一种柠檬苦素类化合物在制备治疗肾癌药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种柠檬苦素类化合物在制备治疗肾癌药物中的应用。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的柠檬苦素类化合物，可以从干燥的枳壳中提取、分离纯化得到。本发明将化合物(Ⅰ)应用于制备治疗肾癌药物中，本发明的应用可以抑制肾癌细胞的增殖，促进细胞的凋亡，抑制呈浓度及时间依赖性。本发明应用中的化合物(Ⅰ)化合物(Ⅰ)为非传统意义的化疗药物，对机体的损害小，而且避免了癌细胞对传统化疗药物的耐药性。既可以单独应用，也可以以组合物的形式进行应用。
【专利说明】
一种柠檬苦素类化合物在制备治疗肾癌药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从干燥的枳壳中分离得到的一种柠檬苦素类 化合物在制备治疗肾癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 肾癌是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，又称肾腺癌，简称为肾癌。包 括起源于泌尿小管不同部位的各种肾细胞癌亚型，但不包括来源于肾间质的肿瘤和肾盂肿 瘤。早在1883年德国的病理学家Grawitz根据显微镜下看癌细胞形态类似于肾上腺细胞，提 出肾癌是残存于肾脏内的肾上腺组织起源学说。
[0003] 枳壳为芸香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培变种的干燥未成熟果 实。7月果皮尚绿时采收，自中部横切为两半，晒干或低温干燥。味苦、辛、酸。性微寒。归脾、 胃经。具有理气宽中，行滞消胀之功效。用于胸胁气滞，胀满疼痛，食积不化，痰饮内停，脏器 下垂。枳壳是中药典型的理气药之一，广泛应用于中医临床。
[0004] 枳壳所含化学成分较为复杂，目前已知的有效成分主要有黄酮类、挥发油类、生物 碱类、香豆素类和一些微量元素等。枳壳中黄酮类成分主要有:橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、 柚皮芸香苷、异柚皮苷、陈皮素、柚皮素、川陈皮素、红橘素、去甲基川陈皮素、去甲川陈 皮素、橙黄酮、4'，5,7,8_四甲氧基黄酮、4-0-甲基黄芩素、3-羟基_3'，4'，5,6,7,8_六甲氧 基黄酮和5，6-二羟基-7，4 二甲氧基黄酮等。挥发油主要有柠檬烯、芳樟醇、2-十一烷酮、 γ-松油烯。枳壳中所含的生物碱类活性成分主要有辛弗林、N-甲基酪胺、酪胺、大麦芽碱 等。枳壳中所含的香豆素类成分主要有葡萄内酯、伞形花内酯、异前胡素、马明丙酮化合物、 泼朗弗林、异米拉素、花椒毒酚、5-异戊烯氧基线呋喃香豆素、5-甲氧基线呋喃香豆素等。
[0005] 枳壳中的橙皮苷具有抗炎、抗氧化、抗癌和保肝等作用；柚皮苷具有抗炎镇痛、降 血糖等作用；川陈皮素具有抗炎，抗病毒，抗氧化等药理作用；川陈皮素具有很好的抗肿瘤 的作用；柚皮素具有抗抑郁、保肝、抗氧化、改善大鼠学习记忆障碍、抗血小板聚集的作用。 枳壳挥发油的主要成分是柠檬烯。在临床上，柠檬烯胶囊已上市，主要用于胆囊炎、胆管炎、 胆结石和胆道术后综合征等的治疗。在枳壳挥发油中，另一重要成分为芳樟醇，具有防腐、 抗菌、抗病毒和镇静等作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种从干燥的枳壳中分离得到的一种柠檬苦素类化合物在 制备治疗肾癌药物中的应用。
[0007] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0008] -种柠檬苦素类化合物在治疗肾癌药物中的应用，具有下述结构式的化合物(I)，
[0009]
[0010] 进一步地，所述化合物(I)从枳壳中分离提取获得，包含以下操作步骤：
[0011] (a)干燥的枳壳粉碎，用70~80%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依 次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和 正丁醇萃取物；
[0012] (b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个柱体积，再 用70%乙醇洗脱12个柱体积，收集70%乙醇洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱物浸膏；
[0013] (C)步骤(b)中70%乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、 30:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；
[0014] (d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、10:1和5:1的 二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
[0015] (e)步骤（d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为 70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物 (1)〇
[0016] 进一步地，步骤(a)中，用75%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0017]进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0018] -种药物组合物在制备治疗肾癌药物中的应用，该药物组合物含有治疗有效量的 上述化合物（I)和药学上可接受的载体。
[0019] 本发明应用中的化合物（I)用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式 使用。以药物组合物应用时，药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I )，其余为药物 学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0020] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0022] 本发明将化合物（I)应用于制备治疗肾癌药物中，本发明的应用可以抑制肾癌细 胞的增殖，促进细胞的凋亡，抑制呈浓度及时间依赖性。本发明应用中的化合物（I)化合物 α)为非传统意义的化疗药物，对机体的损害小，而且避免了癌细胞对传统化疗药物的耐药 性。，既可以单独应用，也可以以组合物的形式进行应用。
【附图说明】
[0023]图1为化合物(I)结构式；
[0024]图2为化合物（I)理论E⑶值与实验E⑶值比较。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0026]实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0027] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0028]制备方法：（a)将干燥的枳壳(8kg)粉碎，用75 %乙醇热回流提取(25L X 3次），合并 提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯（3LX3次)和水饱和的正丁 醇(3LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(347g)和正丁醇萃取物；（b)步 骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个柱体积，再用70% 乙醇洗脱12个柱体积，收集70%乙醇洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱物浸膏（129g);(c) 步骤(b)中70%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1(8个柱体积）、50:1(8 个柱体积）、30:1(6个柱体积）、10:1(8个柱体积)和1:1(5个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4(31g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1 (8个柱体积）、10:1(10个柱体积)和5:1(6个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组 分；（e)步骤（d)中组分2(14g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为 70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物 (I)(48mg)〇
[0029] 结构确证:无色晶体（甲醇），册43頂3显示[1+他]+为111/2 523.2314，结合核磁特 征可得分子式为C28H36〇8，不饱和度为11。核磁共振氢谱数据δΗ(ρρηι，DMS0_d6，500MHz):H-1 (4.85，d，J = 7.5)，H-2(2.72，dd，J=16.0,7.5)，H-2(3.43，d，J=16.0)，H-5(2.39，d，J = 13.5)，H-6(1.57，d，J = 13.5)，H-6(1.85，t，J=13.5)，H-7(3.33，d，J = 4.5)，H-9(1.96，s)， H-ll(3.78，br，s)，H-12(3.34，d，J = 6.0)，H-14(2.89，s)，H-16(2.41，dd，J=19.0,9.0)，H-16(2.20，dd，J=19.0,9.0)，H-17(4.19，t，J=10.0)，H-18(0.61，s)，H-19(1.41，s)，H-21 (7.45，s)，H-22(6.46，d，J=1.0)，H-23(7.47，t，J=1.5)，H-28(1.22，s)，H-29(1.39，s)，H-30(1.16,8)，7-0!1(4.69，(1，了 = 4.5)，1-(^〇(1.87,8);核磁共振碳谱数据6。(卯111，0130-(1 6， 125MHz):70.7(CH，1-C)，34.5(CH2,2-C)，169.6(C，3-C)，85.1(C，4-C)，38.9(CH，5-C)，27.8 (CH2,6-C)，68.8(CH，7-C)，44.0(C，8-C)，36.2(CH，9-C)，41.7(C，10-C)，70.6(CH，n-C)， 70.1(CH，12-C)，44.0(C，13-C)，57.2(CH，14-C)，220.1(C，15-C)，41.8(CH2，16-C)，34.9 (CH，17-C)，21.1(CH3，18-C)，22.9(CH 3，19-C)，123.3(C，20-C)，140.8(CH，21-C)，111.2(CH， 22-C) ,141.7(CH,23-C), 33.8(CH3,28-0,17.7(CH3,29-C) ,19.3(CH3,30-C) ,169.1(C,1- OAc)，20.3(CH3，l-0Ac);碳原子标记参见图1。红外波谱表明该化合物含有羟基(3526CHT 1)， 羰基（1732cm-〇和烯烃（1685cm-〇等基团。1H NMR谱显示六个甲基信号(δΗΙ · 87，1 ·41，1 · 39， 1.22，1.16,〇.61，各3!1，8)，0型取代的呋喃环0!17.45,8;6.46，(1，了=1.〇!^和7.47，^ = 1.5Hz)，以及一个乙酰氧基[δΗΙ. 87(3Η，s) ]。13C NMR、DEPT和HSQC谱中显示有28个碳信号， 包括六甲基，三个亚甲基，十一个次甲基（四个含氧碳和三个烯烃碳），以及八个季碳(三个 羰基碳，一个含氧碳和一个烯烃碳）。上述数据表示，该化合物为柠檬苦素类化合物，再结合 不饱和数可知该化合物为五环结构。HMBC谱中，H-1 (δΗ4.85，d，J = 7.5)与C-2 (SC34.5)和两 个羰基碳[SC169.1(0Ac)和169.6(C-3)]的相关性表明，C-1位连有一个乙酰氧基。HMBC谱中 H-1 与 C-3，C-5 和 C-10，H2-2 与 C-3，Me-28 和 Me-29 与 C-4，Me-19 与 C-1 的相关性表明 A 环为七 元内酯环。HMBC谱中，质子(4.69，d，J = 4.5)与C-7(SC68.8)的相关性表明B环的C-7位连有 一个羟基。此外，两个含氧碳信号SC70.6(CH，11-C)和70.1(CH，12-C)表明C环存在一个11， 12-环氧基团。HMBC谱中，H-14和H 2-16与酮羰基C-15(SC220.1)的相关性表明D环为五元环。 通过HMBC谱中H-17与C-20，C-21和C-22,以及H 2-16与C-20的相关性可知呋喃环位于C-17位 上。R0ESY 谱中，Η-6β 与 Me-19，Me-19 与 Me-29，Me-19 与 Me-30，Me-30 与 H-7，Me-30 与 H-12 和 H-12 与 H-17 的相关性表明 H-7，H-12，H-17，Me-19，Me-29和Me-30为β构型。此外，H-6α与H-5，H-5与Me-28，H-5与H-9，H-9与H-14，H-14与7-OH，以及H-14与Me-18的相关性表明它们均为α构 型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和R0ESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化 合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
[0030]实施例2:化合物（I)药理作用试验 [0031] -、材料和仪器
[0032] 人肾癌RC-2细胞株购于ATCC细胞库(美国）。分析纯蔗糖购于国药集团化学试剂公 司。重水(D20)购于青岛腾龙微波科技有限公司。1^8、303、30%丙烯酰胺单体、1'冊61120购 于重庆医科大学基础研究所实验室。小牛血清、RPMI-1640购于美国Gibco公司。Centriplus 离心超滤管、Amicon Ultra高回收率高流速切向流超滤离心管（100kD)、PVDF膜购于 Mi 11 ipore公司。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于上海安亭科学仪器厂。5 X SDS-PAGE蛋白质 上样缓冲液、BeyoECL荧光检测试剂、考马斯亮蓝G250、考马斯亮蓝R250购于碧云天生物技 术研究所。化合物（I)自制，HPLC归一化纯度大于98%。鼠抗人批？70单克隆抗体、兔抗人 ICAM-1单克隆抗体、兔抗人G250多克隆抗体购于Sigma公司。兔抗人Survivin多克隆抗体武 汉博士德生物有限公司。
[0033] 超净工作台（苏州华新空调净化有限公司），自动平衡离心机(上海医用分析仪器 厂），光学显微镜(NIKON，日本），透射电子显微镜(LeicaTCS-NT，德国），低温高速离心机（日 立公司，日本），低温超高速离心机H-80B(日立公司，日本）。垂直电泳槽、电转槽(北京六一 厂，中国）。台式高速离心机、酶标仪(上海安亭科学仪器厂，中国）。96孔培养板(Corning公 司，美国）。凝胶仪、PCR扩增仪(BI0-RAD，美国）。
[0034]二、试验方法
[0035] 1、MTT检测化合物（I)不同浓度48h对肾癌细胞株RC-2增殖的影响
[0036]用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液(含有0.1 %青霉素、链霉素)常规培养人肾 癌细胞株RC-2，根据细胞生长密度1~2天换液一次，3天传代一次。取对数期生长细胞，按照 如下步骤操作：（1)接种细胞:胰酶消化对数生长期的肾癌RC-2细胞，用含10%小牛血清的 RPMI-1640培养液lmL制成单细胞悬液，混匀后用移液管按照体积100μL7孔，即接种肾癌细 胞数目5 X 103个/孔，加入96孔培养板中。每组细胞设置3个复孔；（2)培养细胞:将培养板小 心置入孵箱中（37 °C、5 % C02)培养3天；（3)处理细胞:分别按空白组(加5yL DMS0液）、0.25、 0.5、0.75、lymol/L化合物（I)处理组分组后加药处理48h; (4)显色：在各个时间点，予以每 孔各加入MTT溶液20yL，之后继续放入孵箱中孵育4h，然后小心把孔内培养液用注射器吸 去;对于当天接种的细胞而言，离心之后（l〇〇〇rpm，5min)，然后将孔内培养液移除。之后把 150yL DMS0加入每孔，使其充分振荡lOmin后，把结晶物溶解完全；（5)比色:在全自动酶标 仪上检测各孔在580nm波长下的光密度值[(D580)]，按公式测定细胞活力:D(580)实验孔/D (580)对照孔 XI00 %。
[0037] 2、MTT检测0.5μΜ化合物（I)不同时间对肾癌细胞株RC-2增殖的影响
[0038] 接种和处理细胞及显色和比色步骤同上（1)、（2)、（4)、（5)，处理细胞:分别按空白 组（加5yL DMS0液）、0.5μΜ化合物（I)处理24h、48h、72h分组。
[0039] 3、制备 exosomes
[0040] (1)细胞分组：取6份细胞计数相近的人肾癌RC-2细胞株体外常规培养，其中三份 为对照组（CE)，另外三份为实验组（CE2)，等细胞呈对数生长时，两组细胞株按照3 X 106/ 100mL重新传代至新的培养瓶，严格控制每组细胞培养基的体积一致;在实验组，等细胞培 养48h后加入0.5μΜ的化合物（I)处理细胞48h，之后收集培养上清液各150mL;对照组不加药 物，加入与实验组等量的DMS0，48h后收集培养上清液各150mL，置于-20°C冰箱保存；（2)提 取exosomes:培养上清液150mL，300g低温离心(4°C) 10min去除细胞;800g低温离心30min获 取上清l〇〇〇〇g低温离心30min获取上清通过100kD MW⑶Centriplus离心超滤管浓缩超滤 (MWC0:分子量截留），以1000g离心30min，得到约20mL超滤液。将超滤液分别移至2mL含30g/ L的蔗糖重水垫的10mL的离心管中，100000g低温超速离心lh。收集离心管底部的缓冲垫用 PBS稀释，置于100kD MWC0高回收率高流速切向流超滤离心管中1000g离心30min，得到3mL exosome。。. 22μηι滤膜过滤除菌，_80°C保存备用设置对照组细胞(CE1)来源的exosomes为 EX1 组 exosomes，实验组细胞(CE2)来源的 exosomes 为EX2 组 exosomes。
[0041] 4、BCA法检测exosomes蛋白含量
[0042] (1)测定方法:取96孔酶标板，按下表加入试剂并绘制标准曲线：
[0043]
[0044] 上述试剂加完后，准确吸取10yL样品溶液于酶标孔中，加入BCA试剂200yL，轻摇， 于37°C保温30min，冷却至室温后，以空白为对照，在酶标仪上562nm处比色，以牛血清白蛋 白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据样品的 吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质浓度；（2)计算方法:exosome浓缩液总蛋白质含量 (mg)=浓缩后的总体积XBCA法测定蛋白质浓度。重复6次实验，取平均值做统计学分析。 [0045] 5、统计学方法
[0046] 使用软件GRAGHPAD PRISM 5.0进行图表制作及统计学分析，计量资料以1±8表 示，比较组间差异使用方差分析或t检验。
[0047]三、结果及结论
[0048] 1、MTT显示不同浓度化合物（I)作用肾癌细胞株RC-2后细胞活力变化 [0049] MTT结果显示当化合物（I)浓度0·75μΜ作用细胞时，细胞活力（71·32±4·68%)与 化合物（I)浓度〇·5μΜ及0·25μΜ作用细胞时细胞组（91.43±2.74%;94.67±1.21%)相比， 差异具有统计学意义(Ρ〈〇. 05)。
[0050] 2、ΜΤΤ显示0.5μΜ化合物（I)不同时间作用肾癌细胞株RC-2后细胞活力变化 [0051 ] ΜΤΤ结果显示当0.5μΜ化合物（I)作用细胞72h组（71.34±1.64%)与作用4811组 (91 ·04±6· 23% )、24h组(94.56± 1 · 13% )对比，细胞活力差异具有统计学意义(Ρ〈0·05)。 [0052] 3、Exosomes计数和蛋白定量
[0053] 电镜下实验组(EX2)和对照组(EXl)exosomes计数和exosomes蛋白定量结果:经化 合物（I)处理后，RC-2细胞产生的exosomes数量和exosome蛋白含量较未经药物处理组都明 显增加，差异具有统计学意义(P〈〇. 05)。结果见表1。
[0054]结果说明，化合物⑴能够抑制肾癌细胞株RC-2增殖，这种抑制呈浓度及时间依赖 性。经化合物（I)处理后，透射电镜观察肾癌细胞株RC-12源性exosomes形态未见明显改变， 其分泌量和蛋白含量较处理前明显增加(P<〇.05)，这些说明化合物（I)对肾癌细胞株RC-12的抑制作用与化合物（I)引起的肾癌细胞RC-2表达野生型p53mRNA上调有关。
[0055] 表1实验组和对照组分泌exosomes数量及蛋白含量对比
[0056] Luud/j 头施例3
[0058] 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的 比例加入赋形剂，制粒压片。
[0059] 实施例4
[0060] 口服液制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服 液。
[0061 ] 实施例5
[0062] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒 石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0063] 实施例6
[0064] 注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤， 灌封灭菌制成注射液。
[0065] 实施例7
[0066] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。
[0067] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种柠檬苦素类化合物在制备治疗肾癌药物中的应用，其特征在于:具有下述结构 式的化合物(I)，2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述化合物（I)从枳壳中分离提取获得，包 含以下操作步骤： (a) 将干燥的枳壳粉碎，用70~80%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次 用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正 丁醇萃取物； (b) 步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个柱体积，再用 70%乙醇洗脱12个柱体积，收集70%乙醇洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱物浸膏； (c) 步骤(b)中70%乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、30: 1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得至1」5个组分； (d) 步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、10:1和5:1的二氯 甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分； (e) 步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的 甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(a)中，用75%乙醇热回流提取，合并 提取液。4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。5. -种药物组合物在制备治疗肾癌药物中的应用，其特征在于:该药物组合物含有治 疗有效量的权利要求1所述的化合物(I)和药学上可接受的载体。
【文档编号】A61K31/585GK106038573SQ201610389578
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】董秋月
【申请人】杭州更蓝生物科技有限公司