一种青刺果发酵原浆化妆品及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种青刺果发酵原浆化妆品及其制备方法与应用。本发明提供了一种制备青刺果发酵原浆的方法，包括如下步骤：以青刺果为底物，以酿酒酵母为菌种，进行发酵。所述方法制备得到的青刺果发酵原浆也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种产品，其活性成分为所述青刺果发酵原浆；产品的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)：(a)抗氧化；(b)清除DPPH自由基；(c)抗衰老。本发明的利用发酵工程技术从青刺果中提取活性物质，操作简单，且由于不添加任何外来物质，制备得到的青刺果发酵物即青刺果发酵原浆对皮肤安全无伤害。产品中富含多糖、黄酮等物质，与发酵滤液中的发酵产物成分具有协同作用，能够显著抗氧化及抗衰老。
【专利说明】
-种青刺果发酵原浆化妆品及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种青刺果发酵原浆化妆品及其制备方法与 应用。
【背景技术】
[0002] 青刺果又名青刺尖，枪刺果为菩薇科扁核木属的一种常绿灌木。产于云南、贵州、 四川、西藏。生长于海拔1000-2560米的山坡、荒地、山谷或路旁等处。己基斯坦、尼泊尔、不 丹和印度北部也有分布。青刺尖始载于《滨南本草》："性微寒，味苦。攻一切疮毒痴痘"；现在 亦有文献记载:本品"根、茎、叶、果：味苦，性微寒，无毒。茎叶主治痴痘毒疮、风火牙痛、枪 伤、骨折、蛇咬伤;根主治虚咳、久咳、积食、风湿关节炎;果主治目鸾多泪、消化不良。"其在 滨西北少数名族地区已有几千年的食药用历史，该地区的摩梭人使用青刺果已有悠久的历 史，至今摩梭簇人还用青刺果油擦脸、擦头发。青刺果的内茎、叶、根、果实均可入药，具有攻 毒、活血、桂疲、补虚、贫血、接骨消肿等功效。青刺果含黄酬、多糖、脂肪酸、生物碱等多种活 性成分。现代研究表明：青刺果具有免疫调节作用、抗菌、降血糖、降血脂、抗炎等作用。由于 青刺果有着广泛的用途，青刺果活性成分的研究就显得更加的重要。
[0003] 利用各种提取技术从植物中提取具有高活性的成分已经成为目前的研究热点。传 统的提取技术包括有机溶剂提取法、热水提取法等，但运些方法产品安全性低、耗时长、提 取率低。安全性高、提取率高和环保的新型提取方法越来越备受人们关注。微生物法提取植 物活性成分是利用微生物在生长过程中分泌的多种酶，对植物中的活性成分进行提取和修 饰。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种青刺果发酵原浆化妆品及其制备方法与应用。
[0005] 本发明提供了一种制备青刺果发酵原浆的方法，包括如下步骤：W青刺果为底物， W酿酒酵母为菌种，进行发酵。
[0006] 酿酒酵母与青刺果的配比可为:5 X 105-15 X 108CFU: 15-25邑。
[0007] 酿酒酵母与青刺果的配比具体可为:8 X 107CFU: 20g。
[000引所述发酵的条件为:25-35 °C、46-53小时。
[0009] 所述发酵的条件具体可为:28°C、48小时。
[0010] 所述发酵的条件具体可为:28°C、180巧m振荡培养48小时。
[0011] 发酵体系具体可由酿酒酵母菌液、青刺果干粉和水组成。
[0012] 发酵体系的组成如下：5-15mL酿酒酵母菌液、15-25g青刺果干粉和280-350mL水。
[0013] 发酵体系的组成如下:7-10mL酿酒酵母菌液、18-23g青刺果干粉和300mL水。
[0014] 发酵体系的组成具体如下:8mL酿酒酵母菌液、20g青刺果干粉和300mL水。
[0015] 酿酒酵母菌液的菌浓度可为105~108CFU/mL，具体可为10 7CFU/mL。
[0016] 酿酒酵母菌液的制备方法如下：将酿酒酵母单菌落接种至YPD培养基，培养至 OD6〇(U直=0.5-1. ο，得到酵母菌菌液(酵母菌菌液中的酿酒酵母浓度为ΙΟ5~108C即/mL)。
[0017]酿酒酵母菌液的制备方法具体如下:将酿酒酵母单菌落接种至100ml YTO培养基， 25°C、15化pm振荡培养至0D6日日nm值= 0.75,得到酵母菌菌液(酵母菌菌液中的酿酒酵母浓度 为10?即/血)。
[001引 YPD培养基的抑可为6.5-7.5，具体可为7.0。
[0019] YPD培养基：由溶质和溶剂组成;溶剂为水;溶质及其在YH)培养基中的浓度:酵母 提取物1% (质量分数），膜蛋白腺2% (质量分数），葡萄糖2% (质量分数）。
[0020] 青刺果干粉具体可为过40-50目筛后的青刺果干粉。
[0021 ] 酿酒酵母具体可为ATCC编号为26603的菌株。
[0022] 所述方法还包括如下步骤:取发酵产物，灭菌，然后离屯、收集上清液。
[0023] 所述灭菌的条件可为：115-12rC，15-25min。
[0024] 所述灭菌的条件具体可为：12rC，20min。
[00巧]所述离屯、的条件可为：3800-4200巧m、l〇-15min。
[00%] 所述离屯、的条件具体可为:400化pm离屯、lOmin。
[0027] W上任一所述方法制备得到的青刺果发酵原浆也属于本发明的保护范围。
[002引所述青刺果发酵原浆：pH = 5.7-6.6 ;粘度160-250CP;可溶性固形物含量3.0- 5.0%(白利度）。
[0029] 所述青刺果发酵原浆:抑=6.1，粘度210cP，可溶性固形物含量4.0% (白利度），粗 多糖浓度为34. Olg/kg，总黄酬浓度为12.09g/kg。
[0030] 所述青刺果发酵原浆：外观为粘稠液体、颜色为淡黄色至栋黄色；菌落总数小于 50CFU/mL，无致病菌检出。
[0031] 本发明还保护一种产品，其活性成分为权利要求7所述青刺果发酵原浆;所述产品 的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c):(a)抗氧化;（b)清除DPPH自由基；（C)抗衰老。
[0032] 本发明还保护所述青刺果发酵原浆在制备产品中的应用;所述产品的功能为如下 (a)和/或(b)和/或(c):(a)抗氧化;（b)清除DPK1自由基；（C)抗衰老。
[0033] 本发明还保护所述青刺果发酵原浆的应用，为如下(a)和/或(b)和/或(C): (a)抗 氧化;（b)清除DPK1自由基；（C)抗衰老。
[0034] W上任一所述产品具体可为化妆品。所述化妆品包括但不限于:面膜、精华液或爽 肤水。
[0035] 本发明的利用发酵工程技术从青刺果中提取活性物质，操作简单，且由于不添加 任何外来物质，制备得到的青刺果发酵物即青刺果发酵原浆对皮肤安全无伤害，具有更高 的抗衰老活性。
[0036] 本发明的有益效果如下：
[0037] (1)本发明提供的青刺果发酵物（即青刺果原浆)的制备方法采用发酵工程技术， 通过选择合适的菌种及发酵条件，从青刺果中提取得到活性物质。一方面，可最大程度保留 植物中的活性成分，且相对于传统的水提法，避免了有机溶剂的引入，安全环保;另一方面， 不需要添加酶等外来物质，不仅节约生产成本，而且最大化的简化了生产步骤，使该发酵技 术能够实现大量生产、工业化生产，并能够充分保证产品质量的稳定性。
[0038] (2)本发明提供的青刺果发酵原浆含有健康皮肤不可或缺的氨基酸、矿物质等自 然成分，且由于在制备过程中未引入外来物质，不含任何化学成分，可w直接作为面膜或精 华液或爽肤水的成品使用，比现有市面上的其他产品更加天然，不会给肌肤造成任何负作 用。
[0039] (3)本发明提供的青刺果发酵原浆，具有较强的抗氧化能力可清除自由基，促进细 胞代谢，增强细胞活力，改善机体的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞老化，具有 抗衰老的功效。
【附图说明】
[0040] 图1为青刺果发酵原浆对DPK1自由基清除作用曲线。
【具体实施方式】
[0041] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。W下实施例中的定量试验，均设置Ξ次重复实验，结果取平 均值。
[0042] 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae):ATCC编号为26603eDPPH:购自阿法埃莎 (中国）化学有限公司，产品目录号为044150。
[0043] YPD培养基(pH7.0):由溶质和溶剂组成;溶剂为水;溶质及其在YTO培养基中的浓 度:酵母提取物1% (质量分数），膜蛋白腺2% (质量分数），葡萄糖2% (质量分数）。
[0044] 青刺果干粉的制备方法:取青刺果(果实），充分烘干后粉碎，然后过50目筛，得到 青刺果干粉。青刺果购自云南白药公司，产地为云南。
[0045] 粗多糖检测方法:按照GB/T 5009.8-2008中的酸水解法进行检测并计算。
[0046] 总黄酬检测方法:按照GB/T 20574-2006(分光光度比色法)进行检测并计算。
[0047] 实施例1、制备青刺果发酵原浆 [004引一、制备酵母菌菌液
[0049] 将酿酒酵母单菌落接种至100ml YPD培养基，25°C、150巧m振荡培养至0D6日日nm值= 0.5-1.0，得到酵母菌菌液(酵母菌菌液中的酿酒酵母浓度为105~108CFU/mL)。
[0050] 二、制备青刺果发酵原浆
[0化1 ] 1、将5-15血步骤一得到的酵母菌菌液、15-25旨青刺果干粉和28〇-35〇1^水混合，然 后25-35 °C振荡培养46-53小时，然后收集整个发酵体系，即为发酵产物。
[0052 ] 2、取步骤1得到的发酵产物，115-12 rC灭菌15-25min。
[0化3] 3、取步骤2的产物，3800-4200巧m离屯、10-15min，收集上清液，即为青刺果发酵原 浆。
[0054] Ξ、青刺果发酵原浆的性质
[0055] 青刺果发酵原浆:外观为粘稠液体、颜色为淡黄色至栋黄色;pH = 5.7-6.6;粘度 160-250CP;可溶性固形物含量3.0-5.0 % (白利度）；菌落总数小于50CFU/mL，无致病菌检 出。
[0化6] 根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于lOOOCFU/ml，所W本发明 制备的青刺果发酵原浆符合化妆品质量要求。
[0057] 实际操作中，也可W将青刺果发酵原浆进行活性炭处理，W脱色和去味。
[0058] 实施例2、制备青刺果发酵原浆
[0059] 一、制备酵母菌菌液
[0060] 将酿酒酵母单菌落接种至100ml YPD培养基，25°C、150巧m振荡培养至0D6日日nm值= 0.75，得到酵母菌菌液(酵母菌菌液中的酿酒酵母浓度为107CFU/mL)。
[0061 ]二、制备青刺果发酵原浆
[0062] 1、将8mL步骤一得到的酵母菌菌液、20g青刺果干粉和300mL水混合，然后28°C、 18化pm振荡培养48小时，然后收集整个发酵体系，即为发酵产物。
[0063] 2、取步骤1得到的发酵产物，12rC灭菌20min。
[0064] 3、取步骤2的产物，40(Κ)巧m离屯、lOmin(离屯、半径为9cm)，收集上清液，即为青刺果 发酵原浆。
[0065] 青刺果发酵原浆:抑=6.1，粘度210cP，可溶性固形物含量4.0%(白利度），粗多糖 浓度为34. Olg/kg，总黄酬浓度为12.09g/kg。
[0066] 实施例3、青刺果发酵原浆作为化妆品的应用
[0067] -、安全性检测
[0068] 人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对实施例2 制备的青刺果发酵原浆进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。
[0069] 试验对象:在知情同意的前提下，招募志愿者30人，年龄范围在18-60岁。
[0070] 试验方法如下：
[0071] 1、将0.2mL青刺果发酵原浆滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内，作为试验 组斑试器;将0.2mL蒸馈水滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内，作为空白对照组斑 试器。
[0072] 2、利用无刺激性的胶带将一个试验组斑试器和一个空白对照组斑试器分别固定 贴敷于同一受试者背部的不同部位，持续24小时（期间志愿者不能摘掉斑试器，亦不可使受 试部位接触水），然后去除斑试器，从去除斑试器开始计时，分别于30min后、24小时后和48 小时后观察皮肤的反应。
[0073] 试验结果如表1所示。
[0074] 表1中各符号表示的含义如下：
[0075] 表示阴性反应；
[0076] "±"表示可疑反应:仅有微弱红斑；
[0077] V'表示弱阳性反应(红斑反应）：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；
[0078] "++"表示强阳性反应(瘤疹反应）：红斑、浸润、水肿、丘疹、瘤疹;反应可超出受试 区；
[0079] "+++"表示极强阳性反应(融合性瘤疹反应）；明显红斑、严重浸润、水肿、融合性瘤 疹;反应超出受试区。
[0080] 根据化妆品卫生规范2007:30例受试者中出现1级皮肤不良反应Γ±")的人数多 于5例，或出现二级皮肤不良反应Γ+")的人数多于2例，或出现任何1例Ξ级皮肤不良反应 Γ++")或Ξ级W上皮肤不良反应Γ+++")时，则判定受试物对人体有不良反应;反之，则视 为对人体无不良反应。
[0081] 表1斑贴试验结果
[0082]
[0083] 从表1中可W看出：实施例2得到的青刺果发酵原浆产生1例可疑反应，说明本发明 提供的青刺果发酵原浆均具有安全性，不会给人体带来不良反应。
[0084] 二、青刺果发酵原浆的抗氧化性能检测
[0085] DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氨能力，它在有机 溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH 的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定 吸光值的变化来评价样品对DPI^自由基的清除效果。
[0086] 2Xl〇-4mol/L DPPH溶液的溶剂为无水乙醇。
[0087] 取实施例2制备得到的青刺果发酵原浆，作为待测液1。取实施例2制备得到的青刺 果发酵原浆，用去离子水稀释，得到青刺果发酵原浆所占的体积百分含量为4.00%的待测 液2。取实施例2制备得到的青刺果发酵原浆，用去离子水稀释，得到青刺果发酵原浆所占的 体积百分含量为5.00%的待测液3。取实施例2制备得到的青刺果发酵原浆，用去离子水稀 释，得到青刺果发酵原浆所占的体积百分含量为6.67%的待测液4。取实施例2制备得到的 青刺果发酵原浆，用去离子水稀释，得到青刺果发酵原浆所占的体积百分含量为10.00 %的 待测液5。取实施例2制备得到的青刺果发酵原浆，用去离子水稀释，得到青刺果发酵原浆所 占的体积百分含量为20.00 %的待测液6。
[008引DPK1自由基清除实验的具体实验步骤为：
[0089] (1)待测液与2X l〇-4mol/L的DPP田容液等体积混匀(A潜）；
[0090] (2)无水乙醇与2 X l〇-4mol/L的DPP田容液等体积混匀(A2管）；
[0091] (3)待测液与无水乙醇等体积混匀(A3管）；
[OOW] (4)37°C静置反应30min后，在517nm下ilAi管、A2管、A3管吸光度值。
[OOW]清除率（％) = [(A2+A3)-Ai]/A2。
[0094] W青刺果发酵原浆在待测液中所占的体积百分含量为横坐标，清除率为纵坐标， 制作青刺果发酵原浆对DPK1自由基清除作用曲线，见图1。
[009引由图1可知，实施例2制备的青刺果发酵原浆在4%-100%浓度范围内对DPPH自由 基清除率均在80 % W上，6.67 %青刺果发酵原浆对DPPH自由基清除率为91.88 %，说明青刺 果发酵原浆具有很强的抗氧化能力可清除自由基，促进细胞代谢，增强细胞活力，改善机体 的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞老化，发挥其抗衰老的作用。
【主权项】
1. 一种制备青刺果发酵原浆的方法，包括如下步骤：以青刺果为底物，以酿酒酵母为菌 种，进行发酵。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：酿酒酵母与青刺果的配比为：5 X 105-15 X IO8CFU:15-25g。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于:酿酒酵母与青刺果的配比为:8 X IO7CFU: 20g。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵体系由酿酒酵母菌液、青刺果干粉和水 组成。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述发酵的条件为:25-35 °C、46-53小时。6. 如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述方法还包括如下步骤:取发酵 产物，灭菌，然后离心收集上清液。7. 权利要求1至6中任一所述方法制备得到的青刺果发酵原浆。8. -种产品，其活性成分为权利要求7所述的青刺果发酵原浆;所述产品的功能为如下 (a) 和/或(b)和/或(c): (a)抗氧化；（b)清除DPPH自由基；（c)抗衰老。9. 权利要求7所述青刺果发酵原浆在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下（a) 和/或(b)和/或(c): (a)抗氧化;（b)清除DPPH自由基；（c)抗衰老。10. 权利要求7所述青刺果发酵原浆的应用，为如下(a)和/或(b)和/或(c): (a)抗氧化； (b) 清除DPPH自由基；（c)抗衰老。
【文档编号】A61K8/97GK105919889SQ201610429434
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】李萌, 王昌涛, 赵丹, 张佳婵, 王冬冬
【申请人】北京工商大学