专利名称：蛹虫草发酵中药黄芪开发的植物源动物用免疫增强剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及黄芪发酵开发的植物源动物用免疫增强剂，属于动物保健品领域，专 用于药用真菌蛹虫草菌发酵黄芪开发的植物源动物用免疫增强剂。
背景技术：
近年来，我国发酵制药业的飞速发展，而药用真菌双向发酵技术是目前开发中药 最有希望的途径，药用真菌发酵技术是指以药用真菌为发酵菌种，利用中药作为药性基质， 两者共同构成发酵组合，双方相适应并在一定条件下进行固体发酵的技术，掺用中药作为 药性基质发酵，使发酵产物的免疫增强效果比单用其中的任何一种效果有很明显提高。经 试验，以黄芪为发酵基质经蛹虫草菌发酵的产物经拌料饲喂后对动物免疫功能具有较强修 复和增强作用，大大增强了动物对疾病的抵抗力。我国药用真菌种类丰富，且应用病种面广，已涉及医院各重要病科与人体各有关 系统。不少品种具有调节机体免疫功能的作用，已多研究用于抗癌、消炎等方面，近数年来 对抗病毒作用、免疫增强作用备受关注，已有关于药用真菌产物对非典、艾滋、禽流感病毒 等有效的报告，令人兴奋。蛹虫草菌在我国的研究历史悠久，蛹虫草为子囊菌亚门，麦角菌 目，麦角菌科、虫草属的模式种，学名为Cordyc印s militaris，又名北冬虫夏草、北虫草等， 中医认为，虫草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳萎遗精，腰膝酸痛，病后 虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代科学论证蛹虫草不仅具有特殊的营养价值，而且有明显的药用价值。其中尤 以虫草酸、虫草素、虫草多糖和SOD等多种生物活性物质的药用价值最为显著。虫草酸(甘 露醇)可以显著地降低颅压，促进机体新陈代谢，因而使脑溢血和脑血栓病症得到缓解。虫 草素是一种具有抗菌活性的核苷类物质，对核多聚腺苷酸聚合酶有很强的抑制作用。在DNA 转录mRNA过程中使mRNA成熟障碍，抑制癌细胞的生长。并有降血糖的作用。虫草多糖是 一种高度分枝的半乳甘露聚糖，它能促进淋巴细胞转化，提高血清IgG的抗体含量和机体 的免疫功能，增强机体自身抗癌抑癌的能力。SOD(超氧化物歧化酶)可以消除机体内超氧 自由基，具有抗衰老、抗癌抑癌的作用。此外，蛹虫草还含有丰富的硒(Se)，这种微量元素已 被大家公认是人体必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化酶的活性中心，以硒半胱氨酸的形 式连接在酶蛋白的肽链上，保护细胞膜的稳定性的正常的通透性，并刺激免疫球蛋白和抗 体的产生，增强机体免疫和抗氧化能力。同时，大量的科学实践证明硒可以明显地抑制癌细 胞的生长。其中，蛹虫草的免疫调节作用尤其突出，经过对小鼠进行淋巴转化试验、Ea及E玫 瑰花试验、特异性免疫玫瑰花试验(巨噬细胞吞噬试验、抗绵羊红细胞抗体效价试验)，结 果表明蛹虫草多糖具有明显的提高免疫功能作用。本发明是在蛹虫草菌的发酵活性基础 上，利用黄芪作为培养基，采用固体发酵技术，发酵出效果显著的植物源动物免疫增强剂， 国内外尚属首例。同时，随着我国中药制药业的飞速发展，药品加工能力不断提高，产品种类日益繁多，药渣的排出量逐年增加。据统计，中药制药企业每年将产生数千万吨的中药药渣，并 且90%以上的生产厂家均将药渣作为废料垃圾，以黄芪药渣为例，我省每年就有1000吨左 右，仅仅南京中医药大学南星制药厂每年就有近300吨黄芪药渣，这在一定程度上造成了 植物资源的巨大浪费，同时由于药渣未及时处理还会对周边环境造成污染，所以采用药用 真菌双向性固体发酵技术对中药药渣进行发酵处理，并使之形成新的有益成分而具有新的 性味功能，并作为兽用免疫增强剂被再利用将是中药药渣的最有效处理和利用方式。这也 为充分利用中药材资源、使其“变废为宝”提供了很好的研究方向和产业模式，必将会为其 它中药材品种的合理应用、开发奠定坚实的基础。
发明内容
技术问题本研究的目的在于提供了一种安全、有效、经济、无公害的植物源动物免 疫增强剂及其制备方法，同时充分开发利用中药黄芪资源。技术方案本发明是以黄芪或黄芪药渣为主要培养基、接种蛹虫草菌(Cordyc印s militaris)进行发酵而开发的植物源动物用免疫增强剂，是通过以下方法制备而成的发酵体系1 使用黄芪、玉米粉、麸皮、尿素进行固体发酵基的配制，其中黄芪的质 量分数为58 %，玉米粉质量分数为28 %，麸皮质量分数10 %，尿素4 %，发酵条件为发酵 体系中料水比1 2，用0. IM的盐酸调节PH为5.0，接种蛹虫草菌(Cordyc^psmilitaris) 作为发酵菌种，使其含量为> 9. 2 X IO6个/g，发酵过程中温度维持25°C -30°C，发酵时间为 264小时。发酵体系2 使用黄芪药渣、玉米粉、麸皮、尿素进行固体发酵基的配制，其中 黄芪药渣的质量分数为50%，玉米粉质量比为31%，麸皮15%，尿素质量比为4% ； 发酵发酵体系中料水体积比为1 2，用0. IM的盐酸调节PH为5.0，接种蛹虫草菌 (Cordycepsmilitaris)作为发酵菌种，使其含量为> 15. 7X IO6个/g，发酵过程中温度维 持为25°C -30°C，发酵时间为264小时；发酵体系结束后所得发酵产物经55°C干燥烘干，然后用6tlCo γ射线进行辐照杀 菌处理，辐照杀菌吸收剂量范围为5-10kGy，吸收剂量不均勻度< 1. 38，即得到所述的植物 源动物用免疫增强剂产品。产品检验及质量标准将发酵样品研磨粉碎，精密称取0. 3g至具塞锥形瓶中，准 确加入纯甲醇30ml，并进行超声提取30min。然后4000r/min离心IOmin，取上清液5ml，蒸 干溶剂，并以流动溶解定容至5mL，高速离心(13000r/min)备用。以高效液相色谱法对照虫草素、虫草酸的标准曲线测定发酵产物中的虫草素、虫 草酸含量，以虫草素含量在3. 2mg/g、虫草酸含量在52mg/g以上为发酵成功标准，同时以 葡聚糖为辅料对发酵产物虫草素、虫草酸含量进行调整，使每批发酵产品中虫草素含量为 2. 8mg/g、虫草酸含量为46mg/g。有益效果本发明所提供的黄芪开发的植物源动物免疫增强剂及其制备方法与现 有技术相比，具有如下优点和积极效果(1)免疫增强效果明显。试验证明，两种发酵产物经拌料饲喂后，能使受抑制的吞 噬细胞和淋巴细胞功能恢复正常，并增强细胞免疫机能，促进体液免疫细胞的增殖、成熟和抗体产生，大大提高疫苗的免疫效果。(2)生产中无环境污染，无残留，同时应用效果明显，对人畜安全，是一种无公害植 物源动物免疫增强剂。(3)同时，在已有药用真菌发酵中药材技术的基础上独创性的使用黄芪药渣作为 药用基质进行发酵，一方面黄芪药渣取材较广，成本低，并达到转废为宝的目的，关键在于 提取黄芪多糖后黄芪药渣中仍富含大量黄芪皂甙，植物黄酮，胆碱，亚麻酸以及多种氨基酸 和微量元素，这些有益成分如添加于动物日常饲料中将更适合动物营养要求，以及免疫能 力提高。(4)采用本发明中的辐照杀菌方法可显著降低产品中各种微生物的含量，细菌总 数降低到lOOOcfu/g以下，大肠菌群降低到30MPN/100g以下，霉菌和沙门氏菌未检出，并能 够保持产品中主要营养成分以及外观色泽和口感不变。该方法操作简便，快捷，成本低，可 广泛应用，在常温下贮存，保质期可达1年以上。
具体实施例方式以蛹虫草菌(Cordyc印s militaris)(本菌种购得于中国普通微生物菌种保藏管 理中心，菌株编号5. 699)为发酵菌种，利用黄芪或黄芪药渣作为培养基，两者共同构成发 酵组合并进行发酵所开发的植物源动物用免疫增强剂产品(中药发酵产品)的制备发酵体系1 使用黄芪、玉米粉、麸皮、尿素进行固体发酵基的配制，其中黄芪的质 量分数为58 %，玉米粉质量分数为28 %，麸皮质量分数为10 %，尿素4 %，发酵条件为发酵 体系中料水比为1 2，用0. IM的盐酸调节PH为5.0，接种蛹虫草菌(Cordyc^psmilitaris) (本菌种购得于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号5. 699)作为发酵菌种，使其 含量为> 9. 2 X IO6个/g，发酵过程中温度维持为25V -30°C，发酵时间为264小时。发酵 结束后所得产物经55°C烘干，用60Co γ射线进行辐照杀菌处理，辐照杀菌吸收剂量范围 为5-10kGy，吸收剂量不均勻度< 1. 38。产品检验及质量标准将发酵样品研磨粉碎，精密称取0. 3g至具塞锥形瓶中，准 确加入纯甲醇30ml，并进行超声提取30min。然后4000r/min离心IOmin，取上清液5ml，蒸 干溶剂，并以流动溶解定容至5mL，高速离心(13000r/min)备用。以高效液相色谱法对照虫草素、虫草酸的标准曲线测定发酵产物中的虫草素、虫 草酸含量，以虫草素含量在3. 2mg/g、虫草酸含量在52mg/g以上为发酵成功标准，同时以 葡聚糖为辅料对发酵产物虫草素、虫草酸含量进行调整，使每批发酵产品中虫草素含量为 2. 8mg/g、虫草酸含量为46mg/g。发酵体系2 使用黄芪药渣、玉米粉、麸皮、尿素进行固体发酵基的配制，其中 黄芪药渣的质量分数为50%，玉米粉质量比为31%，麸皮15%，尿素质量比为4% ； 发酵发酵体系中料水体积比为1 2，用0. IM的盐酸调节PH为5.0，接种蛹虫草菌 (Cordyc印smilitaris)(本菌种购得于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号 5. 699)作为发酵菌种，使其含量为> 15. 7 X IO6个/g，发酵过程中温度维持为25°C-30°C， 发酵时间为264小时；发酵结束后所得两种发酵产物经55°C烘干，用60Co γ射线进行辐照杀菌处理， 辐照杀菌吸收剂量范围为5-10kGy，吸收剂量不均勻度< 1. 38。
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产品检验及质量标准将发酵样品研磨粉碎，精密称取0. 3g至具塞锥形瓶中，准 确加入纯甲醇30ml，并进行超声提取30min。然后4000r/min离心IOmin，取上清液5ml，蒸 干溶剂，并以流动溶解定容至5mL，高速离心(13000r/min)备用。以高效液相色谱法对照虫草素、虫草酸的标准曲线测定发酵产物中的虫草素、虫 草酸含量，以虫草素含量在3. 2mg/g、虫草酸含量在52mg/g以上为发酵成功标准，同时以 葡聚糖为辅料对发酵产物虫草素、虫草酸含量进行调整，使每批发酵产品中虫草素含量为 2. 8mg/g、虫草酸含量为46mg/g。实施例1 蛹虫草发酵黄芪(发酵体系1)所得发酵产品动物实验1将40只14日龄健康罗曼雏鸡随机分成对照组和试验组，均按常规方法饲养，在 试验前测定各组鸡的新城疫母源抗体，选取母源抗体为24以下的雏鸡作为实验鸡，并进行 称重，并进行ND-Lasota疫苗(南京天邦生物科技有限公司)以1羽份/只接种量接种，同 时给试验组雏鸡在正常日粮中添加上述发酵产品，使发酵产品的质量分数为4%，持续添加 30天，在试验后10、20、30和40d分别翅静脉采血，进行ND-HI抗体检测(用于测定发酵产 品对鸡体体液免疫增强效果)、ERFC试验(用于测定发酵产品对鸡体细胞免疫增强效果)、 外周血T淋巴细胞ANAE形成率测定(用于测定发酵产品对鸡体细胞免疫增强效果)，在试 验结束时，每组随机取10只鸡称重后，供水禁食24h，颈静脉放血致死，分别采集法氏囊和 脾脏，进行囊体比、脾体比比较。2. 1鸡新城疫HI抗体检测试验前(14日龄)各组鸡ND-HI抗体效价测定结果组间 差异不显著(P > 0. 05)，免疫后10、20、30和40d试验组新城疫HI抗体滴度极显著高于对 照组(P < 0. 01)，证明此免疫增强剂能显著增强体液免疫功能，提高ND-HI抗体滴度，结果 见表1。表1免疫增强剂对鸡新城疫HI抗体消长的影响(log2)
权利要求
一种植物源动物用免疫增强剂，是以蛹虫草菌(Cordyceps militaris)接种黄芪或黄芪药渣为主的固体培养基经发酵、杀菌处理而获得的产品。
2.根据权利要求1所述的一种植物源动物用免疫增强剂，是通过以下方法制备而成1)发酵体系真菌黄芪固体发酵体系中药黄芪的质量比为58%，玉米粉质量比为28%，麸皮10%， 尿素质量比为4%;发酵体系中料水体积比为1 2，用0. IM的盐酸调节PH为5.0，接种蛹 虫草菌(Cordyc印s militaris)作为发酵菌种，使其含量为彡9. 2 X IO6个/g，发酵过程中 温度维持为25°C _30°C，发酵时间为264小时；或者真菌黄芪药渣固体发酵体系黄芪药渣的质量比为50%，玉米粉质量比为31%， 麸皮15%，尿素质量比为4% ；发酵体系中料水体积比为1 2，用0. IM的盐酸调节PH为 5.0，接种蛹虫草菌(Cordyceps militaris)作为发酵菌种，使其含量为彡15. 7 X IO6个/g， 发酵过程中温度维持为25°C -30°C，发酵时间为264小时；2)杀菌处理发酵结束后所得发酵产物经55°C干燥烘干，并用25cm*35cm透明聚乙烯PE塑料包装袋 真空包装并密封，装入瓦楞纸箱封口 ；在原包装下用6tlCo Y射线进行辐照杀菌处理，辐照 杀菌吸收剂量范围为5-10kGy，吸收剂量不均勻度< 1. 38，即得到所述的植物源动物用免 疫增强剂产品。
3.根据权利要求1或2所述的一种植物源动物用免疫增强剂，其特征在于，以高效液相 色谱法对照虫草素、虫草酸的标准曲线测定发酵产物中的虫草素、虫草酸含量，以虫草素含 量在3. 2mg/g、虫草酸含量在52mg/g以上为发酵产物标准。
全文摘要
本发明提供了一种以蛹虫草菌作为发酵菌种发酵中药黄芪开发的植物源动物用免疫增强剂，属于动物保健品领域。其中以中药黄芪及黄芪药渣为原料，接种蛹虫草菌(Cordyceps militaris)，使其含量为≥15.7×106个/g，发酵过程中温度维持为25℃-30℃，发酵时间为264小时；发酵产物经杀菌处理后可直接饲喂家禽或猪，作为动物免疫增强剂使用。本发明原料来源广，生产成本低，免疫增强效果好，生产中无环境污染，发酵产物对人畜安全，效果显著，是一种无公害植物源动物用免疫增强剂。
文档编号A61P37/04GK101940611SQ201010262350
公开日2011年1月12日 申请日期2010年8月25日 优先权日2010年8月25日
发明者张笑意, 曹映海 申请人:南京南农高科兽药研究所有限公司;江苏南农高科动物药业有限公司;南京和普生物科技有限公司