包含Gc-巨噬细胞活化因子的组合物及其用图
【专利说明】包含Gc-巨隘细胞活化因子的组合物及其用途 发明领域
[0001] 本发明设及稳定的药物组合物，所述稳定的药物组合物包含Gc巨隧细胞活化因子 (GcMAF)。本发明特别设及储存稳定的药物组合物，所述储存稳定的药物组合物包含GcMAF 和至少一种药学上可接受的表面活性剂和/或具有表面活性的合成的水溶性聚合物，W及 其用于治疗与巨隧细胞活化相关的疾病的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 巨隧细胞活化在炎症发展和免疫应答调节中起重要作用。与炎症相关的巨隧细胞 活化需要B淋己细胞和T淋己细胞和血清维生素 D结合蛋白（还称为"组特异性组分"或Gc蛋 白）的参与。
[0004] Gc蛋白是人血浆α-2巨球蛋白级分的多态糖蛋白，具有52kDa的表观分子量，通常 构成人血浆中约0.5%的蛋白。Gc蛋白携带包含具有双分支半乳糖和唾液酸末端的N-乙酷 半乳糖胺的Ξ糖。该寡糖被炎症引发的B淋己细胞的可诱导的膜β-半乳糖巧酶水解W产生 巨隧细胞前体活化因子。巨隧细胞前体活化因子继而被Τ淋己细胞的膜Neu-1唾液酸酶水解 W产生巨隧细胞活化因子(GcMAF)。用固定化的β-半乳糖巧酶和唾液酸酶逐步处理纯化的 Gc蛋白也被显示产生GcMAF。
[000引已经显示GcMAF具有破坏肿瘤的作用。证明了因为血清Gc蛋白在癌症患者中被由 癌细胞分泌的血清α-Ν-乙酷半乳糖巧酶(Nagalase)去糖基化，GcMA巧舌性在运些患者中被 消除或降低。因此，去糖基化的Gc蛋白不转化为GcMAF,且巨隧细胞活化被降低或消除。施用 外源GcMAF到患有黑素瘤、前列腺癌、结肠直肠癌或转移性乳腺癌的癌症患者显示出GcMAF 通过克服活性巨隧细胞不足的治疗效应(Yamamoto等，2008，Int. J. Cancer，122:461-467; Yamamoto等，Trans. Oncol. 2008，1:65-72)。在用GcMAF治疗的感染HIV的和骨硬化的患者中 观察到对巨隧细胞活化的相似效应。
[0006] 美国专利号5,177,002公开了产生巨隧细胞活化因子的方法，该方法包括使糖基 化的人组特异性组分与β-半乳糖巧酶或β-半乳糖巧酶与唾液酸酶、α-甘露糖巧酶或其混合 物的组合体外接触，并获得巨隧细胞活化因子。美国专利号5，177,002还公开了用于在有相 应需要的个体中诱导巨隧细胞活化的方法，该方法包括对个体施用由此产生的人巨隧细胞 活化因子。
[0007] W0 93/07288公开了用于产生有效的巨隧细胞活化因子的方法，其中使动物维生 素 D结合蛋白在体外与（i )β-半乳糖巧酶或（i i )β-半乳糖巧酶与唾液酸酶、α-甘露糖巧酶或 其混合物的组合接触。W0 93/07288还公开了用于活化巨隧细胞的方法，该方法包括对动物 施用由此产生的巨隧细胞活化因子。
[0008] W0 96/40903公开了维生素 D结合蛋白（Gc蛋白）及其小结构域(还被称为结构域 III)经由杆状病毒载体的克隆。克隆的Gc蛋白和克隆的结构域III用固定化的β-半乳糖巧 酶和唾液酸酶处理W分别产生巨隧细胞活化因子，GcMAFc和CcIMAFdWO 96/40903还公开了 巨隧细胞活化因子用于治疗癌症、人类免疫缺陷病毒化IV)感染和骨质疏松的用途。
[0009] W0 2012/137199公开了包含基本上缺乏糖巧酶的巨隧细胞活化因子(MAF)的药物 组合物，及使用其治疗癌症或感染HIV的患者的方法。
[0010] Pihl等（Basic&Clin Pharm&Toxicol. ,2010,107:853-860)公开了对纯化的血浆 来源的人Gc蛋白进行的临床前毒理学实验，并指出发现了 Gc蛋白在5%麦芽糖的存在下W 憐酸盐缓冲的盐水(PBS)中约lOmg/ml的浓度稳定四年，完全保留肌动蛋白结合能力且Gc蛋 白的量无显著变化。
[0011 ] F*acini等Kancer Immunol. Immunother. ,2011,60:479-485)评价了不同GcMAF制 剂在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)测定中它们抑制PGEi-刺激的血管生成的效力，并表明在25°C储 存15天减少了约50 %的GcMAF效力。
[0012]对保持GcMAF化学稳定性和生物活性的储存稳定的GcMAF药物组合物存在未满足 的需求。
[001引发明概述
[0014] 本发明提供了药物组合物，所述药物组合物在储存后具有改进的稳定性，所述药 物组合物包含Gc蛋白来源的巨隧细胞活化因子(GcMAF)和至少一种药学上可接受的表面活 性剂和/或具有表面活性的合成的水溶性聚合物。本发明还提供了治疗与巨隧细胞活化相 关的疾病或素乱的方法，所述方法包括对需要此类治疗的受试者施用所述稳定的药物组合 物。
[0015] 本发明部分基于W下发现：当将低浓度的GcMAF的含水溶液储存在4°C或冷冻并然 后解冻时，该溶液的储存导致了 GcMAF的化学稳定性和生物活性的显著损失。
[0016] 现公开了常规药学上可接受的多肤稳定剂，诸如人血清白蛋白化SA)、精氨酸和糖 醇甘露糖醇，无论单独或组合加入对稳定GcMAF的含水溶液(低于30μg/ml)中的GcMAF基本 上无效。
[0017] 本发明的发明人出乎意料地发现了向具有低浓度GcMAF的含水溶液中加入药学上 可接受的表面活性剂克服了在储存后化学稳定性和生物活性损失的问题。例如，加入非离 子表面活性剂到化g/ml GcMAF的含水溶液在4°C、25°C和甚至37°C下多达Ξ个月的储存期 间保持GcMAF化学稳定性。本发明的发明人还公开了非离子表面活性剂能够在具有低浓度 例如化g/ml的GcMAF的溶液的一轮或更多轮冷冻和解冻之后保持溶液中的GcMAF。
[0018] 还公开了非离子表面活性剂不仅在长期储存低浓度GcMAF溶液期间保持了 GcMAF 化学稳定性，而且如通过巨隧细胞活化测量的，在此储存期间还保存了GcMAF生物活性。
[0019] 本发明的发明人还公开了离子表面活性剂W及具有表面活性的水溶性聚合物在 长期储存期间有效稳定GcMAF。然而，多糖诸如透明质酸或海藻酸盐对GcMAF不发挥显著的 稳定效应。因此，本发明的组合物是高度有益的，因为当被配制为低浓度(~lOOng/ml到~ lmg/ml)GcMAF的液体制剂时，其在长期储存之后，即在4°C下至少六个月之后，保持GcMAF的 化学稳定性和生物活性。而且，本发明的组合物简化GcMAF的操作和递送并使冷冻组合物并 在解冻后对GcMAF化学稳定性基本上极小或没有影响成为可能，由此进一步避免解冻后立 即使用组合物的需要。
[0020] 根据第一个方面，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含稳定的或稳定 化的Gc巨隧细胞活化因子(GcMAF)或其生物活性变体或片段和选自由W下组成的组的至少 一种药学上可接受的赋形剂:表面活性剂和水溶性聚合物。
[0021] 根据一些实施方案，稳定的GcMAF选自由W下组成的组:独立地具有连接到氨基酸 残基的N-乙酷半乳糖胺基团的人GcMAF和动物GcMAF。根据一个实施方案，稳定的GcMAF是具 有连接到氨基酸残基的N-乙酷半乳糖胺基团的人GcMAF。根据另外的实施方案，稳定的 GcMAF包含如SEQ ID NO: 1到3中的任一个所列出的氨基酸序列。根据另外的实施方案，稳定 的GcMAF片段包含相应于Gc蛋白的氨基酸400-435的氨基酸序列。根据还另外的实施方案， 稳定的GcMAF片段由如SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:5中列出的氨基酸序列组成。
[0022] 根据另外的实施方案，当组合物呈液体的形式时，稳定的GcMAFW从约10化g/ml到 约Img/ml范围的浓度存在，可选地当组合物呈液体的形式时，GcMAF W从约1 OOng/ml到约 300μg/ml、另外可选地从约200ng/ml到约30μg/ml且仍另外可选地从约200ng/ml到约化g/ ml范围的浓度存在。每种可能性是本发明的单独的实施方案。根据某个实施方案，当组合物 呈液体的形式时，GcMAF W从约200ng/na到约化g/ml范围的浓度存在。
[0023] 根据另外的实施方案，表面活性剂选自由W下组成的组:非离子表面活性剂、阴离 子表面活性剂、阳离子表面活性剂、兼性表面活性剂(amphoteric surfactant)和两性离子 表面活性齐iKzwitterionic surfactant)。
[0024] 根据一些实施方案，非离子表面活性剂选自由W下组成的组：山梨聚糖脂肪酸醋、 聚氧山梨聚糖脂肪醋（polyoxysorbitan fatty acid esters)、聚氧化締高级醇酸 (polyoxya化ylene higher alcohol ethers)和聚氧化締高级醇醋。非离子表面活性剂的 实例包括，但不限于，聚氧乙締山梨糖醇醋、聚氧乙締异辛基苯基酸、聚氧乙締壬基苯基酸、 聚氧乙締十二烷基酸、辛基葡萄糖巧和烷基麦芽糖巧。根据还另外的实施方案，非离子表面 活性剂选自由W下组成的组：聚山梨醇醋8〇(TWEEN?8〇)、聚山梨醇醋6〇(tWEEN? 60)、聚山梨醇醋20(TWEEN?20)、N-十二烷基-β-D-麦芽糖巧、Triton X-100、Brij 58、 泊洛沙姆188、泰洛沙泊、PEG-40硬脂酸醋、NP-40、Pluronic? F-68和泊洛沙姆4070。每种可 能性是本发明的单独的实施方案。根据某个实施方案，非离子表面活性剂是聚山梨醇醋，例 如，聚山梨醇醋 8〇(tween"8〇)。
[0025] 根据另外的实施方案，水溶性聚合物是具有表面活性的合成的水溶性聚合物。根 据另外的实施方案，具有表面活性的合成的水溶性聚合物选自由W下组成的组:聚乙締醇、 聚环氧丙烷/环氧乙烧嵌段共聚物、乙二醇/丙二醇的共聚物、聚-1,3-二氧戊烧、聚-1，3,6-Ξ嗯烧、乙締/马来酸酢共聚物、丙二醇均聚物和聚氧乙基化多元醇。根据示例性实施方案， 具有表面活性的水溶性聚合物是聚乙締醇。
[0026] 根据另外的实施方案，药物组合物还可包含张度剂。根据某个实施方案，张度剂是 氯化钢。
[0027] 根据另外的实施方案，该药物组合物还可包含缓冲剂。缓冲剂的实例包括，但不限 于，憐酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、Tris缓冲液和巧樣酸盐缓冲液。
[0028] 根据还另外的实施方案，药物组合物还可包含药学上可接受的载体或稀释剂。根 据某个实施方案，载体是水。
[0029] 根据仍另外的实施方案，药物组合物W选自由W下组成的组的形式被配制:溶液、 悬浮液、乳剂、粉末、片剂和胶囊。根据某个实施方案，组合物W水溶液的形式被配制。根据 示例性实施方案，药物组合物包含GcMAF、聚山梨醇醋80、氯化钢、憐酸盐缓冲液和水，其中 组合物的pH范围在约5到约8之间，且其中GcMAF在组合物中的浓度范围从约1 OOng/ml到约 Img/ml、可选地从约1 OOng/ml到约300μg/ml、还可选地从约200ng/ml到约30μg/ml，及仍还 可选地从约2(K)ng/ml到约化g/ml。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
[0030] 根据另一个方面，本发明提供了用于治疗与巨隧细胞活化相关的疾病或素乱的方 法，所述方法包括对需要运样治疗的受试者施用治疗有效量的根据本发明的原理的药物组 合物。
[0031] 根据一些实施方案，受试者是人类或动物。根据某个实施方案，动物是宠物动物， 诸如狗。
[0032] 根据另外的实施方案，与巨隧细胞活化相关的疾病或素乱选自由W下组成的组： 癌症、病毒性疾病、细菌感染、自身免疫性疾病、孤独症和慢性疲劳综合症。每种可能性代表 了本发明的单独的实施方案。
[0033] 根据另外的实施方案，稳定的GcMAF是独立地具有连接到氨基酸残基的N-乙酷半 乳糖胺基团的人GcMAF或动物GcMAF。根据某个实施方案，GcMAF是具有连接到氨基酸残基的 N-乙酷半乳糖胺基团的人GcMAF。根据另外的实施方案，GcMAF包含如SEQ ID NO: 1到3中的 任一个中列出的氨基酸序列。每种可能性代表了本发明的单独的实施方案。
[0034] 根据另外的实施方案，药物组合物通过非肠道或通过口服施用途径来施用。根据 某个实施方案，药物组合物通过静脉内、肌肉内或通过皮下施用途径来施用。每种可能性代 表了本发明的单独的实施方案。