专利名称：一种柞蚕丝素蛋白微球及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种有机高分子微球的制备方法，特别涉及一种用柞蚕丝素蛋白为原料制备的微球及其制备方法，属生物医学材料技术领域。
背景技术：
近年来，随着生物技术和基因工程的发展，越来越多的生物活性物质如蛋白质、酶有望用于疾病治疗。然而，由于蛋白质、多肽类药物口服后在肠道中易降解，静脉注射体内循环时间短、生物半衰期短，大大制约了其应用。为解决这些问题，出现了各种蛋白质类药物剂型，包括水凝胶、纳米球、微球、脂质复合物的脂质体、固体脂质纳米粒、油包水型乳剂等。以生物可降解材料制备微球为载体，将生物活性物质固定化后，转运到特定部位，以预定的速率和剂量发挥作用。与其他缓控释系统相比，微球具有制备较简单、稳定性好、成本低等特点，已成为近年来研究的热点。 柞蚕丝素蛋白是由柞蚕丝腺内壁上的内皮细胞分泌的高纯度蛋白质，其氨基酸组成中以甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸为主，具有良好的生物相容性，其本身及其降解产物对细胞和机体无毒，不会或较少引起炎症和免疫排斥反应。特别是其蛋白质分子中含有的RGD三肽序列。RGD序列作为细胞膜整合素受体与细胞外配体相结合的识别位点，介导细胞与细胞外基质及细胞之间的相互作用，能够促进细胞对于微球的识别，提高药物的靶向性、提高药物的生物利用度。将柞蚕丝素蛋白制备成微球用以生物活性物质的装载，缓释给药前景广阔。在本发明作出之前，文献([J]安徽农业大学学报，2005，32 ( 2) : 243 245)报道了一种柞蚕丝素粉的制取方法，以饱和硫酸铵溶液进行盐析使丝素沉淀获得柞蚕丝素粉，这种粉末颗粒大，形状不规则，难以用于药物释放领域。中国发明专利(CN1243059C)公开了一种纳米丝素颗粒的制造方法，通过向丝素蛋白溶液中加入甲醇、乙醇等变性剂，使丝素蛋白变性沉淀，得到纳米丝素蛋白微球，这是用于家蚕丝素蛋白微球的制备。还有文献(Biomaterials, 31 (2010) 1025 - 1035)报道了利用PVA/丝素相分离技术制备几百纳米到几十微米的丝素蛋白微球，需要溶解去除PVA以及仍然是用于家蚕丝素微球的制备。由于家蚕丝素蛋白氨基酸序列中不含有RGD三肽序列，因此对于细胞识别以及靶向性方面不足。而用饱和硫酸铵盐析获得的柞蚕丝素粉末也难以用于生物活性分子的装载。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种具有良好的生物相容性、微球直径小，形状规则，分散性好，不粘连，可被生物降解，且制备工艺简便的柞蚕丝素蛋白微球及其制备方法。本发明采用的技术方案是提供一种柞蚕丝素蛋白微球的制备方法，将柞蚕丝进行脱胶、溶解、透析处理后得到柞蚕丝素蛋白溶液；将柞蚕丝素蛋白溶液浓度调节为10 100mg/mL，在10 60°C的温度条件下，加入柠檬酸或醋酸缓冲溶液调节柞蚕丝素蛋白溶液的pH值为3 6，经超声波震荡和搅拌处理30 100 min,得到柞蚕丝素蛋白微球悬浊液；对得到的悬浊液进行离心分离、冷冻干燥后，得到直径为O. I 10 μ m、可被生物降解的柞蚕丝素蛋白微球。本发明技术方案还包括按上述制备方法得到的柞蚕丝素蛋白微球。本发明的原理是柞蚕丝素蛋白是一种弱的两性天然高分子，其蛋白质序列中含有聚丙氨酸序列疏水链段以及亲水性的氨基酸残基如酪氨酸、丝氨酸等序列。整个柞蚕丝素蛋白分子链可以看成是由80个交替排列的亲疏水区域组成，其结构类似于嵌段型高分子表面活性剂的结构。在水溶液中，柞蚕丝素蛋白分子主要以无规线团的形式存在，亲水和疏水链段随机分散在水溶液中，分子之间相互纠缠，从能量上看，整个体系处于不稳定状态，它具有向稳定结构变化的倾向。在外界物理或化学条件如加热、改变环境PH值、振动和搅拌等的刺激下，柞蚕丝素分子链疏水作用力增强，在溶液内部开始形成少量的β_折叠疏水晶核结构，最终将会自组装成微球。 因此，本发明通过调节温度、pH值、在搅拌以及超声波振动下使柞蚕丝素蛋白原位自组装生成微球。本发明具有以下明显优点
I、自组装原位生成法制备柞蚕丝素蛋白微球，该法工艺过程简单、设备简易、微球产量较高、粒径分布均匀并且尺寸可控，方便选择最适合的微球大小用于载药等应用。制备过程为常温常压的温和过程，避免了化学交联剂或者甲醇、乙醇等变性剂的使用，能够保持柞蚕丝素蛋白的生物相容性，是一种制备柞蚕丝素蛋白微球的新方法。2、采用这种自组装原位生成法制备的柞蚕丝素蛋白微球具有良好的生物相容性，对人体无毒、无害、无免疫原性。这种不溶于水的柞蚕丝素蛋白微球由于粒径小，分散性好，可制成各种化妆品、护肤品、防晒膏等；由于制备过程采用常温常压、无化学交联剂的温和技术，因此可以作为具有生物活性物质的载体，装载酶、核酸、多肽、蛋白质药物等；由于柞蚕丝素蛋白微球直径小，不粘连，可以在血液中自由运行，因而可作为针剂在疾病诊断和治疗中发挥独特作用。
图I是本发明实施例提供的柞蚕丝素蛋白微球的电子显微镜照片。
具体实施例方式下面结合实施例和附图对本发明做进一步描述。实施例I :
将100 g柞蚕生丝放入5 L质量浓度为O. 05%的Na2CO3水溶液中，于98 100°C的温度条件下处理30min，重复4次，使蚕丝脱胶，充分洗涤干燥后得到纯柞蚕丝素纤维。将纯柞蚕丝素纤维加入饱和的硫氰酸锂溶液中，在50°C搅拌溶解成柞蚕丝素蛋白混合溶液。将所得到的柞蚕丝素混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析4天，以除去硫氰酸锂等杂质，得到纯柞蚕丝素蛋白溶液。调节柞蚕丝素蛋白浓度为20 mg/mL,按体积比I :1的比例加入pH=4. 3的醋酸和醋酸钠的缓冲液，混合液置于35 V水浴环境中，同时开启超声波震荡以及搅拌，60min后获得柞蚕丝素蛋白微球悬浊液，经离心分离，冷冻干燥获得柞蚕丝素蛋白微球，不溶于水。参见附图1，它是本实施例提供的柞蚕丝素蛋白微球的电镜图，从图I可以看出，得到的柞蚕丝素蛋白微球呈圆形，不粘连，直径分布在I 3微米，平均直径为2微米。实施例2:
将O. I公斤柞蚕生丝放入3升质量浓度为O. 15%的碳酸钠水溶液中，于98 100°C处理2小时，使柞蚕生丝脱胶，充分洗涤后得到纯柞蚕丝素纤维。将晾干后的纯柞蚕丝素纤维，用I升浓度为9. 3摩尔/升的硫氰酸锂溶液，在50±5°C下加热溶解得到柞蚕丝素蛋白混合溶液。用纤维素膜为透析材料，将所得的柞蚕丝素蛋白混合溶液用去离子水透析3天，去除硫氰酸锂等杂质，得到纯柞蚕丝素蛋白溶液。调节柞蚕丝素蛋白浓度为40 mg/mL,按体积比I :1的比例加入pH=4的醋酸和醋酸钠的缓冲液，混合液置于30 V水浴环境中，同时开启超声波震荡以及搅拌，50min后获 得柞蚕丝素蛋白微球悬浊液，离心分离，冷冻干燥后获得柞蚕丝素蛋白微球。经电镜观察检测，该柞蚕丝素蛋白微球呈圆形，不粘连，直径分布在I 6微米，平均直径为4微米。不溶于水。实施例3
将200克柞蚕丝放入8升质量浓度为O. 05%的碳酸钠水溶液中，于98 100°C处理
O.5小时脱胶，重复处理3次，充分洗涤后得到纯柞蚕丝素纤维。将晾干后的柞蚕丝素纤维用I升浓度为9. 3摩尔/升的硫氰酸锂溶液，55±5°C下加热溶解得到柞蚕丝素蛋白混合溶液。用纤维素膜为透析材料，将所得的柞蚕丝素蛋白混合溶液用去离子水透析3天，得到纯柞蚕丝素蛋白溶液。调节柞蚕丝素蛋白浓度为10 mg/mL,按照体积比I :1的比例加入pH=3的柠檬酸和柠檬酸钠的缓冲液中，混合液置于35 V水浴环境中水浴，同时开启超声波震荡以及搅拌，IOOmin后获得柞蚕丝素蛋白微球悬浊液，然后离心分离，冷冻干燥获得柞蚕丝素蛋白微球。经电镜观察检测，该柞蚕丝素蛋白微球呈圆形，不粘连，直径分布在O. I 2微米，平均直径为O. 5微米，不溶于水。实施例4
将O. 5公斤柞蚕茧壳放入25升质量浓度为O. 5%的中性皂溶液中，于98 100°C处理2小时，使茧壳脱胶，充分洗涤后得到纯柞蚕丝素。将晾干后的纯柞蚕丝素，用2. 5升9摩尔/升的硫氰酸锂水溶液，在60±2°C搅拌溶解成柞蚕丝素蛋白混合溶液。用纤维素膜为透析材料，将所得的柞蚕丝素蛋白混合溶液用去离子水透析，去除硫氰酸锂等杂质，得到纯的柞蚕丝素蛋白溶液。调节柞蚕丝素蛋白浓度为20 mg/mL,按体积比I :1的比例加入pH=5的柠檬酸和柠檬酸钠的缓冲液，混合液置于35 V水浴环境中水浴，同时开启超声波震荡以及搅拌，SOmin后获得柞蚕丝素蛋白微球悬浊液，离心分离，冷冻干燥，获得柞蚕丝素蛋白微球。经电镜观察检测，该柞蚕丝素蛋白微球呈圆形，不粘连，直径分布在O. 5 3微米，平均直径为O. 8微米。该微球不溶于水。
权利要求
1.一种柞蚕丝素蛋白微球的制备方法，将柞蚕丝进行脱胶、溶解、透析处理后得到柞蚕丝素蛋白溶液，其特征在于再进行如下步骤的加工将柞蚕丝素蛋白溶液浓度调节为10 100mg/mL,在10 60°C的温度条件下，加入柠檬酸或醋酸缓冲溶液调节pH值为3 6，经超声波震荡和搅拌处理30 100 min，得到柞蚕丝素蛋白微球悬浊液；经离心分离、冷冻干燥，得到直径为O. I 10 μ m、可被生物降解的柞蚕丝素蛋白微球。
2.一种按权利要求I制备方法得到的柞蚕丝素蛋白微球。
全文摘要
本发明公开了一种柞蚕丝素蛋白微球及其制备方法。将柞蚕丝进行脱胶、溶解、透析处理后得到柞蚕丝素蛋白溶液，调节溶液浓度为10～100mg/mL，在10～60℃下，加入柠檬酸或醋酸缓冲溶液调节pH值为3～6，经超声波震荡和搅拌处理，得到柞蚕丝素蛋白微球悬浊液；经离心分离、冷冻干燥，得到直径为0.1～10μm、可被生物降解的柞蚕丝素蛋白微球。本发明采用原位自组装生成法制备柞蚕丝素蛋白微球，工艺过程简单、微球粒径分布均匀，且保持了柞蚕丝素蛋白的RGD序列，能够促进细胞对于微球的识别，提高药物的靶向性和生物利用度，可作为具有生物活性物质的载体，装载酶、核酸、多肽、蛋白质药物等，应用于疾病诊断和治疗等。
文档编号A61Q17/04GK102977381SQ201210527040
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日
发明者卢神州, 毛丽, 李贵军, 邢铁玲 申请人:苏州大学