫分泌量逐渐增 多，具有明显的富集效应。而黄巧30mg/ml组在运S个时间检测点诱导RIMVECs产生IFN- 丫 效果均不显著(P〉〇.05)。从组间比较来看，在化检测点各组间比较差异不显著(P〉0.05);在 1化检测点黄巧6mg/mL组同O.lmg/mL组、Img/mL组比较诱导产生IFN-丫量显著增加（P< 0.05)，30mg/mL组同6mg/mL组比较诱导产生IFN- 丫量减少，差异极显著(P<0.0 l);在24h检 测点黄巧6mg/mL组同0.1 mg/mL组比较诱导产生IFN- 丫量显著增加(P<0.05)，30mg/mL组同 6mg/mL组和Img/mL组比较诱导产生IFN- 丫量减少，差异极显著(P<0.0 l)。
[0046] 实验例2:黄巧甲巧和黄琴多糖诱导RIMVECs分泌IFN- 丫的研究
[0047] 1、主要仪器设备
[004引旋转蒸发仪:上海申生科技有限公司，型号R1002B
[0049] 96孔酶标仪:美国Thermo公司，型号Multiskan Ascent
[0050] 洗板机:北京拓普分析仪器有限公司，型号DEM-3
[0化1] 冷冻高速离屯、机:德国化pendorf公司，型号AG 22331
[0化2] 超低溫冰箱：日本Sanyo公司，型号MDF-U32V
[0053] 恒速摇床:江苏海口其林贝尔仪器制造有限公司，型号TS-I
[0054] 2、主要试剂与药品
[0055] 大鼠IFN- 丫检测试剂盒:深圳晶美生物工程公司，批号F服0002)
[0化6] 嚷挫蓝(MTT):美国Sigma，批号M2128
[0化7] 二甲基亚讽(DMSO):国药集团化学试剂有限公司，批号T20041102 [0化引 3、细胞分组与处理
[0059] 取生长至汇合状态的第二代RIMVECs，0.05 %膜蛋白酶-0.005 %抓TA溶液消化吹 打脱壁，调整密度为2X105cells/mL，接种于96孔板中，静置培养至80%汇合，将培养基更 换为DMBl维持培养基，解育过夜，吸弃维持培养基，加入含有黄巧甲巧和黄巧多糖(购自中 国药品生物制品检定所)的DMEM维持培养液，使其终浓度分别为25、50、25、5化g/mL，空白对 照组加入维持培养基，每组五孔重复。解育化、1化、2地后检测IFN-丫。
[0060] 4、采样
[0061] 将细胞置于37°C、5%C02培养箱中继续培养，1化时采集细胞上清液。采集的样品 经3000r/min离屯、lOmin，将离屯、后的细胞上清液无菌分装于0.6mL的离屯、管中，置于-80°C 保存备用。
[0062] 5、IFN-丫的ELISA检测
[0063] IFN-丫的测定(双抗夹屯、化ISA法)严格按照试剂盒说明书进行操作，步骤简述如 下：
[0064] (1)将所有样品、标准品溶液和酶标板取出，恢复至室溫后，每孔加入10化L样品或 者标准品溶液，其中每一浓度的标准品溶液做2孔重复，最后另取2孔做空白显色孔，不加任 何样品或标准品溶液，加完后用封板胶纸封住酶标板，37°C溫箱解育90min。
[0065] (2)甩去酶标板内液体，用洗涂液浸洗4次。
[0066] (3)每孔加入10化L 37°C预热的生物素化抗体工作液，空白显色对照孔不加液体， 轻敲板壁混匀，用封板胶纸封住酶标板，37°C溫箱解育60min。
[0067] (4)甩去酶标板内液体，用洗涂液浸洗4次。
[0068] (5)每孔加入10化L 37°C预热的酶结合物工作液，空白显色对照孔不加液体，轻敲 板壁混匀，用封板胶纸封住酶标板，37°C溫箱解育30min。
[0069] (6)甩去酶标板内液体，用洗涂液浸洗4次。
[0070] (7)每孔加入100化37°C预热的显色剂，孔内液体立即转为蓝色，37°C避光反应 20min。
[0071] (8)每孔加入10化L 37°C预热的终止液，轻敲板壁混匀，孔内液体由蓝色转为黄 色。
[0072] (9)立即用酶标仪测定A450值。
[0073] (10)绘制标准曲线，计算各孔样品浓度值。
[0074] 6、数据处理
[0075] 根据测定A450值，分别计算各检测孔的浓度值，根据每一样品重复孔的浓度，计算 其平均值和标准差，试验数据W之：fcS表示，组间进行t检验差异显著性分析。
[0076] 7、结果与分析
[0077] 图2中，与对照组比较，*冲<0.01，冲<0.05 ;各成分组内与同时间点2化g/mL组比 较，#胖<0.01，胖 <0.05。
[007引图3中，与对照组比较，*冲<0.01，冲<0.05 ;各成分组内与同时间点2化g/mL组比 较，#胖<0.01，胖 <0.05。
[0079] 从图巧日图3中可W看出，黄巧甲巧25iig/mL组和黄巧多糖25iig/mL组表现一致，在 化、1化、24h时诱导RIMVECs分泌IFN-丫量与空白对照组相比较均有所增力日，但化时诱导量 差异不显著。〉0.05)，1化时诱导量差异显著。<0.05)，2地时差异极显著。<0.01);黄巧甲 巧50yg/mL组与对照组比较在化和1化检测时能显著诱导RIMVECs分泌IFN- 丫（P<0.05)，在 2地能极显著诱导RIMVECs分泌IFN- 丫（P<0.01);黄巧多糖50yg/mL组与对照组比较化和24h 检测时能显著诱导RIMVECs分泌IFN-丫（P<0.05)，在1化能极显著诱导RIMVECs分泌IFN-丫 (P<0.0 l)。在所检测时间范围内随着解育时间的延长，两组细胞上清液中IFN- 丫分泌量逐 渐增多，具有明显的富集效应。从组间比较可W看出黄巧甲巧在1化检测点50yg/血组与25y g/mL组比较差异显著(P<0.05)，而在化和1化检测差异不显著(P〉0.05);黄巧多糖50iig/mL 组与25iig/mL组相比较在化差异不显著(P〉0.05)，而在1化诱导RIMVECs分泌IFN-丫的量两 组相比差异极显著(P<〇. Ol)，2地比较差异显著(P<0.05)。
[0080] 实施例1
[0081 ]黄巧水煎液的制备:加入黄巧重量9倍量的水，浸泡，煎煮1.化，过滤既得。
[0082] 实施例2
[0083] 黄巧水煎液的制备方法为加入黄巧重量10倍量的水，浸泡，煎煮化，过滤，除菌既 得。
[0084] 实施例3
[0085]黄巧水煎液的制备:加入黄巧重量8倍量的水，浸泡，煎煮化，过滤既得。
[00化]实施例4
[0087]将黄巧烘干后称取适量，加入药物重量10倍量的洁净水，浸泡30min煎煮，煮沸后 文火煎煮化，用四层纱布过滤药物，药渣加入8倍量药重的开水，煎煮化，过滤药液，合并两 次药液用旋转蒸发仪浓缩至药液中生药含量为l.Og/mL，过滤除菌，置于4°C备用。
【主权项】
1. 黄芪在制备促进IFN- γ分泌的药物的用途，其特征在于:所述的黄芪的制剂为:水煎 液或含有黄芪甲苷或/和黄芪多糖的制剂。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于:所述的水煎液的制备方法为：加入黄芪重量 8-10倍量的水，浸泡，煎煮0.5~2h，过滤既得。3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于:加入黄芪重量10倍量的水，浸泡，煎煮lh，过 滤，除菌既得。4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的促进IFN-γ分泌诱导是指γ诱导 R頂VECs产生IFN-γ。
【专利摘要】本发明涉及黄芪在制备促进IFN-γ分泌的药物的用途，所述的黄芪的制剂为：水煎液或含有黄芪甲苷或/和黄芪多糖的制剂。
【IPC分类】A61P35/00, A61P37/04, A61K31/7048, A61K36/481, A61P31/12, A61K31/715
【公开号】CN105497108
【申请号】CN201510962309
【发明人】胡格, 穆祥, 张磊, 董虹, 张涛
【申请人】北京农学院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月21日