地榆总皂苷治疗炎症性肠病的制作方法
【专利摘要】本发明为地榆总皂苷治疗炎症性肠病。本发明涉及地榆总皂苷对炎症性肠病的治疗作用，属于药学领域。本发明提供了地榆总皂苷对显著逆转TNBS引起的结肠损伤；并通过实验证明，地榆皂苷可以明显缓解TNBS诱导大鼠发生结肠炎后体重减轻现象，明显减轻TNBS诱导的大鼠结肠炎病理改变程度，炎细胞浸润减少，黏膜上皮变性减少。TNBS造成大鼠体内严重的炎症反应，导致大鼠血清中TNF?α、IL?1β、IL?6促炎因子表达升高，地榆皂苷可以逆转大鼠血清中炎症因子升高的现象。TNBS同时导致大鼠结肠氧自由基系统中MPO、MDA表达升高，SOD表达下降，因此地榆皂苷可以逆转大鼠结肠氧自由基系统紊乱的现象。本发明还提供了地榆皂苷对LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞中炎症因子的炎症因子的影响，结果发现，地榆皂苷可显著地下调TNF?α，IL?6和IL?1β的表达，从而发挥抗炎作用。地榆总皂苷可用于炎症性肠病的治疗。
【专利说明】
地愉总皂昔治疗炎症性肠病
技术领域
[0001] 本发明设及地愉总皂巧对炎症性肠病的治疗作用，增加地愉总皂巧的适应症，促 进地愉总皂巧的开发，属于药物领域。
【背景技术】
[0002] 地愉在我国资源丰富、种类繁多，并且已经有较为纯熟的人工栽培技术可W进行 大面积繁殖。地愉中含有较质及多酪类、Ξ祗及其巧类、黄酬及其巧类等多种化学成分，具 有止血、抗炎消肿、抗肿瘤，抗氧化W及抗过敏等药理作用W-W。地愉皂巧及其巧元成分W Ξ祗皂巧类化合物为主，其结构类型主要有乌苏烧型、齐墳果烧型、达玛烧型和羽扇豆烧 型，其中乌苏烧(ursane)型和齐墳果烧(oleanane)型最为常见。地愉皂巧生物利用度低、通 透性差、在体内很难达到有效浓度;然而，地愉皂巧具有明确的止血、抗炎消肿、抗肿瘤，抗 氧化W及抗过敏等药理作用。运种PK与PD不相关的现象提示我们，地愉皂巧可能是通过一 种间接机制发挥作用。
[0003] 炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD)是一种原因不明的慢性非特异 性炎症性肠病，IBD在发达国家发病率高于发展中国家，但近年来随着我国经济水平的提 高、人群饮食习惯和生活习惯的改变，I抓在我国发病率有逐年升高的趋势。由于发病机制 尚不明确，临床上常表现为反复发作而治愈难度大。饮食及其他因素可W影响免疫力低下 的易感者，使其对肠道细菌免疫反应的抵抗能力降低，从而丧失对正常菌群的耐受性，最后 导致疾病的发生。人体肠道中有大量菌群，广谱抗生素能预防I抓发生，说明I抓发病与菌群 有关。在IBD的发病机制中，免疫因素有着十分重要的作用。在IBD患者的结肠黏膜中均可检 测到大量的浆细胞，淋己细胞，中性粒细胞和巨隧细胞，运些免疫细胞可释放多种细胞因 子，例如IL-li3，IL-6和TNFs等属于促炎症细胞因子，会导致炎症的发生与发展。I抓病变过 程有肠腔内压增高、交感神经活动增强、内源性缩血管物质活性递质等现象，使肠血流量降 低，或暂时性缺血后出现再灌流现象，能引起供氧还原不完全，导致大量氧自由基形成，损 伤肠粘膜。
[0004] 因此，从药代动力学-药效学角度系统地考察地愉皂巧对炎症性肠病的治疗作用 的可行性与可能性，促进地愉皂巧的二次开发。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于从药代动力学-药效学角度系统地考察地愉皂巧对 炎症性肠病的治疗作用的可行性与可能性，促进地愉皂巧的二次开发。
[0006] 在药代物质基础研究过程中，首先基于高分辨、高灵敏度、高分析速度的LC-Q- T0F/MS技术对地愉提取物中皂巧类成分进行鉴定，构建炎症性肠病大鼠模型，考察地愉皂 巧在正常及炎症性肠病模型大鼠体外代谢差异，寻找影响地愉皂巧在正常和模型大鼠体内 外代谢差异的主要因素。构建炎症性肠病大鼠模型，考察地愉皂巧在正常及炎症性肠病模 型大鼠体外代谢差异，在此过程中，利用Ξ硝基苯横酸构建炎症性肠病模型。分别考察地愉 皂巧在正常大鼠和炎症性肠病大鼠模型血浆、尿、粪、肠道菌群等样本中的药源性成分谱的 差异，寻找影响地愉皂巧治疗结肠炎的药代-药效物质基础。
[0007] 在地愉皂巧对炎症性肠病的治疗作用的药理活性研究过程中，建立LPS诱导的小 鼠 RAW264.7巨隧细胞的体外炎症模型，通过酶联免疫法检测不同浓度地愉皂巧对肿瘤坏死 因子-a(TNF-a)，白细胞介素-6(化-6)及白细胞介素-liKlkie)的影响。体内实验部分运用 Ξ硝基苯横酸构建大鼠体内溃瘍性结肠炎模型，分成对照组、模型组、低剂量组(lOmg/kg)、 中剂量组(25mg/kg)、高剂量组(50mg/kg)及阳性药组(250mg/kg)。造模后给药治疗7天后， 比较不同组体质量变化情况，测定血清中IL-Ιβ、IL-6和TNF-a的表达;取结肠溃瘍明显处进 行病理分析，常规HE染色，评价各组样品炎症程度；同时取结肠组织匀浆后测定其髓过氧化 物酶(MP0)、丙二醒(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)在结肠中的表达。结果发现，地愉皂巧剂量 依赖性地逆转由TNBS引起的TNF-a(P<〇.〇l)和化-1β(Ρ<〇.〇1)表达的上调，化-6(P< 0.01)在50yg/mL浓度下与模型组有显著性差异。体内实验表明，地愉皂巧明显减轻TNBS诱 导的大鼠结肠炎病理改变程度;模型组大鼠体重显著低于对照组(P<〇.001)，低剂量组、中 剂量组、高剂量组与阳性药组可显著升高造模后大鼠体重;造模后大鼠血清中IL-6表达升 高(P<0.05)，与模型组相比，地愉皂巧低剂量、高剂量及阳性药组可显著降低由TNBS诱导 的结肠炎症反应;造模后大鼠血清中IL-Ιβ表达升高(P<0.05)，与模型组相比，地愉皂巧低 剂量、中剂量及阳性药组可显著下调由血清中IL-Ιβ的表达;造模后大鼠血清中TNF-a表达 升高，与对照组相比有显著性差异(P<〇.01)，地愉皂巧治疗组的TNF-a表达有一定下调的 趋势。
[0008] 通过W上研究，从药代动力学-药效学角度系统地考察地愉皂巧对炎症性肠病的 治疗作用的可行性与可能性，促进地愉皂巧的二次开发。
【附图说明】：
[0009] 图1:地愉总皂巧对RAW264.7细胞活性的影响。
[0010] 图2:地愉皂巧对LPS诱导的RAW264.7细胞细胞因子表达的影响（A)TNF-a(B)化-1β (C)比-6。
[0011] 图3:地愉皂巧对造模大鼠体质量影响。
[0012] 图4:TNBS造模后大鼠结肠组织病变结果及其地愉总皂巧的治疗作用（Α)对照组 (B)模型组(C)治疗组(D)阳性药组。
[001 ：3 ] 图5:地愉皂巧对大鼠结肠组织中各指标表达的影响(A)MP0 (B) SOD (C)MDA。
[0014] 图6:地愉皂巧对大鼠血清中细胞因子的影响(A)比-6(B)IL-lf3(C)TNF-a。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合附图和实施例，对本发明进行进一步的说明。
[0016] 实施例1地愉提取物中皂巧类成分的定性分析
[0017] 第一步:地愉皂巧的碎裂方式分析:皂巧类成分会发生脱糖基反应，162化表示脱 去己糖（glucose，Glc-)，132Da表示脱去戊糖(arabinose，Ara-)。分析碎片信息发现，在地 愉皂巧I和II二级碎片质谱图中，453.33、471.34和585.38具有较高的强度。因此，我们选择 特征碎片离子m/z 453.33、471.34、585.38与中性丢失m/z 132、162作为皂巧类成分特征信 息，建立适用于地愉皂巧快速鉴定的特征碎片离子诊断技术及中性丢失技术。
[0018] 第二步:通过特征离子诊断技术及中性丢失技术，首次全面且快速地鉴定出皂巧 类成分24种，相关结果(保留时间，分子式，准确分子量，质量偏差，碎片离子)列于表1。鉴定 出的皂巧类化合物构型如图1-4所示。其中乌苏烧型皂巧类成分有18种，齐墳果烧型皂巧类 成分有1种，其它类型皂巧类成分有5种。
[0019] 表1地愉提取物中皂巧类成分相关信息
[0020]
[0021]
[0022] 实施例2地愉皂巧在正常及炎症性肠病模型大鼠体外代谢物鉴定
[0023] 步骤一 ：TNBS灌肠造肠炎模型的制备：将TNBS溶解于无水乙醇溶液（1:1)中，配制 成浓度为lOOmg/kg溶液。腹腔注射7 %水合氯醒麻醉大鼠后，。用注射器吸取配置好的TNBS 溶液，用凡±林充分润滑导管末端后灌肠，导管末端距大鼠的肛口约5cm，将注射器内的 TNBS缓慢推入结肠后，倒置大鼠 Imin。对照组小鼠给予同等剂量的生理盐水。
[0024] 步骤二:肠道菌群制备:大鼠股动脉放血处死，取出回盲瓣，暴露其内容物，称量肠 道内容物质量。Ig内容物加入3mL样品保存液(20 %甘油加1.8 %氯化钢），吹打均匀后分装 到1.5mL无菌EP管中，保存在-80°C备用。
[0025] 步骤Ξ:药物与肠道菌群体外共溫解：在无菌操作台中用PY培养基将菌液稀释5 倍，稀释后的菌液在摇床中37°C，200巧m溫解12h后，在无菌操作台中取90化菌液和10化地 愉皂巧溶液混合，置于2.化溫解盒中，迅速放入厌氧袋，在摇床中37°C，200巧m分别溫解比。 溫解结束时用ImL冰正下醇终止反应并进行提取(η = 5)。10, OOOg离屯、lOmin，取上清0.8血， 置45 °C真空离屯、浓缩装置中挥干，200化乙腊溶解残渣，40，OOOg离屯、lOmin，扣L进样分析。 研究结果见表2和表3。
[0026] 表2正常组肠道菌群中地愉皂巧代谢物成分
[0027]
[002引
[0029]表3模型组肠道菌群中地愉皂巧代谢物成分
[0030]
[0031 ]实施例3地愉皂巧在正常及炎症性肠病模型大鼠体内代谢研究
[0032] 步骤一：实验动物及分组:健康雄性SD大鼠 24只，分为正常组与模型组。模型组肛 口给予TNBS(100mg/kg)7天后，两组灌胃给W地愉皂巧(50mg/kg)。
[0033] 步骤二:生物样品收集:给药前采空白血浆样品，灌胃给药后化股动脉放血处死， 分别取模型组和对照组血浆于加入了肝素钢的软管中。灌胃给药，分别放入代谢笼中，收集 给药前及给药后0~2地、24~4她、48~72h、72~96h的尿液和粪便。
[0034] 步骤Ξ:生物样品处理:分别取对照组与模型组大鼠血浆20化1中，加入ImL正下醇 振荡2min，10，OOOg离屯、lOmin，取上清0.8mL，置45 °C真空离屯、浓缩装置中挥干，200化乙腊 溶解残渣，40，OOOg离屯、lOmin，扣L进样。另取20化L尿液，加入1血正下醇振荡2min，10，OOOg 离屯、lOmin，取上清0.8mL，置45°C真空离屯、浓缩装置中挥干，200化乙腊溶解残渣，40,000g 离屯、lOmin，扣L进样。粪便样品称重后，按5mL/g的比例加入超纯水研磨成混悬液。取20化1 粪混悬液，加入ImL正下醇振荡2min，10,000g离屯、lOmin，取上清0.8mL，置45°C真空离屯、浓 缩装置中挥干，200yL乙腊溶解残渣，40, OOOg离屯、lOmin，5yL进样。分析结果见表4~6。
[0035] 表4地愉皂巧在模型大鼠血浆中代谢物成分
[0036]
[0037] 表5地愉皂巧在模型组大鼠尿液中的代谢物信息
[00；3 引
[0039]表6地愉皂巧在模型组大鼠粪便中的代谢物信息
[0040]
[0041]
[0042] 实施例4地愉皂巧治疗炎症性肠病药效作用研究
[0043] 步骤一:采用MTT法检测细胞活性，用地愉总皂巧(浓度分别为10、25、50和10化g/ mL)处理RAW 264.7单核巨隧细胞后，在10、25、5〇4旨/1^浓度下地愉皂巧细胞不会出现明显 的细胞毒性反应(图1)，lOOyg/mL浓度下地愉皂巧有细胞毒性(P<0.01)。
[0044] 步骤二：LPS刺激显著上调了RAW 264.7细胞中TNF-a(P<〇. 001)、IL-6(P<0.001) 和IL-Ιβ(P<0.001)的表达。与LPS组相比，地愉皂巧剂量依赖性地下调了由WS刺激所引起 的TNF-a，比-1β和IL-6的表达升高。愉皂巧低浓度(P<0.01)、中浓度(P<0.01)和高浓度(P <0.01)能显著下调LPS诱导的RAW264.7巨隧细胞的TNF-a分泌量。地愉皂巧低浓度(P< 0.01)、中浓度(P<0.01)和高浓度(P<0.01)能显著下调LPS诱导的RAW264.7巨隧细胞的 比-1β表达。地愉皂巧高浓度(P<0.01)能显著降低LPS诱导的RAW264.7巨隧细胞的化-6表 达，见图2。
[0045] 步骤Ξ:对照组大鼠活泼，体重增长，大便正常，呈干颗粒状。模型组大鼠自主活动 减少，体重增长与对照组相比有显著性差异(P<〇.001)。不同剂量地愉皂巧治疗组不同程 度减轻大鼠体重下降趋势，低剂量组(P<0.05)、中剂量组(P<0.05)、高剂量组(P<0.05) 及阳性药组(P<〇.01)与模型组相比有差异。地愉中剂量组及阳性药组与对照组无统计学 差异。表明地愉皂巧可W缓解TNBS引起的大鼠体重减轻现象(见图3)。
[0046] 步骤四：地愉皂巧对结肠组织病理形态的影响见图4。
[0047] 正常组:结肠组织结构清楚，可见黏膜层、黏膜下层、肌层和外膜，黏膜上皮细胞无 变性、坏死和脱落，固有层见较多大肠腺，间质未见充血、水肿，无炎细胞浸润。
[004引模型组：全部结肠组织见组织病理学改变。各例黏膜上皮细胞基本完整，未见变 性、坏死和缺失。黏膜层及黏膜下层重度炎细胞浸润，一侧区域肠壁严重变窄，肠腺大量缺 失。
[0049] 治疗组:各例黏膜上皮细胞基本完整，未见变性、坏死和缺失。黏膜层及黏膜下层 中度炎细胞浸润，固有层大量肠腺呈囊性扩张，细胞被挤压变扁，部分区域黏膜下层纤维结 缔组织轻度增生
[0050] 阳性药组:全部例肠组织查见组织病理学改变。黏膜层及黏膜下层轻微炎细胞浸 润，黏膜下层疏松水肿，部分区域肠腺缺失。
[0化1 ] 步骤五:地愉皂巧对大鼠结肠组织中指标的影响包括：对MPO、SOD、MDA含量的影 响，结果如图5所示。溃瘍性结肠炎大鼠结肠组织中MPO表达明显升高(P<0.05)，各剂量治 疗组中大鼠结肠组织MPO表达不同程度降低，低剂量组(P<0.05)、中剂量组(P<0.01)、高 剂量组(P<〇.05)及阳性药组(P<0.01)与模型组相比有统计学显著性差异。造模后大鼠结 肠组织中SOD表达降低(P<0.05)，表明机体清除自由基能力下降。给予地愉皂巧治疗后， SOD表达有恢复到正常水平的趋势。造模后大鼠 MDA表达量明显增多（P<0.05) dMDA是过氧 化反应的产物，具有细胞毒性。它与脂质作用并发生过氧化反应，会导致蛋白质、核酸等生 命大分子的交联聚合。地愉皂巧治疗后MDA有恢复到正常的趋势。
【主权项】
1. 地榆皂苷提取物中含有复杂的皂苷类成分，主要为乌苏烷型和齐墩果烷型皂苷，其 中含量较高的成分为地榆皂苷I和地榆皂苷II。2. 如权利要求1所述的地榆皂苷提取物，其特征在于:在大鼠体内外发生I相，II相和脱 糖基代谢。3. 如权利要求1所述的地榆皂苷提取物，其特征在于:对炎症性肠病的治疗作用。
【文档编号】A61K31/7048GK105920137SQ201610397150
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】梁艳, 王广基, 肖竞成, 李昔诺, 付涵煦, 邵宇皓, 李昊丰
【申请人】中国药科大学