专利名称：用于浓缩omega-3脂肪酸的方法
用于浓缩omega-3脂肪酸的方法本申请要求2010年9月24日提交的美国临时申请第61/386，096号的优先权，将其全文引入本文作为参考。本发明总体涉及用银盐水溶液(例如AgNO3水溶液)从脂肪酸油混合物中浓缩多不饱和脂肪酸(例如omega-3脂肪酸)的方法。omega-3脂肪酸可用于多种应用，包括药物和/或营养补充产品。例如，omega-3脂肪酸可调节血浆脂质水平、心血管和免疫功能、胰岛素作用、神经元发育和视觉功能。omega-3脂肪酸可对心血管疾病(例如高血压和高甘油三酯血症)的风险因素和对凝血因子VII磷脂络合物活性产生有益的效果。omega-3脂肪酸还可以降低血清甘油三酯，增加血清HDL胆固醇，降低收缩期和舒张期血压和/或脉搏率，并且可降低凝血因子VI1-磷脂络合物的活性。另外，omega-3脂肪酸通常可良好地耐受，且不引起严重的副作用。海产品油(通常也指鱼油)是omega-3脂肪酸(包括二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA))的来源·之一，已发现其可调节脂类代谢。植物油、微生物油和藻类油也是omega-3脂肪酸的来源。已研发了多种omega-3脂肪酸的制剂。例如,omega-3脂肪酸油混合物的一种形式是从含有DHA和EPA的鱼油中得到的主要omega-3、长链、多不饱和月旨肪酸的浓缩物，例如以商标Omacor /Lovaza / Zodin / Seacor 销售的商品。参见，例如，美国专利第5，502，077号、第5，656，667号和第5，698，594号。特别地，每IOOOmg的Lovaza 胶囊含有至少90%的omega-3脂肪酸乙酯(84%的EPA/DHA);约465mg EPA乙酯和约375mg DHA乙酯。其他的omega-3脂肪酸可提供活性。例如，Kaur等人(Prog.Lipid Res.(2011)vol.50 (I),pp.28-34)认为n_3DPA具有某些生物效应。有证据表明，n_3DPA具有比EPA大10倍的内皮细胞迁移能力，这可能在伤口愈合过程中是很重要的。此外，报道了 n-3DPA在抑制血小板聚集方面比EPA和DHA更有效。另外，n-3DPA可在减弱与年龄相关的空间学习(spatial learning)和长时程增强(long-term potentiation)的下降方面发挥作用。然而，由于纯化合物的供应量有限，还未对n-3DPA进行广泛的研究。omega-3脂肪酸的许多来源也是omega-6脂肪酸的来源。然而，在一些生物学过程中，omega-3和omega-6脂肪酸可表达相反的活性，因而低浓度的omega-6脂肪酸(即高n-3/n-6比例)是期望的。符合欧洲药典专论1250的市售产品通常具有范围为24-40的n-3/n_6 比例。Breivik (Long-Chain 0mega_3Specialty Oils, The Oily Press, PJBarnes&Associates, Bridgwater UK, pp.111-140, 2007)给出了用于制备 omega-3 酸浓缩物的方法的综述。由于海产品油的脂肪酸组成很复杂，难以仅用一种浓缩技术制备高度浓缩的omega-3脂肪酸组分。通常情况下，使用技术的组合，最经常使用结合了根据不饱和度分离(例如，酶分离和/或尿素分馏)和根据碳链长度分离(例如，分子/短程蒸馏和/或超临界流体提取)的技术。与起始油的量相比，常规技术通常具有获得含低收率omega-3脂肪酸的浓缩物的缺点。这在结合低收率的技术(如尿素包合和短程蒸馏)时可能尤为突出。
此外，分离方法(如短程蒸馏和主要基于链长分离脂肪酸酯的其他方法)通常无法分离具有相同碳原子数的omega-3和omega-6脂肪酸,例如C20:4n_3和C20:4n_6,或C22:5n-3和C22:5n_6。例如,尿素分懼可导致omega-6脂肪酸比同系物omega-3脂肪酸具有更高的浓缩因子，因为脂肪酸衍生物与尿素形成固体络合物的倾向随着脂肪酸酯的第一双键与羰基的距离(通常被称为Λ值)而增大。如果omega-6脂肪酸的Λ值为Λ ’，则相应的omega-3脂肪酸的Λ值为(Λ’+3)，从而导致与尿素形成络合物的程度更高。这种倾向对于omega-3脂肪酸的高度浓缩物尤其显著，其中使用了相对量很高的尿素。已进行了使用银盐从混合物中分离多不饱和脂肪酸的研究。参见，例如，Quinn 等人(pp.133-169, Perry 等人，Progress in separetion and Purification^:,ffiley-1nterscience, New York,1971) ；Peers 等人(J.Food Technology (1986)vol.21pp.463-469) ；Suzuki 等人(Bioseparetion(1993)vol.3, pp.197-204) ；Teramoto等人(Ind.Eng.Chem.Res.(1994), vol.33pp.341-345) ；Teramoto 等人(J.MembraneSc1.，(1994)vol.91, pp.209-213) ；Kubota 等人(Sep.Sc1.Technol.(1997)，vol.32,pp.1529-1541) ;·Chen 等人(J.Jiangsu University of Science and Technology (NaturalScience) (2000), vol.21, pp.18-22) ;Tao 等人(Chinese J.Marine Drugs, (2004) N0.3，pp.28-30) ；Huong(J.Chemistry (2007), vol.45,pp.757-762) ；Li 等人(Sep.Sc1.Technol.(2008)vol.43，pp.2072-2089) ;EP0454430B1 ;EP0576191A2 ;Seike 等人(Journal ofChemical Engineering of Japan (2007), Vol.40, ppl076_1084);和 Kamio 等人(Ind.Eng.Chem.Res., (2011) vol.50 (11), pp.6915-24)。然而,先前已知的方法未提供浓缩 omega-3脂肪酸的足够选择性和/或有效的方法。因此，在本领域中仍需要从脂肪酸油混合物中浓缩omega-3脂肪酸的更有效的方法。应理解，前面的总体描述和下面的详细描述仅仅是示例性和说明性的且对所要求保护的本发明不具限制性。本发明总体涉及从脂肪酸油混合物中浓缩至少一种omega-3脂肪酸的方法，所述方法包括:(a)混合脂肪酸油混合物和银盐(例如AgNO3或AgBF4)水溶液以形成水相和有机相，其中在水相中，所述银盐水溶液与至少一种omega-3脂肪酸形成络合物；(b)分离有机相和水相；(c)用置换液提取水相，或将水相的温度升高到至少30° C，或用置换液提取与升高温度相结合，从而形成至少一种提取物；(d)合并水相和水，或用超临界CO2提取水相，或合并水相和水与用超临界C02提取水相相结合，以解离络合物，其中水相包含所述银盐和至少一种含有脂肪酸浓缩物形式的溶液；和(e)从包含所述银盐的水相中分离所述至少一种含有脂肪酸浓缩物形式的溶液。
图1为通过将水相加热至70° C所回收的脂肪酸浓缩物的气相色谱，如实施例1所述。图2为在除去图1所示的浓缩物后通过将水相在水中稀释所获得的脂肪酸浓缩物的气相色谱，如实施例1所述。图3为通过用己烷作为置换溶剂提取所获得的成分的气相色谱，如实施例2A表4A所述。图4为浓缩物4的气相色谱,如实施例3表5所述。图5为表示具体选定的脂肪酯的乙酯的相对浓度的图表，如实施例2B表4E所述。详细说明下文将更详细地描述本发明的具体方面。本申请中使用的和本文阐明的术语和定义旨在表示在本发明之内的含义。在本文和上文中参考的专利和科学文献并入本文作为参考。本文提供的术语和定义若与引入参考中的术语和/或定义相冲突，以本文为准。单数形式“一种(a)”、“一个(an)”和“所述(the) ”包括复数形式，除非上下文另有指出。术语“约(approximately) ”和“约(about) ”表示与提到的数字或数值近似相同。本文所用的术语“约”通常应理解为包含具体数量、频率或数值的±30%范围内。术语“脂肪酸”包·括例如含有至少一个羧酸基团的短链和长链的饱和及不饱和的(例如，单不饱和的和多不饱和的)烃。术语“omega-3脂肪酸”包括天然的和合成的omega-3脂肪酸，以及药学上可接受的酯、游离酸、甘油三酯、衍生物、缀合物(参见例如Zaloga等人，美国公开第2004/0254357号，以及Horrobin等人，美国专利第6，245，811号，各自并入本文作为参考)、前体、盐及其混合物。omega-3脂肪酸油的实例包括但不限于:omega_3多不饱和脂肪酸,例如α -亚油酸(ALA, 18: 3η_3)、十八碳四烯酸(即 stearidonic acid, STA, 18: 4n_3)、二十碳三烯酸(ETE,20:3n-3)、二十碳四烯酸(ETA，20:4n-3)、二十碳五烯酸(EPA，20: 5n_3)、二i^一碳五烯酸(ΗΡΑ, 21: 5n_3)、二十二碳五烯酸(DPA, clupanodonic acid, 22: 5n_3)和二十二碳六烯酸(DHA,22:6n-3) ;omega_3脂肪酸与甘油的酯,例如单-、二-或三-甘油酯；以及omega-3月旨肪酸与伯醇、仲醇和/或叔醇的酯，例如脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯。术语“omega-6脂肪酸”包括天然的和合成的omega-6脂肪酸，以及药学上可接受的酯、游离酸、甘油三酯、衍生物、缀合物、前体、盐及其混合物。omega-6脂肪酸油的实例包括但不限于:omega-6多不饱和的长链脂肪酸，例如亚油酸(18:2η_6)、γ-亚油酸(18:3η-6)、二十碳二烯酸(20:2η-6)、二高-Y-亚油酸(20:3η_6)、花生四烯酸(20:4η_6)、二十二碳二烯酸(22:2η_6)、肾上腺酸(22:4η-6)和二十二碳五烯酸(即osbond acid,22:5n-6);以及酯、甘油三酯、衍生物、缀合物、前体、盐和/或其混合物。本发明公开的多不饱和脂肪酸(例如，omega-3脂肪酸和/或omega-6脂肪酸)、酯、甘油三酯、衍生物、缀合物、前体、盐和/或其混合物可以以它们的浓缩和/或纯化形式和/或作为油(例如海产品油(例如，鱼油)、藻类油、微生物油和/或植物油)的组分使用。脂肪酸油混合物根据本发明公开的脂肪酸油混合物可来自动物油和/或非动物油。在本发明的一些实施方式中，所述脂肪酸油混合物来自至少一种选自海产品油、单细胞油、藻类油、植物油、微生物油及其组合的油。海产品油包括，例如，鱼油、磷虾油以及来自鱼的脂类组分。植物油包括，例如，亚麻籽油、菜籽油、芥子油和大豆油。单细胞/微生物油包括，例如，Martek、Nutrinova和Nagase&Co的产品。单细胞油通常被定义为来自微生物细胞的油且其可供人类食用。参见，例如，Wynn and Ratledge, “Microbial oils !production,processing and markets for specialty long-chain omega-3polyunsatutrated fattyacids，，，pp.43-76，Breivik(Ed.)，Long-Chain 0mega_3Specialty Oils，The Oily Press，P.J.Barnes&Associates, Bridgewater UK, 2007 中。其他油包括植物油甘油三酯，通常被称为长链甘油三酯，例如蓖麻油、玉米油、棉子油、橄榄油、花生油、红花油、芝麻油、大豆油、氢化大豆油和氢化植物油；中链甘油三酯(例如来自椰子油或棕榈籽油的那些)，甘油一酯，甘油二酯和甘油三酯。除混合的甘油酯夕卜，有其他油例如丙二醇酯，比如丙二醇的辛酸/癸酸混合二酯，饱和的椰子油与棕榈仁油衍生的辛酸、亚油酸、琥珀酸的酯，或癸脂肪酸的丙二醇酯。脂肪酸油混合物中的脂肪酸可被酯化，例如形成烷基酯，例如乙酯。在一些实施方式中，所述脂肪酸为甘油酯形式，例如选自单_、二-和三甘油酯。在其他实施方式中，所述脂肪酸为游离酸形式。脂肪酸油混合物中的不饱和脂肪酸可以是顺式和/或反式构型。全顺式构型的omega-3脂肪酸的实例包括·但不限于:(全-Z) _9，12，15-十八碳三烯酸(ALA)、(全-Z)-6，9，12，15-十八碳四烯酸(STA)、(全-Z)-11，14，17-二十碳三烯酸(ETE)、(全-Z)-8，11，14，17-二十碳四烯酸(ETA)、(全-Z)-，7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(DPA)、(全-Z)-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸(EPA)、(全-Z)-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(DHA)和(全-Z)-6, 9, 12, 15, 18- 二^ 碳五烯酸(HPA)。全顺式构型的omega-6脂肪酸的实例包括但不限于:(全-Z)-4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(osbond acid)、(全-Z)-9，12-十八碳二烯酸(亚油酸)、(全-Z)-5，8，11，14- 二十碳四烯酸(AA)和(全-Z)-6，9，12-十八碳三烯酸(GLA)。顺式构型的单不饱和脂肪酸的实例包括但不限于:(Z)-9-十六碳烯酸(棕榈油酸)、(Z)-9-十八碳烯酸(油酸)、(Z)-1l-十八碳烯酸(异油酸)、(Z)-9-二十碳烯酸(鳕油酸)、(Z)-1l-二十碳烯酸(二十碳-11-烯酸)、(Z)-ll-eicoesenoic acid、(Z)-11-二十二碳烯酸(鲸腊烯酸)、Z_13_ 二十二碳烯酸(芥酸)和(R-(Z) )-12-羟基-9-十八碳烯酸(蓖麻油酸)。根据本发明公开的脂肪酸油混合物的实例包括但不限于欧洲药典Omega-3酸乙酯60、欧洲药典0mega-3酸专论中的鱼油富集物(Fish Oil Rich)、美国药典鱼油专论、欧洲药典0mega-3酸甘油三酯、欧洲药典0mega-3酸乙酯90和美国药典0mega-3酸乙酯专论中规定的脂肪酸。含有不同脂肪酸的脂肪酸油混合物的市售实例包括但不限于:Incromega omega-3 海产品油浓缩物，例如 Incromega TG7010SR、Incromega E7010SR>Incromega TG6015 > Incromega EPA500TG SR、Incromega E400200SR> Incromega E4010 >Incromega DHA700TG SR、 Incromega DHA700E SR、 Incromega DHA500TG SR、Incromega TG3322SR> Incromega E3322SR> Incromega TG3322> Incromega E3322>Incromega Trio TG/EE(Croda International PLC, Yorkshire, England) ;EPAX6000FA、EPAX5000TG、EPAX4510TG、EPAX2050TG,EPAX5500EE, EPAX5500TG、EPAX5000EE、EPAX5000TG、EPAX6000EE、EPAX6000TG、EPAX6500EE、EPAX6500TG、EPAX1050TG、EPAX2050TG、EPAX6015TG/EE、EPAX4020TG 和 EPAX4020EE (EPAX 为 Trygg Pharma AS 的全资子公司;Omacor /Lovaza / Z0din /SeaC0r 最终药物产品，K85EE、AGP103、K30EE、K50EE 和 K70EE (PronovaBioPharma Norge AS) ； MEG-3⑩ EPA/DHA 鱼油浓缩物(Ocean Nutrition Canada)；DHA FNO “功能性营养油(Functional Nutritional Oil) ” 和 DHA CL “清液(ClearLiquid) ”(Lonza) ;Superba 憐虫下油(Aker Biomarine) ;Martek 生产的含 DHA 的 omega-3产品；Neptune磷奸油(Neptune) ； M(I)IleB生产的鱼肝油产品和抗反流(ant1-reflux)鱼油浓缩物(TG) ；Lysi omega-3 鱼油；Seven Seas TrioHMgl 鱼肝油混合物(Seven Seas)；Fri Flyt omega-3 (Vcstci^lciis):以及Epadel (Mochida)。这些市售的具体实例提供了多
种omega-3脂肪酸、组合以及酯基转移方法或制备方法得到的其他成分，其中所述方法或制备方法是为了从多种来源(例如海产品、藻类、微生物(单细胞)和/或植物来源)得到omega-3脂肪酸。在本发明公开的一些实施方式中，所述脂肪酸油混合物含有至少一种omega-3脂肪酸，例如EPA和/或DHA。在至少一个实施方式中，所述脂肪酸油混合物含有EPA和DHA。，所述脂肪酸油混合物可进一步包含至少一种其他脂肪酸，例如EPA和DHA以外的多不饱和脂肪酸(PUFA)。这种PUFA的实例包括但不限于:其他omega-3脂肪酸，例如EPA和DHA以外的C2(|-C22omega-3脂肪酸,和omega-6脂肪酸。在本发明的一些实施方式中，所述方法制备C22:5n-3(n_3DPA)的浓缩物。用于浓缩omega-3脂肪酸·的方法本发明公开的一些实施方式涉及从脂肪酸油混合物中浓缩至少一种omega-3脂肪酸的方法。根据一个实施方式，所述方法包括混合脂肪酸油混合物和银盐水溶液，例如硝酸银(AgNO3)溶液。虽然本讨论集中在AgNO3I，但本领域技术人员将认识到，可使用其他合适的银盐，例如四氟硼酸银(AgBF4)。银离子可以与脂肪酸油混合物中的多不饱和脂肪酸形成络合物，所述多不饱和脂肪酸如omega-3脂肪酸，例如EPA和/或DHA。由此形成的银络合物可存在于水相中，而脂肪酸油混合物中的其他脂肪酸(例如，饱和脂肪酸、短链脂肪酸、单不饱和脂肪酸和/或其他不饱和脂肪酸，如双键比所述复杂的PUFA更少的脂肪酸)可作为不溶的脂肪酸存在于有机相中。所述银盐溶液(例如AgNO3溶液)的浓度范围可以为约10%重量至约90%重量，例如约60%重量至约80%重量。在一些实施方式中，例如，AgNO3水溶液的浓度为约60%重量、约70%重量、约75%重量或约80%重量。在一些实施方式中，脂肪酸油混合物与AgNO3的重量比为至少0.4。例如，在一些实施方式中，脂肪酸油混合物与AgNO3的重量比范围为约
0.4至约1.6。所述脂肪酸油混合物和AgNO3溶液可在室温(例如，约20° C至约25。C)，或通过冷却在低于室温的温度，例如约-25° C至约20° C，或在高于室温的温度，例如约25° C至约90° C混合。在与脂肪酸油混合物混合之前和/或之后，至少一种有机溶剂(例如极性有机溶剂)可以加入到AgNO3溶液中。合适的有机溶剂的实例包括但不限于醇，例如乙醇和甲醇。极性有机溶剂的加入可例如提高脂肪酸从脂肪酸油混合物到AgNO3水溶液的溶解度。所述脂肪酸油混合物和AgNO3溶液通常混合大约数分钟至几小时，例如，约15分钟至约2小时，从而得到有机相和水相，例如油-水乳液。本领域技术人员将认识到，所需的混合时间将取决于所涉及的体积和混合效率。例如，在通过微型反应器制备的节涌流(slugflow)中，当用硝酸银水溶液提取DHA乙酯和EPA乙酯时，可能需要小于20秒即达到平衡(Seike等人(2007) Journal of Chemical Engineering of Japan, Vol.40,ppl076_1084)。对于汇聚在一起使混合效率较低的大体积，脂肪酸与银离子水溶液的转移和络合将花费基本上更长的时间以达到平衡，例如2小时或更长。 沉降后，所述有机相和水相可根据本领域中已知的方法进行分离。例如，相分离可通过将所述混合物放置足够长的时间以获得两个基本透明的相、通过离心分离、通过膜技术或通过其他合适的方法进行。除去有机相后，水相可用置换液(例如有机溶剂)提取，从而形成至少一种提取物。例如，所述置换液可通过优先除去某种脂肪酸(如EPA和DHA以外的omega-6脂肪酸和/或omega-3脂肪酸)，提供升高的选择性。不受理论所束缚，所述置换液可通过影响脂肪酸在水相中的相对溶解度和/或通过与银络合物相互作用来提供选择性。在一些情况下，可选择置换液使其不与银离子形成络合物，或与比待浓缩的omega-3脂肪酸相比，使其与银离子形成弱的络合物。合适的置换液的实例包括但不限于:烷烃、烯烃、环烷烃、环烯烃、二烯烃、芳烃(aromates)和卤代溶剂。可以非限制性地提及具体实例，例如二氯甲烷和含有一个或多个氯原子的其他溶剂和/或一种或更多种其他的卤化物、己烷、己烯、庚烷、庚烯、环己烷、环己烯、1，7-·辛二烯、1，5-环辛二烯，以及包含一个或多个双键的其他烯烃，例如包含一个、两个或甚至三个双键的烯烃，以及含有氧和氮的溶剂，例如酮和酰胺/胺。所述水相可提取超过一次，即，至少两次连续提取。以溶于银离子水相的脂肪酸油混合物的重量计，每次提取中置换液的量的范围可以为约0.1至约5倍。可以根据在浓缩一种或多种具体omega-3脂肪酸时所需的选择性使用不同的置换液和/或置换液的组合。在分离所述水相和有机相前，可将其加热。在这种情况下，确定适当的温度时可考虑所述有机相的沸点。一般来说，可将所述水相/有机相混合物加热至约30° C至约90° C的温度范围。在一些实施方式中，除去所述有机相后加热所述水相，从而形成至少一种提取物。例如，所述水相可加热至至少30° C的温度，例如约30° C至约90° C的温度范围。在这种情况下，加热可导致omega-6脂肪酸和/或具体omega-3脂肪酸(例如EPA和DHA以外的C2(|-C22omega-3脂肪酸)浓缩的脂肪酸油混合物从所述水相中释放。加热应在无氧和足够温和的条件下谨慎完成以避免多不饱和脂肪酸发生氧化、异构化和/或降解。进一步根据所述方法，水相可用水稀释以离解AgNO3络合物，从而游离脂肪酸浓缩物，即，至少一种omega-3脂肪酸浓缩的脂肪酸油混合物。在一些实施方式中，稀释所述水相超过一次，即，至少两次连续稀释。稀释时使用水的量的范围可以为所使用的固体硝酸银(AgNO3(S))的重量的约I至约20倍。确切量取决于多种因素，包括银离子浓度和脂肪酸油混合物的性质。所述脂肪酸浓缩物随后可以从水相中分离以形成至少一种溶液。在一些实施方式中，可回收银离子用于在随后方法中再次使用。例如，可通过再生(包括例如通过电解再生)、过滤、离心分离和/或纯化回收银离子用于再次使用。进一步根据所述方法，水相可在超临界压力下用二氧化碳(CO2)提取以离解Ag+络合物，从而游离全部或部分脂肪酸浓缩物。二氧化碳可含有至少一种极性调节剂，例如水或醇，例如乙醇。用二氧化碳提取的益处可包括无需大量的水来裂解络合物。CO2易于通过释放压力从乙酯中除去。CO2无毒并且可以为保护活性Ag+不生成非活性Ag2O提供所需的惰性气氛。根据本发明的方法可浓缩至少一种omega-3脂肪酸，同时降低至少一种omega-6脂肪酸在脂肪酸油混合物中的浓度。例如，相对于脂肪酸油混合物，所述方法可提高脂肪酸浓缩物中omega-3与omega-6脂肪酸的比例。在一些实施方式中，脂肪酸浓缩物混合物中omega-3脂肪酸与omega-6脂肪酸(n-3/n_6)的比例大于约40,例如大于约80、大于约100、大于约150或大于约200。在一些实施方式中，脂肪酸浓缩物中的omega-6脂肪酸的总浓度可小于约3%重量，例如小于约2%重量，或小于约1%重量。本发明公开的方法还可以浓缩一种或多种omega-3脂肪酸，同时降低其他omega-3脂肪酸的浓度。在一些实施方式中，例如，所述方法浓缩EPA和DHA，同时降低EPA和DHA以外的C2(l-C22omega-3脂肪酸的浓度。在一些实施方式中，脂肪酸浓缩物中EPA和DHA以外的C2Q-C22omega-3脂肪酸的总浓度小于3%重量，例如小于2.5%重量，例如小于0.5%重量。本发明公开的方法进一步提供通过浓缩相对于其他的omega-3脂肪酸的更多或更少的一种omega-3脂肪酸，来·调整脂肪酸油混合物中的EPA/DHA比例。例如，所述EPA/DHA比例可通过改变温度、置换液和/或水稀释比例，和用含有或不含有极性调节剂(例如水或醇，例如乙醇)的CO2提取进行调整。在一些实施方式中，至少一种脂肪酸浓缩物、至少一种提取物和至少一种溶液中的EPA/DHA比例范围为约0.1至约10，以重量计。所述脂肪酸浓缩物、至少一种提取物和/或至少一种溶液可使用至少一种纯化方法进行纯化。所述纯化方法可除去例如残留的银化合物、残留的置换液、短链脂肪酸(例如，脂肪酸16:4n-l)、通过与银离子络合而富集的低分子量化合物、环境污染物、胆固醇和/或维生素。这种纯化方法包括但不限于:短程蒸馏、分子蒸馏、超临界流体提取、酶分离方法、碘内酯化分懼(iodolactonization fractionation)和制备色谱法。可重复本发明公开的方法以进一步浓缩至少一种omega-3脂肪酸和/或浓缩一种或多种其他的omega-3脂肪酸。所述方法还可以用于浓缩至少一种omega-6脂肪酸。例如，所述脂肪酸浓缩物、至少一种提取物和/或至少一种溶液可包含在一种或多种上述的随后方法中的脂肪酸油混合物。从根据本发明公开的一种或多种浓缩方法获得的脂肪酸浓缩物可包含至少80%的至少一种omega-3脂肪酸,例如至少90%、至少95%或甚至至少98%的至少一种omega-3脂肪酸。从本申请公开的方法获得的脂肪酸浓缩物、至少一种提取物和/或至少一种溶液还可以通过至少一种常规分馏方法例如短程蒸馏、分子蒸馏、碘内酯化分馏、酶分馏方法、提取和/或色谱法进行处·理。由此获得的脂肪酸浓缩物可包含至少80%的至少一种omega-3脂肪酸，例如至少90%、至少95%或甚至至少98%的至少一种omega-3脂肪酸。在一个实施方式中，例如，至少一种分馏方法制备包含至少90%(全-Z)-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(DHA)，例如至少95%DHA，或例如至少98%DHA的脂肪酸浓缩物。在另一个实施方式中，至少一种分馏方法制备包含至少80% (全-Z)-7，10, 13，16，19- 二十二碳五烯酸(DPA)，例如至少90%DPA，例如至少95%DPA，或例如至少98%DPA的脂肪酸浓缩物。本领域技术人员将认识到，通过至少一种常规分馏方法处理根据本发明公开获得的浓缩物能够制备符合例如欧洲药典专论1250,0mega-3-酸乙酯90专论和/或美国药典0mega-3-酸乙酯专论的组合物。本发明公开的方法可减少至少一种环境污染物在脂肪酸油混合物中的浓度，使得所述脂肪酸油浓缩物、至少一种提取物和/或至少一种溶液包含比脂肪酸油混合物浓度更低的至少一种环境污染物。环境污染物包括但不限于:多氯联苯(PCB)化合物、多氯
二苯并二胃恶(PCDD)化合物、多氯二苯并呋喃(PCDF)化合物、溴化阻燃剂如多溴二苯醚
(PBDE)、四溴双酚A (TBBP-A)和六溴环十二烷(HBCD)，以及杀虫剂如DDT (2，2双-(对氯苯基)-1，1，1-三氯乙烷)和DDT的代谢产物。本发明公开的方法还可降低总胆固醇(即，游离和/或结合的胆固醇)在脂肪酸油混合物中的浓度，使得脂肪酸浓缩物包含比脂肪酸油混合物浓度更低的总胆固醇。在本发明的一些实施方式中，在与AgNO3水溶液结合前，所述脂肪酸油混合物在至少一种剥离(stripping)方法步骤(例如蒸馏)中被剥离，其中所述剥离方法步骤降低至少一种环境污染物和/或总胆固醇在脂肪酸油混合物中的量。下面的实施例旨在举例说明本发明，而且本质上并非是限制性的。应理解，本领域技术人员会理解与本文提供的公开相一致的其他实施方式。下表中给出的组成值是基于气相色谱(GC)面积百分·比。本领域技术人员将理解，GC面积百分比不同于GC质量百分比，例如，它们可高于相应的GC质量百分比。在欧洲药典专论2.4.29“ Compos it ion of FattyAcids in Oils Rich in 0mega-3_Acids”中提供了分析GC质量百分比的步骤。·实施例实施例1:温度相分离前。将K50EE用70%重量AgNO3溶液(K50EE:AgN03=3:5)混合约1.5小时并升至所需温度(参见表1，即，8° C、21° C、50° C、60° C或70° C)。将油/水混合物静置约2小时分成水相和有机相，并除去有机相。水相用水稀释(水:AgN03(s) =约7.5:1，以重量计)，导致有机物质(即脂肪酸浓缩物)游离。收集浓缩物并通过GC分析(GC面积％)测定其组成，如表I所示。结果显示，较高的温度降低了 n-6脂肪酸和/或具体的n-3脂肪酸(例如，EPA和DHA以外的长链(LC)脂肪酸)的相对浓度。表1:脂肪酸浓缩物的组成；在各种温度混合K50EE:AgN03=3:5(GC面积％)。
权利要求
1.从脂肪酸油混合物中浓缩至少一种omega-3脂肪酸的方法，所述方法包括: (a)混合脂肪酸油混合物和银盐水溶液以形成水相和有机相，其中在水相中，所述银盐水溶液与至少一种omega-3脂肪酸形成络合物； (b)分离有机相和水相； (c)用置换液提取水相，或将水相的温度升高到至少30°C，或用置换液提取与升高温度相结合，从而形成至少一种提取物； (d)合并水相和水，或用超临界CO2提取水相，或合并水相和水与用超临界C02提取水相相结合，以解离络合物，其中水相包含所述银盐和至少一种含有脂肪酸浓缩物形式的溶液；和 (e)从包含所述银盐的水相中分离所述至少一种含有脂肪酸浓缩物形式的溶液。
2.根据权利要求1的方法，其中银盐的浓度范围为约10%至约90%，以重量计于水中。
3.根据权利要求2的方法，其中银盐的浓度范围为约60%至约80%，以重量计于水中。
4.根据权利要求3的方法，其中银盐的浓度为约60%，以重量计于水中。
5.根据权利要求1的方法，其中所述银盐选自AgNO3和AgBF4。
6.根据权利要求1的方法，其中所述至少一种omega-3脂肪酸选自(全-Z)-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸(EPA)、(全-Z)-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(DHA)及其组合。
7.根据权利要求6的方法，其中所述方法浓缩EPA或DHA，或EPA和DHA。
8.根据权利要求7的方法，其中在至少一种脂肪酸浓缩物、至少一种提取物和至少一种溶液中的EPA/DHA的比例范围为约0.1至约10，以重量计。
9.根据权利要求1的方法，其中所述脂肪酸浓缩物包含至少90%omega-3脂肪酸，以重量计。
10.根据权利要求6的方法，其中所述脂肪酸浓缩物包含至少8096EPA和DHA，以重量计。
11.根据权利要求1的方法，其中所述脂肪酸浓缩物包含相对于脂肪酸油混合物降低了浓度的至少一种omega-6脂肪酸。
12.根据权利要求11的方法，其中所述方法相对于脂肪酸油混合物提高了脂肪酸浓缩物中omega-3与omega-6脂肪酸的比例。
13.根据权利要求11-12中任一项的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中omega-3脂肪酸与omega-6脂肪酸的比例大于约40。
14.根据权利要求11-12中任一项的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中omega-3脂肪酸与omega-6脂肪酸的比例大于约80。
15.根据权利要求11-12中任一项的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中omega-3脂肪酸与omega-6脂肪酸的比例大于约100。
16.根据权利要求11-12中任一项的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中omega-3脂肪酸与omega-6脂肪酸的比例大于约150。
17.根据权利要求11-12中任一项的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中omega-3脂肪酸与omega-6脂肪酸的比例大于约200。
18.根据权利要求11-17中任一项的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中的omega-6脂肪酸的总浓度小于约3%重量。
19.根据权利要求11-17中任一项的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中的omega-6脂肪酸的总浓度小于约2%重量。
20.根据权利要求11-17中任一项的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中的omega-6脂肪酸的总浓度小于约1%重量。
21.根据权利要求1的方法，其中脂肪酸油混合物与银盐溶液的比例范围为约0.4至约1.6,以重量计。
22.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)进一步包括将醇加入水相中。
23.根据权利要求22的方法，其中所述醇包括乙醇。
24.根据权利要求1的方法，其中所述置换液包括有机溶剂。
25.根据权利要求24的方法，其中所述有机溶剂选自卤代溶剂、烷烃、烯烃、环烷烃和环烯烃。
26.根据权利要求24的方法，其中所述有机溶剂选自二氯甲烷、己烷、己烯、环己烷、环己烯和二烯烃。
27.根据权利要求1的方法，其中用置换液提取水相包括至少两个连续提取。
28.根据权利要求1的方法，其中所述至少30°C的温度范围为约30° C至约90° C。
29.根据权利要求1的方法，其中至少重复一次合并水相和水，或用超临界CO2提取水相，或合并水相和水与用超临界C02提取水相相结合，以解离络合物。
30.根据权利要求1的方法，其中，分离包含脂肪酸浓缩物的有机相后，从含有银盐的水相中回收银盐用于再次使用。
31.根据权利要求1的方法，其中所述脂肪酸油混合物来自动物油、植物油、微生物油、藻类油或其任意组合。
32.根据权利要求31的方法，其中所述动物油是海产品油。
33.根据权利要求32的方法，其中所述海产品油是鱼油。
34.根据权利要求31-33中任一项的方法，其中所述油的形式选自甘油酯、乙酯和游离脂肪酸形式。
35.根据权利要求1的方法，其中所述脂肪酸浓缩物包含相对于脂肪酸油混合物降低了浓度的至少一种环境污染物。
36.根据权利要求1的方法，其中所述脂肪酸浓缩物包含相对于脂肪酸油混合物降低了浓度的胆固醇。
37.根据权利要求1的方法，其中所述至少一种omega-3脂肪酸选自乙酯、游离酸和甘油酯的形式。
38.根据权利要求1的方法，其中所述脂肪酸浓缩物包含相对于脂肪酸油混合物降低了浓度的至少一种(全-Z) -5，8，11，14，17- 二十碳五烯酸(EPA)和(全-Z)-4，7，10，13，16，19- 二十二碳六烯酸(DHA)以外的 C20-C22omega-3 脂肪酸。
39.根据权利要求38的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中EPA和DHA以外的C20-C22omega-3脂肪酸的总浓度小于3%重量。
40.根据权利要求38的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中EPA和DHA以外的C20-C22omega-3脂肪酸的总浓度小于2.5%重量。
41.根据权利要求38的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中EPA和DHA以外的C20-C22omega-3脂肪酸的总浓度小于0.5%重量。
42.根据权利要求1的方法，进一步包括:(f)通过至少一种纯化方法纯化所述脂肪酸浓缩物。
43.根据权利要求42的方法，其中所述至少一种纯化方法选自短程蒸馏、分子蒸馏、碘内酯化分离、超临界流体提取、酶分馏和制备色谱法。
44.根据权利要求43的方法，其中所述至少一种纯化方法包含短程蒸馏和分子蒸馏。
45.根据权利要求1的方法，其中所述方法至少重复一次，其中至少一种脂肪酸浓缩物、至少一种提取物和至少一种溶液包含随后方法中的脂肪酸油混合物。
46.根据权利要求45的方法，其中所述方法制备包含至少80%的选自(全-Z)-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸(EPA)和(全-Z)-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(DHA)和(全-Z) -7, 10, 13, 16, 19- 二十二碳五烯酸(DPA)的至少一种omega-3脂肪酸的脂肪酸浓缩物。
47.根据权利要求45的方法，其中所述方法制备包含至少90%的选自EPA、DHA和DPA的至少一种omega-3脂肪酸的脂肪酸浓缩物。
48.根据权利要求45的方法，其中所述方法制备包含至少95%的选自EPA、DHA和DPA的至少一种omega-3脂肪酸的脂肪酸浓缩物。
49.根据权利要求45的方法，其中所述方法制备包含至少98%的选自EPA、DHA和DPA的至少一种omega-3脂肪酸的脂肪酸浓缩物。
50.根据权利要求1的方法，其中所述至少一种脂肪酸浓缩物、至少一种提取物和至少一种溶液通过至少一种分馏方法进行处理。
51.根据权利要求50的方法，其中所述至少一种分馏方法选自蒸馏、提取、碘内酯化和色谱法。
52.根据权利要求50-51中任一项的方法，其中所述至少一种分馏方法制备包含至少80%的选自C2(|-C22omega-3脂肪酸的至少一种omega-3脂肪酸的脂肪酸浓缩物。
53.根据权利要求50-51中任一项的方法，其中所述至少一种分馏方法制备包含至少90%的选自C2(|-C22omega-3脂肪酸的至少一种omega-3脂肪酸的脂肪酸浓缩物。
54.根据权利要求50-51中任一项的方法，其中所述至少一种分馏方法制备包含至少95%的选自C2(|-C22omega-3脂肪酸的至少一种omega-3脂肪酸的脂肪酸浓缩物。
55.根据权利要求50-51中任一项的方法，其中所述至少一种分馏方法制备包含至少98%的选自C2(|-C22omega-3脂肪酸的至少一种omega-3脂肪酸的脂肪酸浓缩物。
56.根据权利要求50-51中任一项的方法,其中所述至少一种omega-3脂肪酸选自(全-Z) -4，7，10，13，16，19- 二十二碳六烯酸(DHA)和(全-Z) -7，10，13，16，19- 二十二碳五烯酸(DPA)。
57.根据权利要求1的方法，其中所述脂肪酸油混合物包含至少一种选自二英、PCBs、DDT和TOBE的持久性有机污染物。
58.根据权利要求57的方法，其中所述方法减少脂肪酸油混合物中的至少一种持久性有机污染物达脂肪酸浓缩物中的至少95%。
59.根据权利要求1的方法，其中所述脂肪酸油混合物包含胆固醇。
60.根据权利要求59的方法，其中所述方法将脂肪酸油混合物中的胆固醇减少到在脂肪酸浓缩物中小于0.lmg/g。
61.根据权利要求1的方法，其中超临界CO2包含至少一种极性调节剂。
62.根据权利要求61的方法，其中所述至少一种极性调节剂选自水和醇。
63.根据权利要求1的方法，其中在约-25°C至约20° C，约20° C至约25° C，或约25。C至约90° C的温度范围内混合脂肪酸油混合物和银盐水溶液。
64.根据权利要求1的方法，其中，混合脂肪酸油混合物和银盐水溶液后，在约-25。C至约20° C，约20° C至约25° C，或约25° C至约90° C的温度范围内分离水相和有机 相。
全文摘要
本发明总体涉及用银盐水溶液(例如AgNO3水溶液)从脂肪酸油混合物中浓缩omega-3脂肪酸的方法。
文档编号C11C1/08GK103221524SQ201180055920
公开日2013年7月24日 申请日期2011年9月23日 优先权日2010年9月24日
发明者H.布雷维克, O.索尔斯塔德, F.O.利布诺 申请人:普罗诺瓦生物医药挪威公司