性甾体前体单独或与选择性雌激素受体调节剂联合用于预防和治疗绝经后女性的性功能障碍的制作方法
【专利摘要】治疗或降低包括人在内的温血易感动物获得阴道功能障碍的新的方法，特别是阴道干燥和性交困难，导致行功能障碍和低性欲和性能，包括给予性甾体前体。进一步给予雌激素或选择性雌激素受体调节剂，特别是选自雷洛昔芬、阿佐昔芬、他莫昔芬、屈洛昔芬、托瑞米芬、lodoxifene、GW 5638、TSE?424、ERA?923和拉索昔芬，更加特别的是具有通式(I)结构的化合物：明确地公开了式(I)用于医学治疗和/或抑制上述一些疾病的发展。还公开了用于递送活性成分的药物组合物和对本发明有用的药盒。
【专利说明】性甾体前体单独或与选择性雌激素受体调节剂联合用于预防 和治疗绝经后女性的性功能障碍 本申请是以下申请的分案申请：申请日：2005年10月20日；申请号：200580043744.0 (PCT/CA2005/001612);发明名称：同上。 发明的技术领域
[0001] 本发明涉及单独使用性留体前体或以新的联合疗法在包括人在内的易感温血动 物中治疗或降低获得影响阴道固有层或肌层的问题的可能性的方法。特别是，联合治疗包 括给予选择性雌激素受体调节剂(SERM)和提高患者的性留体前体的水平，所述前体选自脱 氢表雄甾酮(DHEA)、硫酸脱氢表雄酮(DHEA-S)、和雄甾-5-烯-3β，17β-二醇（5-二醇）。也可 给予雌激素以抵消（conteract)-些SERMs对热潮红和其它绝经期症状的潜在作用。还可给 予5型cGMP磷酸二酯酶抑制剂来改善性功能。本发明还涉及实施前述联合的药盒和药物组 合物。
[0002] 在US 5，843，932中，报导了在卵巢切除的大鼠背部皮肤的2cm2面积上以50 %乙 醇-50%丙二醇溶液形式以每天两次30mg的剂量用DHEA治疗1、3或6个月对阴道萎缩的影 响。病理组织学检查显示，用DHEA治疗的大鼠阴道上皮增生和粘液化，并且阴道粘膜萎缩逆 转。
[0003] 用大鼠进行的研究，当将DHEA应用到背部皮肤1、3和6个月仅检查了对阴道上皮的 作用（Sour la等人，1998,J.Steroid BiochemMol Biol.，66(3) :137-149)，而没有检查另 外两层，即固有层和肌层。然后观察到DHEA在阴道上皮局部应用的效果是在远离阴道的部 位皮肤上施用效果的大约10倍，因此需要全身吸收以发挥其作用。
[0004] 在先前以10%DHEA乳膏在绝经后女性皮肤上给药12个月对DHEA作用的研究中，仅 仅评价了DHEA的雌激素活性（Labrie等人，1997, J.Clin.Endocrinol .Metab·，82 :3498-3505)。其中指出（第3500页）〃阴道细胞学作为DHEA的雌激素作用的特定参数检查〃。这是由 于评价的方法，即限于浅表和易移动的上皮细胞的阴道涂片。
[0005] 本发明描述了DHEA和其它成分对阴道的三个层的作用，即肌层、固有层和上皮层， 在这三个水平上都具有新的益处。认为DHEA对固有层和肌层的有益效果对于5型cGMP磷酸 二酯酶抑制剂的积极作用来说是极其重要的，所述5型cGMP磷酸二酯酶抑制剂例如是万艾 可和其它化合物或前列腺素 E1。 相关技术的背景
[0006] 阴道干燥影响大约50%的50到60岁的绝经后女性和72%的70岁以上的绝经后女 性(Rossin-Amar，2000，Gynecol Obstet Fertil，28(3): 245-249)。在这些女性当中，大约 80%经历过泌尿生殖器病症，尤其是阴道炎和性交困难(Pandit and 0uslander，1997，AmJ Med Sci，314(4):228-31 )。因为这些问题被认为至少部分与性留体丧失相关，因此在绝经 期要考虑进行适当的局部激素替代疗法。近来已经认识到绝经后女性不仅丧失所有的卵巢 雌激素而且她们还逐渐丧失雄激素，这些雄激素源自于外周胞分泌脱氢表雄留酮(DHEA)转 变的雄激素和雌激素(Labrie等人，1991，MoI Cell Endocrinol，'78:C113_C118;Labrie等 人，1995，Ann NY Acad Sd，774:16-28;Labrie等人，2003，End Rev，24(2):152-182)。事实 上，从30岁到40岁血清DHEA和DHEA-S 日益减少（Labrie等人，2003，End Rev，24(2) :152-182;Orentreich等人，1984，J CKn Endocrinol Metab，59:551_555;Labrie等人，1997，J Clin Endocrinol Metab，82:2396-2402)。一系列研究表明低水平的DHEA和DHEA-S与一系 列年龄相关的病态和疾病有关(Labrie等人，1997, J. Cl in. Endocrinol .Me tab.，82:3498-3505;Helzlsouer等人，1992，Cancer Res，52(1):1-4;Szathmari等人，1994，0steoporos Int,4(2)：84-88；Thoman and ffeigle,1989,Adv Immununol,46：221-261；Barrett-Connor 等人，1999，J Reprod Med，44( 12): 1012-1020 ;Barrett-Connor等人，1999，JAmGeriatr Soc，47(6):685-691)。
[0007]减轻阴道干燥和其它绝经期症状的有效途径是使用激素替代疗法（HRT ) (Greendale and Judd，1993，JAmGeriatr 3〇。，41(4):426_436;31：11(1(1等人，1980，？&861:1:〇， Paleotti and Ambrus Eds，MT Press，Lancaster，p :127-139)。然而，近来的临床研究表明 联合雌激素和孕激素增加了乳腺癌的发病率，并且对心血管疾病有潜在的消极影响 (Colditz等人，1995，N Engl J Med，332:1589-1593;Ross等人，2000，J Natl Cancer Inst，92(4) :328-332;Rossouw等人，2002, JAMA，288(3):321-333)。同时，虽然对联合的雌 激素-雄激素替代疗法的可能性的兴趣不断增加(Rosenberg等人，1997,J Reprod Med，42 (7) :394-404;Burd等人，2001，Curr Women Health Rep,1(3):202-205)，但是雌激素成分 的使用受到上述潜在并发症的限制。根据近来我们对人性留体生理学了解的进展，尤其是 在绝经后女性中（Labrie等人，1991，Mol Cell Endocrinol，78:C113-C118;Labrie等人， 2003，End Rev，24(2): 152-182)，DHEA的使用为绝经后女性提供适当水平的通过胞分泌机 制在特定组织中合成的雄激素和雌激素成为可能，且没有全身作用（Labrie等人，1997， J. Clin .Endocrinol .Me tab.，82:3498-3505:16-28; Labrie等人，2003, End Rev，24(2): 152-182;Labrie，2001，Ref Gyn Obstet，8:317-322;Lasco等人，2002，145:457-461)。阴道 功能雄激素-敏感原理的修复也应当有助于5型cGMP磷酸二酯酶抑制剂或前列腺素 El的作 用。
[0008] 选择性雌激素受体调节剂（SERM)Acolbifene(EM-652)是最初开发用于预防和治 疗乳腺癌的苯并吡喃衍生物（Gauthier等人，1997，J Med Chem，40:21 17-2122)〇 Acolbifene是所有已知化合物中对ER具有最高亲和力的化合物(Gauthier et al，1997, J Med Chem，40:2117-2122;Labrie等人，1999，J Steroid Biochem Mol Biol，69(l-6) :51-84; Tremblay等人，1997，MoI. Endocrinol.，11:353-365)，并且其在ERa和Erf上都产生了活 性(Tremblay等人，1998，Endocrinology，139:111-118)。该化合物至少在大鼠的乳腺和子 宫内膜显示了纯的和高效的抗雌激素活性，同时降低了血清胆固醇和甘油三酯并预防骨丢 失（Labrie等人，1999，J Steroid BiochemMol Biol，69(l-6):51_84)。而且，已经证明给予 DHEA，不仅不妨碍，而且在裸小鼠中产生了与纯抗雌激素 Acolbifene对人乳房肿瘤生长相 同的额外的抑制作用（Dauvo is等人，1991，Cancer Res，51:3131-3135; Luo等人，1997， Endocrinology，138:4435-4444) AHEA和Acolbifene的联合治疗已经被提出作为乳腺癌的 有益化学预防和治疗途径(Labrie，2001，Ref Gynecol Obstet，8:317-322)。事实上，DHEA 对人乳腺癌异种移植物在裸小鼠中生长的抑制作用支持了其用作激素替代疗法(Dauvois 等人，1991，Cancer Res，51:3131_3135;Couillard等人，1998，J Natl Cancer Inst，90: 772-778)。
[0009] WO 99/63974公开了选择性雌激素受体调节剂与性留体前体联合的医疗用途。 发明概述
[0010] 因此，本发明的目的是提供治疗可以导致性欲和性功能降低的阴道问题，更特别 是阴道干燥、性交困难和性功能障碍同时使不希望的副作用最小化的有效方法。
[0011] 另一目的是提供降低患上述问题的风险的方法。
[0012] 在一个实施方案中，本发明涉及治疗或降低患阴道干燥的风险的方法，包括在需 要所述治疗或所属留体前体的个体或患者中增加选自脱氢表雄留酮(DHEA)、硫酸脱氢表雄 酮(DHEA-S)和雄留-5-烯-3β，17β-二醇（5-二醇）的性留体前体的水平，且进一步包括给予 所属患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)作为联合治疗的部分。
[0013] 在另一实施方案中，本发明包括另外给予雌激素以抵消SERMs对热潮红和其它绝 经期症状的作用。
[0014] 在另一实施方案中，本发明包括另外给予5型CGMP磷酸二酯酶抑制剂或前列腺素 E1以改善性功能。
[0015] 用于本文时，选择性雌激素受体调节剂(SERM)是直接或通过其活性代谢物用作乳 房组织中的雌激素受体拮抗剂(〃抗雌激素〃)的化合物，还提供了对骨组织和血清胆固醇水 平的雌激素或雌激素-类似的作用（即通过减少血清胆固醇）。在体外或在人体或大鼠乳房 组织中用作雌激素受体拮抗剂的非留体化合物(尤其是如果该化合物用作人乳腺癌细胞的 抗雌激素)可能用作SERM。相反，留体抗雌激素不倾向于用作SERMs，因为它们对血清胆固醇 并不易于显示任何有益作用。我们已经试验和发现用作SERMs的非甾体抗雌激素包括EM-800、EM-01538、雷洛昔芬、他莫昔芬、屈洛昔芬、托瑞米芬、艾多昔芬、TSE-424、ERA-923、拉 索昔芬(CP 336156)、阿佐昔芬(LY353381)和GW-5638。我们已经试验了甾体抗雌激素 ICI 182,780且发现不能用作SERM。根据本发明SERMs可以与这些化合物用作抗雌激素时本领域 已知的相同剂量给予。
[0016] 不打算受理论的束缚，认为SERMs，其中的许多，优选，具有被1到2个碳原子连接的 两个芳环，被预期与雌激素受体相互影响，因为分子前面的部分被该受体最佳地识别。优选 的SERMs具有侧链，其可选择性在乳房组织中引起拮抗性质而在其它组织中没有显著拮抗 性质。因此，这些SERMs可如愿地在乳房中用作抗雌激素，同时令人惊奇地和如愿地在骨组 织和对血液成分(脂质和/或胆固醇的浓度被有利的影响）用作雌激素(或提供雌激素样作 用）。对胆固醇和/或脂质的有利作用有可能地转变为对动脉粥样硬化的有利作用，已知动 脉粥样硬化被胆固醇和脂质的不正当水平不利地影响。
[0017] 在另一实施方案中，本发明包括方法、药物组合物和药盒，其中的选择性雌激素受 体调节剂具有有下述特征的分子式： a) 被1到2个lto 2插入碳原子间隔的2个芳环，两个芳环未被取代或者被羟基或在体 内转变为羟基的基团取代； b) 具有芳环和叔胺官能团或其盐的侧链。 优选侧链选自：
[0018] 还优选2个芳环都是苯基，且侧链具有选自次甲基、亚甲基、-CO、-0-和-S-、芳环和 叔胺官能团或其盐的部分。
[0019] 在另一实施方案中，选择性雌激素受体调节剂选自苯并噻吩衍生物、三苯乙烯衍 生物、吲哚衍生物、苯并吡喃衍生物、5，6,7，8_四氢萘和苯并二氢吡喃衍生物。
[0020] 在一个实施方案中，优选的是选择性雌激素受体调节剂为下式的苯并噻吩衍生的 化合物：
其中办和办独立地选自：氢、羟基、和在体内转变为羟基的部分； 其中R3和R4独立地选自：C1-C4烷基，或者其中的R3、R4和它们结合的氮，一起为选自吡 咯烷并、二甲基-1-吡咯烷子基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亚甲基亚氨基 (hexamethyleneimino)和吗啉代的任何结构； 其中 A选自-CO-、-CH0H和-CH2-; 其中B选自次苯基、吡啶亚基(pyr idy 1 idene)和-环C4H2N2-。 特别地，选择性雌激素受体调节剂选自雷洛昔芬、阿佐昔芬(LY 353381)和LY 335563。
[0021] 在另一实施方案中，优选的是选择性雌激素受体调节剂为下式的三苯乙烯衍生的 化合物：
其中D是-0CH2CH2N(R3)R4或-CH = CH-COOH(R3和R4都独立地选自C1-C4烷基，或者R3、R4 和它们结合的氮原子一起为选自吡咯烷并、二甲基-1-吡咯烷并、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子 基、六亚甲基亚氨基和吗啉代的环状结构）； 其中E和K独立地是氢或羟基； 其中J是氢或卤素。 特别地，选择性雌激素受体调节剂是他莫昔芬、0H-他莫昔芬、屈洛昔芬、托瑞米芬、 Iodoxifene和GW 5638。
[0022]在另一实施方案中，优选的是选择性雌激素受体调节剂为下式的吲哚衍生的化合 物：
其中 D选自-OCH2CH2N(R?) Rs、-CH=CH-CO N(R?) Rs、-CC-(CH2) n-N(R?) Rs (R7和Rs都独立地 选自&-C6烷基、或R7、R8和它们结合的氮原子一起为选自吡咯烷并、二甲基-1-吡咯烷子基、 甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亚甲基亚氨基、吗啉代、环的环状结构）； 其中X选自：氢和C1-C6烷基； 其中Ri、R2、R3、R4、Rs和R6独立地选自：氢、羟基、Ci-Cs烷基、和在体内转变为羟基的部 分。 特别地，选择性雌激素受体调节剂是TSE-424和ERA-923。
[0023]在另一实施方案中，优选的是选择性雌激素受体调节剂是下式的化合物：
其中办和办独立地选自：氢、羟基、和在体内转变为羟基的部分； 其中R#PR6独立地是氢或&-C6烷基； 其中D是-0CH2CH2N(R3)R4(R3和R 4都独立地选自&-C4烷基，或者R3、R4和它们结合的氮原 子一起为选自吡咯烷并、二甲基-1-吡咯烷子基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亚甲基亚 氨基、吗啉代的环状结构）。 其中X选自-0-和-CH2-。 特别地，化合物选自：顺式-(5R，6S)-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基乙氧基）苯 基]_5,6,7,8_四氢萘-2-醇，D-(-)_酒石酸盐(拉索昔芬）和(3,4-反式-2,2-二甲基-3-苯 基-4-[4-(2-(2-(吡略烧-1-基）乙氧基)苯基)-7_甲氧基色满]。
[0024]在另一实施方案中，优选的是选择性雌激素受体调节剂具有下式结构：
其中办和办独立地是氢、羟基或在体内转变为羟基的部分； 其中Z是二价封闭部分，特别地，Z选自-0-、-NH-、-S-和-CH2-; 其中R100是通过4-10个插入原子将L隔离B环的二价部分； 其中L是选自-SO-、-CON-、-N〈和-SON〈的二价或三价极性部分； 其中Gi选自氢、&到(：5的烃或连接G#PL以形成5-到7-元杂环的二价部分、和卤素或前 述基团的不饱和衍生物。 其中G2不存在或选自氢、&到(：5的烃或连接GjPL以形成5-到7-元杂环的二价部分、和 卤素或前述基团的不饱和衍生物； 其中G3选自氢、甲基和乙基。 更特别的是，优选下述通式结构的苯并吡喃衍生物：
其中D是-0CH2CH2N(R3)R4(R3和R 4都独立地选自&-C4烷基，或R3、R4和它们结合的氮原子 一起为选自吡咯烷并、二甲基-1-吡咯烷子基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亚甲基亚氨 基、吗啉代、环的环状结构）。 其中办和办独立地选自：氢、羟基、和在体内转变为羟基的部分。
[0025]还优选的是苯并吡喃衍生物是在碳2上具有绝对构型S的旋光性化合物或其药学 可接受的盐，所述化合物具有下述分子结构：
其中RjPR2独立地选自羟基和在体内转变为羟基的部分； 其中R3是选自饱和的、不饱和的或取代的吡咯烷基，饱和的、不饱和的或取代的哌啶子 基，饱和的、不饱和的或取代的哌啶基，饱和的、不饱和的或取代的吗啉代，含氮环状部分， 含氮多环部分和NRaRb (Ra和Rb独立地是氢、直连或支链&-C6烷基、直连或支链C2-C6链烯基 和直连或支链C 2-C6炔基）。
[0026]在一个实施方案中，苯并吡喃衍生物是选自乙酸、已二酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑 磺酸、柠檬酸、富马酸、氢碘酸、氢溴酸、盐酸、双氢氯噻嗪酸、羟萘甲酸、乳酸、马来酸、甲磺 酸、甲基硫酸、1，5-萘二磺酸、硝酸、棕榈酸、三甲基醋酸、磷酸、丙酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、 对苯二甲酸、对-甲苯磺酸和戊酸的酸的盐。
[0027]优选的选择性雌激素受体调节剂是： Acolbifene
雷洛昔芬、阿佐昔芬、他莫昔芬、屈洛昔芬、托瑞米芬、Iodoxifene、GW 5638、TSE-424、 ERA-923和拉索昔芬。 附图的简要说明
[0028]图1表示从外口（阴道口）（第1节段)到子宫水平(第7节段）（阴道部子宫），沿着大 鼠阴道的纵轴分成7个横节段。
[0029]图2表示9组大鼠第5节段的阴道上皮组织形态学。Bar in(J)，40μπι。 (Α)作为雌激素作用的典型，动情期周期大鼠的复层鳞状上皮由四个主要的层组成：1 个细胞层的基底层(b)，6到7个细胞层的棘层(s)和5到6层颗粒层(g)覆盖角质层(c)形成紧 密填充的扁平角质化细胞。 (B) 用受雌激素-妊娠前影响的发情前期的周期大鼠举例说明粘液化。在大多数第2到7 节段，1层基底细胞层(b)被5到6个细胞层的棘层(s)覆盖，底层粘液化(m)包括3-4层粘液细 胞。 (C) 在0VX对照中，基底细胞层(b)被1层萎缩立方细胞(a)覆盖。 (D) 用日口服剂量的Acolbifene治疗0VX大鼠的阴道上皮，（2.5mg/kg)显示萎缩，而外 层低柱状粘液细胞(m)覆盖着基底细胞层(b)。 (E) 用日口服剂量的倍美力(0.5mg/kg)治疗的OVX大鼠的阴道上皮。与动情期发现的相 比，OVX-诱导的萎缩被雌激素模式代替。 (F) 在接受倍美力-Acolbifene的OVX动物中，尽管观察到了较大的粘液细胞，与 Aco lb if ene-治疗的动物的形态学相似，萎缩占优势。 (G) 接着在2X2cm的背部皮肤上每日1次表皮应用DHEA(80mg/kg)治疗0VX动物，观察到 由3-5层的粘液细胞(m)构成的肥大上皮覆盖着基底层(b)。一些内陷成为该上皮的特征(箭 头)。 (H) 在用DHEA+Acolbifene-治疗的动物的阴道上皮的大多数区域，粘液细胞(m)层停留 在基底细胞层(b)，尽管在许多区域，许多层粘液细胞覆盖着基底细胞层。一些内陷成为该 上皮的特征(箭头）。 (I) 用DHEA+倍美力治疗在3只动物中导致混合上皮，该混合上皮由被3-5层粘液细胞 (m)覆盖的3到7个细胞层-厚复层鳞状上皮(s)组成。在2只动物中，复层鳞状上皮的区域是 主要的（插入） DBar in insert，30μηι〇 (J) 当联合DHEA、倍美力和Acolbifene时，上皮与DHEA+Acolbifene组的相似。
[0030] 图3表示0VX动物的阴道粘膜，在(A)中，显示了以伴随上皮内微脓肿(M)的病灶白 细胞浸润为特征的严重炎症变换和，在(B)中，显示了以上皮厚度减少和作为上皮完全消失 显现的溃疡为特征的病灶腐蚀。
[0031] 图4显示了Acolbifene对阴道上皮内层第1节段(外部开放)的雌激素样作用，相关 组进行比较。在动情期未受损大鼠 (A)和倍美力-治疗的动物(D)中，上皮为10-15层的厚度 且角质化，在0VX对照组(B)中，上皮厚度减少到4-6层，并且没有角质化(没有看见颗粒层）， 而在Acolbifene-治疗的动物(C)中，厚度恢复到9-11层，且角质化。
[0032]图5显示了单独或联合用DHEA、倍美力和Acolbifene治疗0VX动物36周厚，大鼠阴 道第5节段水平上三个不同阴道间隔的厚度(ym):a)上皮，b)固有层，c)肌层和d)总厚度。增 加动情期和动情前期正常无伤动物作为参考对照。具有相同字母的组在P〈〇.05下没有统计 学差异。
[0033]图6显示了第5节段图解的固有层胶原纤维的紧密度，如低(A)，中(B)或高(C)。 [0034]图7显示了三个阴道间隔的显微照片：（E)上皮，（L)固有层和(M)肌层，在不同的组 中，在大鼠阴道的第5节段水平强调相对肌层厚度。用条分开的3个阴道壁层表明最佳地评 价了不同组的厚度分布。A)未受损的，B)0VX，和用OAcolbifene治疗的0VX，D)倍美力，E)倍 美力+Acolbifene，F)DHEA，G)DHEA+Acolbifene，H)DHEA+倍美力，I)DHEA+倍美力 + Acolbifene。
[0035] 图8显示了36周后测量的0VX和单独或联合用Acolbifene、倍美力和DHEA治疗的 0VX动物的阴道重量。加入未受损动物作为对照。
[0036] 图9显示了不同组中在第5节段水平上AR、ERa和PR在(E)上皮、（L)固有层和(M)肌 层中的免疫组织化学定位。这些条表示三个阴道间隔间的分离。
[0037]图10和11显示了大鼠中不同SERMs间的比较:阴道上皮形态学。
[0038]图12显示了载玻片的图象，该图象为了显示8个阴道节段的定位(整个上排和右下 角的部分），接着相应于最初解剖学位置的顺序的4个子宫节段（1节段子宫颈和2个子宫角 的3节段-每几个角2个部分）。第8节段包括邻近子宫颈开始初的侧面阴道皱褶。
[0239]图13显示了影响未受损大鼠 动情期(左栏），第4节段的阴道上皮12-18层厚，第6节段12-15层厚。 动情后期(右栏），第4节段的阴道上皮6到10细胞层，第6节段5到7层。
[0040] 图14显示了影响OVARIECTOMIZED UNTOUCHED大鼠。在第4节段，阴道被2到6细胞层 的鳞状复层上皮排列。在第6节段，观察到完全的萎缩，伴随平坦的2到3个细胞层。通过整个 阴道可以观察到一些小圆柱状粘液细胞的稀疏病灶。
[0041] 图15显示了安慰剂/栓剂的作用。与0VX未改变组相比，安慰剂组的阴道鳞状复层 上皮略微厚一些，第4节段显示4到8个细胞层。在第6节段，观察到了与0VX未改变组相同的 形态学，具有2-3个上皮细胞层。可以在阴道中发现小圆柱状粘液细胞病灶，与0VX未改变的 动物相比略多。
[0042]图16显示了DHEA 0.33mg/栓剂的作用。在第4节段，阴道上皮被3到7个细胞层分层 为磷状。大约20到60 %的阴道内层由对齐的粘液细胞和15到50 %的肥大的粘液细胞交替组 成，覆盖1层或多层鳞状复层上皮层，和非粘液化区域。在第6节段，上皮厚度减少到几乎在 0VX未改变的动物中发现的厚度:被圆柱状粘液细胞覆盖的的2-5个细胞层。在粘液细胞的 发生中观察到巨大的变化，这些细胞覆盖着5到75 %的阴道表面，与非粘液化区域交替。 [0043]图17显示了DHEA 0.66mg/栓剂的作用。在第4节段，复层鳞状上皮3到6细胞层厚。 大约5到20 %的阴道内层由对齐的粘液细胞和10到75 %的肥大的粘液细胞交替组成，覆盖 着1或多层鳞状复层上皮层。也存在非粘液化上皮区域。在第6节段，上皮厚度减少，且由2到 4个细胞层的鳞状复层上皮组成，被对齐的粘液细胞层超越。粘液化区域与非粘液化区域交 替在20到80 %的阴道表面变化。
[0044]图18显示了DHEA lmg/栓剂的作用。在第4节段，复层鳞状上皮显示了3到9个细胞 层。覆盖3到4鳞状细胞层的肥大粘液细胞覆盖了50到70%的阴道表面，同时对齐的粘液细 胞排列了 5到30%的阴道表面。非粘液化区域插在粘液化细胞中间。在第6节段，上皮厚度也 减小，且由2到4个细胞层组成。覆盖1到3个鳞状细胞层的肥大粘液细胞覆盖了大约30到 100%的阴道表面，而对齐的粘液细胞覆盖了 0到70%。还观察到了一些散开的非粘液化区 域。
[0045]图19是用DHEA(栓剂)在0VX大鼠阴道内应用14天治疗对体重影响的图表。与安慰 剂组相比，以0.33mg和0.66mg剂量给予DHEA的组的体重轻微降低，而在lmg的组中增加较显 著。
[0046]图20是将0 · 33mg、0 · 66mg或lmg阴道内应用至IjOVX大鼠后DHEA的血清浓度的图表。 当DHEA分别以0.33mg、0.66mg或lmg的剂量给予时，DHEA治疗7小时后的曲线下面积(AUC)值 是32+4ng·h/ml、50 ± 7ng·h/ml和131± 23ng·h/ml。 发明的详细描述
[0047]在绝经期卵巢分泌雌激素停止后，实际上所有的雄激素和雌激素都是通过胞分泌 机制由肾上腺起源的脱氢表雄留酮(DHEA)在外周靶组织中合成的。事实上，在卵巢雌激素 的缺失中，血清DHEA的逐渐降低似乎在常与绝经期相关的阴道干燥、炎症、性交困难和性功 能障碍中起重要作用。为了评价潜在的新的激素替代疗法的特定的雌激素和/或雄激素作 用，该激素替代疗法在其它有益效果中可减轻阴道干燥，我们检查了卵巢切除(〇VX)8个月 后大鼠阴道的生态学和以单独给药或联合的形式用DHEA，结合雌激素(倍美力)和选择性雌 激素受体调节剂Acolbifene治疗OVX动物。在动情期未受损动物和用倍美力治疗的OVX大鼠 中，典型的阴道雌激素模式是角质化的复层鳞状上皮。0VX导致了与炎症相关的普遍萎缩， 而Acolbifene降低了炎症发病率且增加了阴道上皮中粘液细胞的数量和大小。在使用的剂 量上，倍美力完全逆转了 0VX-诱导的上皮萎缩，而DHEA部分逆转了萎缩。事实上，用DHEA治 疗的0VX动物的阴道上皮变成了增生3-5层柱状粘液和杯状细胞典型的雄激素作用。将倍美 力加入到DHEA中导致了上皮厚于未受损动物。而且，DHEA增加了固有层中胶原纤维的紧密 度。另一方面，单独用Acolbifene治疗显示了增加固有层厚度的倾向，当与DHEA联合是达到 了未受损动物的数值。
[0048] 0VX之后，阴道肌层减少了46%，通过DHEA和倍美力逆转的作用分别是41 %和 100%。在另一方面，0VX后阴道壁厚度降低50%，通过DHEA和倍美力分别逆转42%和93%， 而DHEA和Acolbifene的联合将总阴道壁厚度逆转到了与未受损对照动物没有显著差异的 值。
[0049]免疫组织化学在所有DHEA治疗组中显示了强的雄激素受体(AR)标记。在另一方 面，在任何Acolbifene治疗组中没有检测到雌激素受体a(ERc〇和黄体酮受体(PR)标记。
[0050] 因此，用DHEA或联合DHEA和Acolbifene治疗通过主要的雄激素作用部分或完全地 阻止了在阴道壁的各层中观察到的0VX-诱导的萎缩改变，如通过上皮粘液化和AR增量调节 所显示的。本发明的数据也显示了DHEA对三层阴道壁特别令人关注的作用，即高度粘液化 的上皮，固有层中胶原纤维紧密度的增加和肌层厚度的增加。因此，DHEA对阴道粘膜发挥了 雄激素和雌激素作用，从而进一步提供了生理学替代疗法。虽然被检查的每个化合物都具 有对阴道功能的潜在有益效果，单独的DHEA或与其联合可缓解阴道干燥和恢复总体阴道 生理学和帮助纠正与绝经期相关的性功能障碍。DHEA和其它成分可局部或全身施用。
[0051] 本发明的选择性雌激素受体调节剂具有有下述特征的分子式:a)被1到2个插入碳 原子间隔的两个芳环，两个芳环都未被取代或者被羟基或在体内转变为羟基的基团取代； 和b)具有芳环和叔胺官能团或其盐的侧链。
[0052] 本发明的一个优选的SERM是PCT/C A96/00097(W0 96/26201)中报导的EM-800。 EM-800的分子结构是：
[0053] 本发明另一优选的SERM是US 6,710,059 B1 中报导的acolbifene(EM-1538,也称 为EM-652.HC1)
是有效的抗雌激素 EM-652的盐酸盐。与EM-800相比，EM-1538合成更加安全、简单和容 易。给予EM-800或EM-1538，被认为在体内产生相同的活性化合物。
[0054]另一优选的 SERM 是拉索昔芬（CP-336，156;(-)_ 顺式-(5R，6S)-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)苯基]-5,6,7,8-四氢萘-2-醇，D-(-)_酒石酸盐）（可从Pfizer Inc.， USA获得)。
[0055]本发明其它优选的SERMs包括他莫昔芬（（Z)-2-[4-(l，2-二苯基-1-丁烯基）]-N， N-二甲基乙胺）（可从Zeneca，UK获得）、托瑞米芬（可从Orion-Farmos Pharmaceutica， Finland，or Schering-Plough获得）、屈洛昔芬和雷洛昔芬(Eli Lilly and Co.，USA)、阿 佐昔芬（LY 335563)和LY 353381(Eli Lilly and Co.，USA)、Ospemifene(FC 1271)(可从 Orion-Farmos Pharmaceutica，Finland获得）、Iodoxifene(SrnithKline Beecham，USA)、 左美洛昔芬(3,4-反式-2,2-二甲基-3-苯基-4-[4-(2-(2-(吡咯烷-1-基）乙氧基)苯基)-7-甲氧基色满](NovoNordisk，A/S，Denmark)，其公开于Shalmi等人W097/25034，W097/ 25035，TO 97/25037，TO 97/25038;和Korsgaard等人TO 97/25036中）、GW-5638(被Willson 等人，1997，Endocrinol，138(9) :3901-3911 公开）、由Aventis(France)开发的SERM 3339和 吲哚衍生物(Miller等人EP 0802183A1公开）和TSE-424和由Wyeth Ayers(USA)开发，公开 于JP 10036347中的ERA-923(American home products corporation)和公开于W0 97/ 32837中的非留体雌激素衍生物。
[0056]当需要效能时使用的任何SERM都可以使用，如制造者推荐的那些。合适的剂量在 本领域中是已知的。任何商业上可获得的其它非留体抗雌激素都可根据本发明使用。可以 使用任何具有与SERMs相似活性的化合物(例如:雷洛昔芬）。
[0057]当口服给药时，根据本发明施用的SERMs优选以0.01到10mg/kg体重每天（优选 0.05到1.0mg/kg)的剂量范围给药，对于平均体重的人来说每天10mg，尤其是每天20mg，优 选以两个相等的分剂量，或当胃肠外给药(即，肌内、皮下或经皮给药)时，以0.003到3.Omg/ 1^体重每天(优选0.015到0.311^/1]11)的剂量范围给药，对于平均体重的人来说每天1.511^， 尤其是每天3. Omg，优选为两个相等的分剂量。优选SERMs与下述药学可接受的稀释剂或载 体一起给予。
[0058]优选的5型cGMP磷酸二酯酶抑制剂是由Pfizer USA以商品名〃万艾可〃推向市场的 昔多芬、Eli Lilly USA以商品名"Cialis〃推向市场的Tadalafil、Bayer(德国）以商品名〃 Levitra 〃推向市场的伐地那非。还优选当前正在开发的5型cGMP磷酸二酯酶抑制剂:Dong-A Pharm Tech(韩国）开发的DA-8159、Merck(德国）开发的EMR-62203、Seiyaku(日本)开发的 TA-1790、Schering-Plough(美国）开发的 SCH-446132 和 Pfizer(美国）开发的 UK-371800。 [0059] 1个优选的前列腺素是由NexMed(美国）以商品名"Alprox-TD"推向市场的前列腺 素 E1。
[0060]对于本文推荐的所有剂量，主治临床医生应当监测个体患者反应，并相应调整剂 量。 本发明效力的实施例 实施例1 材料和方法 动物和处理
[0061 ]在实验开始时使用体重大约220-270g的10到12周龄的雌性Sprague-Dawley大鼠（ Cl*l:CD?(SD)Br VAF/Plus?)(Charles River Laboratory，St_Constant，Canada)。在开 始实验前，使动物适应环境条件至少一周(温度:22±3°C ;湿度:50±20% ; 12-h光照-12-h 黑暗循环，在07:15h开灯）。将动物单独圈养，它们可自由接近水和啮齿动物食物(Lab Diet 5002，Ralston Purina，St-Louis，MO)。本实验是根据在动物实验室中保护和使用实验动物 的CCAC指南进行的，该指南是由加拿大动物保护理事会(CCAC)和实验动物保护鉴定和委派 协会(AAALAC)批准的。
[0062]将总共126只雌性大鼠随机分成9组，每组14只动物，分组如下：1)未受损对照组； 2)切除卵巢对照组(0VX); 3) OVX+Aco 1 bi f ene (2 · 5mg/kg); 4) 0VX+倍美力(0 · 5mg/kg); 5) 0VX + 倍美力+Acolbifene;6)OVX+DHEA(8〇mg/kg) ;7)OVX+DHEA+Acolbifene;8)OVX+DHEA+倍美 力;9)0VX+DHEA+Ac 〇lbifene+倍美力。在研究的第一天，在异氟烷-诱导麻醉下将各组动物 (除了第1组)双侧切除卵巢(0VX)。通过口服强饲法(0.5ml/大鼠）施用作为0.4%甲基纤维 素混悬液中的倍美力和Aco 1 bif ene，同时将50 %乙醇-50 %丙二醇中的DHEA(0 · 5ml/大鼠） 局部应用到脱了毛的2 X 2cm背部皮肤上。倍美力的剂量选择对应于足以逆转0VX-引起的子 宫萎缩的最小剂量，而Acolbifene则以足以引起与0VX类似的子宫萎缩的剂量给药，在它对 倍美力-处理的0VX动物给药以后。所用的DHEA剂量使得DHEA血中浓度为70-100nm 〇l/L。在 研究的第2天开始处理，化合物每天给药一次，共给药36周。未受损对照组和0VX对照组的动 物只接受赋形剂。
[0063]最后一次给药后24小时，在异氟烷麻醉下通过腹主动脉处放血将通宵禁食的动物 处死(9只动物每组），或者通过心内灌注10%中性缓冲福尔马林将通宵禁食的动物处死(5 只动物每组）。从非灌注动物中收集阴道并称重，而从灌注动物中收集的阴道则用黑墨水在 腹侧标记，然后如下所述进行修剪。 组织学手术
[0064] 将各只灌注动物的未受损阴道后固定(post-fixed)在10%中性缓冲福尔马林中。 然后将各个阴道分成7个相等的横节段，如图1所示，常规处理，并完全包埋在同一个石蜡块 中。在石蜡块内部，将7个阴道圆柱状节段按照它们原来的解剖位置的顺序放置，并与石蜡 块表面垂直定向放置，然后在横切面上切割各节段。每只动物都切割4μπι厚的石蜡切片，并 用苏木精-曙红染色，以进行形态学检查。 组织形态测定术
[0065] 在第5节段上进行不同阴道层的测量（图1)，该第5节段大约在中间区域和阴道部 子宫（第7节段)之间的一半位置处。发现该第5节段具有典型的上皮表面和足够厚的平滑 肌。用DC-3303CCD彩色照相机（Dage-MTI，Michigan City，IN，USA)拍照，并用Image-Pro Plus 3.0软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD，USA)进行定量。如此，使用 X5物镜 (Leica Microsystems，Willowdale，Ont ·，Canada)，从上皮层和肌层的典型区域中得到了 每层3-4个厚度的测量结果，和3个阴道层总共的测量结果。如此测量总的阴道厚度、上皮层 厚度和肌层厚度。从总的阴道厚度中减去上皮层和肌层的厚度得到固有层的厚度。 免疫组织化学
[0066] 用Zymed SP试剂盒（San Francisco，CA)进行免疫染色。在甲醇中使石錯切片(4μ m)脱石蜡，并通过乙醇再水合。用3%Η2〇2的甲醇溶液预培养30min消除内源性过氧化物酶活 性。应用采用梓檬酸盐缓冲液的微波回收技术(microwave retrieval technique) (Tacha and Chen，1994)。载玻片冷却以后，用10%山羊血清阻断非特异性结合20min。然后在室温 下分别用 1:200、1:250和 1:250浓度的ERa (AB-1，Calbiochem，Cal ifornia)、AR(N-20，Santa Cruz Biotechnology，California)或PR(Ab_4，NeoMarkers，California)抗体培养切片 1.5h。在PBS缓冲液中清洗以后，用生物素化的抗家兔二次抗体培养各切片1 Omin，此后用链 霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶再培养l〇min。将二氨基联苯用作色原体使生物素/链霉菌 抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物在显微镜监测下显影。用#2Gill's苏木精复染30秒。为了 对照，用培养抗体的过量的肽进行免疫吸附法，或用非免疫家兔IgG来代替。如表2所示进行 免疫染色过的细胞核的数量和强度的半定量评价。 表1.7个大鼠阴道节段中的上皮层、固有层和肌层的组织学评价
E =上皮形态:KS(角化复层鳞状），LHM(大的肥大粘液细胞)， SCM(小的对齐的柱状或立方粘液细胞），MSM(被粘液细胞混合复层鳞状覆盖）， A (萎缩:小的立方细胞）。 对于给定节段的两种不同的缩写表示两种不同的模式，第一种是主要的。 'L=固有层厚度:T(厚），MT(中等厚），t(薄）；'胶原纤维的紧密程度:H(高），M(中），L (低）； M=肌层厚度:T(厚），MT(中等厚），t(薄），s(不足）。 表2.在大鼠阴道第5节段的上皮层、固有层和肌层中免疫染色过的细胞核的AR、Era和 PR的数量和强度的半定量评价。
-雄激素受体(AR)，雌激素受体a(ERa)，黄体酮受体(PR)，上皮层(E)，固有层(L)，肌层 (M)〇 -代表标记细胞核的半定量评价数字:0 =无，1 =低，2 =中，3 =高 _标记强度表不为:低+，中++，和尚+++ 统计分析
[0067]数据表示为每组8-9只动物的阴道重量的平均数土SEM或每组5只动物的阴道层厚 度测定的平均数土 SEM。根据Duncan-Kramer的多范围检验测定统计学显著性(Kramer， 1956，Biometrics，12:307-310)。 结果 大鼠阴道各层的形态学和厚度
[0068]为了精确详细的检查大鼠阴道壁的三个层，也就是上皮层、固有层和肌层，首先检 查沿着纵轴获得的7个节段（图1)。虽然在各组之间观察到了显著的形态差异，但是一般而 言，在同一组的所有动物中差异是一致的，并且第2、3、4、5、6和7节段已经显示出了相似的 上皮形态。观察到的极少数例外的情况将在后面提及。因此将第5节段用于举例说明各种处 理对阴道上皮的影响。
[0069]在0VX组中，卵巢刺激的缺乏导致阴道上皮萎缩，其特征在于所有节段（表1和图 2C)都存在一些小的粘液细胞区域。最重要的是，经常发现伴随着上皮内微脓肿的很多病灶 集中点（上皮组织内成团的白细胞的小区域)的中度到重度炎症。这些改变经常伴随着病灶 侵蚀(上皮层部分消失的区域)和溃疡(上皮层完全消失）（图3)。
[0070] 在用Acolbifene处理的0VX动物中，第1节段显示出了与未受损组类似的角化复层 鳞状上皮，除了它包括9-11个细胞层以外，而相比较的是，在动情期动物中或当0VX动物接 受倍美力时，是10-15层（图4)。因此，经Acolbifene处理的动物第1节段的上皮厚度高于0VX 大鼠，它只含有4-6个细胞层。在其它节段中（表1)，基底层被低柱状粘液细胞层所覆盖（图 2D)，后者比0VX动物发育得更多。在OVX+Acolbifene组中，在5只动物中只有3只显示出了最 小炎症的迹象，而在所有的0VX动物中普遍发现了中度到重度的炎症改变。
[0071] 在所有的组中，第1节段显示出了类似的复层鳞状上皮，除了在0VX组的动物中，在 该组中，萎缩是主要的特征（图4)。而且，在0VX+DHEA和OVX+DHEA+Acolbifene组中，粘液细 胞经常伴随着第1节段的占优势的复层鳞状上皮(未显示）。
[0072]接受DHEA的0VX动物阴道上皮的7个节段由大型多层柱状粘液细胞组成，该细胞具 有扩张的细胞质液泡，这是雄性作用的典型特征(表1，图2G)。多个大型内陷具有DHEA处理 后的上皮的特征。在〇VX+DHEA+Acolbifene组的所有节段中发现了类似的上皮形态，除了粘 液细胞的大小和它们的层数增多了以外（表1，图2H)。在DHEA+倍美力处理的动物中，从第2 节段到第5节段观察到了由被多层粘液细胞覆盖的不同比例鳞状上皮组成的〃混合〃类型的 厚复层上皮(表1，图21)，从而揭示了联合的雌激素作用和雄激素作用。在该组中，3只动物 在上述节段上显示出了粘液化，而在另外2只动物中，在所有节段中均观察到了复层鳞状上 皮(表1)。当倍美力与DHEA和Acolbifene联合时，上皮就类似于DHEA+Acolbifene组，从而说 明了雌激素引起的鳞状细胞增殖被Acolbifene阻断(表1和图2J)。
[0073] DHEA向0VX动物给药将阴道上皮的厚度增加到了38±4μπι，而Acolbifene向DHEA的 加入并没有改变上皮厚度，它仍旧保持在37 ± 5μπι。当倍美力和DHEA联合对0VX动物给药时， 观察到了 84±6μπι的极大的厚度，这个值与单独接受倍美力的动物组的值没有显著区别。最 后，倍美力、DHEA和Acolbifene的联用导致了32±3μπι-厚的上皮，这个值与单独接受DHEA的 组或接受DHEA与Acolbifene联用的组的值类似。 固有层
[0074]将阴道内胶原纤维的紧密程度分为低度、中度和高度（图6)，如在接近上皮的地方 所观察到的。《低度》和《中度紧密》分别与松弛地或较不松弛地聚集在一起的粗胶原纤维的 存在有关，而《高度紧密》是用于描述紧密填充的精细胶原纤维的术语，这样的胶原纤维显 示出了光滑的有织纹的外观。在所有的动物中，相对于胶原的量存在有相对较少比例的纤 维细胞，它们主要表现为鳞状和萎缩。
[0075]仔细检查每只动物(表1)发现，一般而言，第1节段中胶原纤维的紧密程度是中度 (除了在动情期大鼠和倍美力-处理的0VX动物中它是低的，或在0VX大鼠和DHEA-处理的0VX 大鼠中它是高的），而在第2和3节段中紧密程度增大至达到平台，一般保持不变直至第7节 段。因此，沿着动情期未受损大鼠阴道的纵轴，胶原纤维的紧密程度在第1-3节段中是低的， 在第4-7节段中是高的。萎缩经常与0VX组和OVX+Acolbifene组中胶原纤维的紧密程度增加 有关(表1)。在倍美力-处理的0VX动物中，第1节段的紧密程度是低的，第2和3节段是中度， 而在其他节段中，胶原纤维的紧密程度逐渐增大，在第6和7节段变得最大。
[0076]沿着阴道的固有层厚度的可见光学显微镜检查普遍揭示了第1节段是中等厚度， 而在第2-4节段中较厚。在第5-7节段中，厚度渐进地增大到与第1节段相似的水平。在第5节 段中测量到的固有层厚度的对应平均值（图5B)表明，0VX导致固有层厚度显著增大(在未受 损组中是76±2μηι对135±28μηι)，而Acolbifene引起了非显著的减小(60±8μηι)。在0VX动物 中在倍美力或倍美力+Acolbifene给药以后观察到的增加维持在低于未受损组的水平（100 ±9μπι和90+3μπι，分别相对于135±28以111)。0册六的给药也导致了固有层厚度的统计学非显著 的增加(96 ±20μηι)，并且Acolbifene的加入导致了厚度进一步增加（136 ± 17μηι)，达到了未 受损动物的水平。用倍美力+DHEA处理0VX动物显著增大了厚度（144± 14μπι)，当与单独DHEA 给药相比时。最后，用倍美力+DHEA+Ac〇lbifene处理的动物显示出厚度(99±9μπι)类似于 单独用DHEA处理的组，并且低于倍美力+DHEA组，虽然这种差别在统计学上并不显著。
[0077] DHEA导致肌层厚度中度增加(50±2μπι)，通过加入Acolbifene该厚度稍微减小(41 ±3μπι)。最后，用倍美力和DHEA联合处理导致厚度显著增加（62±3μπι)，当与单独用DHEA处 理的动物相比时。当把Acolbifene加入到倍美力和DHEA中时，肌层厚度减小(46±5yg)至与 DHEA和Acolbifene给药相当的数值。
[0078]当测量总阴道壁厚度时（图5D)，构成外膜的结缔组织的外部薄层没有被包括在 内。0VX导致了显著的（51 % )阴道壁萎缩（128±3μπι，相对于未受损动物的262±39μπι)，并且 Acolbifene加入到0VX没有作用（108±8μπι)(图7Α、Β和C)。倍美力处理将总厚度维持在与未 受损动物相似的数值上（253 ±10μπι)，而Acolbifene向倍美力中加入则逆转了倍美力的作 用（150±4μπι)(分别是图70和EhDHEA处理所达到的总阴道厚度（184±21μπι)比倍美力单独 处理组低大约25% (图7F)。另一方面，Acolbifene加入到DHEA导致了非显著的厚度增加 (213±20μπι)，这种增加非显著地区别于未受损组（图7G)。最后，倍美力和DHEA对0VX动物联 合给药将厚度（290±13μπι)显著增加至与未受损动物相似的数值（图THhAcolbifene向 DHEA和倍美力的加入将数值（176 ± 1 Ιμπι)逆转到与DHEA单独给药没有显著区别的程度（图 71)。 阴道重量
[0079] 处理了 8个月以后，在不同组之间观察到的阴道重量的改变（图8)通常随着上述形 态学观察而出现。的确，0VX以后阴道重量减小了大约50 % (101 ± 5mg)，与未受损组相比 (205±llmg)，而用Acolbifene单独处理0VX动物对于阴道重量却没有影响。另一方面，倍美 力给药导致了阴道重量增加，但仍然没有达到未受损动物的数值水平（170±9mg)，而 Acolbifene加入到倍美力中则将雌激素-引起的重量增加逆转至与0VX动物类似的数值水 平(96±4mg)。相反，当DHEA对OVX动物给药时，阴道重量增加至与倍美力-处理组类似的数 值水平（171±12mg)，并且Acolbifene和DHEA的联用导致了重量减小（135±9mg)，该数值仍 然高于0VX组。最后，倍美力和DHEA对0VX动物联合给药导致阴道重量增加（179 ± 10mg)达到 了与0VX+DHEA组和0VX+倍美力组类似的数值。Acolbifene向该联用的加入没有显著影响 (194± 12mg)。
[0080] 0VX动物的DHEA处理导致三个阴道层很多细胞核的强烈标记或AR，这是当采用 DHEA+Acolbifene联用和DHEA+倍美力联用时所发现的相同的模式，而后一组上皮浅层中较 少数量的标记细胞核则除外。DHEA、倍美力和Aco 1 b i fene的联合也导致了三个阴道壁层大 部分细胞核的强染色。 讨论
[0081] 阴道干燥或萎缩性阴道炎，也被称为泌尿生殖器萎缩，连同性功能障碍是绝经后 女性的常见问题(Notelovitz，2000，Menopause，7(3) :140-142)。最常见的症状是干燥、灼 热、搔痒、刺激和性交困难，从而导致性欲降低和生活质量下降（Berman等人，1999，Curr Opin Urol，9(6) :563-568)。由于已知存在雌激素丧失，因此雌激素替代疗法(ERT)和HRT是 治疗的选择。然而，由于对女性性留体生理学的新的信息强烈建议了雄激素的重要作用 (Labrie等人，2003，End Rev，24(2) :152-182)，因此本研究比较了HRT或ERT的备选方案的 全身激素作用，也就是DHEA单独或与纯抗雌激素 Acolbifene联合，以及与倍美力一起对大 鼠阴道形态和性留体受体表达的影响。DHEA经皮给药避免了通过肝脏的首过效应(Labrie 等人，1996，Endocrinol，150: S107-S118)。
[0082]最后，我们的结果显示出了用倍美力处理有显著的阴道重量增加，当与0VX动物相 比时，该值类似于在DHEA-处理组中观察到的值。适当的回顾如下，虽然啮齿动物阴道和子 宫重量增加通常被用作动情力的衡量标准，然而在其它化合物中，这些器官也可以响应黄 体酮和睾酮（Emmens and Martin，1964，Dorfman Ed，Ed Academic Press ΝΥ:1)〇 [0083]在可能的三联组合中，马雌激素倍美力的目标是作用于脑以缓解血管舒缩症状。 事实上，纯选择性抗雌激素 Acolbifene与雌激素联合给药以中和雌激素不希望出现的外周 效应的益处已经由Labrie等人充分描述了（Labrie等人，2003，Endocrinol，144(11) :4700-4706)。在本研究中，当Acolbifene对0VX动物施用时，由SERM引起的最典型的形态学特征是 覆盖基底细胞层的壁对齐的小粘液细胞浅层的出现，这是在倍美力-Acolbifene组中略微 更显著的模式，这种模式在用Acolbifene处理的所有组中仍然具有优势，包括当把SERM加 入到DHEA中时。在未成年大鼠 （Anderson and Kang，1975，AmJ anat，144(2) :197-207)和成 年大鼠（Yoshida等人，1998，Cancer Lett，134(1) :43-51)中已经报道了在抗雌激素处理下 的阴道上皮粘液化。虽然已经将这种形态模式与黄体酮引起的粘液化进行了对比 (Anderson and Kang，1975，AmJ anat，144(2):197-207)，但是由抗雌激素引起的上皮粘液 化的分子机制仍然是未知的。
[0084] 已经在绝经后女性中报道了 DHEA的很多有益效果（Labrie等人，1997， J.Clin.Endocrinol .Metab.，82:3498-3505;Labrie等人，1991，Mol Cell Endocrinol，78: Cl 13-C118)。由于对DHEA特异的受体还没有被表征，所以在大鼠阴道DHEA处理以后观察到 的形态学改变反映出它胞分泌转变成通过胞分泌机制具有雄激素作用和/或雌激素作用的 活性性留体(Labrie等人，1991，Mol Cell Endocrinol，78:C113-C118)。那些改变包括强烈 的上皮粘液化、高度敏锐的紧密性、具有细微纹理的固有层胶原纤维和中度的肌层厚度都 增加了，当与OVX动物相比时。两种最先的形态学改变是典型的雄激素作用，而第三是显示 出了雌激素样活性，这从伴随着的肌层内黄体酮受体表达增加得到了进一步的支持。
[0085] 由于DHEA在外周组织中转变成了雄激素和雌激素二者之一或这二者，所以在本 研究中用DHEA处理0VX动物后观察到的稠粘液化的多层上皮表明了大鼠阴道内粘液化的占 优势的雄激素作用，这种作用可以在上皮水平掩盖任何可能的共存的少量雌激素作用。先 前的研究已经显示出了大鼠阴道内相同的粘液化作用（Sourla等人，1998, J Steroid Biochem.Mol .Biol.，66(3): 137-149)。在那项先前的研究中，阴道内应用DHEA取得了显著 的作用，其剂量比DHEA应用于背部皮肤之后产生作用所需的剂量低十倍。
[0086] 目前的数据表明在大鼠阴道内共同存在有主要的雄激素作用和次要的雌激素作 用。而且，目前的结果得到了 0VX动物阴道上皮的观察结果的很好的支持，所述动物接受同 样局部应用的DHEA，和我们的研究中所用的相比，还加上皮下剂量的抗雄激素氟他胺(FLU) (未公布的结果）。的确，由DHEA的雄激素成分产生的粘液化的雄激素作用被FLU完全逆转 了，并且产生了复层鳞状上皮，这是典型的雌激素作用(数据未显示）。如果DHEA在大鼠阴道 中具有特殊的雄激素作用(粘液化），那么这种作用将被FLU逆转，然后又会观察到与0VX动 物类似的萎缩的上皮。在性腺切除的雄性和雌性大鼠中进行的先前的研究已经清楚地证明 了 DHEA的处理会导致对前列腺、精囊和子宫产生刺激的雄激素和/或雌激素作用，这取决于 所研究的革巴组织(Labrie等人，1988，Endocrinol，123:1412-1417)。
[0087]另一方面，DHEA+Acolbifene的联合显示出了上皮粘液化程度减少，从而表现出很 好对齐的粘液细胞层一一Acolbifene作用一一和多层肥大粘液细胞内陷的交替，这对应于 DHEA的雄激素作用。因此，Acolbifene抑制DHEA的部分雌激素作用，而DHEA的主要雄激素对 应成分(counterpart)则被保留，并加入了Acolbifene的少许雌激素样作用，后者在阴道口 水平上能看得最清楚。在Acolbifene加入到DHEA之后观察到的阴道重量减少比Acolbifene 加入到倍美力之后获得的阴道重量减少要小，这说明了被抗雌激素逆转的DHEA的雌激素成 分较少，而主要的雄激素成分未受影响。另外，在DHEA+Acolbifene组中固有层厚度和胶原 纤维紧密程度的增加，当分别与0VX组和未受损动物相比较时，再次表明了雄激素在增加胶 原紧密程度和厚度方面的潜在作用，因为DHEA的雌激素成分被Acolbifene阻断了。
[0088] 其它研究已经证明了DHEA对大鼠乳腺（Sourla等人，1998，Endocrinol，139:753- 764)、皮肤皮脂腺（Sourla等人，2000,J Endocrinol，166(2) :455-462)和骨矿物质密度 (Martel等人，1998, J Endocrinol，157:433-442)的作用几乎是唯一的雄激素作用。然而， 大鼠阴道内DHEA的雌激素作用的存在先前已经在用该化合物处理过的未成熟大鼠中通过 诱导阴道开放和早熟排卵而证明过了，而DHT，一种不能芳构化成雌激素的雄激素，没有产 生这种作用（Knudsen and Mahesh，1975，Endocrinol，97(2): 458-468)。大鼠阴道组织使雄 激素尤其是Testo芳构化的能力很有可能解释DHEA在该器官中的大部分雌激素作用 (Lephart等人，1989，Biol R印rod，40(2): 259-267)。雄甾-5-烯-3β，17β-二醇（5-二醇），已 知与雌激素受体结合的一种DHEA代谢产物(Shao等人，1950,J Biol Chem，250:3095-3100; Poortman等人，1975，J Clin Endocrinol Metab，40(3):373_379;Van Doorn等人，1981， Endocrinol，108:1587_1594;Adams等人，1981，Cancer Res，41:4720-4726)，也可能促成雌 激素作用（Poulin and Labrie，1986，Cancer Res，46:4933_4937)。因此，抗雌激素 Acolbifene与DHEA的计划联用将会避免5-二醇的任何不希望的刺激作用。另一方面，通过 防止骨流失，acolbifene还将显示出额外的益处（Martel等人，2000, J Steroid BiochemMol Biol,74(1-2):45-56)〇
[0089]在我们的知识的最大范围之内，先前还没有研究显示出DHEA对固有层胶原纤维的 紧密度和形态具有刺激作用，范围缩小一些，甚至没有显示出对肌层的刺激作用。这种 DHEA-衍生的雄激素和雌激素作用对于绝经后女性的阴道功能可能会具有有益的影响，并 且将为5型磷酸二酯酶抑制剂如昔多芬或tadalafil的作用提供所需的底物，所述作用有可 能是经由雄激素或雌激素-诱导的内皮一氧化氮合酶(eN0S)_介导的促进阴道平滑肌舒张 (综述在Munarriz等人，2003，J Urol，170(2Pt 2):S40_S44，Discussion S44-S45)。事实 上，已经发现了Acolbifene引起了人类和大鼠上皮细胞的eN0S(Simoncini等人，2002， Endocrinol，143(6):2052-2061)。
[0090]在用DHEA处理的所有组中获得的结果显示，从大鼠阴道内DHEA胞分泌转化衍生的 雄激素在三个组织隔层中以类似的方式上调了 AR表达。
[0091] 伴随着雄激素对大鼠阴道AR的强烈调节所观察到的有益的形态学改变说明，绝经 后女性DHEA-衍生的雄激素的血清水平下降可能会促成这个年龄组的阴道健康下降并最终 促成性欲缺乏和性快感丧失。确实在为性欲降低寻求咨询的女性中发现了下降的血清总 Testo、游离Testo和DHEA_S(Guay and Jacobson，2002，J Sex Marital Ther，28Suppl 1: 129-142)。
[0092] 在本研究中，我们已经显示了用DHEA或用DHEA与Acolbifene的联合以及用DHEA与 Acolbifene和倍美力的联合处理0VX雌性大鼠，经由AR，通过占优势的雄激素作用，逆转了 在阴道中发现的0VX-引起的萎缩改变，这反应在强烈的上皮粘液化和固有层内胶原纤维的 紧密度增加。单独用DHEA处理也适当地增大了肌层厚度。该数据强调了从外周靶组织中的 DHEA和DHEA-S局部合成的性甾体的重要性。除了这些有益作用以外，Acolbifene还降低了 炎症的发病率，这很可能是通过阴道口的保护角质化鳞状上皮的雌激素-样诱导作用和内 部粘液化的抗雌激素作用。
[0093]已经进行了各种尝试来解决阴道干燥的问题，该问题通常与性交困难和性快感丧 失相关联。举例来说，通常开出局部阴道雌激素制剂的药方来提供缓解，但是子宫内膜可能 被非对抗性雌激素刺激(Mattson等人，1989，Maturitas，11:217-222)。在切除子宫的绝经 后女性中，ERT仍然被使用，但公知具有发展成乳腺癌的增加的风险。而且，ERT通过增加性 激素结合球蛋白而降低血浆雄激素水平，这可能会引起相对的卵巢和肾上腺雄激素缺乏， 从而为同时存在的生理雄激素替代创造了额外的理论（Casson等人，1997,0bstet Gynecol,90(6):995-998). 实施例2 方法 动物和处理
[0094] 使用切除了卵巢的体重215_265g的10到12周龄的雌性Sprague-Dawley大鼠（CrL: CD(SD)Br) (Charles River Laboratory，St-Constant，Canada)。将动物单独圈养在环境控 制室内（温度：22 ± 3°C ;湿度：50 ± 20 % ; 12-h光照-12-h黑暗循环，在07:15h开灯）。动物可 自由接近自来水和合格的啮齿动物食物（Lab Diet 5002(团粒），Ralston Purina，St- 1^〇11^，10)。本实验是在动物实验室中根据保护和使用实验动物的0^(：指南进行的，该实验 室是由加拿大动物保护理事会(CCAC)和实验动物保护鉴定和委派协会(AAALAC)批准的。 [0095] 进行不同的实验:两项20天的研究和两项8个月的研究。在这两项第一个实验的每 一个中，将动物随机分成3组，每组13或14只动物，分组如下：1)未受损对照组;2)切除卵巢 (0VX)对照组；3)0VX+雷洛昔芬（0 · 5mg/kg)，或3)0VX+LY 363381 (0 · 5mg/kg)。在第一项8个 月的研究中，将动物随机分成5组，每组7-8只动物，分组如下：1)未受损对照组;2)切除卵巢 (0VX)对照组；3)0VX+Acolbifene(0 · 5mg/kg) ;4)0VX+ERA-923(0 · 5mg/kg); 5)0VX+TSE-424 (0.5mg/kg)。在另一项8个月的研究中，将动物随机分成3组，每组10-11只动物，分组如下： 1)未受损对照组;2)切除卵巢(0VX)对照组;3)0VX+拉索昔芬(0.5mg/kg)。在研究的第一天， 将适当组的动物在异氟烷麻醉下双侧切除卵巢(0VX)。然后从研究的第1天到第20天，或者 从研究的第1天到第32周通过口服强饲法每天一次给予作为0.4%甲基纤维素混悬液 (0 · 5ml /大鼠）中的试验化合物。
[0096]最后一次给药后24小时，在异氟烷麻醉下通过放血将动物处死。收集阴道并在切 除后立即将其浸入10%中性缓冲福尔马林。然后将阴道切成7个横节段（用于Acolbifene、 ERA-923和TSE-424)，或者只将样品切成中部横节段(雷洛昔芬、拉索昔芬或LY 363381)。 然后常规处理各节段，并包埋在石蜡块中。适当的时候，将所有节段按照它们原来的解剖位 置的顺序放置在石蜡块中，并与石蜡块表面垂直定向放置，从而能在横切面上切割各节段。 每只动物都切割4μπι厚的石蜡切片，并用苏木精-曙红染色，以进行形态学检查。
[0097] 在图10和11中显示了不同SERM之间的比较:在放大率200 X下，0VX大鼠的阴道上 皮形态。图Α到D显示了阴道第1节段（阴道口）的上皮形态。虽然0VX动物的上皮是薄的（4-6 个细胞层），萎缩的，并且在A中没有显示出可见的颗粒层，但是在3个SERMs中同样的上皮却 是厚的（8-11个细胞层），并且在B、C和D中显示出了多层颗粒隔层。在E到K中，描述了位于阴 道中部的节段。在0VX动物中，E中的阴道上皮是薄的和萎缩的（2-3个细胞层），然而在所有 的处理组中该厚度却增加了（F到K)，这是由于覆盖基底细胞层的一个(Ac 〇lbifene、ERA-923和TSE-424)或多个(雷洛昔芬、拉索昔芬或LY363381)粘液细胞层的存在。 实施例3 材料和方法
[0098] 实验开始时，使用体重大约250_275g的10到12周龄的雌性Sprague-Dawley大鼠（ CD⑧.（SD)Br) (Charles River Laboratory，St-Constant，Canada)。在实验开始前使 动物适应环境条件(温度：22 ± 3°C ;湿度：50± 20% ; 12-h光照-12-h黑暗循环，在07:15h开 灯)至少一周。将动物单独圈养，并可自由接近水和啮齿动物食物(Lab Diet 5002，Ralston Purina，St-Louis，M0)。本实验是根据保护和使用实验动物的CCAC指南进行的，该指南是由 加拿大动物保护理事会(CCAC)和实验动物保护鉴定和委派协会(AAALAC)批准的。
[0099]将总共25只雌性大鼠随机分成5组，分组如下：1)3只切除卵巢的不受影响的对照 组（0VX); 2)4只0VX+安慰剂栓剂；3)6只0VX+0 · 33mg DHEA栓剂；4)6只0VX+0 · 66mg DHEA栓 剂;5)6只0VX+1.00mg DHEA栓剂。在研究的第1天，在异氟烷-诱导麻醉下将所有组的动物 都进行双侧卵巢切除(0VX)。在研究的第5天开始将一个栓剂插入阴道，并持续每天一次，直 至研究的第18天，总共处理14天。将栓剂轻轻地放在阴道开口处，然后在小光滑玻璃棒的帮 助下在阴道内小心推大约2_3mm，玻璃棒用70%乙醇消毒，并在各只动物使用之间使其干 燥。
[0100]最后一次给药后24小时，在异氟烷麻醉下通过放血将动物处死。收集阴道一一包 括尿道一一和子宫，然后如下所述进行修建。为了进行进一步的分析，抽取两片腹股沟乳腺 的样品，还抽取大约2X2cm的脱毛背部皮肤正方形片的样品，将后者放在一张卡片纸上并 轻轻地弄平。 栓剂的制备
[0101 ]用Whitepsol H-15基质制备DHEA检剂（Medisca，Montreal，Canada)。也可以使用 任何其它的亲脂性基质，如?81：1：；^386、￥6〇(^66、可可脂、可可豆油或￥11；^6。8〇1基质的其它 联合。称取适量DHEA，得到最终体积50μ1 ± 3μ1，0.33mg或0.66mg或1. OOmg每栓剂的最终浓 度。根据先前测量过的栓剂基质密度计算要称重以获得所需最终体积的栓剂基质小丸的适 当的量，是47.5mg每50μ1。将栓剂基质放入小烧杯中，以50%功率用微波熔化大约3min和 30sec，然后转移到加热板上，将其调节到最低功率，以保持栓剂基质温度为50±3°C。然后 将DHEA微粉(从Scheweizerhall Inc.得到，纯度100%) -次性全部加入基质中，在被光滑 的圆端玻璃棒小心缓慢压碎和溶解之前，让整团物质下沉并润湿3min。最后，用带有预热吸 管端的ΙΟΟΟμΙ-Gilson移液管将含有溶解的DHEA的基质(安慰剂是不含DHEA的基质)倾倒入 含有一连串50μ1-模具的管架内。这些模具是由微量离心管制成的，它们中的每一个之前都 用50μ1水标过刻度，并在水平面处拉出的水平线处切断。室温冷却30min以后，将栓剂在4 °C 下再放置30min。最后，用保险刀片修建溢出的基质，从模具中将栓剂取出，并在4°C下保存 在密封玻璃瓶中直至使用。在给动物应用之前，使它们恢复到室温。 组织学手术
[0102] 切除后立即将器官浸入10%中性缓冲福尔马林中。将各个阴道和子宫分成8个相 等的横节段和4个横节段，这4个横节段中分别包括来自子宫颈的2个节段和来自两个邻近 的角(proximal horn)和远端的角(distal horn)之一的2个节段。将这些节段常规处理，并 全部一起包埋在同一个石蜡块中。在石蜡块内部，将所有的节段按照它们原来的解剖位置 的顺序放置，并与石蜡块表面垂直定向放置，然后在横切面上切割各节段。每只动物都切割 4μπι厚的石蜡切片，并用苏木精-曙红染色，以进行形态学检查。 结果 上皮形态
[0103] 在检查了所有阴道节段以后，发现第4和6节段对于各处理组之间的比较是典型 的。第4节段最接近阴道口，它不显示出外部皮肤的特征，并且不受或最低限度地受通常在 对照动物的阴道粘膜外部区域中发现的轻度到中度炎症改变的影响。第6节段代表了较深 的阴道粘膜，是从子宫颈分离出的唯一一个节段。一般而言，与背侧相比，阴道腹侧存在较 厚的和分泌更多粘液的上皮。 未受损
[0104] 如图13所示，在动情期，阴道上皮主要受雌激素影响，较厚且角质化。这出现在第4 节段的12-18个细胞层中，和第6节段的12-15层中。与在阴道口处看到的厚复层鳞状上皮相 反，颗粒层在内部阴道上皮中并不明显。在动情后期，在最低限度激素的影响下，阴道上皮 变薄。这出现在第4节段的6-10个细胞层中，和第6节段的5-7层中。 切除卵巢的不受影响的
[0105] 如图14中所示，在第4节段中，阴道排列着2-6个细胞层的鳞状复层上皮。在动物之 间，这个节段的厚度差别很大。在第6节段中，观察到了完全的萎缩，只有2-3个扁平细胞层。 可以在这些动物的整个阴道中看到一些罕见的小柱状粘液细胞病灶集中点。在该组的3只 动物中，有2只在外部的3个节段中出现了轻度炎症改变。 安慰剂
[0106] 如图15中所示，与0VX不受影响的组相比，安慰剂组的阴道鳞状复层上皮稍微厚一 些，第4节段具有4-8个细胞层。然而在第6节段中，观察到了在0VX不受影响的组中发现的相 同的形态，即2-3个上皮细胞层。和0VX不受影响的动物一样，在整个阴道中可以发现小柱状 粘液细胞病灶集中点，当与0VX不受影响的动物相比时稍微多一些。在该组的4只动物中，3 只动物在外部的3个节段中出现了轻度炎症改变。 DHEA 0.33mg/栓剂
[0107] 如图16中所示，一般而言，在低剂量时，DHEA的形态学影响以对齐得很好的圆柱状 粘液细胞为特征，而在较高剂量时，粘液细胞扩大(肥大），形成空泡并且混乱。在本组中， DHEA的作用在第2节段中轻微可辨，在第3-4节段逐渐增加，在第3-4节段中，对齐得很好的 和肥大的粘液细胞交替存在。DHEA的作用在第5和6节段中缓慢减小，在那里几乎只能观察 到对齐得很好的粘液细胞。这种作用在第7节段中变得几乎不存在了，并且在第8节段的侧 面阴道皱褶中消失了（第8节段包括子宫颈的开始部分）。这样，在第4节段中，阴道上皮是3-7个细胞层的复层鳞状上皮。大约20到60%的阴道内层由对齐得很好的粘液细胞间隔着15 到50%的肥大粘液细胞组成，覆盖着一个或多个鳞状复层上皮层，且具有不分泌粘液的区 域。在第6节段中，上皮厚度减小至几乎与在0VX不受影响的动物中所发现的厚度一样。它由 2- 5个细胞层的鳞状复层上皮组成，被对齐得很好的粘液细胞层所覆盖。在存在的粘液细胞 中观察到了大量的变化，这些细胞覆盖了5到75%的阴道表面，间隔着不分泌粘液的区域。 在6只处理过的动物中，它们中的4只出现了轻度炎症，炎症不平坦地分布在整个阴道上。 DHEA0 · 66mg/栓剂
[0108] 如图17中所示，在这一组中，在第2节段中可辨别出DHEA的作用，在第3-4和5节段 中这种作用显著加大，在那里观察到了大部分肥大粘液细胞。肥大粘液细胞的数量在第6和 7节段中减少，在那里大部分细胞是对齐得很好的粘液细胞。因此，在第4节段中，复层鳞状 上皮是3-6个细胞层厚。大约5到20 %的阴道里层由对齐得很好的粘液细胞间隔着10到75 % 的肥大粘液细胞组成，覆盖着一个或多个鳞状复层上皮层。还存在不分泌粘液的区域。在第 6节段中，上皮厚度减小，且由2-4个细胞层的鳞状复层上皮组成，该上皮被对齐得很好的粘 液细胞层覆盖。分泌粘液的区域的数量占阴道表面的20到80%，且间隔着不分泌粘液的区 域。在6只处理过的动物中，2只动物在3个外部节段中显示出了轻度炎症。 DHEA1 · OOmg/栓剂
[0109]如图18中所示，在这一组中，DHEA的作用在第2节段中也可辨别，但这种作用在第 3- 4和5节段中显著增大，在第3-4和5节段中观察到了非常大量的肥大粘液细胞，这种作用 在第6-7和8节段中很缓慢地减小，在第6-7和8节段中观察到了非常大量的对齐得很好的粘 液细胞。因此，在第4节段中，复层鳞状上皮具有3-9个细胞层。覆在3-4个鳞状细胞层上面的 肥大粘液细胞覆盖了50-70%的阴道表面，而对齐得很好的粘液细胞则覆盖了5-30%的阴 道表面。不分泌粘液的区域分散在分泌粘液的细胞之间。在第6节段中，上皮厚度也减小了， 且由2-4个细胞层组成。覆在1-3个鳞状细胞层上面的肥大粘液细胞覆盖了大约30-100%的 阴道表面，而对齐得很好的粘液细胞则覆盖了 0-70%。还观察到了极少数散在的不分泌粘 液的区域。在6只处理过的动物中，它们中的4只在4个外部节段中出现了轻度炎症。 结论
[0110] 1.用于大鼠阴道内处理的赋形剂具有令人想要的特性： a. 在标有刻度的t吴具中很容易制备； b. 完全溶解DHEA微粉的极好的能力，从而确保标准化剂量； c. 阴道粘膜没有显著的组织反应和形态改变:在前3-4个节段中只观察到了轻微的厚 度增加，这很可能是由于插入栓剂所用的操作手法的问题。 2. DHEA以最低试验剂量(0.33mg/栓剂)对阴道上皮形态产生了影响。这种影响从第3节 段到第5节段变得最大，然后逐渐减小至在第7节段消失。 3. 在0.66mg/栓剂的DHEA剂量下，这种作用也在第3节段中存在，并在第6节段中仍然很 强。 4. 在1. OOmg/栓剂的DHEA剂量下，这种作用从第2-3节段到邻近子宫颈的深阴道皱褶处 都很强。 药物组合物实施例
[0111 ]如下所列，通过实施例的方式而非限制，是利用优选的活性SERMAcolbifene、优选 的活性性留体前体DHEA、优选的激素17β-雌二醇或倍美力、优选的5型cGMP磷酸二酯酶抑制 剂昔多芬或Tadalafil的数种药物组合物。活性成分的浓度可在本文讨论的很大范围内变 化。可包括在内的其它成分的量和类型是本领域公知的。 实施例A 片剂
用班1；^6口8〇1!1-15基质（]\16(1丨8〇&，]\1〇111^6&1，0&仙(1&)制备0]^^检剂。可使用任何其它 亲脂性基质，如?81：1：让386、￥6〇(^66、可可脂、可可豆油或￥11；^6卩8〇1基质的其它组合。 药盒实施例
[0112]如下所列，通过实施例的方式而非限制，是利用优选的活性SERMAcolbifene、优选 的活性性留体前体DHEA、优选的激素17β-雌二醇或倍美力、优选的5型cGMP磷酸二酯酶抑制 剂昔多芬或Tadalafil的数种药盒。活性成分的浓度可在本文讨论的很大范围内变化。可包 括在内的其它成分的量和类型是本领域公知的。 实施例A SERM、雌激素和5型cGMP磷酸二酯酶抑制剂口服给药，而性甾体前体局部应用或经皮给 药。 口服给药的SERM组合物(胶囊）
实施例B SERM和性留体前体口服给药 口服给药的非留体抗雌激素组合物(胶囊）
口服给药的性留体前体组合物（明胶胶囊）
[0113]在上述制剂中其它的SERMs (托瑞米芬、Ospemifene、雷洛昔芬、阿佐昔芬、拉索昔 芬、TSE-424、ERA-923、EM-800、SERM3339、GW-5638)可替换Acolbifene，其它的性甾体抑制 剂可替换DHEA，其它的雌激素可替换倍美力，其它类型的5cGMP磷酸二酯酶抑制剂或前列腺 素 E1可替换昔多芬或Tadalafil。可包括一种以上的SERM或一种以上的前体或雌激素或5型 cGMP磷酸二酯酶抑制剂，在这种情况下加起来的重量百分数优选是上述实施例中给出的单 个前体或单SERM的重量百分数。
[0114]已经以优选的实施方案和实施例的方式描述的本发明，但并不因此而受限制。本 领域的技术人员将容易地辨别出较宽的适用性和仅受专利实施方案限制的本发明的范围。 1. 治疗或降低绝经后女性获得影响阴道固有层和/或肌层的问题的可能性的方法，所 述方法包括给予有所述治疗需求的患者选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄留酮、雄留-5-烯-3 β，17β-二醇和4-雄甾烯-3，17-二酮的性甾体前体。 2. 实施方案1的方法，进一步包括作为联合治疗一部分的给予所述患者治疗有效量的 选择性雌激素受体调节剂的步骤。 3. 实施方案1或2的方法，进一步包括作为联合治疗一部分的给予所述患者治疗有效量 的雌激素的步骤。 4. 治疗或降低绝经后女性获得阴道炎症可能性的方法，所述方法包括给予所述患者治 疗有效量的选择性雌激素受体调节剂。 5. 增加绝经后女性阴道上皮中粘液细胞的数量和大小的方法，所述方法包括给予所述 患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂。 6. 实施方案1、2或3的方法，其中，阴道疾病是选自阴道干燥、性交困难和性功能障碍的 疾病。 7. 增加绝经后女性阴道壁固有层中胶原纤维的紧密度的方法，所述方法包括给予有所 述治疗需求的患者选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄留酮、雄留-5-烯-3β，17β-二醇和4-雄甾 烯-3，17-二酮的性留体前体。 8. 增加绝经后女性阴道壁肌层厚度的方法，所述方法包括给予有所述治疗需求的患者 选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄留酮、雄留-5-烯-3β，17β-二醇和4-雄留烯-3,17-二酮的性 甾体前体。 9. 治疗或降低绝经后女性获得性功能障碍的可能性的方法，所述方法包括给予有所述 治疗需求的所述患者治疗有效量的选择性雌激素受体调节剂，进一步包括作为联合治疗一 部分的给予所述患者治疗有效量的5型CGMP磷酸二酯酶抑制剂或前列腺素的步骤。 10. 实施方案9的方法，进一步包括给予所述患者治疗有效量的选自脱氢表雄酮、硫酸 脱氢表雄留酮、雄留-5-烯-3β，17β-二醇和4-雄留烯-3，17-二酮的性留体前体的步骤。 11. 任一前述实施方案1、2、3、7和8的方法，其中，性留体前体是脱氢表雄酮。 12. 任一前述实施方案1、2、3、7和8的方法，其中，性留体前体是硫酸脱氢表雄甾酮。 13. 任一前述实施方案1、2、3、7和8的方法，其中，性留体前体是雄留-5-烯-3β，17β-二 醇。 14. 实施方案9的方法，其中，5型cGMP磷酸二酯酶抑制剂选自昔多芬（1-[ [3-(4,7-二 氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)-4-乙氧基苯基]磺酰基]-4-甲基 哌嗪）、Tadalaf il (6R，12aR)-6-( 1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2，3，6，7，12，12a-六氢-2-甲基吡嗪并[1，，2' ：1，6]吡啶并[3,4-b]吲噪-1,4-二酮、DA-8159、EMR-62203、TA-1790、UK-371800和SCH-446132。 15. 实施方案9的方法，其中，前列腺素是前列腺素 E1 (前列地尔；（lla，13E，15S)_ll， 15-二羟基-9-氧代前列腺-13-烯-1-酸））。 16. 阴道应用的药物组合物，包括： a) 药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体； b) 治疗有效量的选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮和雄留-5-烯-3β，17β-二醇的性甾 体前体。 17. 药物组合物，包括： a) 药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体； b) 治疗有效量的至少一种选择性雌激素受体调节剂，和 c) 治疗有效量的至少一种5型cGMP磷酸二酯酶抑制剂。 18. 药物组合物，包括： a) 药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体； b) 治疗有效量的至少一种选择性雌激素受体调节剂； c) 治疗有效量的至少一种5型cGMP磷酸二酯酶抑制剂，和 d) 治疗有效量的至少一种选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮和雄留-5-烯-3β，17β-二 醇的性留体前体。 19. 药盒，包括包含治疗有效量的至少一种选自前列腺素 Ε1、昔多芬和Tadalafil的5型 cGMP磷酸二酯酶抑制剂的第一容器，和进一步包括包含治疗有效量的至少一种选择性雌激 素受体调节剂的第二容器。 20. 药盒，包括包含治疗有效量的至少一种选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄留-5-烯-3β，17β-二醇的性留体前体的第一容器，和进一步包括包含治疗有效量的至少一种选择 性雌激素受体调节剂的第二容器和包含治疗有效量的至少一种5型cGMP磷酸二酯酶抑制剂 或前列腺素 E1的第三容器。 21. 前述实施方案2到5，9，17到20，42和43的方法、药物组合物或药盒，其中，选择性雌 激素受体调节剂具有有下述特征的分子式： a) 两个芳环被1到2个插入碳原子间隔，两个芳环都未被取代或者被羟基或在体内转变 为羟基的基团取代； b) 具有芳环和叔胺官能团或其盐的侧链。 22. 实施方案21的方法、药物组合物或药盒，其中，侧链选自：
〇. 23. 实施方案21的方法、药物组合物或药盒，其中，两个芳环都是苯基，且侧链具有选自 次甲基、亚甲基、-co、-o-和-S-、芳环和叔胺官能团或其盐的部分。 24. 实施方案21的方法、药物组合物或药盒，其中，选择性雌激素受体调节剂选自苯并 噻吩衍生物、三苯乙烯衍生物、吲哚衍生物、苯并吡喃衍生物、5,6,7,8_四氢萘和苯并二氢 吡喃衍生物。 25. 实施方案21的方法、药物组合物或药盒，其中，选择性雌激素受体调节剂是下式的 苯并噻吩衍生的化合物：
其中办和办独立地选自：氢、羟基、和在体内转变为羟基的部分； 其中R3和R4独立地选自：C1-C4烷基，或者其中的R3、R4和它们结合的氮，一起为选自吡 咯烷子基、二甲基-1-吡咯烷子基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亚甲基亚氨基和吗啉代 的任何结构； 其中 A选自-CO-、-CHOH和-CH2-; 其中B选自次苯基、吡啶亚基和-环C4H2N2-。 26. 实施方案25的方法、药物组合物或药盒，其中，选择性雌激素受体调节剂选自雷洛 昔芬、阿佐昔芬(LY 353381)和LY 335563。 27. 实施方案21的方法、药物组合物或药盒，其中，选择性雌激素受体调节剂下式的三 苯乙烯衍生的化合物：
其中D是-0CH2CH2N(R3)R4或-CH = CH-COOH(R3和R4都独立地选自C1-C4烷基，或者R3、R4 和它们结合的氮原子一起为选自吡咯烷并、二甲基-1-吡咯烷子基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶 子基、六亚甲基亚氨基和吗啉代的环状结构）； 其中E和K独立地是氢或羟基； 其中J是氢或卤素。 28. 实施方案27的方法、药物组合物或药盒，其中，选择性雌激素受体调节剂是他莫昔 芬、0H-他莫昔芬、屈洛昔芬、托瑞米芬、Iodoxifene和GW 5638。 29. 实施方案21的方法、药物组合物或药盒，其中，选择性雌激素受体调节剂是下式的 吲哚衍生的化合物：
其中 D选自-OCH2CH2N(R?) Rs、_CH=CH-CO N(R?) Rs、-CC-(CH2) n-N(R?) Rs (R7和Rs都独立地 选自&-C6烷基、或R7、R8和它们结合的氮原子一起为选自吡咯烷并、二甲基-1-吡咯烷子基、 甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亚甲基亚氨基、吗啉代的环状结构）； 其中X选自：氢和C1-C6烷基； 其中Ri、R2、R3、R4、Rs和R6独立地选自：氢、羟基、Ci-Cs烷基、和在体内转变为羟基的部 分。 30. 实施方案29的方法、药物组合物或药盒，其中，选择性雌激素受体调节剂是TSE-424 和ERA-923。 31. 实施方案21的方法、药物组合物或药盒，其中，选择性雌激素受体调节剂是下式化 合物：
其中办和办独立地选自：氢、羟基、和在体内转变为羟基的部分； 其中R#PR6独立地是氢或&-C6烷基； 其中D是-0CH2CH2N(R3)R4(R3和R 4都独立地选自&-C4烷基，或者R3、R4和它们结合的氮原 子一起为选自吡咯烷并、二甲基-1-吡咯烷子基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亚甲基亚 氨基、吗啉代的环状结构）。 其中X选自-〇-和-ch2-。 32. 实施方案31的方法、药物组合物或药盒，其中，化合物选自：（-)-顺式-(5R，6S)-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)苯基]_5,6,7,8_四氢萘-2-醇，D-(-)_酒石酸盐(拉索 昔芬）和(3,4-反式-2,2-二甲基-3-苯基-4-[4-(2-(2-(吡咯烷-1-基）乙氧基）苯基)-7-甲 氧基色满]。 33. 实施方案21的方法、药物组合物或药盒，其中，选择性雌激素受体调节剂具有下述 结构：
其中RjPR2独立地是氢、羟基或在体内转变为羟基的部分； 其中Z是二价封闭部分； 其中R100是通过4-10个插入原子将L隔离B环的二价部分； 其中L是选自-SO-、-CON-、-N〈和-SON〈的二价或三价极性部分； 其中Gi选自氢、&到(：5的烃或连接G#PL以形成5-到7-元杂环的二价部分、和卤素或前 述基团的不饱和衍生物； 其中G2不存在或选自氢、&到(：5的烃或连接GjPL以形成5-到7-元杂环的二价部分、和 卤素或前述基团的不饱和衍生物； 其中G3选自氢、甲基和乙基。 34. 实施方案33的方法、药物组合物或药盒，其中，Z选自-〇-、-NH-、-S-和-CH2-。 35. 实施方案33的方法、药物组合物或药盒，其中，化合物是下述通式结构的苯并吡喃 衍生物：
其中D是-0CH2CH2N(R3)R4(R3和R 4都独立地选自&-C4烷基，或R3、R4和它们结合的氮原子 一起为选自吡咯烷并、二甲基-1-吡咯烷子基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亚甲基亚氨 基、吗啉代、环的环状结构）。 其中办和办独立地选自：氢、羟基和在体内转变为羟基的部分。 36. 实施方案35的方法、药物组合物或药盒，其中，苯并吡喃衍生物是在碳2上具有绝对 构型S的旋光性化合物或其药学可接受的盐，所述化合物具有下述分子结构：
其中RjPR2独立地选自羟基和在体内转变为羟基的部分； 其中R3是选自饱和的、不饱和的或取代的吡咯烷基，饱和的、不饱和的或取代的哌啶子 基，饱和的、不饱和的或取代的哌啶基，饱和的、不饱和的或取代的吗啉代，含氮环状部分， 含氮多环部分和NRaRb (Ra和Rb独立地是氢、直连或支链&-C6烷基、直连或支链C2-C6链烯基 和直连或支链C 2-C6炔基）。 37. 实施方案36的方法、药物组合物或药盒，其中，所述化合物或盐基本上不含(2R)-对 映异构体。 38. 实施方案35的方法、药物组合物或药盒，其中，苯并吡喃衍生物是选自乙酸、已二 酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、富马酸、氢碘酸、氢溴酸、盐酸、双氢氯噻嗪酸、羟萘 甲酸、乳酸、马来酸、甲磺酸、甲基硫酸、1，5-萘二磺酸、硝酸、棕榈酸、三甲基醋酸、磷酸、丙 酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对苯二甲酸、对-甲苯磺酸和戊酸的酸的盐。 39. 任一前述实施方案2到5，9，17到20，42和43的方法、药物组合物或药盒，其中，所述 选择性雌激素受体调节剂是：
40. 任一前述实施方案2到5，9，17到20，42和43的方法、药物组合物或药盒，其中，所述 选择性雌激素受体调节剂选自雷洛昔芬、阿佐昔芬、他莫昔芬、屈洛昔芬、托瑞米芬、 Iodoxifene、GW 5638、TSE-424、ERA-923和拉索昔芬。 41. 实施方案1的方法，其中性留体前体是阴道内给药的。 42. 实施方案16的药物组合物，另外包括治疗有效量的至少一种选择性雌激素受体调 节剂。 43. 实施方案42的药物组合物，另外包括治疗有效量的至少一种雌激素。
【主权项】
1. 至少一种选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄留酮和雄留-5-烯-30，170-二醇的性甾体 前体和至少一种选择性雌激素受体调节剂在制备全身用药的药用组合物中的用途，所述药 用组合物包含： (a) 药学可接受赋形剂、稀释剂或载体； (b) 治疗有效量的所述至少一种选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄留酮和雄留-5-烯-30， 170-二醇的性留体前体;和 (c) 治疗有效量的所述至少一种选择性雌激素受体调节剂； 其中所述药用组合物用于治疗或预防性功能障碍。2. 至少一种选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄留酮和雄留-5-烯-30，170-二醇的性甾体 前体和至少一种选择性雌激素受体调节剂在制备口服给药的药用组合物中的用途，所述药 用组合物包含： (a) 药学可接受赋形剂、稀释剂或载体； (b) 治疗有效量的所述至少一种选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄留酮和雄留-5-烯-30， 170-二醇的性留体前体;和 (c) 治疗有效量的所述至少一种选择性雌激素受体调节剂； 其中所述药用组合物用于治疗或预防性功能障碍。3. 权利要求1或2的用途，其中，选择性雌激素受体调节剂具有下述特征的分子式： a) 两个芳环被1到2个插入碳原子间隔，两个芳环都未被取代或者被羟基或在体内转变 为羟基的基团取代； b) 具有芳环和叔胺官能团或其盐的侧链。4. 权利要求3的用途，其中，选择性雌激素受体调节剂具有下述结构：其中办和此独立地是氢、羟基或在体内转变为羟基的部分； 其中Z是二价封闭部分； 其中Rico是通过4-10个插入原子将L与B环隔离的二价部分； 其中L是选自-SO-、-CON-、-N〈和-SON〈的二价或三价极性部分； 其中Gi选自氢、&到(：5的烃或连接G4PL以形成5-到7-元杂环的二价部分、和卤素或前述 基团的不饱和衍生物； 其中G2不存在或者选自氢、&到(：5的烃或连接GjPL以形成5-到7-元杂环的二价部分、和 卤素或前述基团的不饱和衍生物； 其中G3选自氢、甲基和乙基。5. 权利要求3的用途，其中，选择性雌激素受体调节剂是在碳2上具有绝对构型S的旋光 性化合物或其药学可接受的盐，所述化合物具有下述分子结构：其中办和办独立地选自羟基和在体内转变为羟基的部分； 其中R3是选自饱和的、不饱和的或取代的吡咯烷基，饱和的、不饱和的或取代的哌啶子 基，饱和的、不饱和的或取代的哌啶基，饱和的、不饱和的或取代的吗啉代，含氮环状部分， 含氮多环部分和NRaRb(Ra和Rb独立地是氢、直链或支链&-C6烷基、直链或支链C 2-C6链烯基 和直链或支链C2-C6炔基）。6. 权利要求5的用途，其中，所述化合物或盐基本上不含(2R)-对映异构体。7. 权利要求5的用途，其中，苯并吡喃衍生物是选自乙酸、已二酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑 磺酸、柠檬酸、富马酸、氢碘酸、氢溴酸、盐酸、双氢氯噻嗪酸、羟萘甲酸、乳酸、马来酸、甲磺 酸、甲基硫酸、1，5-萘二磺酸、硝酸、棕榈酸、三甲基醋酸、磷酸、丙酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、 对苯二甲酸、对-甲苯磺酸和戊酸的酸的盐。8. 权利要求1或2的用途，其中，所述选择性雌激素受体调节剂是：9. 任一前述权利要求1-8的用途，其中，性留体前体是脱氢表雄酮，选择性雌激素受体 调节剂是acolbifene。10. 任一前述权利要求1-8的用途，其中，性留体前体是脱氢表雄酮。11. 至少一种选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、和雄留-5-烯-30，170-二醇的性甾体 前体和至少一种选择性雌激素受体调节剂在制备用于治疗或预防性功能障碍的药盒中的 用途，该药盒包括包含治疗有效量的所述至少一种选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、和雄 甾-5-烯-3M7P-二醇的性留体前体的全身用药的第一容器，和进一步包括包含治疗有效 量的所述至少一种选择性雌激素受体调节剂的第二容器。12. 至少一种选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、和雄留-5-烯-30，170-二醇的性甾体 前体和至少一种选择性雌激素受体调节剂在制备用于治疗或预防性功能障碍的药盒中的 用途，该药盒包括包含治疗有效量的所述至少一种选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、和雄 甾-5-烯-3M7P-二醇的性留体前体的口服给药的第一容器，和进一步包括包含治疗有效 量的所述至少一种选择性雌激素受体调节剂的第二容器。13. 权利要求11或12的用途，其中，选择性雌激素受体调节剂具有下述特征的分子式： a) 两个芳环被1到2个插入碳原子间隔，两个芳环都未被取代或者被羟基或在体内转 变为羟基的基团取代； b) 具有芳环和叔胺官能团或其盐的侧链。14. 权利要求13的用途，其中，选择性雌激素受体调节剂具有下述结构式：其中办和此独立地是氢、羟基或在体内转变为羟基的部分； 其中Z是二价封闭部分； 其中Rico是通过4-10个插入原子将L与B环隔离的二价部分； 其中L是选自-SO-、-CON-、-N〈和-SON〈的二价或三价极性部分； 其中Gi选自氢、&到(：5的烃或连接G4PL以形成5-到7-元杂环的二价部分、和卤素或前述 基团的不饱和衍生物； 其中G2不存在或选自氢、&到(：5的烃或连接GjPL以形成5-到7-元杂环的二价部分、和卤 素或前述基团的不饱和衍生物； 其中G3选自氢、甲基和乙基。15. 权利要求13的用途，其中，选择性雌激素受体调节剂是在碳2上具有绝对构型S的旋 光性化合物或其药学可接受的盐，所述化合物具有下述分子结构：其中办和此独立地选自羟基和在体内转变为羟基的部分； 其中R3是选自饱和的、不饱和的或取代的吡咯烷基，饱和的、不饱和的或取代的哌啶子 基，饱和的、不饱和的或取代的哌啶基，饱和的、不饱和的或取代的吗啉代，含氮环状部分， 含氮多环部分和NRaRb(Ra和Rb独立地是氢、直链或支链&-C6烷基、直链或支链C2_C 6链烯基 和直链或支链c2-c6炔基）。16. 权利要求15的用途，其中，所述化合物或盐基本不含(2R)-对映异构体。17. 权利要求15的用途，其中，苯并吡喃衍生物是选自乙酸、已二酸、苯磺酸、苯甲酸、樟 脑磺酸、柠檬酸、富马酸、氢碘酸、氢溴酸、盐酸、双氢氯噻嗪酸、羟萘甲酸、乳酸、马来酸、甲 磺酸、甲基硫酸、1，5-萘二磺酸、硝酸、棕榈酸、三甲基醋酸、磷酸、丙酸、琥珀酸、硫酸、酒石 酸、对苯二甲酸、对-甲苯磺酸和戊酸的酸的盐。18. 权利要求11或12的用途，其中，所述选择性雌激素受体调节剂是：19. 任一前述权利要求11-18的用途，其中，性留体前体是脱氢表雄酮。20. 任一前述权利要求11-19的用途，其中，性留体前体是脱氢表雄酮，选择性雌激素受 体调节剂是acolbifene。
【文档编号】A61P15/12GK106038572SQ201610387657
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2005年10月20日
【发明人】M.埃尔-阿尔菲, F.拉布里, L.伯格
【申请人】恩多研究公司