一种提取小球藻中油脂的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提取小球藻中油脂的方法，属于微藻生化工程【技术领域】，包括细胞破碎、萃取、制备藻油和回收小球藻细胞三个步骤。该方法不需要加入絮凝剂、不需要进行浓缩、不需要进行离心或者干燥制藻粉，具有提藻油工艺流程短、操作过程简单、提取时间短、能耗低、成本低、藻油收率高、适于直接从发酵液中提油的优点。
【专利说明】一种提取小球藻中油脂的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微藻生化工程【技术领域】，具体涉及一种提取小球藻中油脂的方法。
【背景技术】
[0002]全球变暖和石油危机催生着低碳经济的发展，替代能源的研究变得刻不容缓。微藻生物柴油作为一种新型绿色能源，由于能够减少CO2的排放、脂质含量高、产量高、土地占用面积小等优点，成为目前世界各国研究的热点。
[0003]利用小球藻进行油脂生产是一个复杂的系统工程，涵盖多个技术环节，包括小球藻的筛选和培育、小球藻的规模培养、油脂的收集和加工等几个方面。每个环节都对设备和生产水平有较高的要求。微藻胞壁坚韧，细胞胞体较油料作物小，所以传统的压榨法、有机溶剂提取法往往很难实现微藻油脂的高效提取。因此探索适合微藻脂质提取工艺方法是必要的。目前利用藻类制备油脂整体成本都比较高，因此寻找工艺简单、能耗少、效率高的提取途径关系到藻类制备油脂前景。
[0004]中国专利200810138499.7公开了一种微生物油脂分离提取方法，但是该方法需要先在搅拌的状态下使用分子筛对藻液进行浓缩。这个过程需要消耗大量的时间、能量。另外回收分子筛的过程中，分子筛和藻细胞混在一起，会造成藻细胞的损失或分子筛的堵塞。在分子筛再生的过程中，还需要进行加热或减压才能恢复分子筛的脱水性能，这个过程同样需要消耗大量的能源,总体成本高,不利于推广和工厂化生产。
[0005]中国专利CN102559376B公开了一种提取异养小球藻中性油脂的方法，但该方法需要先离心收集藻细胞，在整个离心的过程中需要消耗较多的能源。在异养小球藻的发酵过程中，会有部分藻细胞因溶氧、营养物质缺乏而死亡或自溶，生物量(干重)越高这种现象越明显，当生物量(干重)超过100g/L时，其死亡或自溶量约占总量的20?35%。在离心时候，会发生分层:细胞碎片会集聚在最上方，中间是水，最下层是正常细胞。采用离心会导致死亡或自溶部分所产生的油脂损失。
[0006]中国专利201210431210.7公开了一种藻类细胞中的生物油脂及其制备方法和应用，该方法使用了臭氧与高压共同处理藻细胞，不断打压、泄压反复处理40?80次来达到细胞破碎的效果，这个过程操作麻烦能耗高，而且快速泄压有较大的噪音。
[0007]中国专利CN103725413A公开了一种从小球藻中提取海藻油的方法，该方法通过反复冻融技术对小球藻进行破壁处理，用乙醇做溶剂提取海藻油，操作简单、能耗小，但是破壁效果差，油脂提取率低。
[0008]综上所述，现有公开的的藻油提取技术，均存在工艺复杂、能耗较高、提取率低、提取速率慢的缺点。
【发明内容】
[0009]为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种提取小球藻中油脂的方法，该方法不需要加入絮凝剂、不需要进行浓缩、不需要进行离心或者干燥制藻粉，具有提藻油工艺流程短、操作过程简单、提取时间短、能耗低、成本低、藻油收率高、适于直接从发酵液中提油的优点。
[0010]为实现上述发明目的，本发明提供的具体技术方案如下:
[0011]一种提取小球藻中油脂的方法，包括以下步骤:
[0012]I)细胞破碎:将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合，配制成小球藻溶液，再加入纤维素酶，然后将超声破碎仪的超声探头插入小球藻溶液中进行细胞破碎；
[0013]2)萃取:向上述步骤I)破碎后的小球藻溶液中加入疏水性有机溶剂对油脂成分进行萃取，萃取过程继续使用超声破碎仪；
[0014]3)制备藻油和回收小球藻细胞:萃取结束后，加入10%氢氧化钾溶液沉淀小球藻细胞进行回收，摇匀静止10分钟后收集上层有机相，然后旋转蒸发获得油脂。
[0015]所述步骤I)细胞破碎中，小球藻溶液浓度是I X 101°个藻细胞/mL。
[0016]所述步骤I)细胞破碎中，纤维素酶加入量为I?5mg/lmL小球藻溶液，活性单位为20万。
[0017]所述步骤I)细胞破碎中，超声破碎仪功率为250W，探头距离溶液底部I厘米。
[0018]所述步骤I)细胞破碎中，反应所需环境条件是25?35°C，pH 6.0。
[0019]所述步骤I)细胞破碎中，细胞破碎时间是I小时。
[0020]所述步骤2)萃取中，疏水性有机溶剂采用石油醚2 (沸程60?90°C )，添加量为小球藻溶液体积的1/2。
[0021]所述步骤2)萃取中，萃取时间为I小时,萃取温度30?40°C,萃取过程中需要进行振荡。
[0022]所述步骤2)萃取中，超声破碎仪用法同步骤I)。
[0023]本发明的有益之处是:
[0024](I)不需要反复调节压力和温度、不需要加入絮凝剂、不需要进行离心或者干燥制藻粉，而是直接进行细胞破碎，破碎液在利用疏水性有机溶剂萃取时可以直接将里面的油脂萃取出来，提藻油的工艺流程极短，只有三步就可以获得藻油，藻油的提取率高，减少了工艺流程、减少了物料损失、减少了能源消耗。
[0025](2)25?35°C，PH 6.0能够保证油品的质量和色泽，同时结合纤维素酶和超声破碎仪，极大提高小球藻细胞破壁率和油脂提取率。
[0026](3)回收的小球藻经过破壁，其中所富含的各种营养成分能够完全释放出来被人体吸收，用于小球藻产品制造，不会造成浪费，而且营养价值更高。
【具体实施方式】
[0027]实施例1
[0028]I)细胞破碎:将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合，配制成小球藻溶液10mL,浓度是I X 101°个藻细胞/mL，再加入10mg活性单位为20万的纤维素酶，然后将功率为250W的超声破碎仪的超声探头插入小球藻溶液距离底部I厘米处，在25?35°C，pH 6.0环境条件下进行细胞破碎I小时，细胞破碎率为96.3% ;
[0029]2)萃取:向上述步骤I)破碎后的小球藻溶液中加入疏水性有机溶剂石油醚2 (沸程60?90°C ) 50mL, 30?40°C温度条件下对油脂成分萃取I小时，萃取过程进行间歇性振荡；
[0030]3)制备藻油和回收小球藻细胞:萃取结束后，加入10%氢氧化钾溶液沉淀小球藻细胞进行回收，摇匀静止10分钟后收集上层有机相，然后旋转蒸发获得油脂，油脂提取率为 78.7%。
[0031]实施例2
[0032]I)细胞破碎:将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合，配制成小球藻溶液10mL,浓度是I X 101°个藻细胞/mL，再加入300mg活性单位为20万的纤维素酶，然后将功率为250W的超声破碎仪的超声探头插入小球藻溶液距离底部I厘米处，在25?35°C，pH 6.0环境条件下进行细胞破碎I小时，测得细胞破碎率为99.2% ;
[0033]2)萃取:向上述步骤I)破碎后的小球藻溶液中加入疏水性有机溶剂石油醚2 (沸程60?90°C ) 50mL, 30?40°C温度条件下对油脂成分萃取I小时，萃取过程进行间歇性振荡；
[0034]3)制备藻油和回收小球藻细胞:萃取结束后，加入10%氢氧化钾溶液沉淀小球藻细胞进行回收，摇匀静止10分钟后收集上层有机相，然后旋转蒸发获得油脂，油脂提取率为 86.4%o
[0035]实施例3
[0036]I)细胞破碎:将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合，配制成小球藻溶液10mL,浓度是I X 101°个藻细胞/mL，再加入500mg活性单位为20万的纤维素酶，然后将功率为250W的超声破碎仪的超声探头插入小球藻溶液距离底部I厘米处，在25?35°C，pH 6.0环境条件下进行细胞破碎I小时，测得细胞破碎率为99.5% ;
[0037]2)萃取:向上述步骤I)破碎后的小球藻溶液中加入疏水性有机溶剂石油醚2 (沸程60?90°C ) 50mL, 30?40°C温度条件下对油脂成分萃取I小时，萃取过程进行间歇性振荡；
[0038]3)制备藻油和回收小球藻细胞:萃取结束后，加入10%氢氧化钾溶液沉淀小球藻细胞进行回收，摇匀静止10分钟后收集上层有机相，然后旋转蒸发获得油脂，油脂提取率为 89.7%。
[0039]实施例4
[0040]I)细胞破碎:将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合，配制成小球藻溶液10mL,浓度是I X 101°个藻细胞/mL，再加入10mg活性单位为20万的纤维素酶，在25?35°C，pH6.0环境条件下进行细胞破碎I小时，测得细胞破碎率为62.9% ;
[0041]2)萃取:向上述步骤I)将功率为250W的超声破碎仪的超声探头插入破碎后的小球藻溶液距离底部I厘米处，然后加入疏水性有机溶剂石油醚2 (沸程60?90°C )50mL,30?40°C温度条件下对油脂成分萃取I小时，萃取过程进行间歇性振荡；
[0042]3)制备藻油和回收小球藻细胞:萃取结束后，加入10%氢氧化钾溶液沉淀小球藻细胞进行回收，摇匀静止10分钟后收集上层有机相，然后旋转蒸发获得油脂，油脂提取率为 81.6%。
[0043]实施例5
[0044]I)细胞破碎:将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合，配制成小球藻溶液10mL,浓度是I X 101°个藻细胞/mL，再加入300mg活性单位为20万的纤维素酶，在25?35°C，pH6.0环境条件下进行细胞破碎I小时，测得细胞破碎率为68.1% ;
[0045]2)萃取:向上述步骤I)将功率为250W的超声破碎仪的超声探头插入破碎后的小球藻溶液距离底部I厘米处，然后加入疏水性有机溶剂石油醚2 (沸程60?90°C )50mL,30?40°C温度条件下对油脂成分萃取I小时，萃取过程进行间歇性振荡；
[0046]3)制备藻油和回收小球藻细胞:萃取结束后，加入10%氢氧化钾溶液沉淀小球藻细胞进行回收，摇匀静止10分钟后收集上层有机相，然后旋转蒸发获得油脂，油脂提取率为 84.8%0
[0047]实施例6
[0048]I)细胞破碎:将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合，配制成小球藻溶液10mL,浓度是I X 101°个藻细胞/mL，再加入300mg活性单位为20万的纤维素酶，在25?35°C，pH6.0环境条件下进行细胞破碎I小时，测得细胞破碎率为69.5% ;
[0049]2)萃取:向上述步骤I)将功率为250W的超声破碎仪的超声探头插入破碎后的小球藻溶液距离底部I厘米处，然后加入疏水性有机溶剂石油醚2 (沸程60?90°C )50mL,30?40°C温度条件下对油脂成分萃取I小时，萃取过程进行间歇性振荡；
[0050]3)制备藻油和回收小球藻细胞:萃取结束后，加入10%氢氧化钾溶液沉淀小球藻细胞进行回收，摇匀静止10分钟后收集上层有机相，然后旋转蒸发获得油脂，油脂提取率为 88.7%。
[0051]实施例7
[0052]I)细胞破碎:将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合，配制成小球藻溶液10mL,浓度是I X 101°个藻细胞/mL，再加入10mg活性单位为20万的纤维素酶，然后将功率为250W的超声破碎仪的超声探头插入小球藻溶液距离底部I厘米处，在25?35°C，pH 6.0环境条件下进行细胞破碎I小时，测得细胞破碎率为96.3% ;
[0053]2)萃取:向上述步骤I)将功率为250W的超声破碎仪的超声探头插入破碎后的小球藻溶液距离底部I厘米处，然后加入疏水性有机溶剂石油醚2 (沸程60?90°C )50mL,30?40°C温度条件下对油脂成分萃取I小时，萃取过程进行间歇性振荡；
[0054]3)制备藻油和回收小球藻细胞:萃取结束后，加入10%氢氧化钾溶液沉淀小球藻细胞进行回收，摇匀静止10分钟后收集上层有机相，然后旋转蒸发获得油脂，油脂提取率为 87.2%。
[0055]实施例8
[0056]I)细胞破碎:将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合，配制成小球藻溶液10mL,浓度是I X 101°个藻细胞/mL，再加入300mg活性单位为20万的纤维素酶，然后将功率为250W的超声破碎仪的超声探头插入小球藻溶液距离底部I厘米处，在25?35°C，pH 6.0环境条件下进行细胞破碎I小时，测得细胞破碎率为99.2% ;
[0057]2)萃取:向上述步骤I)将功率为250W的超声破碎仪的超声探头插入破碎后的小球藻溶液距离底部I厘米处，然后加入疏水性有机溶剂石油醚2 (沸程60?90°C )50mL,30?40°C温度条件下对油脂成分萃取I小时，萃取过程进行间歇性振荡；
[0058]3)制备藻油和回收小球藻细胞:萃取结束后，加入10%氢氧化钾溶液沉淀小球藻细胞进行回收，摇匀静止10分钟后收集上层有机相，然后旋转蒸发获得油脂，油脂提取率为 95.6%。
[0059]实施例9
[0060]I)细胞破碎:将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合，配制成小球藻溶液10mL,浓度是I X 101°个藻细胞/mL，再加入300mg活性单位为20万的纤维素酶，然后将功率为250W的超声破碎仪的超声探头插入小球藻溶液距离底部I厘米处，在25?35°C，pH 6.0环境条件下进行细胞破碎I小时，测得细胞破碎率为99.5% ;
[0061]2)萃取:向上述步骤I)将功率为250W的超声破碎仪的超声探头插入破碎后的小球藻溶液距离底部I厘米处，然后加入疏水性有机溶剂石油醚2 (沸程60?90°C )50mL,30?40°C温度条件下对油脂成分萃取I小时，萃取过程进行间歇性振荡；
[0062]3)制备藻油和回收小球藻细胞:萃取结束后，加入10%氢氧化钾溶液沉淀小球藻细胞进行回收，摇匀静止10分钟后收集上层有机相，然后旋转蒸发获得油脂，油脂提取率为 96.1%。
[0063]上述实施例1、2、3是仅在细胞破碎过程中使用超声破碎仪，纤维素酶的用量对小球藻细胞破碎率和油脂提取率的影响，可以看出，在其他因素相同的条件下，小球藻细胞破碎率和油脂提取率随着纤维素酶用量的增加而增大，而纤维素酶用量在300mg和500mg时，细胞破碎率和油脂提取率差异不明显，因此纤维素酶的最佳用量为3mg/lmL小球藻溶液。
[0064]实施例4、5、6是仅在萃取过程中使用超声破碎仪,纤维素酶的用量对小球藻细胞破碎率和油脂提取率的影响，结果同上。
[0065]实施例7、8、9是在细胞破碎和萃取两个步骤中均使用超声破碎仪，纤维素酶的用量对小球藻细胞破碎率和油脂提取率的影响，结果同上，但仅在细胞破碎过程中使用超声破碎仪，油脂提取率较低，仅在萃取过程中使用超声破碎仪，细胞破碎率和油脂提取率都较低，而在细胞破碎和萃取两个步骤中均使用超声破碎仪，细胞破碎率和油脂提取率都达到很闻水平，操细胞破壁率最闻可达到99.5%,油脂提取率最闻可达到96.1 %。
[0066]综上所述，本发明最佳的实施方案是实施例9所述方案。本发明不需要反复调节压力和温度、不需要加入絮凝剂、不需要进行离心或者干燥制藻粉，而是直接进行细胞破碎，破碎液在利用疏水性有机溶剂萃取时可以直接将里面的油脂萃取出来，提藻油的工艺流程极短，只有三步就可以获得藻油，藻油的提取率高，减少了工艺流程、减少了物料损失、减少了能源消耗，在25?35°C，PH 6.0条件下能够保证油品的质量和色泽，同时结合纤维素酶和超声破碎仪，极大提高小球藻细胞破壁率和油脂提取率，回收的小球藻经过破壁，其中所富含的各种营养成分能够完全释放出来被人体吸收，用于小球藻产品制造，不会造成浪费，而且营养价值更高。
【权利要求】
1.一种提取小球藻中油脂的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)细胞破碎:将新鲜小球藻与磷酸盐缓冲溶液混合，配制成小球藻溶液，再加入纤维素酶，然后将超声破碎仪的超声探头插入小球藻溶液中进行细胞破碎； 2)萃取:向上述步骤I)破碎后的小球藻溶液中加入疏水性有机溶剂对油脂成分进行萃取，萃取过程继续使用超声破碎仪； 3)制备藻油和回收小球藻细胞:萃取结束后，加入10%氢氧化钾溶液沉淀小球藻细胞进行回收，摇匀静止10分钟后收集上层有机相，然后旋转蒸发获得油脂。
2.根据权利要求1所述的一种提取小球藻中油脂的方法，其特征在于，所述步骤I)中，小球藻溶液浓度是I X 1010个藻细胞/mL。
3.根据权利要求1所述的一种提取小球藻中油脂的方法，其特征在于，所述步骤I)中，纤维素酶加入量为I?5mg/lmL小球藻溶液,活性单位为20万。
4.根据权利要求1所述的一种提取小球藻中油脂的方法，其特征在于，所述步骤I)中，超声破碎仪功率为250W，探头距离溶液底部I厘米。
5.根据权利要求1所述的一种提取小球藻中油脂的方法，其特征在于，所述步骤I)中，反应所需环境条件是25?35°C，pH 6.0。
6.根据权利要求1所述的一种提取小球藻中油脂的方法，其特征在于，所述步骤I)中，细胞破碎时间是I小时。
7.根据权利要求1所述的一种提取小球藻中油脂的方法，其特征在于，所述步骤2)中，疏水性有机溶剂采用石油醚2 (沸程60?90°C )，添加量为小球藻溶液体积的1/2。
8.根据权利要求1所述的一种提取小球藻中油脂的方法，其特征在于，所述步骤2)中，萃取时间为I小时，萃取温度30?40°C，萃取过程中需要进行振荡。
9.根据权利要求1所述的一种提取小球藻中油脂的方法，其特征在于，所述步骤2)中，超声破碎仪用法同步骤I)。
【文档编号】C11B1/04GK104312720SQ201410632017
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】白玉龙, 张国威 申请人:甘肃德福生物科技有限公司