一种放线菌素的应用的制作方法

本发明涉及一种源自海洋微生物的放线菌素，尤其是涉及一种放线菌素的应用。

背景技术：

海洋微生物资源丰富，而放线菌素(actinomycins)则是由海洋微生物制备得到的一类色素肽类抗生素，具有广泛的生物活性，包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒等活性，目前被应用于生物制药等领域，尚有更多的应用领域有待开发。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种放线菌素的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：放线菌素作为染料在纺织面料印染上的应用。

所述的纺织面料为真丝面料。

所述的放线菌素为放线菌素x2，化学结构式为其中数字表示碳原子的标位。

所述的放线菌素x2由原料鞘丝藻lyngbyasp制备得到。

与现有技术相比，本发明的优点在于将从海洋植物中得到的放线菌素作为天然色素对涤纶、锦纶、棉以及真丝等纺织材料进行染色，具有很好的染色效果，同时还具有较好的抗菌功效；尤其对真丝布料具有很好的染色效果，干摩擦牢度4–5级，湿摩擦牢度4级，皂洗牢度为4级；而利用放线菌素x2染色的真丝对金黄色葡萄球菌具有显著抑制作用，o.w.f(onweightoffabric)为4％时，抑菌率为99.49％。

放线菌素应用在染织材料中，原料容易获得，成本低，且抗菌活性使其作为功能染料，在工业上具有很好的应用前景。

放线菌素作为天然色素使用，可以解决化学合成色素用于纺织品染色的染料时存在的安全性、健康性、环保性等方面的问题。

附图说明

图1为本发明实施例一中制备得到的链霉菌a102在培养基上28℃培养7天的照片和在显微镜下观察的图片；

图2为链霉菌a102菌株发酵粗提液的hplc分析图；

图3为本发明实施例一制备得到的放线菌素x2的全波长光谱图；

图4为本发明实施例一中使用放线菌素x2对不同材料织物的染色效果评价图片；

图5为染色真丝(o.w.f＝1％)的抗菌实验结果图(菌液稀释倍数10^-3)，其中，a为空白组，b为对照组，c为实验组；

图6为本发明实施例中使用放线菌素d对真丝织物的染色效果评价图片，其中，(a)为染色前，(b)为染色后，(c)为皂煮后。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

以下具体实施例用来进一步说明本发明，但本发明绝非限于这些例子。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为市购产品，实验步骤如无特殊说明均为标准步骤。

实施例一：放线菌素x2在纺织面料染色上的应用。

本实施例的放线菌素x2通过以下方法制备：

1)将采自温州南麂岛的鞘丝藻lyngbyasp.样品，剪成1cm×1cm的方块，加少许水用研钵充分研磨，利用10倍稀释法将研磨液稀释为10^-2、10^-3的液体，涂布在ph＝7.4–7.6的加盐培养基上，28℃恒温培养6–7天，挑选出外泌黄色色素的菌株，得到链霉菌，命名为a102，用20％甘油将菌株保存于-80℃，待用，其中加盐培养基的配方为：20g可溶性淀粉，1gkno3，0.5gk2hpo4，0.5gmgso4·7h2o，0.5gnacl，0.01gfeso4·7h2o，20g琼脂，25g海盐，1l蒸馏水；

形态观察：在高氏一号平板成白色斑点状，外圈有菌丝。培养3–4天后向外分泌黄色色素，6–7天后整个平板完全变为黄色。在光学显微镜下观察，菌体呈现放射状菌丝。

16srrna测序：测序结果与genbank数据库比对，并对序列进行系统发育树的构建，确定菌株为蓝微褐链霉菌streptomycescyaneofuscatus。

链霉菌s.cyaneofuscatusa102，已于2019年8月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.18358。

2)将步骤1)得到的链霉菌纯化后接种到上述相同配方的加盐培养基上，在28℃培养箱中培养5天。

切取上述高氏一号平板表面的菌种适量，接种至已灭菌的、盛有ph＝7.0–7.4的加盐isp4培养基的三角瓶中，28℃恒温下，以摇床转速160rpm震荡培养7天后采用乙酸乙酯灭活，待用；

；加盐isp4培养基为10g/l可溶性淀粉，1g/lmgso4·7h2o，2g/l(nh4)2so4，1mg/lfeso4·7h2o，1g/lk2hpo4，1g/lnacl，2g/lcaco3，1mg/lmncl2·7h2o，1mg/lznso4·7h2o，24.4g/l海盐；

将上述链霉菌a102经加盐isp4培养基发酵培养的发酵液用离心机以转速5000rpm，25℃离心15min；取上层清液，以发酵液：乙酸乙酯＝1：1的比例进行萃取，收集乙酸乙酯层；用旋转蒸发仪浓缩蒸干，用甲醇重溶，过0.22μm的滤膜；进一步利用hplc分离纯化：采用c18柱(ymc-packods-a，250×20mm)，以30–70％的乙腈/水为流动相进行梯度洗脱，流速为8ml/min，收集保留时间tr＝15min的峰(检测波长443nm)，得到放线菌素x2，产量达98.2mg/l，化学结构式为：

，其中数字表示碳原子的标位。

对产物进行鉴定，结果如下：

1)性状：无定形桔红色粉末

2)溶解性：难溶于水，可溶于乙醇，易溶于甲醇、乙酸乙酯等有机试剂

3)紫外光谱：产物全波长光谱如图3所示，在443nm处有最大吸收峰。

4)核磁谱图信号归属：产物¹³c信号归属与文献(frontiersinmicrobiology(2017)doi10.3389/fmicb.2017.01147,identification,bioactivity,andproductivityofactinomycinsfromthemarine-derivedstreptomycesheliomycini,dongyangwang,congwangetal.)报道的放线菌素x2核磁数据完全一致，比较结果见表1。

表1.所制备的产物¹³cnmr数据δc(ppm,incdcl3)与文献比较

放线菌素x2的染色实验：

1)实验材料：本实施例制备所得放线菌素x2、棉、涤纶、锦纶、真丝、皂片、碳酸钠、硫酸钠、剪刀等；

2)染色方法：1％o.w.f，水浴比1：30，温度为80℃，40g/l硫酸钠，8g/l碳酸钠，具体为：

a)裁剪40mm×100mm的棉、涤纶、锦纶和真丝各一块，称重后根据配方称量各试剂量，并配好染浴；

b)织物用水润湿后挤干，分别投入到对应染浴中，置于80℃的恒温水浴锅中染色，不断搅拌，防止染色不匀；

c)上染5min后，向染浴中加入硫酸钠，并不断搅拌，染色30min；

d)向染浴中加入碳酸钠进行固色，不断搅拌；

e)40min后，固色完成，取出试样，充分水洗，晾干。

3)实验结果

染色结果如图4所示，从图中可以看出，该色素对真丝布料染色效果最佳，对真丝布料进行进一步染色效果评价，结果显示干摩擦牢度4–5级，湿摩擦牢度4级，皂洗牢度为4级。

实验结果证明本发明所涉及的放线菌素x2具有很好的真丝染色效果，可用于染整工业。

染色真丝的抗菌活性实验

1)实验材料：染色真丝布料、未染色真丝、营养肉汤(牛肉膏3g/l；蛋白胨5g/l；蒸馏水1l；ph＝6.8±0.2)、肉汤琼脂培养基(牛肉膏3g/l；蛋白胨5g/l；琼脂粉15g/l；蒸馏水1l；ph＝6.8±0.2)、0.03molpbs缓冲液(磷酸氢二钠2.84g/l；磷酸二氢钾1.36g/l；蒸馏水1l；ph＝7.2–7.4)

2)实验方法：

a)吸取2ml活化的金黄色葡萄球菌菌液，移入装有9ml营养肉汤的试管中，充分混匀。吸取1ml移入另一支装有9ml营养肉汤的试管中，充分混匀。吸取1ml移入装有9ml×0.03mol/lpbs缓冲液的试管中，充分混匀。吸取5ml移入装有45ml×0.03mol/lpbs缓冲液的三角烧瓶中。

b)准备9支装有pbs缓冲液的试管，其中3支加入未染色真丝对照样，3支加入染色真丝试样，另3支不加试样作为空白对照。

c)“0”接触时间制样：用吸管往3个对照组试管和3个空白组试管中各加入5ml接种菌液。盖好瓶塞，放在24℃恒温振荡器上，以130–160r/min，振荡1min，然后进行下一步“0”接触时间取样。

d)“0”接触时间取样：用移液枪从“0”接触时间制样的6支试管中各吸取1ml溶液，移入装有9ml×0.03mol/lpbs缓冲液的试管中，充分混匀。用10倍稀释法再进行1次稀释，充分混匀。吸取1ml移入灭菌的平皿，倾注肉汤琼脂培养基约15ml。分别吸取每个10^-2稀释倍数的试管制作两个平板作平行样。室温凝固，倒置平板，37℃培养24h记录每个平板中的菌落数。

e)定时振荡接触：向3个抗菌织物试样试管中各加入5ml接种菌液。已完成“0”接触时间取样且塞好塞子的另6个试管不再加入接种液。再将此9个试样的试管置于24℃恒温振荡器上，以150r/min，振荡24h。

f)24h后，从每个试管中吸取1ml试液，移入装有9ml×0.03mol/lpbs缓冲液的试管中，充分混匀。用10倍稀释法系列稀释至合适稀释倍数。用移液枪从每个稀释倍数的试管中分别吸取1ml加入灭菌的培养皿，倾注肉汤琼脂培养基约15ml。每个处理做两个平行。室温凝固，倒置平板，37℃培养24h。选择菌落数在30cfu–300cfu之间的合适稀释倍数的平板进行计数。若最小稀释倍数平板中的菌落数<30，则按实际数量记录；若无菌落生长，则菌落数记为“<1”。

3)实验结果及分析

“0”接触取样计数结果如表2所示：

表2“0”接触取样计数(稀释倍数10^-2)

定时取样计数结果如表3所示：

表3定时取样计数

a)活菌浓度的计算

根据两个平板得到的菌落数,按式(1)计算每个试样试管内的活菌浓度(保留两位有效数字)。

k＝z×r(1)

k：每个试样烧瓶内的活菌浓度(cfu/ml)；

z：两个平板菌落数的平均值；

r：稀释倍数。

b)试验有效性的判断

根据式(2)计算试验菌的增长值f。对金黄色葡萄球菌，当f大于或等于1.5；且对照烧瓶中的活菌浓度比接种时的活菌浓度增加时，试验判定为有效。否则试验无效，需重新进行试验。

f＝lgwt-1gw0(2)

f：对照样的试验菌增长值；

wt：3个对照样18h振荡接触后试管内的活菌浓度的平均值(cfu/ml))；

w0：3个对照样“0”时接触后试管内的活菌浓度的平均值(cfu/ml)；

wt＝(38+33+52+45)/4×104＝395000cfu/ml(记录平板菌落数在30-300之间的平板)

w0＝(3+1)/2×102＝200cfu/ml

f＝lg395000-lg200＝3.30≥1.5(表明试验有效)

c)抑菌率的汁算

振荡接触18h后，比较对照组与实验组试管内的活菌浓度，按式(3)计算抑菌率(保留2位有效数字)。

y＝(wt-qt)/wt×100％(3)

y：式祥的抑菌率；

wt：3个对照样18h振荡接触后试管内的活菌浓度的平均值(cfu/ml)；

qt：3个实验样18h振荡接触后试管内的活菌浓度的平均值(cfu/ml)。

y＝(395000-2000)/395000×100％＝99.49％≥70％(表明染色真丝对金黄色葡萄球菌有抗菌效果)。抗菌实验的直观效果如图5所示。

实施例二：放线菌素d在真丝面料染色上的应用。

放线菌素d的化学结构式为：

，实验的操作步骤与实施例一相同。

染色结果如图6所示，对真丝布料进行色效果评价结果，皂洗牢度达到4级。