预防或治疗缺血/再灌注损伤之后无复流的方法
【专利摘要】本发明公开了预防或治疗缺血/再灌注损伤之后无复流的方法。本发明提供了预防或治疗哺乳动物对象中的心脏缺血-再灌注损伤的方法。所述方法提供了给药有效量的芳香族阳离子肽以预防或治疗所述哺乳动物对象中的解剖无复流区。所述方法包括将有效量的芳香族阳离子肽给药至有需要的对象。
【专利说明】
预防或治疗缺血/再灌注损伤之后无复流的方法
[000。 本申请是申请日为2011年07月08日、申请号为"201180042936. 5"、发明名称为 "预防或治疗缺血/再灌注损伤之后无复流的方法"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求2010年7月9日提交的第61/363129号、2010年7月9日提交的第 61/363133号、和2010年11月11日提交的第61/412655号美国临时专利申请的优先权，运 些临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
[0004] 本发明总体设及预防或治疗缺血/再灌注组织损伤的组合物和方法。具体地，本 发明的实施方式设及给药有效量的芳香族阳离子肤，来预防或治疗存在缺血/再灌注组织 损伤风险的或患有缺血/再灌注组织损伤的哺乳动物对象中的解剖无复流区。
【背景技术】
[0005] 提供W下描述来便于读者理解。所提供的信息或所引用的参考文献都不能被认为 是现有技术。
[0006] 在急性屯、肌梗塞（AMI)后，直接的治疗目标是形成梗塞相关动脉的通杨。然而，成 功恢复屯、外膜冠状动脉通杨并不一定使组织灌注得到改善。微血管系统的结构破坏或堵 塞，即所谓的"无复流"现象，可在经皮冠状动脉介入治疗术（PCI)之前发生或者由于经皮 冠状动脉介入治疗术（PCI)而发生并且能够损伤冠状动脉血流。具有无复流现象的患者具 有不良的临床预后。无复流现象通常与组织中的解剖无复流区的存在相关。成像模式的发 展已经增强了无复流的可视化，其证明了无复流的发生率高于只通过临床判断而估计的无 复流的发生率。运一现象是重要的，因为无复流与梗塞面积相关且提供有用的预后信息。无 复流与左屯、室射血分数减小、左屯、室重构W及不良的临床结果有关，运使具有该无复流现 象的患者成为再灌注患者中的高危人群。因此，已将注意力从仅仅实现屯、外膜冠状动脉通 杨转向可导致解剖无复流区的微血管系统状况上。
【发明内容】
[0007] 本发明的技术设及通过将治疗有效量的芳香族阳离子肤（例如 D-Arg-2'，6'-Dmt-Lys-Phe-NH2)或其药学上可接受的盐（例如醋酸盐或Ξ氣醋酸盐）给药 至有需要的对象来治疗或预防哺乳动物中的屯、脏缺血-再灌注损伤。在一些实施方式中， 本发明的技术设及在治疗或预防缺血/再灌注之后的解剖无复流区、出血区和梗塞面积中 可使用的方法。
[0008] 在一些方面中，本申请提供了一种治疗或预防解剖无复流区的方法，其包括将治 疗有效量的芳香族阳离子肤（例如D-Arg-2'，6'-Dmt-Lys-Phe-NH2)或其药学上可接受的 盐（例如醋酸盐或Ξ氣醋酸盐）给药至有需要的对象。在一些实施方式中，该方法还包括 对所述对象执行血管重建术。在一些实施方式中，芳香族阳离子肤是具有W下特点的肤：
[0009] 至少一个净正电荷；
[0010] 最少四个氨基酸；
[0011] 最多约20个氨基酸；
[0012] 净正电荷的最小数目（Pm)和氨基酸残基的总数目（r)之间的关系为：其中，3pm是 小于或等于r+1的最大数；W及芳香族基团的最小数目（a)和净正电荷的总数目（Pt)之间 的关系为：其中，除了当a为1时，Pt也可为1之外，2a是小于或等于P t+1的最大数。在特 定的实施方式中，所述对象是人类。
[0013] 在一些实施方式中，2Pm是小于或等于r+1的最大数，且a可W等于Pt。所述芳香 族阳离子肤可W是具有最少两个正电荷或最少Ξ个正电荷的可溶于水的肤。在一些实施方 式中，所述肤包括一种或多种非天然存在的氨基酸，例如一种或多种D型氨基酸。在一些实 施方式中，氨基酸的在C-末端的C-末端簇基被酷胺化。在某些实施方式中，所述肤最少具 有4个氨基酸。肤可W有最多约6个、最多约9个或者最多约12个氨基酸。
[0014] 在一些实施方式中，所述肤在N-末端包括酪氨酸或2'，6'-二甲基酪氨酸（Dmt) 残基。例如，所述肤可具有式 Tyr-D-Arg-Phe-LyS-NH2或 2 '，6 ' -Dmt-D-Arg-Phe-LyS-NH 2。 在另一实施方式中，所述肤在N-末端包括苯丙氨酸或2 '，6'-二甲基苯丙氨酸残基。例如， 所述肤可具有式化e-D-Arg-Phe-Lys-NHz或 2'，6' -Dmp-D-Arg-Phe-Lys-NHz。在特定的实 施方式中，芳香族阳离子肤具有式D-Arg-2' ,6' -Dmt-Lys-Phe-NHz或其药学上可接受的盐 (例如醋酸盐或Ξ氣醋酸盐）。
[0015] 在一个实施方式中，所述肤由下式I所定义：
[0016]
[0017] 其中，R郝R 2各独立地选自：
[001 引 α)氨；
[001引 扣）直链的或支链的Ci-Ce的烷基；
[0020] (iii)
[0021]
其中 m=l-3;
[0022] (iv)
[0026] R呀P R 4各独立地选自：
[0027] (i)氨；
[0028] (ii)直链的或支链的Ci-Ce的烷基；
[0029] (iii)Ci-Ce 的烷氧基；
[0030] (iv)氨基；
[0031] (v)Ci-C4的烷基氨基；
[00扣](vi)Ci-C4的- 烷基氨基；
[0033] (Vii)硝基；
[0034] (viii)径基；
[003引 （ix)面素，其中"面素 "包括氯、氣、漠和舰；
[003引 R5、r6、R\ R嘴R 9各独立地选自；
[0037] (i)氨；
[0038] (ii)直链的或支链的Ci-Ce的烷基；
[0039] (iii)Ci-Ce 的烷氧基；
[0040] (iv)氨基；
[00川 （v)Ci-C4的烷基氨基；
[004引 （vi)Ci-C4的- 烷基氨基；
[004引（Vii)硝基；
[0044] (viii)径基；
[004引 （ix)面素，其中"面素 "包括氯、氣、漠和舰；且
[0046] η为1到5的整数。
[0047] 在特定的实施方式中，R郝R2是氨；R郝R墙甲基；35、护、1?\护和1?9都是氨；且 η为4。
[0048] 在一个实施方式中，肤由下式II所定义：
[0049]
[0050] 其中，R郝R2各独立地选自：
[0051] (i)氨；
[0052] (ii)直链的或支链的Ci-Ce的烷基；
[0053] (iii)
[005引 R3、R4、R5、R6、R 7、R8、R9、Ri°、Ri嘴 R I2各独立地选自：
[0060] (i)氨；
[0061] (ii)直链的或支链的Ci-Ce的烷基；
[0062] (iii)Ci-Ce 的烷氧基；
[0063] (iv)氨基；
[0064] (V)的烷基氨基；
[00财 （vUCi-C4的二烷基氨基；
[0066] (vii)硝基；
[0067] (viii)径基；
[006引 （ix)面素，其中"面素 "包括氯、氣、漠和舰拟及
[0069] η为1到5的整数。
[0070] 在特定的实施方式中，R\ R2、R3、R4、R5、R6、R 7、R8、R9、Ri°、Ri嘴R I2均为氨；且η为 4。在另一实施方式中，1?1、1?2、1?3、护、1?5、1?6、护、护、3嘴31咱为氨；3嘴|^12为甲基；310为 径基；且η为4。
[0071] 可各种方式将芳香族阳离子肤给药。在一些实施方式中，肤可W 口服给药、局 部给药、鼻内给药、腹腔内给药、静脉内给药、皮下给药或经皮肤（例如离子电渗疗法）给 药。在一些实施方式中，通过冠状动脉内途径或动脉内途径进行给药芳香族阳离子肤。
[0072] 在一个实施方式中，本发明的技术提供一种用于预防或治疗需要预防或 治疗的哺乳动物对象中的解剖无复流区的方法，该方法包括将治疗有效量的肤 D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz或其药学上可接受的盐（例如醋酸盐或Ξ氣醋酸盐）给药 至对象，从而预防或治疗对象中的微血管损伤。在一个实施方式中，该方法还包括对所述对 象执行血管重建术的步骤。在一个实施方式中，解剖无复流区指对象的微血管破坏或堵塞。 在一个实施方式中，所述哺乳动物对象存在解剖无复流区的风险或患有解剖无复流区疾 病。在一个实施方式中，所述对象存在与屯、血管组织相关的或者在屯、血管组织中的解剖无 复流区的风险，或患有与屯、血管组织相关的或者在屯、血管组织中的解剖无复流区疾病。在 一个实施方式中，所述对象存在与脑组织相关的或者在脑组织中的解剖无复流区的风险， 或患有与脑组织相关的或者在脑组织中的解剖无复流区疾病。在一个实施方式中，所述对 象存在与肾脏组织相关的或者在肾脏组织中的解剖无复流区的风险，或患有与肾脏组织相 关的或者在肾脏组织中的解剖无复流区疾病。在一个实施方式中，所述对象存在与骨骼组 织相关的或者在骨骼组织中的解剖无复流区的风险，或患有与骨骼组织相关的或者在骨骼 组织中的解剖无复流区疾病。在一个实施方式中，解剖无复流区包括所述对象的微血管的 破坏或堵塞。在一个实施方式中，在形成解剖无复流区之前将所述肤给药至所述对象。在 一个实施方式中，在形成解剖无复流区之后将所述肤给药至所述对象。
[0073] 在一个实施方式中，在血管重建术之前将所述肤给药至所述对象。在另一实施方 式中，在血管重建术之后，将所述肤给药至所述对象。在另一实施方式中，在血管重建术期 间和血管重建术之后将所述肤给药至对象。在另一实施方式中，在血管重建术之前、血管重 建术期间和血管重建术之后，将所述肤连续给药至所述对象。
[0074] 在一个实施方式中，在血管重建术之后，将所述肤给药至所述对象至少3小时、至 少5小时、至少8小时、至少12小时或至少24小时。在一个实施方式中，在血管重建术之 前至少8小时时、至少4小时时、至少2小时时、至少1小时时、或至少10分钟时开始将所 述肤给药至对象。
[00巧]在各个实施方式中，所述对象患有屯、肌梗塞、中风、或需要血管成形术。在一个实 施方式中，血管重建术选自：气囊血管成形术、旁路移植物插入、支架插入、经皮腔内冠状动 脉成形术、或定向性冠状动脉斑块旋切术。在一个实施方式中，血管重建术指消除阻塞。在 一个实施方式中，血管重建术指给药一种或多种血栓溶解剂。在一个实施方式中，所述一种 或多种血栓溶解剂选自：组织型纤溶酶原激活剂、尿激酶、尿激酶原、链激酶、纤溶酶原的酷 化形式、纤溶酶的酷化形式、和酷化的链激酶-纤溶酶原复合物。
[0076] 在一些实施方式中，血管阻塞选自：深静脉血栓、外周血栓、栓塞性血栓、肝静脉血 栓、窦血栓、静脉血栓、阻塞的动静脉短路、和阻塞的导管装置。
[0077] 在一个方面，本发明提供一种冠状动脉血管重建的方法，该方法包括：(a)将治疗 有效量的肤D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz或其药学上可接受的盐（例如醋酸盐或Ξ氣醋 酸盐）给药至哺乳动物对象；和（b)对所述对象执行冠状动脉旁路移植手术。
【附图说明】
[0078] 图1示出用在实施例中的动物的研究设计；
[0079] 图2A和图2B分别为说明体内研究步骤的研究流程图和病理学测量的研究流程 图；
[0080] 图3示出使用组织学染色技术评估来自使用实施例1中所描述的模型进行屯、脏缺 血/再灌注的对照兔子的屯、脏组织。画面A至画面C示出来自一个代表性对照兔子的示例 性屯、脏切片。画面A :示出缺血风险区域的照片。在再灌注时间段结束时冠状动脉再次阻 塞，且通过左屯、房导管注入化isperse蓝。蓝色区域为屯、脏内的灌注区域，而缺乏蓝色染料 的区域没有进行灌注。画面B:无复流区域（硫代黄素 S染色且在紫外光下进行拍照）。在 再阻塞动脉之前，在再灌注时间段结束时通过左屯、房导管注入硫代黄素 S。未受损伤的血管 的区域呈现巧光，而无复流区域发暗。画面C:在TTC(氯化Ξ苯基四氮挫）中培养后的屯、 脏切片。坏死组织区域呈现白色，而非坏死组织染成红色；
[0081] 图4为示出包含在风险区内的出血区域的示例性实施方式的照片；
[0082] 图5为示出D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz对AMI兔子模型中的IA/AR平均值的 作用的图；
[0083] 图6为示出AMI兔子模型中的处理组和对照组中的坏死区和风险区之间的关系的 图；
[0084] 图7为示出AMI兔子模型中的处理组和对照组中的风险区和无复流区之间的关系 的图；
[0085] 图8为示出AMI兔子模型中的处理组和对照组中的风险区和无复流区之间的关系 的图讯
[0086] 图9A和图9B为示出AMI兔子模型中的对照组和处理组中的梗塞面积和无复流区 的图。
【具体实施方式】
[0087] 应当理解，为了提供对本发明的实质性理解，在下文中W不同的详细程度描述了 本发明的某些方面、模式、实施方式、变型和特征。
[0088] 在实施本发明中，使用在分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微 生物学和重组DNA方面的许多常规技术。运些技术是公知的且分别在W下文献中进行解 释：例如 Ausubel 编（1997)的 Qirrent Protocols in Molecular Biology,第 I-III 卷； Sambrook等，Molecular Cloning:A L油oratory Manual,第二版（冷泉港实验室出版社，冷 泉港，纽约，1989) ;Glove;r编（1985)的DNA Cloning:A Practical Approach,第 I 和 II 卷； Gait编（1984)的Oligonucleotide Synthesis ;化mes&Higgins编（198?5)的Nucleic Acid Hybridization;Hames&Higgins 编（1984)的 Transcription and Translation ;Freshney 编（1986)的Animal Cell Cuhure ;Immobilized Cells and Enzymes (II?L 出版社，1986); PerbaL A Practical Guide to Molecular Cloning ;Meth.Enzymol.系列（学术出版社， Inc. , 1984) ;Miller&Calos 编的 Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (冷泉港 实验室，纽约，1987);和 Wu&Grossman 和 Wu 编的 Meth. Enzymol.，第 154 和第 155 卷。
[0089] 下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所 有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意 思。
[0090] 除非内容清楚指明，否则本说明书和所附的权利要求中使用的单数形式"一"和 "该"包括复数的引用对象。例如，所提及的"一个细胞"包括两个细胞或更多细胞的组合等。
[0091] 文中使用的将制剂、药物或肤"给药"至对象包括将化合物引入到或给送至对象W 执行其预期功能的任何途径。可W通过任何合适的途径来执行"给药"，包括口服、鼻内、肠 胃外（通过静脉内、肌内、腹腔内或皮下）或者局部给药。在一些实施方式中，通过冠状动 脉内途径或动脉内途径给药芳香族阳离子肤。"给药"包括自己给药和由其他人给药。
[0092] 本文中使用的术语"氨基酸"包括天然存在的氨基酸和合成的氨基酸W及氨基酸 类似物和W类似于天然存在的氨基酸的形式作用的氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是通 过遗传密码编码的氨基酸W及后来被改性的那些氨基酸，比如径（基）脯氨酸、丫-簇基谷 氨酸和0-憐酸丝氨酸。氨基酸类似物指的是具有和天然存在的氨基酸相同的基本化学结 构的化合物，例如，所述的基本化学结构即结合至氨的α -碳、簇基、氨基和R基，所述氨基 酸类似物比如为高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚讽、蛋氨酸甲基梳。运样的类似物具有改性 的R基（例如正亮氨酸）或改性的肤主链，但保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结 构。氨基酸模拟物指的是具有与氨基酸的通用化学结构不同的结构、但W类似于天然存在 的氨基酸的方式作用的化学化合物。本文中按照IUPAC-IUB生化命名委员会建议的通常已 知的Ξ字母符号或者一字母符号可指代氨基酸。
[0093] 本文中使用的术语"有效量"指的是足W获得所需的治疗和/或预防效果的量，例 如引起预防或减轻屯、脏缺血再灌注损伤或与屯、脏缺血再灌注损伤关联的一种或多种病症 的量。在治疗应用或预防应用的背景下，给药至对象的组合物的量将取决于疾病的类型和 严重性W及个体的性质，比如平常健康情况、年龄、性别、体重和对药物的耐受力。所述量还 取决于疾病的程度、严重性和类型。专业的技术人员能够根据运些因素和其他因素来确定 合适的剂量。所述组合物还可结合一种或多种其他的治疗化合物来给药。在本文描述的方 法中，芳香族的阳离子肤可W给药至具有无复流区的一种或多种症状或症候的对象。在其 它实施方式中，哺乳动物具有屯、肌梗塞的一种或多种症状或症候，比如描述为胸腔中部内 的压觉、胀满或挤压的胸痛；胸痛放射至下己或牙齿、肩膀、手臂和/或背部；呼吸困难或气 促；伴随或不伴随恶屯、呕吐的上腹部不适；W及发汗或出汗。例如，芳香族阳离子肤的"治 疗有效量"是指最小程度地减轻解剖无复流区损伤的生理作用的平均水平。
[0094] 本文中使用的术语"缺血再灌注损伤"指的是由W下引起的损害：首先限制血液供 应到组织，之后再突然供应血液并伴随产生自由基。缺血是供应到组织的血液减少且缺血 之后再灌注、氧突然灌注入缺血的组织。
[0095] "分离的"或"纯化的"多肤或肤基本上不具有源自细胞或组织的源（试剂来自于 该源）的细胞材料或其它受污染的多肤，或者当化学合成时基本上不具有化学前体或其它 的化学物质。例如，分离的芳香族的阳离子肤将不具有会干扰试剂的诊断用途或治疗用途 的材料。运样的干扰材料可W包括酶、激素和其他蛋白质的和非蛋白质的溶解物。
[0096] 本文中使用的术语"多肤"、"肤"和"蛋白质"在本文中是可互换的，W表示包括通 过肤键或改性的肤键而互相连接的两个或更多个氨基酸的聚合物，例如肤电子等排体。多 肤指的是短链（通常称为肤、糖肤或低聚物）W及较长的链（通常称为蛋白质）。多肤可W 包括与20个基因编码的氨基酸不同的氨基酸。多肤包括通过诸如翻译后加工的天然进程 或本领域熟知的化学改性技术改性的氨基酸序列。
[0097] 本文中使用的术语"治疗"或"减轻"指的是治疗处理措施和预防或防止措施，其 中，目的是防止或减缓（减轻）目标病症或失调。如果在接受了根据本文所述的方法的治 疗量的芳香族的阳离子肤后，对象显示出解剖无复流区的尺寸的可W观察到的和/或测定 到的减少，则对象的无复流损伤得到成功地"治疗"。还应当理解，本文描述的治疗或预防 医学病症的各种模式意在表示"显著"，其包括完全治疗或者预防W及小于完全治疗或者预 防，其中达到了某种生物学相关或医学相关的结果。
[0098] 本文中使用的"预防"失调或病症指的是：在统计学样本中，化合物相对于未治疗 的对照样本降低治疗的样本的失调或病症的发生，或者相对于未治疗的对照样本延迟失调 或病症的一种或多种症候的发生或者减轻失调或病症的一种或多种症候的严重程度。如本 文中所使用的，预防缺血再灌注损伤包括预防氧化伤害或预防线粒体通透性转换，从而预 防或减轻流入屯、脏的血液的减少W及随后恢复的有害效应。
[0099] 无复流损伤的预防方法或治疗方法
[0100] 在急性屯、肌梗塞后，快速恢复到受损屯、肌的冠状动脉血流是治疗的重要部分。尽 管开通了梗塞相关动脉，但是冠状微血管的损害或阻塞可显著地减小进入到梗塞区的血 流，运导致形成解剖无复流区。运种效应被称为无复流现象。无复流现象发生在相当大比 例的具有AMI的患者中（即使积极进行再灌注治疗）且该现象与不良预后相关。参见： Ito Η.的 No-reflow phenomenon and prognosis in patients with acute myocardial inf曰rction, Nature Clinical Practice C曰rdiov曰s州1曰r Medicine(2006)，3, 499-506。此 夕F，无复流的程度是ami患者治疗效果的良好预示因子。在梗塞后，微血管阻塞预示更频繁 的屯、血管并发症且与AMI患者的长期预后（梗塞扩展、住院治疗、死亡率、主要不良屯、脏事 件等）直接相关。参见：Wu等的Prognostic significance of microvascular obstruction by magnetic resonance imaging in patients with acute myocardial infarction. Circulation，1998,97 :765-772 ;Ndrepapa 等的 5-year prognostic value of no-reflow phenomenon after percutaneous coronary intervention in patients with 曰cute myocardial infarction. J Am Coll Cardiology,2010,55 (21) :2383-2389 ；Bolognese 等的 Impact of microvascular dysfunction on left ventricular remodeling and long-term clinical outcome after primary coronary angioplasty for acute myocardial infarction. Circulation,2004,109 :1121-1126 ； W 及，Reffelmann 等的 No-reflow phenomenon persists long-term after ischemia/reperfusion in the rat and predicts infarct expansion. Circulation，2003,108 :2911-2917。
[0101] 无复流现象也可发生在除了屯、脏外的其它器官中，例如肝脏、肾脏、脑、皮肤 等。在脑缺血中首次提出无复流概念。经受简短的2. 5分钟缺血的兔脑在缺血解除时 具有正常的血液流动。当兔子遭受较长的缺血时间段时，即使在解除血管阻塞后，进入 到脑组织的流动不能恢复正常。持久性缺血导致微血管发生显著变化，该显著变化妨 碍进入到脑细胞的正常流动。在多种具有脑缺血的动物模型中证实了运种现象的存 在。在多种其它器官（诸如皮肤、骨骼肌和肾脏）中，也出现了运种现象。此外，微循 环变化可调节在器官移植期间缺血再灌注损伤所引起的器官损害。参见：Majno等的 No-reflow after cerebral ischaemia. Lancet，1967,2 :569-570 ;Ames 等的 Cerebral ischemia, II:the no-reflow phenomenon. Am J Pathol，1968,52 :437-447 ;Cerisoli 等的 Experimental cerebral"no-reflow phenomenon":response to intracarotid injection of dexamethasone, furosemide and escina.J Neurosurg Sci，1981，25 :7-12 ;Ito 等 的 Transient appearance of"no-reflow"phenomenon in Mongolian gerbils. Stroke， 1980,11 :517-521 ;Asano T 和 Sano K 的 Pathogenetic role of no-reflow phenomenon in experimental subarachnoid hemorrhage in dogs. J Neurosurg，1977,46 :454-466 ; Chait 等的 The effects of the perfusion of various solutions on the no-reflow phenomenon in experimental free flaps. P last 民econstr Surg，1978,61 :421-430 ; Allen 等的 Pathophysiology and related studies of the no-reflow phenomenon in skeletal muscle. Clin 0rthop，1995,314 :122-133 ;Summers WK 和 Jamison 化的 The no-reflow phenomenon in renal ischemia. Lab Invest，1971，25 :635-643 ;Johnston WH 和 Latta H 的 Glomerular mesangial and endothelial cell swelling following temporary renal ischemia and its role in the no-reflow phenomenon. Am J Pathol， 1977,89 :153-166。
[0102] 本发明的技术涉及通过将治疗有效量的芳香族阳离子版（诸如 D-Arg-2'，6'-Dmt-Lys-Phe-NH2)或者其药学上可接受的盐（诸如醋酸盐或S氣醋酸盐） 给药至有需要的对象来治疗或预防哺乳动物中的缺血-再灌注损伤。在一个方面，本发明 的技术涉及用于治疗或预防在缺血/再灌注之后的解剖无复流区、出血区和梗塞面积的方 法。在一个实施方式中，治疗解剖无复流区包括使对象中的组织灌注的量或面积与没有给 药芳香族阳离子版的类似对象相比增大。在一个实施方式中，预防解剖无复流区包括使对 象中由再灌注导致的微血管损害的量或面积与没有给药芳香族阳离子版的类似对象相比 减小。在一些实施方式中，治疗或预防解剖无复流区包括与没有给药芳香族阳离子版的类 似对象相比，减小对象中再灌注时对受影响的血管的损伤、减小对象中血细胞堵塞的影响 和/或减小对象中内皮细胞的肿胀。可通过现有技术中已知的任何技术来测量预防的程 度或治疗的程度，包括但不限于核磁共振成像（MRI) W评估微血管损害。复流现象也可使 用屯、肌声学造影、冠状动脉血管造影术、屯、肌呈色、冠状动脉多普勒成像、屯、电图、使用巧或 得-99m的核成像单光子发射CT、和正电子发射计算机断层扫描（阳T)来进行评估。成功的 预防或治疗可通过将利用运些成像技术中的任一种技术所观察到的对象中的无复流程度 与没有给药芳香族阳离子肤的对照对象或一群对照对象相比较而确定。
[0103] 在一个方面中，本发明的技术设及通过将某些芳香族阳离子肤（诸如 D-Arg-2'，6'-Dmt-Lys-Phe-NH2)或者其药学上可接受的盐（诸如醋酸盐或Ξ氣醋酸盐）给 药至有需要的对象来治疗或预防解剖无复流区。在一个实施方式中，在形成解剖无复流区 之前，将芳香族阳离子肤给药至对象。在另一实施方式中，在形成解剖无复流区之后，将芳 香族阳离子肤给药至对象。在一个实施方式中，结合血管重建术来执行本方法。还提供了 一种用于治疗或预防屯、脏缺血/再灌注损伤的方法。还提供了一种治疗对象中的屯、肌梗塞 W预防再灌注时对屯、脏造成损伤的方法。在一个方面中，本发明的技术设及一种冠状动脉 血管重建方法，其包括将治疗有效量的芳香族阳离子肤给药至哺乳动物对象w及对该对象 执行冠状动脉旁路移植（CABG)手术。
[0104] 在一个实施方式中，在血管重建术之前将所述肤（诸如 D-Arg-2'，6'-Dmt-Lys-Phe-NH2)或者其药学上可接受的盐（诸如醋酸盐或Ξ氣醋酸盐）给 药至所述对象。在另一实施方式中，在血管重建术之后将所述肤给药至所述对象。在另一 实施方式中，在血管重建术期间和血管重建术之后，将所述肤给药至所述对象。在另一实施 方式中，在血管重建术之前、血管重建术期间和血管重建术之后连续将所述肤给药至所述 对象。在另一实施方式中，在AMI和/或血管重建术或CABG手术之后将所述肤定期地（即 长期地）给药至所述对象。
[0105] 在一些实施方式中，在血管重建术之后将所述肤给药至所述对象。在一个实施方 式中，在血管重建术之后，将所述肤给药至所述对象至少3小时、至少5小时、至少8小时、 至少12小时或至少24小时。在一些实施方式中，在血管重建术之前将所述肤给药至所述对 象。在一个实施方式中，在血管重建术之前至少8小时时、至少4小时时、至少2小时时、至 少1小时时、或至少10分钟时开始将所述肤给药至对象。在一个实施方式中，在血管重建 术之后，将所述肤给药至所述对象至少一周、至少一个月或至少一年。在一些实施方式中， 在血管重建术之前和血管重建术之后将所述肤给药至所述对象。在一些实施方式中，在特 定的时期内将所述肤作为输液剂给药至所述对象。在一些实施方式中，将所述肤作为丸剂 给药至所述对象。
[0106] 芳香族阳离子肤为水溶性且具有强极性。尽管运些属性，但该肤仍可W容易穿透 细胞膜。该芳香族阳离子肤通常包括由肤键共价连接的至少3个氨基酸或至少4个氨基酸。 在该芳香族阳离子肤中存在的氨基酸的最大数目为通过肤键而共价连接的大约20个氨基 酸。合适地，氨基酸的最大数目为大约12个、更优选地大约9个、且最优选地大约6个。
[0107] 芳香族阳离子肤的氨基酸可W是任何氨基酸。本文中使用的术语"氨基酸"用来指 包括至少一个氨基和至少一个簇基的任何有机分子。通常，至少一个氨基是相对于簇基在 α位。所述氨基酸可W是天然存在的。例如，天然存在的氨基酸包括诸如通常在哺乳动物 蛋白中发现的二十种最常见的左旋（L)氨基酸，即丙氨酸（Ala),精氨酸（Arg)，天口冬酷胺 (Asn)，天口冬氨酸（Asp)，半脫氨酸（切S)，谷氨酷胺（Gin)，谷氨酸（Glu)，甘氨酸（Gly)，组 氨酸化is),异亮氨酸（lie),亮氨酸化eu)，赖氨酸化ys)，蛋氨酸（Met),苯丙氨酸（Phe)， 脯氨酸（Pro)，丝氨酸（Ser)，苏氨酸灯hr)，色氨酸灯rp)，酪氨酸灯yr)，和鄉氨酸（Val)。 其它天然存在的氨基酸包括诸如与蛋白质合成无关的代谢过程中合成的氨基酸。例如，氨 基酸一鸟氨酸和瓜氨酸是在哺乳动物新陈代谢的产生尿素期间合成的。天然存在的氨基酸 的另一示例包括径（基）脯氨酸（Hyp)。
[0108] 所述肤可选地包括一种或多种非天然存在的氨基酸。在一些实施方式中，所述肤 不具有天然存在的氨基酸。所述非天然存在的氨基酸可W是左旋化-)氨基酸、右旋值-) 氨基酸或其混合物。非天然存在的氨基酸是运样的氨基酸：通常不是在生物体的天然代谢 过程中合成的，且非天然地出现在蛋白质中。此外，非天然存在的氨基酸合适地也不会由普 通的蛋白酶识别。非天然存在的氨基酸可W存在于肤的任何位置中。例如，非天然存在的 氨基酸可W在N-末端、C-末端或者在N-末端和C-末端之间的任何位置。
[0109] 例如，非天然的氨基酸可W包括天然氨基酸中不存在的烷基、芳基或烷基芳基。非 天然烷基氨基酸的一些示例包括β -氨基下酸，β -氨基下酸，丫 -氨基下酸，δ -氨基戊酸 和ε-氨基己酸。非天然的芳基氨基酸的一些示例包括邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸和对 氨基苯甲酸。非天然的烷基芳基氨基酸的一些示例包括邻氨基苯乙酸、间氨基苯乙酸和对 氨基苯乙酸、W及丫-苯基-β-氨基下酸。非天然存在的氨基酸包括天然存在的氨基酸的 衍生物。所述天然存在的氨基酸的衍生物可W包括诸如对天然存在的氨基酸添加一种或多 种化学基团。
[0110] 例如，可W将一种或多种化学基团添加至苯基丙氨酸残基或酪氨酸残基的芳香环 的2'、3'、4'、5'或6'位置或者至色氨酸残基的苯并环的4'、5'、6'或7'位置。所述基团可 W是可W添加到芳香环的任何化学基团。运样的基团的一些示例包括支链的或者无支链的 的烷基，比如甲基、乙基、正丙基、异丙基、下基、异下基、或叔下基；C 的烷氧基（即 烷氧基）；氨基；C1-C4的烷基氨基和C 1-C4的二烷基氨基（例如，甲氨基、二甲氨基）；硝基； 径基；面素（即氣、氯、漠或舰）。天然存在的氨基酸的非天然存在的衍生物的一些特定示 例包括正鄉氨酸（Nva)和正亮氨酸（Nle)。
[0111] 肤中氨基酸的改性另一示例是将肤中的天冬氨酸或谷氨酸残基的簇基衍生化。衍 生化的一个示例是与氨或伯胺或仲胺（例如甲胺、乙胺、二甲胺或二乙胺）的酷胺化。衍生 化的另一示例包括与诸如甲醇或乙醇进行醋化。另一种运样的改性包括赖氨酸、精氨酸或 组氨酸残基的氨基的衍生化。例如，运些氨基可W被酷化。例如，一些合适的酷基包括苯甲 酷基或者包括W上提及的C1-C4的烷基中的任一烷基的烧酷基，比如乙酷基或丙酷基。
[0112] 非天然存在的氨基酸对常见的蛋白酶优选地为抵抗性的、且更优选地为不敏感 的。对蛋白酶抵抗性的或者不敏感的非天然存在的氨基酸的示例包括W上提及的任一种自 然存在的左旋化-)氨基酸的右旋值-)形式W及左旋和/或右旋的非天然存在的氨基酸。 尽管右旋氨基酸存在于通过与细胞的常规的核糖体蛋白合成方法不同的方法而合成的某 些肤抗生素中，但右旋氨基酸通常不存在于蛋白质中。本文中使用的右旋氨基酸被认为是 非天然存在的氨基酸。
[0113] 为了使蛋白酶灵敏度最小，肤应当具有小于5个、优选地小于4个、更优选地小于 3个、且最优选地小于2个的由普通蛋白酶识别的连续左旋氨基酸，而与氨基酸是否为天然 存在无关。在一些实施方式中，肤仅具有右旋氨基酸，而不具有左旋氨基酸。如果肤具有蛋 白酶敏感的氨基酸序列，则所述氨基酸中的至少一个氨基酸优选地为非天然存在的右旋氨 基酸，由此提供蛋白酶抗性。蛋白酶敏感序列的示例包括可W由常见的蛋白酶（比如肤链 内切酶和膜蛋白酶）容易地切割的两个或更多个连续的碱性氨基酸。碱性氨基酸的示例包 括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
[0114] 与肤中的氨基酸残基的总数目相比，在生理抑条件下，芳香族阳离子肤应当具有 最小数目的净正电荷。生理pH条件下的净正电荷的最小数目在下文称为（Pm)。肤中的氨 基酸残基的总数目在下文称为（r)。下文讨论的净正电荷的最小数目都是在生理抑条件 下。本文中使用的术语"生理抑"指的是哺乳动物体的组织和器官的细胞中的正常抑。例 如，人的生理抑通常为约7. 4,而哺乳动物中的正常生理抑可W为由约7. 0至约7. 8的任 一 pH。
[0115] 本文中使用的"净电荷"指的是存在于肤中的氨基酸所携带的正电荷的数目和负 电荷的数目的之间的相抵余数。在本说明书中，应当理解，净电荷是在生理抑条件下测定 的。在生理pH条件下带正电的天然存在的氨基酸包括左旋赖氨酸、左旋精氨酸和左旋组氨 酸。在生理pH条件下带负电的天然存在的氨基酸包括左旋天冬氨酸和左旋谷氨酸。
[0116] 通常地，肤具有带正电的N-末端氨基和带负电的C-末端簇基。所述电荷在生理 抑条件下相互抵消。作为计算净电荷的实例，肤Tyr-D-Arg-Phe-Lys-Glu-His-TiT-D-Arg 具有一个带负电的氨基酸（即Glu)和四个带正电的氨基酸（即，两个Arg残基、一个Lys 和一个化S)。因此，W上的肤具有3个净正电荷。
[0117] 在一个实施方式中，芳香族阳离子肤的在生理抑条件下的净正电荷的最小数目 (Pm)和氨基酸残基的总数目（r)之间具有如下关系：其中，3pm是小于或等于r+1的最大数。 在该实施方式中，净正电荷的最小数目（Pm)和氨基酸残基的总数目（r)之间的关系如下： [011引表1.氨基酸数目和净正电荷（3Pm《 P+1)
[0119]
[0120] 在另一实施方式中，芳香族阳离子肤的净正电荷的最小数目（Pm)和氨基酸残基的 总数目（r)之间具有如下关系：其中，2pm是小于或等于r+1的最大数。在该实施方式中，净 正电荷的最小数目（Pm)和氨基酸残基的总数目（r)之间的关系如下：
[0121] 表2.氨基酸数目和净正电荷（2pm《 P+1)
[0122]
阳12引在一个实施方式中，净正电荷的最小数目（Pm)和氨基酸残基的总数目ω相等。 在另一实施方式中，肤具有Ξ个或四个氨基酸残基，其净正电荷的最小数目为1、合适地净 正电荷的最小数目为2且更优选地净正电荷的最小数目为3。
[0124] 还重要的是，芳香族阳离子肤相比于净正电荷的总数目（Pt)具有最小数目的芳香 基团。芳香基团的最小数目在下文称为（a)。具有芳香基团的天然存在的氨基酸包括氨基 酸-组氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。例如，六肤Lys-Gln-Tyr-D-Arg-Phe-T巧具有2 个净正电荷（由赖氨酸残基和精氨酸残基提供）W及Ξ个芳香基团（由酪氨酸残基、苯丙 氨酸残基和色氨酸残基提供）。
[012引芳香族阳离子肤还应当在芳香基团的最小数目（a)和在生理抑条件下的净正电 荷的总数目（Pt)之间具有如下关系：其中，除了当Pt为1时a也可为1之外，3a是小于或 等于Pt+1的最大数。在该实施方式中，芳香基团的最小数目（a)和净正电荷的总数目（Pt) 之间的关系如下：
[0126] 表3.芳香基团和净正电荷（3a《Pt+1或a = Pt= 1)
[0127]
阳12引在另一实施方式中，芳香族阳离子肤在芳香基团的最小数目（a)和净正电荷的总 数目（Pt)之间具有如下关系：其中，2a是小于或者等于Pt+1的最大数。在该实施方式中， 芳香氨基酸残基的最小数目（a)和净正电荷的总数目（Pt)之间的关系如下：
[0129] 表4.芳香基团和净正电荷（2a《Pt+1或a = Pt= 1)
[0130]
[0131] 在另一实施方式中，芳香基团的数目（a)和净正电荷的总数目（Pt)相等。
[0132] 簇基且尤其是C-末端氨基酸的末端簇基合适地与诸如氨进行酷胺化，W形成 C-端酷胺。可选地，C-端氨基酸的末端簇基可W与任一伯胺或仲胺进行酷胺化。所述伯 胺或仲胺可W是诸如烷基、尤其是支链的或无支链的C1-C4的烷基或者芳香胺。因此，在肤 的C末端的氨基酸可W转化为酷胺基、N-甲基酷胺基、N-乙基酷胺基、N，N-二甲基酷胺基、 N，N-二乙基酷胺基、N-甲基-N-乙基酷胺基、N-苯基酷胺基或N-苯基-N-乙基酷胺基。未 出现在芳香族阳离子肤的C-末端的天冬酷胺残基、谷氨酷胺残基和天冬氨酸残基和谷氨 基酸残基的游离的簇酸基也可被酷胺化，不论它们是否存在于肤内。运些内部位置的酷胺 化可W与氨或W上所述伯胺或仲胺中的任何一者进行。
[0133] 在一个实施方式中，芳香族阳离子肤是具有两个净正电荷W及至少一个芳香族氨 基酸的Ξ肤。在特定的实施方式中，所述芳香族阳离子肤是具有两个净正电荷和两个芳香 族氨基酸的Ξ肤。
[0134] 芳香族阳离子肤包括但不限于W下肤的示例：
[0135]
[0137] 在一个实施方式中，肤具有μ型阿片（mu-opioid)受体激动剂活性（即肤激活μ 型阿片受体）。可通过与克隆的μ型阿片受体连接的放射性配体或通过使用豚鼠回肠的生 物测定来评估μ型阿片活性（Schiller等，化r J Med Chem, 35:895-901，2000 ;Zhao等， J化armacol Exp化er，307:947-954, 2003)。μ型阿片受体的激活通常引起止痛效应。在 某些情况下，具有μ型阿片受体激动剂活性的芳香族阳离子肤是优选地。例如，在诸如急 性疾病或病症的短期治疗期间，使用激活μ型阿片受体的芳香族阳离子肤可能是有利的。 运类急性疾病和病症经常与中度疼痛或剧烈疼痛相关。在运些情况下，在人类患者或其他 哺乳动物的治疗方案中该芳香族阳离子肤的止痛效应是有利的。然而，根据临床的需要，不 激活μ型阿片受体的芳香族阳离子肤也可W与或不与止痛剂一起使用。
[013引可选地，在其他情况下，不具有μ型阿片受体激动剂活性的芳香族阳离子肤是优 选地。例如，在长期治疗中，例如慢性疾病状况或病症，使用激活μ型阿片受体的芳香族阳 离子肤可能是不可取的。在运些情况下，该芳香族阳离子肤潜在不利的或令人上癒的效应 可排除在人类患者或其他哺乳动物的治疗方案中的使用激活μ型阿片受体的芳香族阳离 子肤。潜在不利的效应可包括镇静、便秘和呼吸抑制。在运类情况下，不激活μ型阿片受 体的芳香族阳离子肤可能是合适的治疗。
[0139] 具有μ型阿片受体激动剂活性的肤通常为那些在Ν-末端（即在第一氨基酸位 置）具有酪氨酸残基或具有酪氨酸衍生物的肤。酪氨酸的合适的衍生物包括2'-甲基酪 氨酸，6' -二甲基酪氨酸（2' 6' -Dmt)、3'，5' -二甲基酪氨酸（3' 5' -Dmt)、 N，2'，6' - Ξ甲基酪氨酸灯mt)和2' -径基-6' -甲基酪氨酸（血t)。
[0140] 在一个实施方式中，具有μ型阿片受体激动剂活性的肤具有式 Tyr-D-Arg-Phe-LyS-NH2。该肤具有氨基酸酪氨酸、精氨酸和赖氨酸所贡献的Ξ个净正 电荷，和氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸所贡献的两个芳香基。酪氨酸可W为酪氨酸的改性 衍生物，例如2'，6'-二甲基酪氨酸，W制备具有式2'，6' -Dmt-D-Arg-Phe-Ly3-畑2的 化合物。该肤具有640的分子量，且在生理抑条件下携带Ξ个净正电荷。该肤W能量 非依存的方式易于穿过若干哺乳动物细胞类型的原生质膜狂hao等，J化armacol Exp Ther.，304:425-432, 2003)。
[014。 不具有μ型阿片受体激动剂活性的肤通常在Ν-末端（即氨基酸位置1)上不具 有酪氨酸残基或不具有酪氨酸衍生物。在N-末端上的氨基酸可W为不同于酪氨酸的任何 天然存在的或非天然存在的氨基酸。在一个实施方式中，N-末端上的氨基酸为苯丙氨酸或 苯丙氨酸的衍生物。苯丙氨酸的示例性衍生物包括2'-甲基苯丙氨酸（Imp)、2'，6'-二甲 基苯丙氨酸（2'，6' -Dmp)、N，2'，6' - Ξ甲基苯丙氨酸灯mp)和2'-径基-6'-甲基苯丙 氨酸（Hmp)。
[0142] 不具有μ型阿片受体激动剂活性的芳香族阳离子肤的示例具有式 Phe-D-Arg-Phe-Ly3-畑2。可选地，Ν-末端的苯丙氨酸可为苯丙氨酸的衍生物，例如 2 '，6 ' -二甲基苯丙氨酸（2 ' 6 ' -Dmp)。在一个实施方式中，在氨基酸位置1处具有2 '，6 ' -二 甲基苯丙氨酸的肤具有式2' ,6' -Dmp-D-Arg-Phe-Lys-NHz。在一个实施方式中，氨基酸序 列重排使得Dmt不在N-末端。运类不具有μ型阿片受体激动剂活性的芳香族阳离子肤的 示例具有式 D-Arg-2' 6' -Dmt-Lys-Phe-NHz。
[0143] 本文提到的肤和它们的衍生物还可包括功能类似物。如果类似物具有与所列举的 肤相同的功能，则肤被认为功能类似物。例如，该类似物可w为肤的取代变型，其中一个或 多个氨基酸被另一氨基酸所取代。该肤合适的取代变型包括保守的氨基酸取代物。氨基酸 可W根据其物理化学性质而进行如下分组：
[0144] (a)非极性氨基酸：Ala (A) Ser (S) T虹灯)Pro (P) Gly (G)切S (C);
[0145] (b)酸性氨基酸：Asn (脚 Asp (D) Glu 巧)Gin (曲；
[0146] (c)碱性氨基酸：Hi s做Arg佩Lys似；
[0147] (d)疏水性氨基酸：Met(M)Leu(L)Ilea)Val(V) 及
[014引 （e)芳香族氨基酸：Phe (F) Tyr灯)Τ巧(W) Hi s化）。
[0149] 肤中的氨基酸被同一组中的另一种氨基酸取代称为保守取代，且可W保留原始肤 的物理化学性质。相反，肤中的氨基酸被不同组中的另一种氨基酸取代通常更有可能改变 原始肤的物理化学性质。
[0150] 激活μ型阿片受体的肤的示例包括但不限于表5中所示的芳香族阳离子肤。
[0151] 表5具有μ型阿片活性的肤类似物
[0152]
[0156] D油二二氨下基
[0157] Dap =二氨基丙酸
[015引 Dmt =二甲基酪氨酸
[0159] Mmt = 2' -甲基酪氨酸
[0160] Tmt = N，2'，6' 甲基酪氨酸
[0161] 血t = 2' -径基-6' -甲基酪氨酸
[0162] 化sDap = β -丹横酷α，β -二氨基丙酸
[0163] atnDap = β -邻氨基苯甲酯A- α，β -二氨基丙酸
[0164] Bio =生物素
[0165] 不激活μ型阿片受体的类似物的示例包括但不限于表6中所示的芳香族阳离子 肤。
[0166] 表6.缺少μ型阿片活性的肤类似物
[0169] ~Cha =环己基丙氨酸 '
' ' '
[0170] 表5和表6中显示的肤的氨基酸可W是左旋结构或右旋结构。
[0171] 可通过本领域熟知的任何方法来合成肤。例如，用于W化学方式合成肤的合适方 法包括诸如Stuart和化ung在W下文献中描述的方法：Solid Phase Peptide Synthesis, 第二版，Pierce Qiemical Company(1984) 及Methods linzymol. 289, Academic Press 公 司，纽约（1997)。 阳17引 芳呑族阳离子化的预防用旅巧治疗用旅
[0173] 概述。本文中描述的芳香族阳离子肤（诸如D-Arg-2'，6'-Dmt-Lys-Phe-N肥）或 者其药学上可接受的盐（诸如醋酸盐或Ξ氣醋酸盐）可用于预防或治疗疾病或病症。具体 地，本发明提供了用于治疗存在血管阻塞损伤、解剖无复流区或屯、脏缺血再灌注损伤的风 险（或易得血管阻塞损伤、解剖无复流区或屯、脏缺血再灌注损伤）的对象的预防和治疗方 法。因此，本方法提供了通过将有效量的芳香族阳离子肤给药至需要该芳香族阳离子肤的 对象来预防和/或治疗对象中的血管阻塞损伤或屯、脏缺血再灌注损伤或解剖无复流区。
[0174] 基于芳香族阳离子肤的治疗法的生物学效果的确定。在各种实施方式中，进行合 适的体外或体内分析来确定基于特定的芳香族阳离子肤的治疗的效果和该芳香族阳离子 肤的给药是否适用于治疗。在各种实施方式中，可采用代表性动物模型进行体外分析，W 确定给定的基于芳香族阳离子肤的治疗是否在预防或治疗解剖无复流区中起到了所期望 的效果。在人类对象中测试之前，治疗中所用的化合物可W在合适的动物模型系统中进行 测试，所述动物模型系统包括但不局限于大鼠、小鼠、鸡、猪、牛、猴子、兔子、羊、豚鼠等。类 似地，对于体内测试而言，在给药至人类对象之前，可W使用本领域所知的任何动物模型系 统。
[0Π 5] 预防方法。一方面，本发明提供了一种通过将预防解剖无复流区发生或发展的芳 香族阳离子肤给药至对象，来预防对象的解剖无复流区的方法。例如，可W通过本文描述的 诊断分析或预兆性分析来确定处于解剖无复流区的风险中的对象。在预防性应用中，将足 够量的芳香族阳离子肤的药物组合物或药剂给药至易得疾病或病症或者处于疾病或病症 的风险中的对象W消除或降低该疾病或病症的风险、降低该疾病或病症的严重程度或延迟 该疾病或病症发病，包括该疾病或病症的生物化学的、组织学的和/或行为学的症状、该疾 病或病症的并发症和该疾病的发展期间存在的中间病理表型。将预防性的芳香族阳离子肤 进行给药可W发生在异常的病症特点表现出来之前，使得疾病或障碍得到防止，或者选择 性地其发展得到延迟。适当的化合物可W基于W上描述的筛选试验确定。
[0176] 治疗性方法。本发明的另一方面包括出于治疗目的来治疗对象中的血管阻塞损 伤、解剖无复流区或屯、脏缺血再灌注损伤的方法。在治疗性应用中，将足够量的组合物或药 物给药至疑似患上运样的疾病或病症的对象或者已患有运样的疾病或病症的对象，来充分 消除或者至少部分地抑制所述疾病或病症的症状，包括该疾病或病症的并发症和该疾病或 病症发展中的中间病理表现型。因此，本发明提供了治疗患有解剖无复流区的个体的方法。 阳177] 给药横式巧有效剂量
[0178] 可W使用本领域的技术人员所知的任何方法来将细胞、器官或组织与肤接触。适 当的方法包括体外法、间接体内法或体内法。体内法通常包括将芳香族阳离子肤（比如上 文描述的芳香族阳离子肤）给药至哺乳动物、优选地给药至人。当用在体内W治疗时，芳香 族阳离子肤可有效的量（即具有期望的治疗效果的量）给药至对象。剂量和给药方 案将取决于对象中的损伤的程度、所使用的特定的芳香族阳离子肤的性质（例如其治疗指 数）、该对象W及该对象的病史。
[0179] 可W在临床前试验和临床试验期间利用内科医生和临床医生熟悉的方法来确定 有效量。在该方法中有用的肤的有效量可W通过用于给药药物组合物的多种已知方法中的 任一方法来给药至需要该肤的哺乳动物。肤可全身给药或局部给药。
[0180] 该肤可被表达为药学上可接受的盐。术语"药学上可接受的盐"意味着由碱或酸 制得的、对给药至患者（例如哺乳动物）而言可接受的盐（例如，对于给定的给药方案具有 可接受的哺乳动物安全性的盐）。然而，应该理解，盐没有必须为药学上可接受的盐，例如 不用于给药病患的中间化合物的盐。药学上可接受的盐可W从药学上可接受的无机碱或 有机碱、W及从药学上可接受的无机酸或有机酸得到。此外，当肤含有碱性部分，例如胺、 喀晚或咪挫，和酸性部分例如簇酸或四挫时，可形成两性离子且该两性离子包括在本文使 用的术语"盐"的范围之内。从药学上可接受的无机碱衍生得出的盐包括锭盐、巧盐、铜盐、 正铁盐、亚铁盐、裡盐、儀盐、儘盐、亚儘盐、钟盐、钢盐和锋盐等。从药学上可接受的有机碱 衍生得出的盐包括伯胺盐、仲胺盐和叔胺盐，该盐包括取代胺、环胺、天然存在的胺等，例如 精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N，Ν'-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨 基乙醇、乙醇胺、乙二胺、Ν-乙基吗嘟、Ν-乙基赃晚、还原葡糖胺、葡糖胺、组氨酸、海己明 (hy化油amine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗嘟、赃嗦、赃晚（piperadine)、聚胺树醋、普 鲁卡因、嚷岭、可可碱、Ξ乙胺、Ξ甲胺、Ξ丙胺、缓血酸胺等。从药学上可接受的无机酸衍生 得出的盐包括棚酸盐、碳酸盐、氨面酸盐（氨漠酸盐、盐酸盐、氨氣酸盐或氨舰酸盐）、硝酸 盐、憐酸盐、氨基横酸盐和硫酸盐。从药学上可接受的有机酸衍生得出的盐包括脂肪族径基 酸盐（例如巧樣酸盐、葡糖酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐和酒石酸盐）、脂肪 族单簇酸盐（例如醋酸盐、下酸盐、甲酸盐、丙酸盐和Ξ氣醋酸盐）、氨基酸盐（例如天冬氨 酸盐和谷氨酸盐）、芳香族簇酸盐（例如苯甲酸盐、对-氯苯甲酸盐、二苯基乙酸盐、龙胆酸 盐、马尿酸盐和Ξ苯基乙酸盐）、芳香族径酸（例如邻-径基苯甲酸盐、对-径基苯甲酸盐、 1-径基糞-2-簇酸盐和3-径基糞-2-簇酸盐）、抗坏血酸盐、二簇酸盐（例如富马酸盐、马 来酸盐、草酸盐和班巧酸盐）、葡糖糖醒酸盐、苦杏仁酸盐、粘酸盐、烟酸盐、乳清酸盐、帕莫 酸盐、泛酸盐、横酸盐（苯横酸盐、精脑横酸盐、乙二横酸盐（edisylic)、乙横酸盐、径乙基 横酸盐、甲横酸盐、糞横酸盐、糞-1，5-二横酸盐、糞-2, 6-二横酸盐和对-甲苯横酸盐）、辛 那酸（xinafoic acid)盐等。在一些实施方式中，盐为醋酸盐或Ξ氣醋酸盐。
[0181] 本文描述的芳香族阳离子肤（诸如D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz)或者其药学 上可接受的盐（诸如醋酸盐或Ξ氣醋酸盐）可W单独地或组合地加入到药物组合物W给药 至对象来治疗或预防本文中描述的疾病。运类组合物通常包括活性剂和药学上可接受的载 体。本文中使用的术语"药学上可接受的载体"包括与给药药物相符合的生理盐水、溶剂、 分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。辅助性的活性化合物可W 加入到所述组合物中。
[0182] 通常将药物组合物配制成与其计划给药途径相符。给药途径的示例包括注射（例 如，静脉注射、皮内、腹腔或皮下）、口服、吸入、经皮肤（局部）、眼内、离子电渗疗法和经粘 膜给药。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可W包括W下成分：诸如注射用水的 消毒稀释液、生理盐水、不挥发油、聚乙二醇、丙Ξ醇、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，比如 苯甲醇或苯甲酸甲脂防腐剂；抗氧化剂，比如抗坏血酸或亚硫酸氨纳；络合剂，比如乙二胺 四乙酸；缓冲液，比如醋酸盐、巧樣酸盐和憐酸盐；W及用于调节渗透压的溶剂，比如氯化 钢或左旋糖。可W用酸或碱来调节pH，比如盐酸或氨氧化钢。肠胃外制剂可W装在玻璃或 塑料制的安飯瓶、一次性注射器或多剂量瓶中。为了患者或治疗医师的方便，可包括治 疗过程（例如，治疗7天）所需的所有用具（例如，药瓶、稀释液瓶、注射器和针头）的试剂 盒的形式提供剂量制剂。
[0183] 适于注射用途的药物组合物可W包括无菌水溶液（在水溶性的情况下）或者用于 临时制备无菌注射液或分散液的分散剂或无菌粉末。为了静脉注射，合适的载体包括生理 盐水、抑菌水、化emo地or EL?度ASF，帕西波尼，N. J.)或憐酸盐缓冲盐水（PBS)。在所有情 况下，用于肠胃外给药的组合物必须无菌且应当是达到易于注射的程度的存在的液体。用 于肠胃外给药的组合物在制造和存储条件下必须稳定且应当被保存同时防止诸如细菌和 真菌的微生物的污染行为。
[0184] 所述芳香族阳离子肤组合物可W包括载体，该载体可W是包括诸如水、乙醇、多元 醇（例如，丙Ξ醇、丙二醇W及液态聚乙二醇等）及其合适的组合物的溶剂或分散介质。 可W通过例如W下的方式来保持适当的流体性：利用比如卵憐脂的涂层；在分散质的情况 下，通过保持所需的颗粒尺寸；和通过利用表面活性剂。可W通过各种抗菌剂和抗真菌剂来 实现防止微生物的行为，例如尼泊金、氯下醇、苯酪、抗坏血酸、硫柳隶等。可W包括谷脫甘 肤和其他的抗氧化剂W防止氧化。在很多情况下，优选的是，在该组合物中包括等渗剂，比 如糖、多元醇（比如甘露醇、山梨醇）或氯化钢。可W通过在该组合物中包括延迟吸收的制 剂来引起可注射组合物的延长吸收，所述延迟吸收的制剂例如为单硬脂酸侣或药用胶。
[0185] 可W通过将所需量的活性化合物加入具有W上列出的一种成分或多种成分的组 合的适当的溶剂中、根据需要然后进行过滤灭菌来制备注射用无菌溶液。通常，通过将活性 化合物加入在包括基本分散介质W及W上列出的所需的其它成分的无菌载体中来制备分 散质。在用来制备注射用无菌溶液的无菌粉末的情况下，典型的制备方法包括真空干燥和 冷冻干燥，运可W产出活性成分W及来自于先前灭菌过滤的溶液中的任何其他所需成分的 粉末。
[0186] 口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的载体。为了 口服治疗给药，活性化合 物可W与赋形剂混合并W片剂、锭剂或胶囊（例如明胶胶囊）的形式使用。还可利用用作 洗口剂的液态载体来制备口服组合物。药学上相容的粘合剂和/或辅助材料可W被包括为 该组合物的一部分。所述片剂、丸剂、胶囊剂或锭剂等可W包括具有相似性质的W下成分或 化合物中的任一种：粘合剂，比如微晶纤维素、黄著胶或明胶；赋形剂，比如淀粉或乳糖；分 裂剂，比如褐藻酸、簇甲淀粉钢、或玉米淀粉；润滑剂，比如硬脂酸儀或Sterotes ;助流剂， 比如胶态二氧化娃；甜味剂，比如薦糖或糖精；或者增味剂，比如薄荷、水杨酸甲醋或枯子 调味品。
[0187] 关于通过吸入法给药，所述化合物可喷雾剂的形式从包括合适的推进物（例 如，比如二氧化碳的气体）的加压容器或分配器或者喷雾器喷洒而递送。运样的方法包括 第6468798号美国专利中描述的方法。
[0188] 本文中描述的治疗化合物的全身给药还可W通过经粘膜方法或经皮肤方法来进 行。对于经粘膜给药或经皮肤给药，适合于待渗透的屏障的渗透剂用在该配方中。运样的 渗透剂通常是本技术领域已知的，例如，对于经粘膜给药而言，运样的渗透剂包括洗涂剂、 胆汁盐类或梭链抱酸衍生物。可W通过使用鼻喷入法来完成经粘膜给药。对于经皮肤给药 而言，活性化合物配制成本领域普遍知道的药膏、软膏、凝胶、乳液。在一个实施方式中，经 皮肤给药可W通过电离子渗透法来进行。
[0189] 治疗性蛋白质或肤可W在载体体系中配制而成。该载体可W是胶态体系。该胶 态体系可w是脂质体、憐脂双分子层媒介物。在一个实施方式中，在脂质体中该治疗肤被 胶囊化，同时保持肤完整性。本领域的本领域技术人员理解，有各种方法来制备脂质体。 (参见：Lichtenberg 等的 Methods Biochem. Anal. , 33:337-462(1988) ;Anselem 等的 Liposome Technology, CRC Press (1993))。脂质体制剂可W延迟排出并增强细胞摄取（参 见 Reddy, Ann. F^harmacother. , 34 (7-8) : 915-923 (2000))。活性剂还可 W载入到由医学上可 接受的成分制备成的颗粒中，所述医学上可接受的成分包括但不限于可溶解的、不可溶解 的、可渗透的、不可渗透的、可生物降解的或胃内滞留的聚合物或脂质体。运样的颗粒包括 但不限于纳米颗粒、可生物降解的纳米颗粒、微颗粒、可生物降解的微颗粒、纳米球、可生物 降解的纳米球、微球、可生物降解的微球、胶囊剂、乳剂、脂质体、胶粒W及病毒载体体系。
[0190] 该载体还可W是聚合物，比如可生物降解的、可生物相容的聚合物基质。在一 个实施方式中，治疗性肤可W嵌入到聚合物基质中，同时保持蛋白质完整性。所述聚合 物可W是天然的，比如多肤、蛋白质或多糖；或者可W是合成的，比如聚α-径酸。示例 包括由例如W下物质制成的载体：胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、乙酸纤维素、硝酸纤维 素、多糖、纤维蛋白、明胶及其组合。在一个实施方式中，所述聚合物是聚乳酸（PLA)或乳 酸径基乙酸共聚物（PGLA)。可各种形式和尺寸来制备并分离聚合物基体，包括微球 和纳米球。聚合物制剂可W引起治疗作用的期间的延长（参见：Reddy, Ann.化armacoth er.，34(7-8) :915-923(2000))。用于人类生长激素化GH)的聚合物制剂已用在临床试验中 (参见：Kozarich 和 Rich, Chemical Biology, 2:548-552 (1998))。
[01W] 高分子微球持续释放剂的示例在PCT公布WO 99/15154灯racy等）、第5674534号 美国专利W及第5716644号美国专利（都属于Zale等）、PCT公布W0 96/40073狂ale等） 和PCT公布W0 00/38651(化址等）中予W描述。第5674534号美国专利W及第5716644 号美国专利W及PCT公布W0 96/40073描述了包括含红细胞生成素的颗粒的聚合物基体， 所述红细胞生成素的颗粒用盐来防止凝聚而稳定。
[0192] 在一些实施方式中，治疗性化合物与将保护所述治疗化合物W防止其从身体中快 速排出的载体一起制备，所述载体比如控释剂，包括植入体和微胶囊化的输送体系。可W使 用可生物降解的、生物相容的聚合物，比如乙締醋酸乙締醋、聚酢、聚乙醇酸、胶原质、聚原 酸醋和聚乳酸。可W利用已知的技术来制备运样的制剂。还可W在市场上获得所述材料，例 如从Alza Co巧oration和Nova Pharmaceuticals, Inc.买到的脂质体悬浮液（包括针对 具有细胞特异性抗原的单细胞克隆抗体的特定细胞的脂质体）也可用作医学上可W接受 的载体。所述胶质体悬浮液可W利用本领域技术人员知道的方法来制备，比如，第4522811 号美国专利中描述的方法。
[0193] 还可W配制所述治疗性化合物W增强细胞内传递。例如，本领域已知脂质体传 递系统例如，参见：Qi〇nn 和化 llis 的"Recent Advances in Liposome Drug Delivery Systems"，Current Opinion in Biotechnology 6:698-708(1995) ;Weiner 的"Liposomes for Protein Delivery: Selecting Manufacture and Development Processes"， Immunomethods 4(3)201-9(1994)讯 Gregoriadis 的"Engineering Liposomes for Drug Delivery:Progress and ProblemsTrends Biotechnol. 13(12):527-37 (1995)〇 W 下 文献描述了利用融合脂质体在体内或在体外将蛋白质传递至细胞：Mizguchi等的Cancer Lett.100:63-69(1996)〇
[0194] 可W通过细胞培养或试验动物中的标准药学过程来确定治疗性药物的用量、毒性 和治疗效率，例如，用于确定LD50 (总数50 %的致命剂量）和邸50 (总数50 %中有效治疗的 剂量）。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，且其可W表示为比率LD50/ED 50。表 现出高治疗指数的化合物是优选的。尽管具有毒性副作用的化合物可W使用，但应当考虑 设计传递系统，该传递系统将运样的化合物祀向组织的受影响的位置，W将对未感染的细 胞的可能损伤最小化，且由此降低副作用。
[0195] 从细胞培养试验和动物研究获取的数据可W用在配制人类中使用的剂量范围中。 运样的化合物的剂量优选地位于包括毒性很小或无毒的邸50的循环浓度的范围中。根据 使用的剂量类型和利用的给药途径，剂量可W在该范围内变化。对于该方法中使用的任何 化合物而言，可W最初根据细胞培养试验来计算出治疗有效的剂量。可W在动物模型中制 定一剂量来获得包括细菌培养中确定的IC50(即，测试化合物的获得最大抑制病症的一半 的浓度）的循环血药浓度范围。运样的制剂可W用来更准确地确定人类中的有用剂量。可 W例如通过高效液相色谱法测定血药浓度。
[0196] 通常，芳香族阳离子肤的足W获得治疗效果或预防效果的有效量的范围为约 0. 000001毫克/千克体重/天到约10000毫克/千克体重/天。优选地，剂量范围从约 0. 0001毫克/千克体重/天到约100毫克/千克体重/天。例如，剂量可W是每天、每两 天或每Ξ天1毫克/千克体重或者10毫克/千克体重，或者在每周、每两周或每Ξ周的1 毫克/千克体重到10毫克/千克体重的范围中。在一个实施方式中，肤的单剂量的范围从 0. 1毫克/千克体重到10000毫克/千克体重。在一个实施方式中，芳香族阳离子肤在载 体中的浓度的范围从0. 2毫克/每毫升到2000毫克/每毫升。示例性的治疗方法每天或 每周提供一次给药。在治疗应用中，在相对短的时间间隔中有相对高的剂量有时是需要的， 直到疾病的进程减缓或终止为止，且优选地直到对象显示出部分或完全地改善了疾病的病 症。其后，可W对患者实行预防性的给药方式。
[0197] 在一些实施方式中，芳香族阳离子肤的治疗有效的量可W定义为目标组织中的肤 的浓度为10 I2摩尔到10 6摩尔，例如约10 7摩尔。可0.01毫克/千克到100毫克/ 千克的全身剂量或身体表面面积的等效剂量来给予前述浓度。优化剂量的时间表，W保持 目标组织的治疗浓度，最优选地通过每天或每周给药，但也包括连续给药（例如，输液或经 皮肤施药）来进行。
[019引在一些实施方式中，芳香族阳离子肤的剂量提供为"低"、"中"或"高"剂量水平。在 一个实施方式中，低剂量提供为从约0.0 lmg/kg/h到约0. 5mg/kg/h、合适地从约0.0 OOlmg/ kg/h到约0.1 mg/kg/h。在一个实施方式中，中剂量提供为从约0.0 Olmg/kg/h到约1. Omg/ kg/h，合适地从约0.0 lmg/kg/h到约0. 5mg/kg/h。在一个实施方式中，高剂量提供为从约 0. 005mg/kg/h 到约 lOmg/kg/h，合适地从约 0.0 lmg/kg/h 到约 2mg/kg/h。
[0199] 本领域技术人员将认识到，某些因素可W影响有效地治疗一对象的剂量和时间， 包括但不限于疾病或失调的严重程度、先前的治疗、健康情况和/或对象的年龄W及存在 的其它疾病。而且，利用本文描述的治疗有效量的治疗组合物来治疗一对象可W包括单次 治疗或一系列治疗。
[0200] 根据本发明的方法治疗的哺乳动物可W是任何动哺乳物，例如，包括农场动物，如 羊、猪、牛和马；宠物动物，如狗和猫；实验室里的动物，如大鼠、小鼠和兔。在优选的实施方 式中，所述哺乳动物是人。 阳20。 解剖无复流区的测量
[0202] 成像技术可用于评估本发明技术的肤对解剖无复流区的作用。（通常参见参考文 献1-51)。无复流现象可使用屯、肌声学造影、冠状动脉血管造影术、屯、肌呈色、冠状动脉多 普勒成像、屯、电图、使用巧或得-99m的核成像单光子发射CT、和正电子发射计算机断层扫 描（PET)来进行评估。对比增强MRI可评估造影剂首过期间的屯、肌灌注。可替选地，在造 影剂注射之后的20分钟时，延迟的对比增强MRI可用于检测坏死。在首过灌注MRI中检测 到低增强区（运表示无复流）与随访的永久性功能失调相关。在一些实施方式中，可使用 屯、脏MRI评估微血管堵塞。例如，1. 5T的身体MRI扫描仪可用于执行屯、脏MRI W评估屯、室 功能、屯、肌水肿（处于风险中的区域）、微血管堵塞和梗塞面积。 阳20引 连施例
[0204] 通过W下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应当被看作W任何方式限制本 发明。
[0205] 如上所述，缺血可导致微血管发生显著变化，该变化干扰进入到许多组织/器官 的正常血流。因而，无复流现象可发生在多种组织/器官中，包括屯、脏、肝脏、脑、皮肤、骨骼 肌、肾脏等。预测到，本发明的芳香族阳离子肤可用在预防或治疗多种组织/器官中的解剖 无复流区的方法中。 阳20引 连施例1在兔，屯、肿经管缺血/巧灌注损伤后，D-Arg-2\ 6' -Dmt-Lvs-Phe-NH^对解 剖无复流区、m血区巧巧集而巧的作用
[0207] 概述。研究了在局部屯、肌缺血（大约30分钟）和再灌注（大约3小时）之后 D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz对梗塞面积和无复流的作用。通过多个实验程序来评估研 究药品（即赋形剂/安慰剂和D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐））的功效，运些实 验程序在研究药品的给药时间点上是不同的，该给药时间点是相对于缺血和随后的屯、肌再 灌注的开始而言的。
[020引给药的路径和持续时间。通过静脉输液给药赋形剂/安慰剂和 D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐）。在图1中给出关于输液和输液的持续时间的细 节。
[0209] 测试动物。在表7中详述了在本研究中所利用的动物。根据USDA和NIH所制定 的标准，将动物饲养在动物设施中。在随机引入到试验方案之前，由专业人员检查兔子且使 兔子适应环境至少2天时间。每天观察所有的兔子是否出现腹泻、食欲不振、不适等症状。 如果看到运些症状中任一症状，该兔子不被包括在研究群体内。在要进行动物试验前，使所 有的动物禁食（移走食物）整晚。所有的动物没有明显的临床疾病。在进行动物实验的 前一天或者在进行动物实验的当天记录每一只兔子的体重，W用于剂量配方计算和麻醉目 的。在完成每一实验后，对动物（已经完全麻醉）实施安乐死和适当处置。
[0210]
[0211] 研究药品值-Arg-2'，6'-Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐）和赋形剂/安慰剂）。记录 下面描述的研究药品的批号、供应商名称、肤含量、有效期和储存条件。按照下面所述的赋 形剂中的混合物的重量体积比来制备用于D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐）的研 究药品制剂。
[0212] 用在运些研究中的D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐）（无菌冻干粉末）由 816曰11:11化91:1(163有限公司提供。将〇-4'旨-2'，6'-〇1111：-1^73斗116-畑2(醋酸盐）研究药品 溶解在无菌生理盐水（0. 9 %的化C1)中W制备D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐） 研究药品原液。在利用生理盐水稀释之后，使用具有小于0. 22 μ m的膜（PES膜或PVDF膜） 的无菌过滤装置过滤该D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐）研究药品的原液，然后在 使用之前将其储存在-20°C下。
[0213] 在每一 D-Arg-2'，6'-Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐）实验的早上，在将 D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐）研究药品原液与无菌生理盐水（0. 9 %化C1) 混合之前，在室溫下解冻等分的冷冻的D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐）研 究药品原液。针对剂量溶液制备和输液速率，表8-表11总结了要用在研究中的 D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐）的浓度 / 剂量。
[0214]
[021 引
[0216]
[0217]
[021引研究设计。利用适应性设计模型设计本研究。因此，合适的话，在大约32只兔子 的第一组（同期组群1)中收集的数据用于修正其余研究（例如随后的同期组群）。在稳 定大约15-30分钟后，得到基线血液动力学参数和溫度。此外，运些兔子被随机分配到下面 四组之一中（参见图1):组1，研究药品0-4'旨-2'，6'-011^寸73斗}16-畑2(醋酸盐）：在冠状 动脉阻塞（CAO)后大约10分钟时开始输液D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐），且在 大约180分钟的再灌注期间持续输液D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐），η = 8 (待 确定的剂量/体积），D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐）输液时间约等于200分钟； 组2,研究药品D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐）：在冠状动脉阻塞（CA0)后大约20 分钟时（在再灌注之前的10分钟时）开始输液D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐）， 且在大约180分钟的再灌注期间持续输液D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐），η = 8 (待确定的剂量/体积），D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐）输液时间约等于190 分钟；组3,研究药品D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐）：在冠状动脉再灌注开始之 前立即开始进行输液D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐）且在大约180分钟的再灌 注期间持续进行输液D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐），n = 8 (待确定的剂量/体 积），D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐）输液时间约等于180分钟；和组4 :研究药 品（对照）为相对于D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐）等体积的赋形剂/安慰剂， 在CA0后大约10分钟时开始输液研究药品（对照），且在大约180分钟的再灌注期间持续 输液研究药品（对照）。赋形剂/安慰剂输液时间大约等于200分钟。
[0219] 对于特定的时间点（例如在再灌注时、开始再灌注后15分钟时W及大约稳定状态 时），为了关于D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz实现期望的血药浓度，用于组1、组2和组3 中每一组的剂量设计应如下：
[0220] 组 1 :0. 05mg/kg/虹的 D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐），组 1 的输液时间 整整200分钟；
[0221 ]组 2 : W 0. 075mg/kg/虹的 D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐）首先输液 20 分钟，然后改变到W 0. 〇5mg/kg/虹的D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐）输液170分 钟讯
[022引 组 3 : W 0. lOmg/kg/虹的 D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐）首先输液 20 分钟，然后改变到W 0. 05mg/kg/虹的D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐）输液160分 钟。
[022引手术准备（参见图2A :研究流程图-体内步骤W及图2B :研究流程图-病理学测 量）。通过肌肉注射氯胺酬（大约75mg/kg)和甲苯嚷嗦（大约5mg/kg)的混合物来麻醉 雄性新西兰白兔。在研究期间按照需要通过静脉输注进行戊己比妥麻醉W维持深度麻醉。 给兔子插入管子且W机械方式通入富氧的空气。将充满液体的导管插入左颈静脉中W给药 研究药品，将充满液体的导管插入右颈静脉中W进行麻醉，将充满液体的导管插入左颈动 脉中W评估血流动力学且在局部屯、肌血流测量期间采集参考血液样品。穿过左边第四肋间 隙打开胸腔，切开屯、包膜，露出屯、脏。在屯、脏的基部附近，旋动脉的第一大前侧分支或者旋 动脉本身被4-0丝线所环绕。在该区域中的CA0通常导致前侧屯、室壁和顶端屯、室壁的大面 积缺血。缝合末端穿过一段管，形成可W勒紧W封堵动脉的勒紧器。将导管置入左屯、耳中 W在研究结束时注射放射性微球体和染料。将溫度探针插入直肠中，利用加热板维持体溫。 所有的兔子将经受大约30分钟的CA0和大约3小时的再灌注。使用放射性微球体技术，测 量在CA0的大约20-30分钟时的局部屯、肌血流W确保风险区中缺血W及确保四组中的缺血 程度相同。
[0224] 研究药品的途径和持续时间。在研究开始之前校准累注入速率和注入体积。采用 输液累W所确定的速率通过颈内导管给药研究药品。在适合于具体组的时间点进行输液且 在大约180分钟的再灌注期间持续输液。
[0225] 数据步骤、采集和测量。监测屯、率、屯、脏收缩压、屯、脏舒张压和直肠溫度，且在大约 基线时、阻塞5分钟时、阻塞15分钟时和阻塞29分钟时、W及再灌注大约5分钟时、再灌注 大约15分钟时、再灌注大约30分钟时、再灌注大约60分钟时、再灌注大约90分钟时、再灌 注大约120分钟时、再灌注大约150分钟时和再灌注大约180分钟时进行记录。运些时间 点可稍微变化W考虑动物的稳定性或不稳定性。
[0226] 在大约180分钟时，通过左屯、房导管将大约Iml/kg的~4%的硫代黄素 S溶液注 入屯、脏中W限定无复流区域。硫代黄素 S是绿黄巧光染料，使内皮着色，用作灌注的标记 物。硫代黄素 S用作标准标记物W识别无复流区域（参见图3)。再阻塞冠状动脉，通过将 大约4毫升的~50%的化13口6'36蓝染料溶液（供应商(：比曰661旨7)注射进入左屯、房中， 勾画出缺血风险区域。
[0227] 局部屯、肌血流技术（RMB巧。在缺血大约25分钟时采用大约2X 106的放射性微 球体（供应商化rkinElmer Life Sciences)测量RMBF。通过左屯、房导管将该微球体注射 进入左屯、房中，W大约2. 06ml/min的速率从颈动脉中获取参考血液样品。在方案结束时， 从风险区（通过没有蓝色染料而确定）和非缺血区切取样品。称重样品且与参考血液样品 一起在计算机化的丫-井型计数仪（供应商Canberra,系统S100)中计数。在适当减去背 景和针对同位素之间的重叠放射性进行修正后，计算RMBF且结果表达为ml/min/g (参见图 3) 〇
[022引血流动力学测量。使用插入到颈动脉中的充满液体的导管来测量屯、率和血压。采 用ADI (供应商Advanced Digital Instruments)系统数字化数据和记录数据。对于每一 时间点，取Ξ次屯、跳的平均值。
[0229] 无复流区、风险区、出血区和坏死的分析。将屯、脏横切成6-8片。在紫外光下对切 片进行拍照W识别无复流区（参见图3,画面B)，在面素照明下对切片拍照识别风险区（参 见图3,画面A)和出血区（参见图4)。然后，在~1%的氯化Ξ苯基四挫灯TC)溶液中培 养切片大约15分钟，浸泡在福尔马林中，再次拍照W显现梗塞（参见图3,画面C)。坏死组 织不能进行TTC染色且呈现白色到浅黄色。无梗塞的组织染有砖红色。在计算机监视器上 观察数码相片。每一切片中的无复流区、出血区、缺血区和通常灌注的区域的面积W及坏 死区和非坏死区的面积使用Image J(供应商Rasband WS, Image J,美国国立卫生研究院 (化tional Institutes of Health)ht1:p://rsb. info. nih. gov/ij/)进行数字化。将每一 切片上的面积乘W切片的重量，所得到的结果汇总W得到无复流区的、风险区的和梗塞区 的量。
[0230] 来自含有坏死区和正常区的梗塞区域的中央的一个切片通过组织学进行检查，对 任一水肿进行半定量化评分（0-3+的分数）。由不知道该研究方案的专业人员进行全部的 照片测量。
[0231] 样品大小、排除标准和数据分析。每一组的初始样品大小将由η = 8的动物组成。 排除标准包括：在再灌注之前发生死亡且研究结束，或者左屯、室的缺血风险区<10%。数据 分析包括将每一组中的在CA0期间在风险区内的局部屯、肌血流大于0. 2ml/min/g的动物排 除在外W及将每一组中的在CAO期间在风险区内的局部屯、肌血流大于0. 2ml/min/g的动物 包括在内。
[0232] 血液样品采集和处理。采集静脉全血样品用于药物动力学（PK)分析。表12汇总 了采集时间点。在下面规定的时间点采集静脉全血样品用于PK分析。对于PK分析，在下面 的时间点，使用预冷却的注射器将1毫升的静脉全血采集到预冷却的含有（喷涂的）KzEDTA 的抓Vacu化ine你血浆分离管（lavender top)中：对于组1、组2和组4,大约基线时、缺 血29分钟至30分钟时（在再灌注开始前）和再灌注后大约30分钟时、再灌注后大约60 分钟时和再灌注后大约180分钟时；对于组3,在再灌注后大约15分钟时、再灌注后大约大 约30分钟时、再灌注后大约大约90分钟时和再灌注后大约大约180分钟时。
[0233] 表12.采集时间点的汇总
[0234]
[0235] 使PK血管充分地且轻柔地混合、并将其立即放入冰中。采集30分钟内，在~4°C 下，W大约1500XG、优选地高达2000XG对样品离屯、15分钟，离屯、后移走两份等分的血浆 (每一份血浆大约0.25毫升）且将其立即放入贴有标签的螺帽聚丙締管中。各个血浆样品 在干冰上快速冷冻，在设定成维持-70°C ± 15°C的条件下冷冻储存，直到进一步分析。
[0236] 统计分析计划。全部数据进行汇总且利用SAS (版本9. 3)进行统计分析。使用方 差分析比较左屯、室重量、梗塞面积、风险面积、无复流面积、出血面积、和血流。通过化key 测试来确定组间差异。通过方差分析来分析血流动力学变量随时间的变化（重复测量）。 对于动物模型，如果f值小于0. 05,则通过对比方法来确定平均值之间的差异。还将使用协 方差分析（ANC0VA)来测试关于具有风险区、无复流区和出血区的坏死屯、肌与侧支血流的 回归模型的组效应。数据表示为平均值+SEM。
[0237] 终点。该研究的终点可包括但不限于屯、率、屯、脏收缩动脉压/屯、脏舒张动脉压、病 理学样本面积及其各自比率、风险区面积、梗塞质量、左屯、室质量、风险区、无复流区、出血 区、坏死面积/梗塞面积和水肿。
[023引其他芳香族阳离子肤（例如化e-D-Arg-Phe-Lys-NHz)或其药学上可接受的盐（例 如醋酸盐或Ξ氣醋酸盐）可W类似的方式进行测试。 阳23引 连施例2 D-Arg-2\ 6' -Dmt-Lvs-Phe-NH^对具有AMI的兔，横巧中的IA/AR平挽估 的作用
[0240] 按照实施例1中所描述的，进行研究W评估D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz对具 有AMI的兔模型中的IA/AR平均值的作用。对D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐） 的输注时间选择的作用进行评估。对低剂量的（从约O.Olmg/kg/h到约0.5mg/kg/h)的 D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐）的输注时间选择的作用进行评估。在表13和图5 中示出结果。根据给药D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐）的对象中的IA/AR比率与 接受安慰剂的对象相比较降低判断出，D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz在治疗缺血性损伤 W及预防和治疗屯、脏中的再灌注损伤中是有效的。在一些实验中，梗塞面积平均减少11% (未示出）。在一些实验中，梗塞面积减少高达44. 7% (表13;图5)。
[0241]
[0242] 其他芳香族阳离子肤（诸如化e-D-Arg-Phe-Lys-NHz)或其药学上可接受的盐（诸 如醋酸盐或Ξ氣醋酸盐）可类似的方式进行测试。可W预测到，使用可替选的肤可得 到类似的结果。 阳24引 连施例3.在兔，子屯、肿缺血/巧灌注损害后，D-Arg-2\ 6' -Dmt-Lvs-Phe-NH^对解 剖无复流区、m血区巧巧集而巧的作用
[0244] 按照在实施例1所描述的，进行研究W评估D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz 对具有AMI的兔子模型中的解剖无复流区、出血区和梗塞面积的作用。结果示出， D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz在治疗缺血损伤W及预防和治疗屯、脏再灌注损伤（包括解 剖无复流区）上是有效的。
[0245] 包括实施例2中详细描述的动物在内的66只兔子加入本方案。基于缺血风险区 面积的预期的排除标准（AR<左屯、室的10%)，来自两个屯、脏的数据被排除在外。对剩余的 64个屯、脏记录了最终数据：组1，η = 15 (在冠状动脉阻塞（CA0)后的10分钟时开始输注 D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐））；组 2, η = 17 (在 CA0 后的 20 分钟时开始输注 D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐））；组 3, η = 17 (在 CA0 后的 29 分钟时开始输注 D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐））；组 4, η = 15(在 CA0 后的 10 分钟时开始输注 生理盐水）。在CA0期间，Ξ个屯、脏的缺血区中的RMBFX). 20ml/min/g ;由于利用输液累进 行流出，3只兔子可具有升高的D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz血清浓度。运些屯、脏包含在 本文示出的数据分析中。
[0246] 在表14中示出4组的缺血风险区、无复流区、出血区和梗塞面积。给出了 4组中 的运些变量的平均值和标准误差值。通过方差分析分析了运些变量间的潜在差异。
[0247] 表14. AR〉左屯、室的10%的所有屯、脏
[024引
[0249] Occl :冠状动脉阻塞
[0巧0] 协方差分析用于测试类变量"组"对W克表示的风险区的程度（AR/LV)和坏死程 度（AN/LV)之间的关系的作用（图6) W及对风险区的程度和无复流区域的程度之间的关 系的作用（图7)。组对无复流区和风险区之间的关系具有显著的作用。处理组的回归线 位于对照组的回归线之下。对AR/LV〉15%的兔子的坏死面积除W风险面积（AN/AR)的分 析，示出利用D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz处理引起梗塞面积在统计学上显著下降了高 于20% (参见表15)。
[0巧1] 表15.对于AR/LV〉15%的兔子的坏死面积除W风险面积
[0 巧 2]
[0巧3] 基于组合的组数据进行组效应的ANC0VA测试。在无复流区和风险区之间的关系 上存在显著的组效应（P = 0. 0085)(图8)。
[0巧4] 4个处理组中的局部屯、肌血流（RMB巧数据。在冠状动脉堵塞25分钟时，测量 了缺血区和非缺血区的RMBF。在原始数据中，3只兔子在缺血风险区中呈现出非缺血值 (〉0.2ml/min/g)。运可能是由于在阻塞过程中夹子逐渐变松。在研究的第二部分中，使用 双重夹紧方法，没有屯、脏在缺血区中具有〉〇. 2ml/min/g的血流。表16示出RMBF值。
[0巧引表16. RMBF(ml/min/g)，其中缺血区血流〉0. 20ml/min/g的3个屯、脏被排除
[0 巧 6]
[ο巧7] D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz处理获得无复流程度与对照屯、脏相比下降21 %的 趋势。变量"组"对无复流区程度和风险区程度之间的关系具有显著的作用。当处理组组 合且与对照比较时，该信号甚至更强（P = 0. 0085)。
[0巧引总之，对于任意特定的风险区大小，D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz使无复流显 著下降，该发现具有重要的临床暗示。近来研究表明，更恶化的无复流预示着在梗塞的慢 性阶段中有更恶化的LV扩张和LV重构，且更恶化的无复流与更坏的预后相关，而与梗塞 面积的变化无关。参见：Reffelmann T 等，Circulation, 2003,108 :2911-17 ;Wu K 等， Circulation, 1998,97 :765-72 ;Nd;r邱epa 等，J Am Coll Cardiol, 2010,55 :2383-89: 和Bolognese等，Cir州lation，2004,109 :1121-26。由于对于平均的给定风险区大小， D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz减小无复流，因此我们预测，D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz 会促进康复（更好地消除坏死碎屑和更好地使用康复所需要的血液元素），从而减小LV重 构（包括减少LV扩张和LV离屯、性肥大）。此外，可能长期存活。
[0259] 本文所公开的其他芳香族阳离子肤（例如化e-D-Arg-Phe-Lys-NHz)或其药学上 可接受的盐（诸如醋酸盐或Ξ氣醋酸盐）可类似的方式测试和使用，预测会得到类似 的结果。 阳260] 连施例4.在麻中缺血/巧灌注损伤后，D-Arg-2\ 6' -Dmt-Lvs-Phe-NH^对解剖无 复流区的影响
[0261] 在脑缺血-再灌注损伤的动物模型中对本发明的芳香族阳离子肤在保护对象W 免存在缺血再灌注引起的解剖无复流区中的作用进行了探讨。
[0262] 脑缺血引发导致脑损害的大量细胞事件和分子事件。一种运样的事件是 解剖无复流区。脑缺血由右中大脑动脉堵塞30分钟而引起。在缺血后0小时时、 化时、24h时、4化时，对野生型（WT)小鼠给予生理盐水赋形剂（Veh)(腹腔给药）或 D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐）（2-5mg/kg)。在缺血后3天时杀死小鼠。将脑横 切成6-8片。在紫外光下对切片进行拍照W识别无复流区。每一切片中的无复流面积使用 Image J(供应商 Rasband WS, Image J,美国国立卫生研究院（化tional Institutes of Health), ht1:p://rsb. info, nih.gov/ii7)进行数字化。每一切片中的无复流面积乘W切 片的重量，结果汇总W得到所述无复流面积的量。
[0263] 使用脑缺血-再灌注（大脑中动脉阻塞20分钟）的小鼠模型，预测到利用 D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz治疗野生型小鼠会使梗塞体积的显著降低且预防或减少解 剖无复流区。因此，D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz对于减少脑缺血-再灌注引起的无复流 的发病率是有效的。
[0264] 本文所公开的其他芳香族阳离子肤（例如化e-D-Arg-Phe-Lys-NHz)或其药学上 可接受的盐（诸如醋酸盐或Ξ氣醋酸盐），可W W类似的方式被测试和使用。预测通过可选 的芳香族阳离子肤会得到类似的结果。
[0265] 连施例5.在肾脏缺血/再灌注损伤后，D-ArR-2'，6' -Dmt-Lvs-Phe-NH三对角军宮"无 复流区的作用
[0266] 在肾脏损伤的动物模型中对本发明的芳香族阳离子肤在保护对象W免存在缺血 再灌注引起的解剖无复流区中的作用进行了探讨。
[0267]将 Sprague Dawley 大鼠（250-300g)分成 3 组：（1)没有 I/R 的假手术组；（2) 1/ R+生理盐水赋形剂处理；（3) I/R+D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐）处理。在缺血 之前W及紧靠着再灌注开始之前，将D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz (醋酸盐）（3mg/kg，溶 解在生理盐水中）给药大鼠30分钟。按照相同的时间表仅给予对照大鼠生理盐水。通过 氯胺酬巧Omg/kg，腹腔给药）和甲苯嚷嗦（4mg/kg，腹腔给药）的混合物麻醉大鼠。使用微 夹使左肾血管蒂暂时堵塞30分钟或45分钟。在缺血时间段结束时，通过去除夹子而建立 再灌注。在那时，去除对侧的右肾。在24小时的再灌注后，处死动物，且通过屯、脏穿刺得到 血样。通过血尿素氮度UN)和血清肌酸酢确定肾功能（生物测量系统度ioAssay Systems) DIUR-500和生物测定系统DICT-500)。
[026引无复流区和坏死的分析。将肾横切成6-8片。在紫外光下对切片进行拍照W识别 无复流区。每一切片中的无复流面积使用Image J(供应商Rasband WS，Image J,美国国 立卫生石开究院（National Institutes of Health), http: //rsb. info, nih. rov/i i/)行数 字化。每一切片中的无复流面积乘W切片的重量，结果汇总W得到所述无复流面积的量。
[0269] 预测到，在45分钟的缺血和24小时的再灌注之后，利用 D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz治疗预防或减少解剖无复流区。例如，预测到，与没有接受 肤治疗的对象相比，在利用芳香族阳离子肤进行治疗的对象中，BUN、血清肌酸酢和肾小球 滤过率中的一个或多个会得到改善。因此，肤D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz对于减少肾 缺血-再灌注引起的无复流的发病率是有效的。
[0270] 其他芳香族阳离子肤（例如化e-D-Arg-Phe-Lys-NHz)或其药学上可接受的盐（诸 如醋酸盐或Ξ氣醋酸盐）可类似的方式被测试和使用。预测到利用可选的芳香族阳离 子肤会得到类似的结果。 阳27。 连施例6-芳呑族阳离子化对保护人类W免存在无复流现象的作用
[0272] 运些研究将确定在血管重建的同时给药D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz是否会限 制在再灌注时发生的解剖无复流区的大小。为了治疗AMI，在多于90%的患者中对罪犯动 脉使用机械再通使到缺血屯、肌的屯、外膜冠状动脉血流得到恢复（TIMI血流3级）。然而，运 些再灌注努力没有解决下游的在毛细血管床级别的血流恢复的重要辅助问题。在直接PCI 期间或在直接PCI之后，在20-40%的患者中观察到微循环功能障碍。在利用支架进行血管 成形术后，ST段抬高回落幅度的不足是微血管问题的标记，且与不良的临床预后有关。在 STEMI中，尽管存在通杨的冠状动脉但仍不能实现屯、肌再灌注已经被称为"无复流"现象。 [027引研究组。在胸痛发作之后的6小时内且两个连续导联中ST段抬高超过0.1 mV并 且临床决策为对其进行经皮冠状动脉介入（PCI)治疗的18岁的或更年长的男性和女性适 合于入选。无论患者是进行直接PCI还是补救PCI，患者适合于该研究。在入院时存在罪犯 冠状动脉堵塞（屯、肌梗死溶栓[TIMI]血流0级）也是一纳入标准。
[0274] 血管造影术和血管重建。在血管重建之前，利用标准的技术来执行左屯、室造影和 冠状动脉造影。利用直接支架术通过PCI执行血管重建。可替选的血管重建手术包括但不 局限于气囊血管成形术、旁路移植物插入、经皮腔内冠状动脉成形术和定向性冠状动脉斑 块旋切术。
[0275] 实验方案。在执行冠状动脉造影术之后且在植入支架之前，满足入选标准的患者 被随机地指定到对照组或肤组。使用计算机生成的随机序列来执行随机分组。在直接支架 术之前的小于10分钟时，肤组中的患者接受静脉推注D-Arg-2' 6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸 盐）。肤溶解于生理盐水中（最终浓度，25毫克/毫升）且通过位于肘前静脉中的导管注 入。对照组中的患者接受等体积的生理盐水。
[0276] 无复流区。主要终点是通过一种或多种成像技术评估的解剖无复流区的大小。使 用屯、肌声学造影、冠状动脉血管造影术、屯、肌呈色、冠状动脉多普勒成像、屯、电图、使用巧或 得-99m的核成像单光子发射CT或正电子发射计算机断层扫描（阳T)来评估无复流现象。 1.5T身体MRI扫描仪用于执行屯、脏MRI W评估屯、室功能、屯、肌水肿（处于危险中的区域）、 微血管堵塞和梗塞面积。在成功的PCI和支架术后的第4 ± 1天、第30 ± 3天和第6 ± 1. 5个 月时，使用造影后延迟增强W量化梗塞的屯、肌。运通过屯、肌造影后信号的强度定量地限定， 所述强度比同一切片内的远端的非梗塞屯、肌的参考区域中的信号强度高多于2SD。标准的 细胞外礼型造影剂的使用剂量为0. 2mmol/kg。在W下时间点使用二维反转恢复制备的快速 梯度回波序列：（1)早期（在造影剂注射后的大约2分钟时），W评估微血管堵塞，如果可W 的话可考虑单次激发技术；和（2)后期（在造影剂注射后的大约10分钟时），W评估梗塞 面积。
[0277] 预测SJ，在再灌注时给药D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2(醋酸盐）将与 和利用安慰剂所看到解剖无复流区相比而言较小的解剖无复流区相关。因此，肤 D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NHz对于减小屯、脏缺血/再灌注引起的无复流的发生率是有效 的。
[027引其他芳香族阳离子肤（例如化e-D-Arg-Phe-Lys-NHz)或其药学上可接受的盐（诸 如醋酸盐或Ξ氣醋酸盐）可类似的方式被测试和使用。预测到，会得到类似的结果。
[0279] 参考文献
[0280] 1.Ito Η 等.（1996). Clinical implications of the'no re-flow'phenomenon. A predictor of complications and left ventricular remodeling in reperfused anterior wall myocardial infarction. Circulation, 93:223-228.
[0281] 2.Kloner 民A 等.（1974). The"no-reflow"phenomenon after temporary coronary occlusion in the dog. J Clin Invest，54:1496-1508.
[028引 3.Kloner RA等· (1980) · Ultrastruc化ral evidence of microvascular damage and myocardial cell injury after coronary artery occlusion:which comes first ? Circulation, 62:945-952.
[0283] 4. Komamura K 等.（1994). Progressive decreases in coronary vein flow during reperfusion in acute myocardial infarction:clinical documentation of the no re-flow phenomenon after successful thrombolysis. J Am Coll Cardiol, 24:370-377.
[0284] 5. Mane i e t LH 等.（1994) · Mi cro vascu 1 ar compr e s s i on dur ing myocardial ischemia:mechanistic basis for no-reflow phenomenon. Am J Physiol,266:H1541-H1550.
[0285] 6.Topol EJ 等.(2000).民ecog打itio打 of the importance of embolization in atherosclerotic vascular disease. Circulation，101:570-580.
[0286] 7. Fuster V 等.(1992). The pathogenesis of coronary artery disease and 化e acute coronary syndromes(1).N Engl J Med, 326:242-250.
[0287] 8. Iwakura K 等.（2001) · Predictive factors for development of the no-reflow phenomenon in patients with reperfused anterior wall acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol，38:472-477.
[028引 9. Coggins MP 等·（2001) · Noninvasive prediction of ultimate infarct size at the time of acute coronary occlusion based on the extent and magnitude of collateral-derived myocardial blood flow. Circulation, 104:2471-2477.
[0289] 10.1 wakura K 等.（2003) · Association between hyperglycemia and the no-reflow phenomenon in patients with acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol，41:1-7.
[0290] 11. Malmberg K 等·（1999) · Glycometabolic state at admission:important risk marker of mortality in conventionally treated patients with diabetes mellitus and acute myocardial infarction:long-term results from the Diabetes and Insulin-Glucose Infusion in Acute Myocardial Infarction(DIGAMI)study. Circulation, 99:2626-2632.
[0291] 12.Tanaka A 等.（2002). No-reflow phenomenon and lesion morphology in patients with acute myocardial infarction. Circulation, 105:2148-2152.
[029引 13. Kotani J 等.（2002)·Plaque gruel of atheromatous coronary lesion may contribute to the no-reflow phenomenon in patients with acute coronary syndrome. Circulation, 106:1672-1677.
[0293] 14. Hori M等.（1986).民ole of adenosine in hyperemic response of coronary blood flow in microembolization. Am J Physiol, 250:H509-H518.
[0294] 15. Okamura A等·（2005)·Detection of embolic particles with 化e Doppler guide wire during coronary intervention in patients with acute myocardial infarction:efficacy of distal protection device. J Am Coll Cardiol，45:212-215.
[0295] 16.Ito H 等.（1992). Lack of myocardial perfusion immediately after successful thrombolysis. A predictor of poor recovery of left ventricular function in anterior myocardial infarction. Circulation，85:1699-1705.
[0296] 17.Villanueva FS 等·（1993)· Qiaracterization of spatial patterns of flow within the reperfused myocardium by myocardial contrast echocardiography. Implication in determining extent of myocardial salvage. Circulation, 88:2596-2606.
[0297] 18.Yano A 等·（2004) · Myocardial contrast echocardiography with a new calibration method can estimate myocardial viability in patients with myocardial infarction. J Am Coll Cardiol，43:1799-1806.
[0298] 19. Zijlstra F等.（1993). A comparison of immediate coronary angioplasty with intravenous streptokinase in acute myocardial infarction. N Engl J Med, 328:680-684.
[0299] 20. Simes RJ 等.（1995) · Link between the angiographic substudy and mortality outcomes in a large randomized trial of myocardial reperfusion. Importance of early and complete infarct artery reperfusion. GUSTO-I Investigators. Circulation, 91:1923-1928.
[0300] 21. Ito H 等.（1996). Myocardial perfusion patterns related to thrombolysis in myocardial infarction perfusion grades after coronary angioplasty in patients with acute anterior wall myocardial infarction. Circulation, 93:1993-1999.
[0301] 22.Grines CL 等.（1999) · Coronary angioplasty wi化 or without stent implantation for acute myocardial infarction. Stent Primary Angioplasty in Myocardial Infarction S化dy Group. N EnglJ Med, 341:1949-1956.
[030引 23. Gibson CM 等·（2000) · Relationship of TIMI myocardial perfusion grade to mortality after administration of thrombolytic drugs. Circulation, 101:125-130.
[030引 24.Iwakura K等·（1996) · Alternation in 化e coronary blood flow velocity pattern in patients with no re-flow and reperfused acute myocardial infarction. Circulation, 94:1269-1275.
[0304] 25. Akasaka T 等.（2000) · Relation of phasic coronary flow velocity characteristics with TIMI perfusion grade and myocardial recovery after primary percutaneous transluminal coronary angioplasty and rescue stenting. Circulation, 101:2361-2367.
[0305] 26. Yamamoto K 等·（2002)·Two different coronary blood flow velocity patterns in thrombolysis in myocardial infarction flow grade 2in acute myocardial infarction:insight into mechanisms of microvascular dysfunction. J Am Coll Cardiol, 40:1755-1760.
[0306] 27. Wehrens X 等·（2000) · A comparison of electrocardiographic changes during reperfusion of acute myocardial infarction by thrombolysis or percutaneous transluminal coronary angioplasty. Am Heart J，139:430-436.
[0307] 28. Claeys MJ 等·（1999) · Determinants and prognostic implications of persistent ST-segment elev过tion 过fter primary 过ngiopl过sty for 过cute myocardial infarction:importance of microvascular reperfusion injury on clinical outcome. Circulation, 99:1972-1977.
[030引 29. Wu KC等.（1998) · Prognostic significance of microvascular obstruction by magnetic resonance imaging in patients with acute myocardial infarction. Circulation, 97:765-772.
[0309] 30. Taylor AJ 等.口004) · Detection of acutely impaired microvascular reperfusion after infarct angioplasty with magnetic resonance imaging. Circulation, 109:2080-2085.
[0310] 31. Ito H 等（1996). Clinical implications of the'no re-f low'phenomenon. A predictor of complications and left ventricular remodeling in reperfused anterior wall myocardial infarction. Circulation, 93:223-228.
[0311] 32.Morishima I 等.（2000). Angiographic no-reflow phenomenon as a predictor of adverse long-term outcome in patients treated with percutaneous transluminal coronary angioplasty for first acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol, 36:1202-1209.
[0312] 33. Kocher AA. (2001). Neovascularization of ischemic myocardium by human bone marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis,reduces remodeling and improves cardiac function. Nat Med, 7:430-436.
[0313] 34. Kunichika H 等.（2004) · Effects of glycoprotein nb/IIIa inhibition on microvascular flow after coronary reperfusion. A quantitative myocardial contrast echocardiography study. J Am Coll Cardiol，43:276-283.
[0314] 35. Montal e SCO t G 等.（200 1) · P1 at e 1 e t gl y copro t e in I lb/111 a inhibition with coronary stenting for acute myocardial infarction. N Engl J Med, 344:1895-1903.
[031引 36.Stone GW 等· （2005)·Distal microcirculatory protection during percutaneous coronary intervention in acute ST-segment elevation myocardial infarction:a randomized controlled trial. JAMA，293:1063-1072.
[0316] 37. Gick M 等.（2005) · Randomized evaluation of the effects of filter-based distal protection on myocardial perfusion and infarct size after primary percutaneous catheter intervention in myocardial infarction with and without ST-segment elevation. Circulation，112:1462-1469.
[0317] 38. Mizote I 等·（2005) · Distal protection improved reperfusion and reduced left ventricular dysfunction in patients with acute myocardial infarction who had angioscopically defined ruptured plaque. Circulation, 112:1001-1007.
[031 引 39. Makaryus AN 等.（2006) · Efficacy of rheolytic 化rombectomy in early versus late myocardial infarction. J Interv Cardiol, 19:135-140.
[0319] 40.All A. (2004) · Rheo lytic 化rombectomy in patients with acute MI did not result in a reduction in myocardial infarct size.Presented at Transcatheter Cardiovascular Therapeutics:2004September 27to October 1 ;Washington，DC.
[0320] 41 · Tsang A 等.（2004) · Pos tcondi t ion ing : a f orm of "modi f i ed reperfusion"protects the myocardium by activating the phosphatidyl inositol 3-kinase-Akt pathway. Circ Res, 95:230-232.
[0321] 42. Staat P 等.(20 0 5) . Po s t c on d i t i on i ng the human heart. Circulation, 112:2143-2148.
[0322] 43. Marzilli M 等.（2000)·Beneficial effects of intracoronary adenosine as an adjunct to primary angioplasty in acute myocardial infarction. Circulation, 101:2154-2159.
[032引 44. Ross AM 等·（2005) · A randomized, double-blinded, placebo-controlled multicenter trial of adenosine as an adjunct to reperfusion in the treatment of acute myocardial infarction(AMISTAD-II).J Am Coll Cardiol，45:1775-1780.
[0324] 45. Ito H 等.(1999). Intravenous nicorandil can preserve microvascular integrity and myocardial viability in patients with reperfused anterior wall myocardial infarction. J Am Coll Cardiol，33:654-660.
[0325] 46.Ishii H 等.(2005). Impact of a single intravenous administration of nicorandil before reperfusion in patients with ST-segment-elevation myocardial infarction. Circulation，112:1284-1288.
[0326] 47. Taniyama Y. (1997). Beneficial effect of intracoronary verapamil on microvascular and myocardial salvage in patients with acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol, 30:1193-1199.
[0327] 48. Umemura S. (2006). The effect of verapamil on the restoration of myocardial perfusion and functional recovery in patients with angiographic no-reflow after primary percutaneous coronary intervention. Nucl Med Commun, 27:247-254.
[032引 49. Pasceri V. (200巧· Effects of 化e nitric oxide donor nitroprusside on no-reflow phenomenon during coronary interventions for acute myocardial infarction. Am J Cardiol，95:1358-1361.
[0329] 50. Hieroux P. (2000) · Myocardial cell protection:a challenging time for action and a challenging time for clinical research. Circulation，101:2874-2876.
[0330] 51. Hieroux P 等·（2000) · Inhibition of the sodium-hydrogen exchanger with cariporide to prevent myocardial infarction in high-risk ischemic situations. Main results of the GUARDIAN trial. Guard during ischemia against necrosis (GUARDIAN)Investigators. Circulation, 102:3032-3038.
[0331] 52. Zeymer U 等·（2001)· Hie Na+/H+exchange inhibitor eniporide as an adjunct to early reperfusion therapy for acute myocardial infarction.民esults of the evaluation of the safety and cardioprotective effects of eniporide in acute myocardial infarction(ESCAMI)trial. J Am Coll Cardiol，38:1644-1650.
[033引 53. Cai Z 和 Semenza GL (2004) · Phosphatidylinositol-3-kinase signaling is required for erythropoietin-mediated acute protection against myocardial ischemia/reperfusion injury. Circulation，109:2050-2053.
[0333] 等同物
[0334] 本发明不限于在本申请中描述的特定实施方式，用作本发明的单独的方面的单一 说明。本领域技术人员将理解，可W不脱离本申请的精神和范围的情况下进行各种修改和 改动。根据W上描述，除了本文中列举的^外，本公开的范围内的功能上等同的方法和装置 对于本领域的本领域技术人员而言是明显的。这样的改动和修改意欲藩在所附权利要求的 范围内。本公开仅受所附权利要求W及与这样的权利要求的范围所等同的全部范围限制。 应当理解，本公开不限于特定的方法、试剂、组合物和生物系统，当然，所述方法、试剂、组合 物和生物系统可w变化。还可理解，本文中使用的术语仅用于描述特定的实施方式，不用来 是限制性的。
[0335] 此外，在W马库什组的方式描述本公开的特征或方面的情况下，本领域的本领域 技术人员将意识到，本公开也是W马库什组中的任一单个成员或亚组成员的方式所描述 的。
[0336] 本领域的本领域技术人员将理解，为了任何或所有目的，尤其是提供说明书支持 方面，本文中描述的所有范围还可涵盖任何且所有的可能子范围及其子范围的组合。任何 列出的范围可W容易地看作充分公开并使其能够同一范围分成至少等半、Ξ分之一、四分 之一、五分之一份、十分之一等的子范围。作为非限制性实施例，本文中描述的每一范围可 W容易地分成下Ξ分之一、中Ξ分之一和上Ξ分之一等。本领域技术人员还将理解，所有的 语言比如"上至""至少"、"大于"、"小于"等包括所本数且适用于可W随后被分成W上上 述所提及子范围的范围。最后，本领域技术人员将理解，范围包括每一单个成员。因此，例 如，具有1到3个单元的组指的是具有1个单元、2个单元或3个单元的组。类似地，具有1 到5个单元的组指的是具有1个单元、2个单元、3个单元、4个单元或5个单元的组，等等。
[0337] 本文所参考的或引用的所有专利、专利申请、在先申请和出版物通过引用而全文 并入本文，包括所有的附图和表格，使得它们不与本说明书的明确教导相矛盾。
[033引在W下的权利要求范围内提出其他的实施方式。
【主权项】
1. 一种用于预防或治疗有需要的哺乳动物对象中的解剖无复流区的方法，所述方法包 括将治疗有效量的肽D-Arg-2'，6' -Dmt-Lys-Phe-NH2S其药学上可接受的盐给药至所述对 象，从而预防或治疗所述对象中的解剖无复流区。
【文档编号】A61K38/07GK105879008SQ201510122649
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2011年7月8日
【发明人】肯尼斯·博罗, D·特拉维斯·威尔逊, 罗伯特·A·科鲁纳, 莎伦·黒勒
【申请人】康德生物医疗技术公司