本发明涉及一种可吸附-脱附蛋白质的复合纳米纤维膜及制备方法，属于蛋白质的分离纯化技术领域。
背景技术
层析分离中，作为提纯的核心部件之一——固定相介质材料的选择尤为重要。目前，主要应用于层析的多为大孔微球、多孔膜层、凝胶等介质。然而以上这几种材料都存在着几点缺陷：1)介质刚性不够，易被压缩，难以获得较高处理速度；2)床层内易产生沟流，传质效果较差；3)配基价格昂贵却不能充分利用，只有少量配基能与蛋白质结合；4)吸附柱易被堵塞和污染，往往只适用于间歇操作，处理量低，操作时间长。静电纺纳米纤维无纺布则具有比表面积大、高贯通性、孔状丰富、分离速度快、低压降及成本低等优势，但以纤维素为基质膜材料分离蛋白质往往遵循筛分机理分离，对目标产物不具有特异性吸附且吸附量低。显然，在开发一种新型纳米纤维结构的层析材料来进行定向、有效地分离蛋白质，一直以来受到人们所关注。
羟基磷灰石是一种结晶状无机盐,属六方晶系,分子式为ca10(po4)6(oh)2，ca/p比为1.67，单位晶胞含有10个ca2+、6个po43-和2个oh-，羟基磷灰石存在着两个化学位点(ca2+,po43-)可吸附多种生物大分子，如蛋白质、核酸等。羟基磷灰石也是目前分离各类生物分子最常用的液相色谱介质之一。但在纯化蛋白质过程中也存在一定问题，如材料刚性大，易于压密造成操作时间延长等。
技术实现要素：
本发明克服现有技术的不足，提供一种可吸附-脱附蛋白质的复合纳米纤维膜及制备方法。
本发明的技术解决方案：
一方面，
本发明提供一种可吸附-脱附蛋白质的复合纳米纤维膜，所述纤维膜为核壳结构，由包含二醋酸纤维素的核层纺丝液和包含纳米级羟基磷灰石的壳层纺丝液采用同轴静电纺丝技术制得，其中，所述纳米级羟基磷灰石均匀粘附于二醋酸纤维素纤维表面。
进一步的，所述核层纺丝液由二醋酸纤维素溶于二甲基亚砜与三氯甲烷混合溶剂中制得；
进一步的，所述壳层纺丝液的原料至少包含纳米级羟基磷灰石；其溶剂体系选自a、双组分体系：二甲基亚砜和三氯甲烷，或b、三组分体系：二甲基亚砜、三氯甲烷和冰醋酸；
进一步的，所述壳层纺丝液的原料还包含二醋酸纤维素；
进一步的，所述壳层纺丝液，优选采用三组分溶剂体系：二甲基亚砜/三氯甲烷/冰醋酸，其原料优选采用仅包含纳米级羟基磷灰石。
另一方面，
本发明还提供一种可吸附-脱附蛋白质的复合纳米纤维膜的制备方法，通过以下步骤实现：
步骤1、制备核层纺丝液：将二醋酸纤维素溶于二甲基亚砜与三氯甲烷混合溶剂中，搅拌、静置脱泡后得到核层溶液；
步骤2、制备壳层纺丝液，选自下述步骤中的任意一种：
(1)将纳米级羟基磷灰石加入二甲基亚砜中，搅拌及超声分散，随后滴加三氯甲烷或三氯甲烷和冰醋酸，制得壳层溶液；
或
(2)将适量二醋酸纤维素加入二甲基亚砜中，待完全溶解后，加入纳米级羟基磷灰石，搅拌及超声分散，随后滴加三氯甲烷或三氯甲烷和冰醋酸，制得壳层溶液；
步骤3、将步骤1所得核层纺丝液和步骤2所述任一种壳层纺丝液采用同轴高压静电纺丝技术成型，得到核壳结构的羟基磷灰石/二醋酸纤维素复合纳米纤维膜。
进一步的，所述壳层纺丝液制备，优选采用三组分溶剂体系：二甲基亚砜/三氯甲烷/冰醋酸，原料优选采用仅包含纳米级羟基磷灰石；
进一步的，所述步骤1中，二醋酸纤维素质量比为10％-20％，工艺条件为常温下搅拌4-6h；
进一步的，所述步骤(1)中，纳米级羟基磷灰石占溶质质量比为10％-15％，两组分溶剂二甲基亚砜/三氯甲烷体积比为1:1～3:2；三组分溶剂二甲基亚砜/三氯甲烷/冰醋酸体积比为2：1：0.5，工艺条件优选为：常温下磁力搅拌2～4h，超声处理1.5～3h；
进一步的，所述步骤(2)中，二醋酸纤维素质量比为3％-5％，纳米级羟基磷灰石占溶质质量比为10％-15％，两组分溶剂二甲基亚砜/三氯甲烷体积比分别为1:1～3:2；三组分溶剂二甲基亚砜/三氯甲烷/冰醋酸体积比为2：1：0.5；工艺条件优选为：常温下磁力搅拌2.5～5h，超声处理1.5～3h；
进一步的，所述同轴静电纺丝可采用常规的工艺参数，例如：电压为20-25kv，针头与接收板距离12-16cm，同轴针头#24内、外直径分别为0.31mm和0.56mm0.84mm；同轴针头#17内、外直径分别为1.06mm和1.65mm；
进一步的，所述步骤3中，核层溶液注射速度为0.3-0.5ml/h，壳层溶液注射速度为0.1-0.3ml/h。
本发明的设计原理在于：
本发明采用新型同轴静电纺丝技术，通过定量调配溶液中聚合物、功能填料与溶剂各组分的比例关系，有效、简单、且快速地解决了同轴静电纺中纳米颗粒与高分子溶液之间的表面复合，形成核壳结构，将羟基磷灰石均匀粘附于二醋酸纤维素纤维表面，以羟基磷灰石作为吸附功能填料，改善二醋酸纤维素纤维吸附性，提高纤维表面对蛋白质吸附位点，同时在壳层溶液的制备中，提出溶剂优选加入冰醋酸，其加入提高了纺丝液导电性，使得复合纤维受静电力更利于拉伸取向，提高纤维表面羟基磷灰石的分布，解决纳米羟基磷灰石颗粒团聚、分散不均一等难题，可以显著提高复合纤维膜蛋白质吸附量。
本发明相对于现有技术的有益效果：
1、本发明制备出“核壳”纳米纤维层析分离膜，拓展复合纳米纤维膜材料在分离纯化的应用，采用同轴静电纺丝技术将纳米级羟基磷灰石均匀粘附在二醋酸纤维素纤维表面，优化了复合体系配方及纺丝工艺条件，不但调控了复合纤维膜纤维尺度与分布，还显著提高了原材料对蛋白质的吸附；
2、本发明中同轴静电纺丝技术纺制的羟基磷灰石/二醋酸纤维素复合纳米纤维膜，纤维尺寸低，分布均匀，孔状丰富，蛋白质吸附量高，易于洗脱；粘附羟基磷灰石后，纯二醋酸纤维素纳米纤维膜的蛋白质吸附量由11.63mg/g提高至163.46mg/g；循环吸附-脱附工艺五次，洗脱率仍可达70％以上；
3、相较于表面化学接枝、矿化沉积磷灰石等改性方法，本发明的制备方法可有效简化复合纤维膜的制备流程，缩短合成时间，降低材料成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明制备的产品及产品的制备方法的保护范围不限于实施例。
实施例1-3和对比例1中所用的二醋酸纤维素的乙酰基取代度为2.5，分子量为39000；实施例1-3中所用的纳米级羟基磷灰石(hap)超过97％的粒径小于100nm。
实施例1
步骤一、称取2.61g二醋酸纤维素溶解于8ml二甲基亚砜和4ml三氯甲烷双组份溶剂中(溶剂体积比2:1)，常温下磁力搅拌4-6h，形成透明的均相核层纺丝液；
步骤二、称取0.39g纳米级羟基磷灰石加入4ml二甲基亚砜中，磁力搅拌2h，超声分散处理1h后，滴加2ml三氯甲烷，最后超声处理0.5h，形成乳白色壳层纺丝液；
步骤三、分别将步骤一与步骤二所得核层纺丝液和壳层纺丝液倒入连接有同轴喷头的注射器中，核层连接#24接口(id＝0.31mm，od＝0.56mm)；壳层连接#17接口(id＝1.06mm，od＝1.65mm)，将其固定于双道微量注射泵上，设置核层纺丝液注射速度为0.4ml/h，壳层纺丝液注射速度为0.15ml/h，调节高压发生器，使电压保持在20-25kv，湿度保持在45％-55％，针头液滴迅速形成泰勒锥，在贴有铝箔的导电接收板上形成羟基磷灰石/二醋酸纤维素复合纳米纤维膜。然后，将膜浸泡于去离子水中24h，即可得羟基磷灰石/二醋酸纤维素复合纳米纤维膜2。
步骤四、将步骤三所得的复合纤维膜浸入1.5mg/ml牛血清白蛋白溶液中，振荡吸附12h，离心处理5min，在uv280nm下测量溶液吸光度，得到膜吸附量。
步骤五、将步骤四中吸附蛋白质后的膜浸入1.0mtris-盐酸(ph＝9.2)洗脱液中，振荡脱附12h，在uv280nm下测量溶液吸光度，得到膜脱附量；
bsa吸附/脱附测试结果见表1。
实施例2
步骤一、称取1.88g二醋酸纤维素溶解于6ml二甲基亚砜和4ml三氯甲烷双组份溶剂中(溶剂体积比3:2)，常温下磁力搅拌4-6h，形成透明的均相核层纺丝液；
步骤二、称取0.17g二醋酸纤维素和0.28g纳米级羟基磷灰石加入4ml二甲基亚砜中，磁力搅拌2.5h，超声分散处理1.5h后，滴加2ml三氯甲烷和1ml冰醋酸，最后超声处理0.5h，形成乳白色壳层纺丝液；
步骤三、分别将步骤一与步骤二所得核层纺丝液和壳层纺丝液倒入连接有同轴喷头的注射器中，核层连接#24接口(id＝0.31mm，od＝0.56mm)；壳层连接#17接口(id＝1.06mm，od＝1.65mm)，将其固定于双道微量注射泵上，设置核层纺丝液注射速度为0.3ml/h，壳层纺丝液注射速度为0.2ml/h，调节高压发生器，使电压保持在22-25kv，湿度保持在45％-55％，针头液滴迅速形成泰勒锥，在贴有铝箔的导电接收板上形成羟基磷灰石/二醋酸纤维素复合纳米纤维膜。然后，将膜浸泡于去离子水中24h，即可得羟基磷灰石/二醋酸纤维素复合纳米纤维膜3。
步骤四、将步骤三所得的复合纤维膜浸入1.5mg/ml牛血清白蛋白溶液中，振荡吸附12h，离心处理5min，在uv280nm下测量溶液吸光度，得到膜吸附量。
步骤五、将步骤四中吸附蛋白质后的膜浸入1.0mtris-盐酸(ph＝9.2)洗脱液中，振荡脱附12h，在uv280nm下测量溶液吸光度，得到膜脱附量；
bsa吸附/脱附测试结果见表1。
实施例3
步骤一、称取2.22g二醋酸纤维素溶解于6ml二甲基亚砜和4ml三氯甲烷双组份溶剂中(溶剂体积比3:2)，常温下磁力搅拌4-6h，形成透明的均相核层纺丝液；
步骤二、称取0.33g纳米级羟基磷灰石加入4ml二甲基亚砜中，磁力搅拌2.5h，超声分散处理1.5h后，滴加2ml三氯甲烷和1ml冰醋酸，最后超声处理0.5h，形成乳白色壳层纺丝液；
步骤三、分别将步骤一与步骤二所得核层纺丝液和壳层纺丝液倒入连接有同轴喷头的注射器中，核层连接#24接口(id＝0.31mm，od＝0.56mm)；壳层连接#17接口(id＝1.06mm，od＝1.65mm)，将其固定于双道微量注射泵上，设置核层纺丝液注射速度为0.5ml/h，壳层纺丝液注射速度为0.3ml/h，调节高压发生器，使电压保持在22-25kv，湿度保持在45％-55％，针头液滴迅速形成泰勒锥，在贴有铝箔的导电接收板上形成羟基磷灰石/二醋酸纤维素复合纳米纤维膜。然后，将膜浸泡于去离子水中24h，即可得羟基磷灰石/二醋酸纤维素复合纳米纤维膜4。
步骤四、将步骤三所得的复合纤维膜浸入1.5mg/ml牛血清白蛋白溶液中，振荡吸附12h，离心处理5min，在uv280nm下测量溶液吸光度，得到膜吸附量。
步骤五、将步骤四中吸附蛋白质后的膜浸入1.0mtris-盐酸(ph＝9.2)洗脱液中，振荡脱附12h，在uv280nm下测量溶液吸光度，得到膜脱附量；
bsa吸附/脱附测试结果见表1。
对比例1
称取2.61g二醋酸纤维素以及8ml二甲基亚砜及4ml三氯甲烷溶剂(溶剂体积比2:1)加入20ml锥形瓶中，常温下磁力搅拌4-6h，形成透明的均相纺丝液；搅拌均匀后将纺丝液静置脱泡8h，然后倒入20ml装有#7针头注射器中，将其固定于单道微量注射泵上，设置注射速度为1-4ml/h，调节高压发生器，使电压保持在20-25kv，湿度保持在45％-55％，针头液滴迅速形成泰勒锥，在贴有铝箔的导电接收板上形成二醋酸纤维素纳米纤维膜。然后，将膜浸泡于去离子水中24h，除去残留溶剂与杂质，烘箱60℃下烘干，即可得纯二醋酸纤维素纳米纤维膜1。
称取0.15g牛血清白蛋白溶解于0.01m磷酸盐缓冲液(ph＝7.2)中，将所制膜浸入蛋白质溶液中，振荡吸附12h，溶液10000转离心5min，在uv280nm下测量溶液吸光度，计算吸附量。将吸附蛋白质的膜浸入1.0mtris-盐酸洗脱液中，振荡脱附12h，在uv280nm下测量溶液吸光度，计算脱附量，bsa吸附/脱附测试结果见表1。
表1bsa吸附/脱附测试结果
从表1可知，采用同轴静电纺丝制备羟基磷灰石/二醋酸纤维素比纯二醋酸纤维素纤维膜蛋白质吸附量有显著提高，通过吸附-脱附循环测试，羟基磷灰石/二醋酸纤维素复合纤维膜脱附量仍然保持良好水平。
从实施例1和2结果对比可知，壳层纺丝液中加入一定浓度的二醋酸纤维素会影响膜纤维尺寸，导致膜蛋白质吸附量与脱附量同时减少。
从实施例1和3结果对比可知，壳层纺丝液中添加冰醋酸后，提高了纺丝液导电性，更利于复合纤维受静电力拉伸取向，提高纤维表面羟基磷灰石分布，可以显著提高复合纤维膜蛋白质吸附量。
实施例2和4结果对比可知，核层纺丝液中二甲基亚砜与三氯甲烷配体积比的变化，会影响膜纤维尺寸，二甲基亚砜含量越小，膜蛋白质吸附量越高。
本发明未详细说明部分为本领域技术人员公知技术。