糖疫苗制剂的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及包含带相反电荷的免疫原性分子的糖疫苗的改进制剂。
[0002] 背景 MAG-Tn3是大小近似llKDa的糖-肽抗原。MAG-Tn3存在于显著比例的人癌症中，且被认 为是免疫治疗的候选抗原。
[0003] 对于免疫治疗，MAG_Tn3可能与免疫刺激剂组合。一种示例性免疫刺激剂是CpG寡 脱氧核苷酸。
[0004] 当制造疫苗时，产生含有一种或多种免疫原性分子的最终液体组合物，通常被称 为"最终材料(final bulk)"。为了便于储存，最终材料可以干燥(例如，通过冻干）。干燥疫 苗，有时被称为冻干饼，可以重构于药学上可接受的溶剂，诸如水、缓冲液等，并且可以被称 为'最终容器'。
[0005] MAG_Tn3/CpG最终材料可能被冻干以产生最终产品以便于储存。该最终产品可能 重构于缓冲系统或佐剂系统中用于施用于患者。
[0006] 当配制分子用于疫苗用途时，不确定所述组合物将是稳定的。例如，分子可以在标 准条件下聚集或沉淀。即使克服此类问题，也可以发生一种或多种组分的物理或化学降解。 需要克服此类限制的组合物和方法。进一步，当单独配制时稳定的分子在其它分子存在的 情况下可以经历共沉淀。
[0007] 发明概述 提供基本上稳定的疫苗组合物，所述组合物包含精氨酸;平衡离子;包含Τη基团的第一 免疫原性分子，其中所述第一免疫原性分子具有净正电荷;和包含寡核苷酸的第二免疫原 性分子，其中所述第二免疫原性分子具有净负电荷;所述组合物的特征在于当所述组合物 包含水时，（i)所述第一和第二免疫原性分子是基本上稳定的；且（ii)所得溶液的pH小于 8.5。在某些方面，所述第一免疫原性分子是Mag-Tn3。在某些方面，所述第二免疫原性分子 包含CpG寡核苷酸。在某些方面，一部分精氨酸作为精氨酸单盐酸盐的种类存在。在某些方 面，将所述组合物干燥。在某些方面，所述组合物包含水。
[0008] 在某些方面，所述组合物进一步包含佐剂组合物，所述佐剂组合物包含佐剂MPL和 QS21中的一者或两者。在某些方面，所述佐剂组合物任选地进一步包含脂质体。
[0009] 还提供用于制备基本上稳定的疫苗组合物的工艺，所述工艺包括组合以下的步 骤:精氨酸;包含Τη基团的第一免疫原性分子，其中所述第一免疫原性分子具有净正电荷； 和包含寡核苷酸的第二免疫原性分子，其中所述第二免疫原性分子具有净负电荷;其中前 述组分中的一种或多种与包含水的液体组合，且其中所述组合物的pH为8.5或更小。还提供 通过这些工艺产生的组合物。
[0010] 提供用于治疗患者的方法，所述方法包括将如本文公开的组合物施用于人的步 骤。还提供用途，特别是精氨酸单盐酸盐作为基本上稳定的疫苗组合物的添加剂的用途。
[0011] 还提供包含如本文公开的组合物的容器。
[0012] 附图简述 图1:分开混合的CpG7909和MAG-Tn3配制程序的流程图。
[0013]图2:标准配制流程图。第一步骤中使用的赋形剂列于表2中。
[0014]图3:谷氨酸/赖氨酸和谷氨酸/精氨酸和1.0%w/v Empigen制剂在4°C24小时之后 的还原SDS-PAGEdMAG-TM是在近似15KDa的主要条带。箭头突出沉淀级分中发现的条带，且 虚线圆和点线圆突出条带强度的增加;虚线比点线强度更高。在10mM琥珀酸盐pH 5.0缓冲 液中稀释的MAG-Tn3 1?中的对照，其被验证为用于单独MAG-Tn3的最稳定缓冲系统。该凝胶 使用Si IverExpress染色。NC:未离心，SN:上清液，P:重悬的沉淀级分，MW:分子量标记。 [0015] 图4:Tris-马来酸盐制剂在4°C24小时之后的SDS-PAGEaMAG-Tr^是在近似15KDa的 主要条带;较低条带对应于在近似8KDa的CpG。箭头突出沉淀级分中发现的条带，且虚线突 出条带强度的增加。在10mM琥珀酸盐pH 5.0缓冲液中稀释的MAG-Tn3 1?中的对照，其被验 证为用于单独MAG-Tn3的最稳定缓冲系统。该凝胶使用染色CpG7909的Silver Quest进行染 色。NC:未离心，SN:上清液，P:重悬的沉淀级分，丽:分子量标记。
[0016] 图5:精氨酸和组氨酸制剂的还原SDS-PAGEJAG-tM是在近似15KDa的主要条带； 较低条带对应于在近似8KDa的CpG。箭头突出沉淀级分中发现de条带。NC:未离心，SN:上清 液，P:重悬的沉淀级分。
[0017] 图6:L-精氨酸筛选制剂的还原SDS-PAGEJAG-TM是在近似15KDa的主要条带;较 低条带对应于在近似8KDa的CpGJC:未离心，SN:上清液，P:重悬的沉淀级分。与其它制剂相 比，在15mM L-精氨酸制剂的沉淀级分中观察到稍微更强条带(上面圈出）。
[0018] 图7:15-35mM L-精氨酸制剂的HPLC-SEC荧光色谱叠加。
[0019] 图8:L-精氨酸单盐酸盐筛选制剂的还原SDS-PAGEaMAG-Tr^是在近似15KDa的主要 条带；较低条带对应于在近似8KDa的CpG。NC:未离心，SN:上清液，P:重悬的沉淀级分。从 225mM至300mM L-精氨酸单盐酸盐观察到沉淀级分中的稍微更强条带，上面圈出。
[0020] 图9:100-200mM L-精氨酸单盐酸盐制剂的HPLC-SEC荧光色谱叠加。
[0021 ] 图10:剂量范围制剂的还原SDS-PAGEaMAG-Tr^是在近似15KDa的主要条带;较低条 带对应于在近似8KDa的CpG。箭头表明最高MAG-Tn3浓度的沉淀级分的轻微条带。NC:未离 心，SN:上清液，P:重悬的沉淀级分。MAG-Tn3纯化的原料对照已经上样于孔2-4中。
[0022] 图ll:200-900ug/mL MAG_Tn3制剂的大小排阻概况的色谱叠加。
[0023] 图12:剂量范围制剂的还原SDS-PAGEaMAG-Tr^是在近似15KDa的主要条带;较低条 带对应于在近似8KDa的CpG。箭头表明较高MAG-Tn3浓度的沉淀级分中的轻微条带。孔18中 存在的较高分子量条带是异常的。NC:未离心，SN:上清液，P:重悬的沉淀级分。
[0024] 图13:420、270和180ugCpG7909/剂量模拟最终容器在T0的HPLC-SEC色谱叠加。
[0025] 图 14:420ug CpG7909/剂量MAG-Tn3制剂在25°C孵育T0、4和24小时的HPLC-SEC叠 加。
[0026] 图15:180、270和420ugCpG/剂量MAG-Tn3制剂在25°C孵育24小时的HPLC-SEC色 谱。
[0027] 详述 申请人发现，在溶液中组合MAG-Tn3和CpG分子引起瞬时共沉淀，并且当使用标准赋形 剂时，当重构冻干的干燥饼时，它是不溶解的。
[0028]本发明人已经令人惊讶地发现，在用于与具有净正电荷的第一免疫原性分子组合 具有净负电荷的第二免疫原性分子一起使用的制剂中包括精氨酸(包含精氨酸单盐酸盐种 类级分)允许合适用作哺乳动物受试者中的可注射疫苗的稳定性和pH的合适组合。
[0029] 包含精氨酸的组合物 在本文某些方面，本公开提供包含精氨酸、平衡离子、具有净正电荷的第一免疫原性分 子和具有净负电荷的第二免疫原性分子的疫苗组合物，所述组合物的特征在于当所述组合 物包含药学上可接受的溶剂时，（i)所述第一免疫原性分子和所述第二免疫原性分子是基 本上稳定的;且（：1：0口^1小于8.5。
[0030]在某些方面，所述第一免疫原性分子包含碳水化合物基团。在某些方面，所述第一 免疫原性分子包含Τη基团。在某些方面，所述第一免疫原性分子包含MAG-Tn3。
[0031 ]在本文某些方面，所述第二免疫原性分子包含寡核苷酸。在某些方面，所述寡核苷 酸是免疫刺激性寡核苷酸。在某些方面，所述寡核苷酸是含有CpG的寡核苷酸。在某些方面， 所述寡核苷酸是CpG7909。
[0032] 精氨酸 精氨酸可以作为L-或D-形式或两者的混合物存在。L-精氨酸也称为L_( + )_精氨酸2-氨 基-5-胍基戊酸;2-氨基-5-胍基戊酸酯;L-a-氨基-d-胍基戊酸酯L-α-氨基-δ-胍基戊酸;?α-氨基-d-胍基戊酸; N5_( 氨基亚氨基 甲基) -L-鸟氨酸 L-α-氨基-δ-胍基戊酸酯； 5_[ (氨基 亚氨基甲基）氨基]-L-正缬氨酸（S)-2-氨基-5-[(氨基亚氨基甲基）氨基]戊酸；（S)-2-氨 基-5-[(氨基亚氨基甲基)氨基]-戊酸酯（S)-2-氨基-5-[(氨基亚氨基甲基)氨基]戊酸酯； 和(S)-2-氨基-5-[(氨基亚氨基甲基)氨基]-戊酸。
[0033]精氨酸由式I代表：
精氨酸可以用盐酸或具有除了氯化物以外的共辄碱的酸中和，导致产生精氨酸· H-X， 其中X包括但不限于cr、sor2和柠檬酸根。
[0034]在本文某些方面，精氨酸的种类包括精氨酸单盐酸盐。
[0035]精氨酸单盐酸盐可以作为L-或D-形式或两者的混合物存在。它也称为（2S)-2_氨 基-5-[(氨基亚氨基甲基)氨基]戊酸单盐酸盐、精氨酸盐酸盐和精氨酸·Ηα。精氨酸单盐酸 盐可以通过用盐酸中和精氨酸来制造。精氨酸单盐酸盐由式II代表。
[0036]精氨酸和精氨酸·Ηα用于细胞培养基和药物开发。氨基酸精氨酸用作溶液添加剂 以针对蛋白-蛋白聚集稳定蛋白，特别是在蛋白重折叠的过程中。参见Baynes等人（2005) Biochemistry 44:4919_4925;Tsumoto等人（2004) Biotechnol. Prog. 20:1301-1308. 如Baynes中所解释，聚集是非天然蛋白构象装配成多聚态，经常导致相分离和沉淀。溶液中 精氨酸的存在显示在两个模型系统中减缓蛋白-蛋白结合反应:胰岛素与单克隆抗体的结 合和碳酸酐酶II (CA)的折叠中间体和聚集体的结合。精氨酸用作人血清白蛋白的替代，以 保护治疗性蛋白（包括糖蛋白）免于降解。参见Kim (2009) Biosci Biotechnol Biochem. 73:61-6〇
[0037] 因为溶液中的精氨酸是多元酸/碱系统，所以它与四种不同的质子化/电荷状态结 合。精氨酸的溶液将包含具有不同的质子化状态的种类的混合物。这些状态如下： 1. "h3b2+，，，
当平衡离子为2 Cl_时，式III的质子化状态被称为精氨酸二盐酸盐。
[0038] 2 · "H2B+"，
当平衡离子为cr时，式IV的质子化状态被称为精氨酸单盐酸盐，或精氨酸· HC1。
[0039] 3· "HB"
式V的质子化状态被称为精氨酸碱。
[0040] 4· "B-，，
当平衡离子为Na+或K+时，式VI的质子化状态被称为精氨酸钠或精氨酸钾。
[0041] 精氨酸的质子化/去质子化根据以下方案进行。
[0042] "免疫原性分子"意指能够在受试者中诱导免疫应答的分子。
[0043] 本文术语"分子"包括但不限于大分子、寡聚体分子和单体。"大分子"意指高相对 分子量的聚合分子，其结构基本上包含实际上或概念上衍生自相对低分子量的分子的单元 的多重重复，包括多糖、多肽、核酸等，以及具有大分子量的非聚合分子，诸如脂质和大环化 合物。"寡聚物分子"意指中间相对分子量的分子，其结构基本上包含实际上或概念上衍生 自较低相对分子量的分子的小多个单元。"单体"是指可以经历聚合的分子。
[0044] 分子的"净电荷"意指在给定pH或pH范围分子上的正电荷和负电荷的算术总和。具 有"净正电荷"的分子在给定pH或pH范围将具有多数正电荷；同样，具有"净负电荷"的分子 在给定pH或pH范围将具有多数负电荷。适用的pH或pH范围是包含相关分子的溶液的pH或pH 范围。
[0045] 包含Τη基团的碳水化合物基团 在本文某些方面，本公开提供包含碳水化合物基团或碳水化合物抗原的免疫原性分 子。
[0046] "碳水化合物基团"意指化学连接至分子的另一部分的分子的碳水化合物部分。因 此，碳水化合物基团可以结合至另一碳水化合物分子或另一类的分子，诸如蛋白（或肽）。具 有碳水化合物基团的示例性分子包括寡糖、多糖、糖肽、糖蛋白等，其中一些可以是碳水化 合物抗原。
[0047] "碳水化合物抗原"意指基于糖的抗原，包括细菌荚膜多糖、肿瘤相关的碳水化合 物抗原等。
[0048] 在本文某些方面，本公开提供包含Τη基团的免疫原性分子。
[0049] "Τη"或"Τη基团"意指如Morrelli (2011) Eur. J. Org.