专利名称：一种微藻油脂提取方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，尤其是涉及一种微藻油脂提取方法。
背景技术：
进入21世纪以来，能源危机从未像今天这样迫在眉睫。石油作为一种不可再生的资源，供应日趋紧张，寻找可替代的能源是人类迫切要解决的问题。与此同时，工业的高速发展带来的二氧化碳巨量排放所导致的换将和气候问题已经严重威胁到人类的后续生存。人们被迫思考，在我们享受工业文明的时候，我们是否还能存在下去。由于石化能源的日益枯竭及其所带来的环境污染问题，使得开发可再生能源成为当今世界的研究热点。微藻既是生产高附加值产品和生物活性物质的潜力资源，又是进行生物能源研究的重要原料。与其他能源植物相比，微藻生物质中的油脂含量高，单位面积产 量最高，可达陆生油料作物的30倍以上，因此被认为是未来生物能源供应的重要原料。201010607927. 3号发明专利公开了一种将微藻粉在甲醇、乙酸或者它们的混合溶剂中浸取，然后将甲醇、乙酸或者它们的混合物蒸发，以得到微藻油脂的方法。但是这种方法，在不破碎细胞壁的前提下用萃取剂进行提取，因为细胞壁不受破坏，细胞中的油脂内含物不能流露出去，萃取难度大，效率也不高。201010593183. 4号发明专利公开了一种以产油微生物发酵醪液为原料，经过酶解、有机溶剂浸提得到微生物油脂的方法。根据其摘要的说法，浸提率最高可达100%。可是广泛的实施和验证，证明其根本不符合事实，因为酶解法破除细胞壁，首先酶作用的原理是与反应物进行靶合，从而促使发生反应，发酵液里面，酶的用量须相当大才能达到使无数个IO9量级的细胞壁发生反应。且酶的催化受反应条件限制，反应中PH值、产物浓度、温度等等多种限制，根本不可能完全催化。更重要的，单一性的酶液，对于工业生产来讲，成本相当高。而常规的破碎及提取方法中，破碎率一般较低，造成细胞浪费，效果也难理想
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种微藻油脂提取方法，所述方法包括下列步骤
(1)将微藻发酵缪液进行离心，收集分离之后的藻体细胞；
(2)将步骤I中所得到的藻体细胞用缓冲液洗涤，再制成待用藻液；
(3)细胞破碎将上述步骤2制得的藻液进行2-3次反复冻融，并且在融化的同时，力口超声波场；
(4)将步骤3中所得到的原液，用索氏提取装置采用萃取剂(丙三醇乙醇石油醚=0. 5:6. 5:3)进行提取，提取条件为
A、萃取剂与原液体积比为41-8:1的比例混合装入反应爸中；
B、将提取温度控制为80°C；
C、提取时间为3h；
(5)烘吹除去步骤4中得到的含有油脂的萃取混合液中的萃取剂。
步骤I所述微藻发酵缪液在3500rpm的离心机内离心20_30分钟。步骤2所述缓冲液为PH6. 5-7. O的PBS缓冲液。步骤3中的冻融条件为_10°C进行冷冻3h，常温解冻O. 5h。步骤3中的超声波为25KHz的超声波，破碎时间4s，间隔时间5s。采用本发明的微藻油脂提取方法，油脂的浸提率可以达到90%以上，且相对于现有的方法，其温度、能耗功率较低，提取条件最适，适合工业扩展，成本低，产率高。
具体实施方式
为了使本发明的目的，使得技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。本发明提供一种微藻油脂提取方法，所述方法包括下列步骤
(I)将微藻发酵缪液进行离心。将微藻发酵缪液在3500rpm的离心机内离心20-30分钟，收集分离之后的藻体细胞。(2)将步骤I中所得到的藻体细胞用PH6. 5-7. O的PBS缓冲液洗涤2_3次，再制成
待用藻液。(3)细胞破碎将上述步骤2制得的藻液进行反复冻融，并且在融化的同时，加超声波场。冻融条件为-10°C进行冷冻，冷冻3h，常温解冻O. 5h ;在融化的过程中，施加25KHZ的超声波，破碎时间4s，间隔时间5s。冻融循环次数为2-3次。(4)提取将步骤3中所得到的原液，用索氏提取装置采用本发明独特配置的萃取剂(丙三醇:乙醇石油醚=0. 5:6. 5:3)进行提取
A、萃取剂与原液体积比为41-8:1的比例混合装入反应爸中；
B、将提取温度控制为80°C；
C、提取时间为3h。(5)将步骤4中得到的含有油脂的萃取混合液，烘吹除去萃取剂，便能得到单一性较好的油脂。本发明与现有技术的区别首先在于采用在相对较适中的温度下，对藻体细胞进行反复冻融，并在融化过程中加设超声波场的方法，对细胞壁进行破坏，使其内含物全部释放出来；采用特制的丙三醇乙醇石油醚=1:6:3的萃取剂进行萃取，最终在精准的条件下控制索氏提取，达到高效的出油率。对比常规的中反复冻融的方法，将待破碎的细胞冷至一 15°C到一 20°C，然后放于40°C迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。这个方法在工业中应用时，因为低温温度在一 15°C到一 20°C冰冻12h至完全冻住，然后40°C迅速融化，工业上要达到较低的制冷温度，首先用电能耗较大，其次还要反复保持12h的超低温，时间长更加进一步加大了成本，且破碎率也达不到较好的效果。单纯的超声波破碎比较细胞弹性较强，破碎率不高效果一样不太理想。本发明将这两种结合起来，是的控制的时间和效果远远大于分别单独实施的效果，同时由于温度、超声强度相对较温和，成本大大降低，时间大大缩短，更主要的细胞破碎率在95%以上。本发明的萃取剂丙三醇乙醇石油醚=0.5:6. 5:3，相对于常用的氯仿+甲醇的萃取剂、乙酸乙酯的萃取剂、无水乙醇萃取剂来说，生化原理上，乙醇作为主要的萃取溶剂提取油脂，同时添加少许的与乙醇任意混溶的甘油，同时再添加石油醚作为辅助兼和溶剂。因为脂质是甘油与脂肪酸酯化反应形成的含有甘油结构的酯类有机物，根据相似相合原理，脂质容易与甘油相合，所有添加一些甘油有助于萃取。但是甘油是油状，挥发性较差，在萃取之后较难与脂质分离，所以对量要有限定。本发明经过多次尝试以后，采取比较好的丙三醇乙醇石油醚=0.5:6. 5:3的比例，萃取的效率较目前的常用的萃取率高出10-20%，适合于脂质提取。本发明中采用的索氏提取的条件，为反复试验之后得出的最佳提取条件
将PBS缓冲液处理后的经过发酵培养的小球藻(中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，编号FACHB-7)细胞制成标准I. OX IO9个/ml的密度，分别进行各个提取条件分析，下表I、表2、表3分别为萃取剂与原液比、温度、时间各个条件下出油率的数据变化情况。表I ^_
权利要求
1.一种微藻油脂提取方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤 (1)将微藻发酵缪液进行离心，收集分离之后的藻体细胞； (2)将步骤I中所得到的藻体细胞用缓冲液洗涤，再制成待用藻液； (3)细胞破碎将上述步骤2制得的藻液进行2-3次反复冻融，并且在融化的同时，力口超声波场； (4)将步骤3中所得到的原液，用索氏提取装置采用萃取剂丙三醇乙醇石油醚=0. 5:6. 5:3进行提取，提取条件为 A、萃取剂与原液体积比为41-8:1的比例混合装入反应爸中； B、将提取温度控制为80°C； C、提取时间为3h； (5)烘吹除去步骤4中得到的含有油脂的萃取混合液中的萃取剂。
2.如权利要求I所述的一种微藻油脂提取方法，其特征在于步骤I所述微藻发酵缪液在3500rpm的离心机内离心20-30分钟。
3.如权利要求2所述的一种微藻油脂提取方法，其特征在于步骤2所述缓冲液为PH6. 5-7. O 的 PBS 缓冲液。
4.如权利要求3所述的一种微藻油脂提取方法，其特征在于步骤3中的冻融条件为-10°C进行冷冻3h，常温解冻O. 5h。
5.如权利要求4所述的一种微藻油脂提取方法，其特征在于步骤3中的超声波为25KHz的超声波，破碎时间4s，间隔时间5s。
全文摘要
本发明一种微藻油脂提取方法，在超声波场条件下用反复冻融的方法破碎细胞壁，然后采用特制的丙三醇乙醇石油醚=0.5:6.5:3萃取剂在最佳的索氏提取条件下进行提取。采用本发明的微藻油脂提取方法，油脂的浸提率可以达到90%以上，且相对于现有的方法，其温度、能耗功率较低，提取条件最适，适合工业扩展，成本低，产率高。
文档编号C11B1/02GK102942991SQ20121051174
公开日2013年2月27日 申请日期2012年12月4日 优先权日2012年12月4日
发明者殷学军 申请人:深圳国能环保节能科技有限公司