降解生物塑料的真菌菌株及其用途的制作方法

专利名称：降解生物塑料的真菌菌株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株真菌菌株，尤其涉及一株降解PBS、PBSA等生物塑料的 Bionectria属真菌菌株。
背景技术：
塑料的生产和应用给人们带来了巨大方便和经济利益，现今世界塑料年总产量已 超过1.7亿吨，而且每年以2500万吨的速度在环境中积累(史吉平等.我国可降解塑料研 究与生产现状.上海塑料，2006，6(2) :4 8)。我国是世界上十大塑料制品生产和消费国之 一，每年各种塑料包装材料、农用地膜、育苗钵、保鲜膜、一次性日用杂品和医疗材料等难以回 收利用的塑料废弃物达3500万吨以上，环境中的废旧塑料因其在自然界不易分解从而引发 日趋严重的环境污染问题(陈希荣.降解塑料塑材发展的重中之重.中国包装工业，2006， (5) :14 17;唐赛珍等.促进生物降解塑料实用化进程的思考.新材料产业，2005， (7): 53 59;赵红玉等.生物降解塑料与可持续发展.中国塑料，2006， (11) :14 20)。
世界各国的限塑令及我国2008年6月1日起颁布实施的"限塑令"进一步表明了 人们对塑料制品引起的环境污染的重视，但这些措施仍不能从根本上解决"白色污染"问 题。目前，传统塑料的替代品_生物降解塑料(如PLA、 PHA、 PBS、 PBSA等)的研究已成为 21世纪世界各国塑料加工业的研究热点。我国在2007年5月建成了年产2万吨的PBS生 产线，而且其产量将逐年上升。可见，生物降解塑料的研发与应用已成为21世纪的新技术 材料的中心课题。 但是，随着生物可降解塑料使用量的不断增大，出现了新的、不容忽视的环境污染 问题。①将合成塑料与生物降解塑料分开单独回收，即使是在国际上先进的垃圾回收系统 中也是极其困难的；②作为生物可降解塑料主要成分的多聚乳酸类材料实质上在常温下很 难分解，在正常储存和使用过程中性能非常稳定，在自然环境中常温分解仍需要很长时间， 只有在一定的湿度并保证与特定(如堆肥等条件下)的微生物接触时才可分解。因此，在 某种意义上说仍然没有完全解决污染问题；③农膜等农用生物可降解塑料在当年或当茬作 物使用后不能立即分解，导致在下茬作物播种、育苗、耕作时严重影响农机具的使用和后续 的生产；④目前的各种可降解塑料的成分中或多或少的存在一些难降解成分；⑤生物可降 解塑料对于环境中的微生物生态系的影响以及是否会二次污染仍不清楚。国外研究结果显 示微生物是解决生物塑料降解的关键因素之一。 从微生物中提取的酶降解PLA或PBS的研究文献或专利国外已有报道，而且报道 微生物是将PLA或PBS作为唯一碳源利用。但到目前为止，真菌、尤其是Bionectria属真 菌菌株降解PBS以及利用其他碳源产生降解酶降解PBS、以及将微生物菌株或发酵液直接 施加到土壤中降解PBS农用膜等废弃物的报道国内外未见。

发明内容
本发明的目的之一是为了解决生物可降解塑料PBS在自然条件下难以短时间内降解的问题而提供一株能够有效降解生物塑料(尤其是聚丁二酸丁二醇酯(PBS))的 Bionectria属真菌菌株。 本发明的目的之二是上述真菌菌株用于降解生物塑料(尤其是聚丁二酸丁二醇 酯)方面的用途。 本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的 本发明的一株能够有效降解生物塑料的真菌菌株淡色生赤壳菌(Bionectria ochroleuca BFM-X1)，其微生物保藏号是:CGMCCNO. 3470 ;分类命名是:Bionectria ochroleuca ;保藏时间2009年12月10日；保藏地址北京市朝阳区北辰西路，中国科学院 微生物研究所；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
本发明真菌菌株的形态特征在PDA培养基上菌落初期亮象牙色，菌丝稀薄，紧 贴于培养基上，培养后期菌落在培养基背面颜色由培养初期的色变为油菜黄，逐渐变为交 通黄，最终变为金雀花黄(参照RALK7国际标准色卡)，在2『C下培养3天即有分生孢子 产生。分生孢子梗细长直立一般约20-30 m，顶端轮生分生孢子小梗，分生孢子顶生聚集 成团，外壁较光滑无隔，椭圆形至近腊肠形，壁薄，无色，大小4. 2-7. 3X2. 3-4. 0 y m，平均 5. 35X2. 60iim。 本发明菌株Bionectria ochroleuca BFM-X1的分离筛选方法取新鲜森林土壤 10g于盛有100ml无菌水的烧杯中，将烧杯放在磁力搅拌器上搅拌10min后静置lOmin，将 悬浮液用10倍梯度稀释法依次稀释得到10—5，吸取0. 2ml上述10—5 土壤稀释液于加有氯霉 素的含PBS乳剂的无机盐培养基(成分下述)平板上，用玻璃刮铲涂抹均匀后放到温箱中 2『C恒温培养。2-3天后出现真菌菌落，同时一些菌落周围出现透明圈。培养72h后，选择 透明圈在2cm以上的菌落并纯化于新的PDA平板上，待菌落长到直径2cm时挑取菌丝块2mm 左右接种于含PBS乳剂的无机盐平板培养基的中央，并以其为中心对称放入灭菌处理过的 同等大小的PBS薄膜4片(20mmX20mm)，相互间隔为2mm。将处理皿置于温箱恒温暗培养 10d后，发现没有降解功能的菌株的菌丝不能扩展生长到PBS膜表面，而具有降解功能的菌 株能从接种点扩展到膜表面，菌丝生长繁茂。此时，菌丝下面的PBS膜片已降解或只剩降解 末期残片。 本发明菌株Bionectria ochroleuca BFM-X1的筛选及降解特性测定采用的培养 基如下 筛选培养基成分0. Olg硫酸亚铁(单独灭菌)、0. 5g氯化钾、2g硝酸钠、lg磷酸 氢二钾、0. 5g硫酸镁、0. 0005g硫酸锰、氯霉素0. 05g、琼脂15g和定量的PBS乳剂，去离子水 调节总体积为lOOOml。灭菌后冷却倒平板待用。
发酵培养基不加琼脂和氯霉素，其余成份同上。 碳源测定时用1%葡萄糖(W/V)、1X大豆油(V/V)、或1%甘油(V/V)等分别取代 固体或液体培养基中的PBS乳剂。 在往复式摇床(120rpm)上，发酵培养基瓶装量均为250ml/500ml三角瓶，接种量 为5%，28"下恒温发酵培养1周。 本发明的属于真菌的菌株Bionectria ochroleuca BFM-X1的培养特性
(1)培养温度5°C -37"，最适温度范围25°C _35°C ; (2)培养pH值4-11。但直径生长，气生菌丝，产孢量等的最佳pH各有不同。
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(3)该菌株在MEA培养基上气生菌丝不发达，菌丝纤细、具有一定的透明质感、紧 紧贴附于培养基上，菌丝颜色与培养基底色相似呈浅栗肉色，背面色素不明显。在YES培养 基上气生菌丝粗短、厚实、紧密，乳白色又泛着淡淡的红，类似奶酪，有从中心向四周辐射状 皱纹；底部色素由外而内是米黄色向土褐色渐深，凸显的褶纹似菊花花序。在CYA培养基上 气生菌丝介于MEA和YES之间，菌丝交织呈现绒絮状，但紧实贴附于培养基上呈米黄色，也 有从中心向四周辐射状皱纹，背面色素为淡淡的橙红色。 同时提取本发明菌株的rDNA并测定ITS(包括5.8S)区域的基因序列(真菌通用 引物ITS1 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'禾P ITS4 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，)，该菌 株ITS区域基因序列在NCBI基因库进行序列同源性比对，发现与Bionectriaochroleuca 的同源性均在99%以上。对照Bionectria属的形态特征(Schroers HJ. 2001 ;Zhuang WY 2007)，结合形态学和分子生物学方法鉴定菌株BFM-X1为Bionectria属菌株，确认本发明 菌株为生赤壳属的淡色生赤壳(Bionectria ochroleuca(Schwein. ) Schroers & Samuels) 真菌。 此外，具有以下特性的属于生赤壳属(Bionectria)的真菌菌株也具有高效降解 聚丁二酸丁二醇酯(PBS)的特性，这些菌株也应属于本发明的保护范围之内
(1)可利用的碳源物质大豆油，甘油，葡萄糖和PBS ;可利用的碳源浓度范围为 lwt% 10wt%。 (2)室内降解温度范围15。C 38。C，最适降解温度25°C 35°C ; (3)降解pH值4 ll，特定条件下最佳降解pH范围为4 8; 本发明的真菌菌株还包括以上所述菌株的能高效降解PBS的菌株Bionectria
ochroleuca BFM-X1的突变体、变异体或其各种代谢产物、衍生物。 本发明真菌菌株通过下述培养基培养得到培养物或培养液，用于降解处理液体 培养0. 001%硫酸亚铁、0. 05%氯化钾、0. 2%硝酸钠、0. 1%磷酸氢二钾、0. 05%硫酸镁、 0. 0005%硫酸锰、1% PBS乳剂，按上述比列用去离子水调节至所需总体积。固体培养时按 1.5%加琼脂。高压灭菌待用。此外，上述培养基中所利用的碳源物质可用大豆油，甘油，葡 萄糖代替；所利用的碳源浓度范围为lwt% 10wt%。液体培养时将本发明菌株按5%的 接种量接入装有250ml发酵培养基的500ml三角瓶中，在往复式摇床(120rpm) ， 28。C下进行 发酵培养。培养7 10天后的发酵液即可用于降解PBS的处理。 本发明菌株短期内降解效率极为显著，在平均气温低于20 °C条件下施用本发明菌 株发酵液处理土壤后，埋于土壤中的PBS薄膜在70天时的降解率为23. 02%，人工保湿下 70天的降解率达到70. 84% ;在月平均气温高于2『C条件下，埋于土壤中的PBS薄膜70天 时降解率高达75. 44%，而人工保湿情况下70天的降解率达到96. 73%，第75天检查时已 完全降解，土壤中已找不到PBS塑料薄膜残片。实验室控制土壤温湿度条件用该菌株的发 酵液处理土壤后，埋于土中的PBS塑料薄膜30天时降解率已高达65. 48%。
本发明菌株除了能降解PBS夕卜，还能有效降解聚丁二酸/己二酸_ 丁二醇酯 (PBSA)，而且降解时间更短、效率更高。 本发明菌株Bionectria ochroleuca BFM-X1对温度、pH等自然环境条件的适应 范围广，在PH4-11范围内都具有降解PBS的能力。本发明菌株来源于普通土壤，容易培养 和保存，可利用大豆油，甘油，或葡萄糖作为PBS的替代碳源物质对其进行发酵培养。本发
5明菌株可以加快PBS、 PBSA等生物塑料及其废弃物的降解，促进生物降解塑料的使用，减少 白色污染，有利于环境保护。


图1为本发明真菌菌株筛选及降解功能技术路线图。 图2为本发明菌株Bionectria ochroleuca BFM-X1利用不同碳源对PBS薄膜的 降解率。 图3为本发明菌株Bionectria ochroleuca BFM-X1对PBS薄膜随时间降解残片 实物扫描图。 图4为本发明菌株Bionectria ochroleuca BFM-X1在一定碳源不同温度下培养 18d对PBS薄膜的降解效率。 图5为不同pH条件下本发明菌株Bionectria ochroleucaBFM-Xl对PBS薄膜的 降解效率。 图6为用本发明菌株的发酵液处理土壤后，室内控制土壤温湿度条件下30天的土 壤中PBS薄膜降解效率。 图7 (a)为用本发明菌株的发酵液处理土壤后，月均温2『C下室外土壤中PBS薄膜 降解率。 图8 (b)为用本发明菌株的发酵液处理土壤后，月均温低于2(TC下室外土壤中PBS 薄膜降解率。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 本发明的高效降解PBS的菌株Bionectria ochroleuca BFM-X1的筛选方法
(1)分离菌株的土壤采自新疆昌吉州新疆农业大学西山试验林场云杉林下。取 新鲜土壤10g于盛有100ml无菌水的烧杯中，将烧杯放在磁力搅拌器上搅拌10min后静置 10min，用10倍梯度稀释法依次稀释得到10—5稀释液，吸取0. 2ml上述10—5 土壤稀释液于加 有氯霉素的1% PBS乳剂的无机盐培养基平板上，用玻璃刮铲涂抹均匀后放到温箱中28°C 恒温培养。无机盐培养基0.001%硫酸亚铁(须单独灭菌，使用时加到总量中)、0.05%氯 化钾、0. 2%硝酸钠、0. 1%磷酸氢二钾、0. 05%硫酸镁、0. 0005%硫酸锰和1. 5%琼脂。
(2) 2-3天后出现真菌菌落，同时一些菌落周围出现透明圈。培养72h后，选择透明 圈在2cm以上的菌落并纯化于新的PDA平板上。 (3)挑取纯化菌株的菌丝块2mm左右接种于上述含PBS乳剂的无机盐培养基的平 板中央，并以其为中心对称放入70%酒精消毒处理过的2cmX2cm的PBS薄膜4片，相互间 隔为2mm。将处理皿置于恒温箱暗培养5 7d时，有降解功能的菌株能从接种点扩展到膜表 面，在膜面上菌丝生长繁茂，此时菌丝下面的PBS膜片已降解或只剩降解末期残片，对PBS薄膜没有降解能力的菌株只在四片膜的间隙中生长，不能扩展到膜表面。
(4)无菌操作从降解残片上挑取菌丝块转接到PDA平板上，纯化并确认降解性，获
得高效降解菌株Bionectria ochroleuca BFM_X1。 试验例1 取在PDA培养基上培养7天的Bionectria ochroleuca BFM-X1菌块2mm，接种到 各试验处理皿的中央，并以其为中心对称放入70%酒精消毒处理过的2cmX2cm的PBS薄膜 4片，相互间隔为2mm。将温度关系测定皿(在10°C 4(TC之间每隔5t:设一处理，共设7 个温度梯度)分别在各温度处理下恒温暗培养18d。其余各试验处理皿置于28t:恒温暗培 养18d，各试验均设对照处理3皿。对照皿除不接Bionectria ochroleuca BFM-X1菌株之 外，其余同试验组。培养结束后分别轻轻揭下各试验处理皿的膜用无菌水反复轻冲洗，用滤 纸吸干残膜表面水分，分别扫描残存PBS薄膜图像。用于确定降解率与时间关系的试验处 理平行接10个皿，从培养第二天起，隔日拿出一皿轻轻揭下4片膜，冲洗、扫描残存PBS薄 膜图像。最后使用ImageJ 1. 38x软件处理扫描图片，计算各试验处理薄膜损失的面积。其 面积的减少率即为各处理菌株对其的降解率。计算公式为降解率(％ )=薄膜损失的面 积之和/4X 100%。相关试验结果见表1和图2 5。 图2为菌株Bionectria ochroleuca BFM-X1利用不同碳源对PBS薄膜的降解率。 在特定温度暗培养18d时本发明真菌菌株在以一定浓度的甘油、大豆油、葡萄糖、PBS乳剂 分别作为唯一碳源的培养基上均可对PBS薄膜产生降解作用，降解效果差异显著。图3为 本发明菌株Bionectria ochroleuca BFM-X1对PBS薄膜随时间降解残片实物扫描图。在 一定碳源特定温度下，18d时降解率接近百分百。第20天时完全降解，皿内已无薄膜固体残 片。图4为本发明菌株Bionectria ochroleuca BFM-X1在一定碳源不同温度下培养18d对 PBS薄膜的降解效率。图5为不同pH条件下本发明菌株Bionectria ochroleuca BFM-X1 对PBS薄膜的降解效率。本发明菌株在pH4时，特定温度和一定碳源及碳源浓度条件下14d 即可将PBS薄膜100%完全降解。降解的pH范围为4-11。 表1不同乳剂浓度培养基上本发明菌株BFM-X1对PBS薄膜的降解率(％ )
培养基中乳剂所测降解率次数
含量(％)123平均
191. 3790. 8691. 9891. 4± 0. 56
1. 570. 2871. 0170. 4970. 59 ± 0. 38
253. 351. 0550. 4851. 61 ± 1. 49
429. 9731. 2832. 1731. 14 ± 1. 1
619. 0319. 0218. 1418. 73± 0. 51
816. 0214. 3314. 9115. 09 ± 0. 86
103. 013. 094. 113. 4 ± 0. 61 试验例2实验室内用本发明菌株发酵液处理土壤后PBS薄膜降解试验。
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在试验盘中先铺3cm厚的已灭菌并用本发明菌株发酵液搅拌均匀的土壤(按每 lkg 土壤用150ml发酵液搅拌处理)然后按序铺放(提前对每一片PBS薄膜进行称量)PBS 膜(4cmX4cm)，再覆发酵液处理土壤3cm，上面覆盖纱布保湿。每隔一天喷洒定量灭菌水保 持一定湿度，控温恒温培养。隔天取样(取2个平行)，在不破坏材料表面结构的情况下，仔 细洗净表面泥土，晾干，称重，利用重量失重法衡量材料降解率。对照组处理不喷淋本发明 菌株发酵液，其余同上。试验结果见图6。试验结果可见，实验室控制土壤温湿度条件用本 发明菌株的发酵液处理土壤后，埋于土中的PBS薄膜30天时降解率已高达65. 48%。
试验例3用本发明菌株发酵液在室外自然苗圃地对PBS薄膜的降解试验。
先整地，做30cm宽、80cm长的垄，垄间距25cm，每条垄上按序(在试验前对每一片 PBS材料进行称量)铺放2排PBS膜(8cmX8cm)，膜片间距2cm，膜上撒一层薄土，处理组用 喷壶均匀喷洒250ml经28t:恒温暗培养(往复式摇床(120rpm)7 10d)得到的本发明菌 株培养发酵液，再覆土5cm。对照组垄不喷洒本发明菌株发酵液，直接覆土5cm。为了掌握 湿度对PBS膜的降解影响，处理组和对照组又分别设垄床上隔日人工定量喷水保湿和不保 湿维持自然状态两组。每间隔5天取样，在不破坏材料表面结构的情况下，仔细洗净表面泥 土、晾干、称重，利用重量失重法衡量降解率。将试验前后重量的变化占原始重量的百分比 视为降解率。每次取样取2个平行样。 降解率的计算降解率=[(原试样质量-降解后试样质量)/原试样质 量]X100%。 相关试验结果见图7(a)和图8(b)。在月平均气温高于2『C条件下，埋于土壤中 的PBS薄膜70天时降解率高达75. 44%，75天时为80. 78% ;而人工保湿情况下70天的 降解率达到96. 73%，第75天检查时已完全降解，土壤中已找不到PBS塑料薄膜残片(图 7(a))。在平均气温低于2(TC的条件下施用本发明菌株发酵液处理土壤后，埋于土壤中的 PBS薄膜在70天时降解率为23. 02% ，75天时为42. 72% ;人工保湿条件下70天的降解率 达到50.84% ;75天时已达70. 65% (图8(b))。
权利要求
一株降解生物塑料的真菌菌株(Bionectriaochroleuca)，其微生物保藏号是CGMCC NO.3470。
2. 权利要求1所述的真菌菌株的突变体、变异体或其衍生物。
3. 按照权利要求2所述的真菌菌株的突变体、变异体或其衍生物，其特征在于其所利 用的碳源物质选自大豆油，甘油，葡萄糖或生物塑料聚丁二酸丁二醇酯；所利用的碳源浓度 范围为lwt% 10wt%。
4. 由权利要求1所述真菌菌株得到的菌株培养物或发酵培养液。
5. 由权利要求2或3所述真菌菌株的突变体、变异体或其衍生物得到的菌株培养物或 发酵培养液。
6. 权利要求1所述的真菌菌株在降解生物塑料中的用途。
7. 按照权利要求6所述的用途，其特征在于，包括将权利要求1所述的真菌菌株进 行培养，得到菌株培养物或发酵培养液；用所得到菌株培养物或发酵培养液降解生物塑料； 其中，将微生物培养以及降解生物塑料环境的pH值控制在4-11。
8. 权利要求2或3所述真菌菌株的突变体、变异体或其衍生物在降解生物塑料中的用途。
9. 按照权利要求4或5所述的菌株培养物或发酵培养液在降解生物塑料中的用途。
10. 按照权利要求6、8或9所述的用途，其特征在于，所述的生物塑料包括聚丁二酸丁二醇酯或聚丁二酸/己二酸_ 丁二醇酯。
全文摘要
本发明公开了一株降解生物塑料的真菌菌株及其用途。本发明真菌菌株(Bionectria ochroleuca)的微生物保藏号是CGMCC NO.3470。本发明真菌菌株对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，在pH4-11范围内都具有降解生物塑料的能力。本发明真菌菌株来源于普通土壤，容易培养和保存，可利用大豆油，甘油，或葡萄糖作为PBS的替代碳源物质对其进行发酵培养。本发明真菌菌株可以快速降解PBS、PBSA等生物塑料及其废弃物，促进生物降解塑料的使用，减少白色污染，有利于环境保护。
文档编号A62D3/02GK101792718SQ20091024301
公开日2010年8月4日 申请日期2009年12月23日 优先权日2009年12月23日
发明者孙琪, 梁英梅, 梅雪立, 田呈明, 陆英 申请人:北京林业大学