专利名称：一种解毒工程菌及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种解毒工程菌及其制备方法和应用。
背景技术：
现代农业生产为满足人们粮食高产的愿望发挥了巨大的作用，一度被奉为第三世 界国家摆脱贫困和饥饿的灵丹妙药，然而面对现代农业中的农副产品品质下降、生物多样 性减少，面对农作物病虫害的日益猖獗、农业资源的浪费、农业环境的退化，面对非洲粮食 危机的有增无减，人们在欣喜之余，逐渐产生了一种困惑、一种疑虑，开始重新审视现代农 业的利弊，重新认识农业资源环境的内涵，重新思考农业科研与决策的方向。杀虫剂(即农药)的应用是一把双刃剑。一方面，害虫大量的侵食农作物，例如在 印度，几乎30%的农作物被害虫侵食，而全球性的食物短缺危机又要求农作物丰产以满足 人类的生存需求，因而作为保护农作物所使用的杀虫剂在农业上的应用越来越广泛，占到 了世界消耗量的3%。另一方面，杀虫剂的过度使用导致环境受到农药污染，同时造成全球 范围的昆虫的杀虫剂抗药性和动物及农作物体内的农药残余。这个矛盾将是未来亟待解决 的尖锐问题。常用的杀虫剂主要有有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类三大类，都会对哺 乳动物造成神经毒性。普遍存在于昆虫体内各种组织中的酯酶(Esterase，简称EST)参与 酯类杀虫剂的解毒作用，是可以对杀虫剂解毒的重要水解酶之一。不同的水解酶具有各自 特定的作用部位，并与之相互作用，将大分子化合物间的键水解掉，使之成为小分子化合物 或无毒的离子。现已从微生物细胞内分离得到的磷酸三酯酶是一种细菌的有机磷水解酶 (OPH)，可以有效水解有机磷类化合物，显著降低其毒性，但是它不能水解羧酸酯键，因而对 于氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类的杀虫剂起不到降毒作用。我国作为一个农业生产大国，更是生产和使用农药的大国。大量使用农药以减轻 农产品受病虫害损失的同时，也带来了日益严重的农药残留问题。长期食用高农残的食品， 会形成慢性神经性中毒，严重的会引发老年痴呆等病症。由于我国农药使用缺乏规范管理， 农产品农药残留普遍超标，导致我国农产品外贸出口遭受重大损失，传统的出口产品，如水 果、茶叶和中草药等屡屡发生大批量退货，出口规模严重受制。此外，高农残的蔬菜和水果 也会给人的身体健康带来极大的危害，据卫生部门统计，1999年1 10月，共收到食物中毒 报告78起，中毒人数4394人，79人死亡，其中由农药引起中毒1108人，死亡59人，超过死 亡人数的70%。统计还显示，近年来在食物中毒人数中，由农药残留引起的中毒所占的比例 越来越高。
发明内容
本发明的目的是提供一种解毒工程菌及其制备方法和应用。本发明提供了一种重组质粒，是在质粒pETDuet-Ι的多克隆位点导入解毒酯酶的 编码基因和水解酶的编码基因得到的重组质粒。
3
所述重组质粒具体可为pETDuet-E4-mpd。pETDuet-E4_mpd 是将质粒 pETDuet_l 中，BamHI和HindIII酶切位点间的小片段替换为解毒酯酶的编码基因，BglII和XhoI酶切 位点间的小片段替换为水解酶的编码基因，得到的重组质粒。所述解毒酯酶可为如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且具有解毒酯酶功能的由序列1衍生的蛋白质；所述水解酶可为如下(C)或(d)的蛋白质(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且具有水解酶功能的由序列3衍生的蛋白质。所述解毒酯酶的编码基因具体可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)其编码序列是序列表中序列2自5’末端第8至1666位核苷酸所示的DNA分 子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白 质的DNA分子；所述水解酶的编码基因具体可为如下5)或6)或7)或8)的DNA分子5)其编码序列是序列表中序列4自5’末端第11至901位核苷酸所示的DNA分 子；6)序列表中序列4所示的DNA分子；7)在严格条件下与5)或6)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；8)与5)或6)或7)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白 质的DNA分子。所述解毒酯酶(E4)的编码基因既可人工合成得到，也可从有机磷抗性的桃蚜中 克隆得到。所述水解酶(mpd)基因既可人工合成得到，也可从细菌中克隆得到。本发明还保护将所述重组质粒导入宿主菌得到的解毒工程菌。所述宿主菌具体可为大肠杆菌BL21 (DE3)。所述解毒工程菌具体可为大肠埃希氏菌(Escherichia coli) pET30_mpd菌株。该 工程菌已于2006年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简 称CGMCCJia 北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为 CGMCC No. 1785。本发明还保护一种制备解毒酶液的方法，是用异丙基硫代半乳糖诱导所述解毒工 程菌进行表达，得到解毒酶液。所述方法中，诱导表达的温度具体可为14-25°C，时间具体可 为16-22小时。所述方法制备得到的解毒酶液也属于本发明的保护范围。所述工程菌，所述解毒酶液可应用于降解农药。所述农药可为有机酸酯农药或有 机磷农药。所述有机酸酯农药具体可为西维因、高效氯氰菊酯或三氯杀虫酯。所述有机磷农药具体可为马拉硫磷或对硫磷，如甲基对硫磷。所述解毒工程菌和所述解毒酶液可应用于制备用于温血动物解毒的药物。本发明的工程菌同时具有解毒酯酶和水解酶的功能，对农药残留的降解谱加宽， 可以同时降有机酸酯农药和有机磷农药，可以用于有机磷中毒温血动物的解毒。本发明的 工程菌，解毒酯酶基因的融合表达量占总蛋白量的56%。本发明的工程菌，在30分钟时，即 可降解67. 0%的马拉硫磷、66. 7%的对硫磷。本发明为利用真核和原核生物的自然资源对 残留在水源、土壤中农药等有毒有害化合物污染的生物治理提供了一条新途径。本发明有 助于解决我国的农药残留的污染问题，有助于消除农药残留污染对国民经济造成的损失和 对人民健康的危害，具有重大的意义和价值。
图1为粗酶液对西维因的降解。图2为粗酶液对马拉硫磷的降解。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。Ex. Taq DNA 聚合酶、各种限制性内切酶 BamHI，BglII, XhoI and Hindlll、T4DNA 连接酶均为TaKaRa产品，其余试剂为分析纯。质粒pETDuet_l购自Novagen公司，用作表 达mpd基因和E4基因的载体，该质粒在大肠杆菌中E. coli DH5 α增殖。Escherichia coli strain BL21(DE3)购自 Novagen 公司。实施例1、工程菌的构建一、重组质粒(pETDuet-E4_mpd)的构建1、水解酶基因的制备人工合成序列4所示的DNA，序列4自5’末端第11至901位核苷酸为水解酶(mpd) 基因，其上游为BamHI位点，下游为HindIII位点。2、解毒酯酶基因的制备人工合成序列2所示的DNA，序列2自5’末端第8至1666位核苷酸为解毒酯酶 (E4)基因，其上游为BglII位点，下游为XhoI位点。3、重组质粒(pETDuet-E4_mpd)的构建①用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切步骤1的水解酶基因。②用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切质粒pETDuet_l。③将步骤①的酶切产物和步骤②的酶切产物连接，得到重组质粒pETDuet-mpd。④用限制性内切酶BglII和XhoI酶切步骤2的解毒酯酶基因。⑤用限制性内切酶BglII和XhoI酶切步骤③得到的重组质粒pETDuet-mpd。⑥将步骤④的酶切产物和步骤⑤的酶切产物连接，得到重组质粒 pETDuet-E4_mpd ο4、重组质粒(pETDuet-E4-mpd)的鉴定
对重组质粒pETDuet-E4-mpd进行测序鉴定。鉴定结果表明mpd基因和E4基因 分别插入了 pETDuet质粒的相应酶切位点，且阅读框正确，得到了目的重组质粒。二、工程菌的制备和粗酶液的提取1、工程菌的制备将重组质粒pETDuet-E4_mpd参照pET System Manual的转化程序转化大肠杆菌 BL21(DE3)，得到工程菌。将工程菌中的一株大肠埃希氏菌(Escherichia coli)pET30_mpd菌株，于2006 年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 1785。2、粗酶液的提取①从新鲜转化的平板挑取Pet30-mpd菌株的单克隆菌落，加入2ml的LB培养基 (含50 μ g/ml氨苄青霉素)，37°C震荡培养8_10小时；②将2ml培养液注入50ml的LB培养基(含50 μ g/ml氨苄青霉素)继续培养；当 细胞的浓度OD6qq = 0. 6时加入500 μ 1 IPTG (浓度为IOOmM)使IPTG终浓度为ImM，在14 25°C诱导16 22小时。③将培养液在5000 Xg离心5分钟；收集Pet30_mpd菌株，重新用PBS调节浓度为 OD600 = 1，5000 Xg 离心 5 分钟；④重新收集Pet30-mpd菌株，再次加入PBS (体积为步骤③PBS的1/10)，使菌液 浓缩倍数为10倍，菌液中加入溶菌酶使其终浓度为100 μ g/ml，加入TritonX-IOO (体 积为步骤③PBS的1/10)，30°C温浴15分钟；在冰浴条件下超声波裂解处理，再离心去除沉 淀，上清液即为Pet30-mpd菌株的粗酶液。三、对照菌的制备和粗酶液的提取1、对照菌I的制备①用限制性内切酶BglII和XhoI酶切步骤二的2的PCR扩增产物。②用限制性内切酶BglII和XhoI酶切质粒pETDuet-1。③将步骤①的酶切产物和步骤②的酶切产物连接，得到重组质粒pETDuet-E4。④将重组质粒pETDuet_E4参照pET System Manual的转化程序转化大肠杆菌 BL21(DE3)，得到对照菌I。提取对照菌I的粗酶液(方法同步骤二的2)。2、对照菌II的制备①用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切步骤1的PCR扩增产物。②用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切质粒pETDuet_l。③将步骤①的酶切产物和步骤②的酶切产物连接，得到重组质粒pETDuet-mpd。④将重组质粒pETDuet-mpd参照pET System Manual的转化程序转化大肠杆菌 BL21(DE3)，得到对照菌II。提取对照菌II的粗酶液(方法同步骤二的2)。3、对照菌III的制备将质粒pETDuet-Ι参照pET System Manual的转化程序转化大肠杆菌BL21 (DE3)， 得到对照菌III。
提取对照菌III的粗酶液(方法同步骤二的2)。四、粗酶液中目的蛋白表达量比较将Pet30-mpd菌株(工程菌)、对照菌I、对照菌II和对照菌III进行SDS-PAGE 分析。结果表明Pet30-mpd菌株诱导表达解毒酯酶的效率与对照菌I (pETDuet_E4)的 效率是一致的；Pet30-mpd菌株诱导表达水解酶的效率与对照菌II (pETDuet-mpd)的效率 是一致的；对照菌III表达解毒酯酶和水解酶的效率都非常低。即Pet30-mpd菌株可以有 效的同时表达解毒酯酶和水解酶，这样就可以实现一次诱导表达发酵培养的时间同时得到 2种酶，从而大大减少了诱导表达发酵培养生产工程菌所需要的各种原材料，缩短了时间， 节约了能源，降低了成本。实施例2、Pet30-mpd菌株的粗酶液对西维因和马拉硫磷的降解作用一、Pet30_mpd的粗酶液对西维因(carbaryl)的降解根据Hayatsu和Nagata(1993)的方法测定西维因的降解，具体如下缓冲液IOmMΚΗ2Ρ04/Κ0Η 缓冲液；pHL 5。显色剂(DBLS)将4. 5mg固蓝B (Fast Blue B salt)溶于4. 5ml水中，然后加入 10. 5ml 5% SDS 溶液。反应体系(20ml)在缓冲液中加入Carbaryl和实施例1制备得到的Pet30_mpd菌 株的粗酶液，反应体系中含130 μ M Carbaryl和5ml粗酶液(107U πιΓ1)。对照体系(20ml)用去离子水代替粗酶液，其它同反应体系。反应温度为37°C，每间隔30min取样2ml。样品中立即加入0. 5ml新制的DBLS溶 液，用分光光度计测定α-萘酚的含量(西维因水解后生成α-萘酚，α-萘酚和DBLS溶液 的生色反应在590nm的波长有最大吸收峰，α -萘酚的浓度与吸收值成正比)，根据α-萘 酚的含量计算西维因的降解程度。试验设置三次重复，结果取平均值。结果见图1。结果表明，Pet30-mpd(工程菌)的粗酶液在2. 5hr内降解64%西维因。二、Pet30_mpd的粗酶液对马拉硫磷(Malathion)的降解根据Leng和Qiao (1986)的方法测定马拉硫磷的降解，具体如下缓冲液IOmMΚΗ2Ρ04/Κ0Η 缓冲液；pHL 5。反应体系(20ml)将马拉硫磷溶于15ml缓冲液中，使其浓度为10. 9 μ M,加入5ml 实施例1制备得到的Pet30-mpd菌株的粗酶液(107U πιΓ1)。对照体系(20ml)用去离子水代替粗酶液，其它同反应体系。反应温度为37°C，每隔15min取Iml样品。样品中加入Iml石油醚进行提取，提 取液用无水硫酸钠干燥后，再用正己烷抽提，抽提液用气相色谱分析。色谱分析所用仪器 为惠普 5890II 型气相色谱(Hewlett-Packard 5890 series II)，NPD 检测器，毛细柱 SGE 公司产品，柱长30m，内径0. 53mm,膜厚0. 5 μ m，检测器温度300°C，进样口温度250°C，柱温 200°C，柱流量2. 79ml/min，线速度29. 7cm/sec，分流比2. 2 1，空气压力58psi，氢气压力 21psi，氮气压力52psi，空气流量81ml/min，氢气流量3ml/min，氮气流量30ml/min，保留时 间llmin。试验设置三次重复，结果取平均值。结果见图2。结果表明，Pet30-mpd(工程菌)的粗酶液在1. 25hr内降解80%马拉硫磷。实施例3、鸡毒死蜱中毒的解毒实验
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成年来航母鸡(Gallus gallus) (12月龄，鸡重约1. 5kg左右)购自北京农业大学 实验鸡场。鸡购回后单独喂养，至少适应环境一周后才开始试验。自由取食和饮水，实验期 间，鸡舍温度控制在20°C左右，每天光照约10h。将实验鸡分成七组，每组10只试验一组同时给予毒死蜱(装入空胶囊中，剂量为170mg/kg，口服)和 Pet30-mpd(工程菌)(0. 5g湿菌体装入空胶囊中，口服)；实验二组先给予毒死蜱(装入空胶囊中，剂量为170mg/kg，口服)，40min后给予 Pet30-mpd(工程菌)(0. 5g湿菌体装入空胶囊中，口服)；对照一组同时给予毒死蜱(装入空胶囊中，剂量为170mg/kg，口服)和对照菌 1(0. 5g湿菌体装入空胶囊中，口服)；对照二组，先给予毒死蜱(装入空胶囊中，剂量为170mg/kg，口服)，40min后给予 对照菌1(0. 5g湿菌体装入空胶囊中，口服)；对照三组同时给予毒死蜱(装入空胶囊中，剂量为170mg/kg，口服)和对照菌 III (0.5g湿菌体装入空胶囊中，口服)；对照四组先给予毒死蜱(装入空胶囊中，剂量为170mg/kg，口服)，40min后给予 对照菌111(0. 5g湿菌体装入空胶囊中，口服)；对照五组给予毒死蜱(装入空胶囊中，剂量为170mg/kg，口服)；给药后密切观察被试鸡的急性中毒情况，在给药后10天称重，处死被试鸡。实验一组和对照一组没有明显急性中毒和迟发性神经毒性症状，在给药3h后逐 渐恢复正常。实验结束时，鸡的体重没有明显下降。试验二组、对照二组、对照三组、对照四 组和对照五组均在给药后40min内出现了急性中毒症状。实验二组出现的急性中毒症状为衰弱无力，口吐粘液，给予工程菌后症状开始减 轻，直至恢复正常，没有明显迟发性神经毒性症状。对照二组出现的急性中毒症状为衰弱无 力，口吐粘液，给予对照菌I后症状开始减轻，直至恢复正常，没有明显迟发性神经毒性症 状。实验结束时，鸡的体重没有明显下降。对照三组、对照四组和对照五组都出现了严重的急性中毒症状和迟发性神经毒性 症状，部分实验鸡死亡，存活的实验鸡出现了不同程度的迟发性神经毒性症状，体重显著下 降。实施例4、粗酶液对甲基对硫磷的降解作用取9个一次性塑料杯，分成三组，每组3个。每个杯中加50ml水，再加入20毫克 的甲基对硫磷，然后分别进行如下处理处理一在杯中加入20 μ 1实施例1制得的Pet30-mpd(工程菌)的粗酶液；处理二 在杯中加入20 μ 1去离子水；处理三在杯中加入20 μ 1实施例1制得的对照菌III的粗酶液。30min后，在每个杯中分别加入20头4龄蚊幼虫，24小时后检测结果。由于工程菌的粗酶液可以将甲基对硫磷降解，处理一的杯中的幼虫全部没有被杀 死；而处理二和处理三中的幼虫全部被杀死。实验结果表明，该粗酶液可以有效降解甲基对 硫磷，从而使甲基对硫磷失去对蚊幼虫的毒杀作用。序列表
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<110>中国科学院动物研究所
<120> 一种解毒工程菌及其制备方法和应用
<130>CGGNAY92742
<160>4
<210>1
<211>552
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
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151015
Cys PheLeuThrCysSerAlaSerAsnThrProLysValGlnValHis
202530
Ser GlyGluIleAlaGlyGlyPheGluTyrThrTyrAsnGlyArgLys
354045
lie TyrSerPheLeuGlylieProTyrAlaSerProProValGlnAsn
505560
Asn ArgPheLysGluProGlnProValGlnProTrpLeuGlyValTrp
65707580
Asn AlaThrValProGlySerAlaCysLeuGlylieGluPheGlySer
859095
Gly SerLysIlelieGlyGlnGluAspCysLeuPheLeuAsnValTyr
100105110
Thr ProLysLeuProGlnGluAsnSerAlaGlyAspLeuMetAsnVal
115120125
lie ValHisIleHisGlyGlyGlyTyrTyrPheGlyGluGlylieLeu
130135140
Tyr GlyProHisTyrLeuLeuAspAsnAsnAspPheValTyrValSer
145150155160
lie AsnTyrArgLeuGlyValLeuGlyPheAlaSerThrGlyAspGly
165170175
Val LeuThrGlyAsnAsnGlyLeuLysAspGlnValAlaAlaLeuLys
180185190
Trp lieGlnGlnAsnlieValAlaPheGlyGlyAspProAsnSerVal
195200205
Thr lieThrGlyMetSerAlaGlyAlaSerSerValHisAsnHisLeu
210215220
90159]IleSerProMetSerLysGlyLeuPheAsnArgAlalielieGlnSer0160]2252302352400161]GlySerAlaPheCysHisTrpSerThrAlaGluAsnValAlaGlnLys0162]2452502550163]ThrLysTyrlieAlaAsnLeuMetGlyCysProThrAsnAsnSerVal0164]2602652700165]GluIleValGluCysLeuArgSerArgProAlaLysAlalieAlaLys0166]2752802850167]SerTyrLeuAsnPheMetProTrpArgAsnPheProPheThrProPhe0168]2902953000169]GlyProThrValGluValAlaGlyTyrGluLysPheLeuProAsplie0170]3053103153200171]ProGluLysLeuValProHisAsplieProValLeulieSerlieAla0172]3253303350173]GlnAspGluGlyLeuliePheSerThrPheLeuGlyLeuGluAsnGly0174]3403453500175]PheAsnGluLeuAsnAsnAsnTrpAsnGluHisLeuProHislieLeu0176]3553603650177]AspTyrAsnTyrThrlieSerAsnGluAsnLeuArgPheLysThrAla0178]3703753800179]GlnAsplieLysGluPheTyrPheGlyAspLysProlieSerLysGlu0180]3853903954000181]ThrLysSerAsnLeuSerLysMetlieSerAspArgSerPheGlyTyr0182]4054104150183]GlyThrSerLysAlaAlaGlnHislieAlaAlaLysAsnThrAlaPro0184]4204254300185]ValTyrPheTyrGluPheGlyTyrSerGlyAsnTyrSerTyrValAla0186]4354404450187]PhePheAspProLysSerTyrSerArgGlySerSerProThrHisGly0188]4504554600189]AspGluThrSerTyrValLeuLysMetAspGlyPheTyrValTyrAsp0190]4654704754800191]AsnGluGluAspArgLysMetlieLysThrMetValAsnlieTrpAla0192]4854904950193]ThrPhelieLysSerGlyValProAspThrGluAsnSerGlulieTrp0194]5005055100195]LeuProValSerLysAsnLeuAlaAspProPheArgPheThrLyslie0196]5155205250197]ThrGlnGlnGlnThrPheGluAlaArgGluGlnSerThrThrGlylie
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<210>3
540
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260265270lie Gly His lie Arg Ala Glu Gly Lys Gly Tyr Arg Phe Val Pro Val275280285Asn Tyr Ser Val Val Asn Pro Lys290295<210>4<211>907<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4ggatcccatggccgcaccgcaggtgcgcacctcggcccccggctactaccggatgctgct60
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cgccgaaggcaagggctaccgtttcgtgccggtgaactactcggtcgtcaaccccaagtg900
aaagctt90权利要求
重组质粒，是在质粒pETDuet 1中的多克隆位点导入解毒酯酶的编码基因和水解酶的编码基因得到的重组质粒。
2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述解毒酯酶是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 且具有解毒酯酶功能的由序列1衍生的蛋白质；所述水解酶是如下(c)或(d)的蛋白质(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 且具有水解酶功能的由序列3衍生的蛋白质。
3. 如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于所述解毒酯酶的编码基因为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)其编码序列是序列表中序列2自5’末端第8至1666位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA分子；所述水解酶的编码基因为如下5)或6)或7)或8)的DNA分子5)其编码序列是序列表中序列4自5’末端第11至901位核苷酸所示的DNA分子；6)序列表中序列4所示的DNA分子；7)在严格条件下与5)或6)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；8)与5)或6)或7)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA分子。
4.一种解毒工程菌，是将权利要求1至3中任一所述的重组质粒导入宿主菌得到的解毒工程菌。
5.如权利要求4所述的解毒工程菌，其特征在于所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)； 所述解毒工程菌优选为保藏编号为CGMCC No. 1785的大肠埃希氏菌(Escherichia coli) pET30-mpd 菌株。
6.一种制备解毒酶液的方法，是用异丙基硫代半乳糖诱导权利要求4或5所述的解毒 工程菌进行表达，得到解毒酶液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述诱导表达的温度为14-25°C，时间为 16-22小时。
8.权利要求6或7所述方法制备得到的解毒酶液。
9.权利要求4或5所述工程菌，权利要求8所述解毒酶液在降解农药中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述农药为有机酸酯农药或有机磷农药； 所述有机酸酯农药为西维因、高效氯氰菊酯或三氯杀虫酯；所述有机磷农药为马拉硫磷或 对硫磷；所述对硫磷为甲基对硫磷。
全文摘要
本发明公开了一种解毒工程菌及其制备方法和应用。本发明提供了一种重组质粒，是将质粒pETDuet-1中的酶切位点中导入解毒酯酶的编码基因和水解酶的编码基因得到的重组质粒。本发明的工程菌是将所述重组质粒导入宿主菌得到的工程菌。该工程菌含有编码解毒酯酶和水解酶的基因，能诱导表达解毒酯酶和水解酶。本发明还保护所述工程菌发酵得到的粗酶液。该工程菌及其粗酶液可以同时降解马拉硫磷、对硫磷、高效氯氰菊酯、三氯杀虫酯等有机酸酯和有机磷类农药，可以用于有机磷中毒温血动物的解毒。本发明为利用真核和原核生物的自然资源对残留在水源、土壤等中农药等有毒有害化合物污染的生物治理提供了一条新途径。
文档编号A62D101/04GK101935669SQ200910241899
公开日2011年1月5日 申请日期2009年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者乔传令, 兰文升, 杨超 申请人:中国科学院动物研究所