使用基因工程菌控制造纸过程生物膜污染的解决方案的制作方法

本发明涉及造纸技术领域，具体而言，涉及一种使用基因工程菌控制造纸过程生物膜污染的解决方案。

背景技术：

由于环保及成本的要求，造纸厂通常选择水循环使用的方式来减少水耗。从微生物学的角度来看，封闭的水循环系统为细菌的滋长提供了丰富的养料(纤维素、半纤维素及部分游离的助剂等)，适宜的温度(30-50℃)，以及足够长的停留时间，即生长良好的培养基。纸浆在纸机网部高速成型过程中，存在飞溅或残留在机架上的情况，易形式沉积物和腐浆。当沉积物悬坠达到一定极限时，就会坠落在成纸表面，则会引起斑点、孔洞、断纸乃至停机等严重问题。且这些沉积物和腐浆难以被清理彻底。

目前针对纸机的微生物污染，现有的控制技术主要分为两大类，一是使用氧化或非氧化型杀菌剂，二是利用氧化还原、atp标记、激光和超声波等装置的监测手段。氧化型杀菌剂杀菌能力强，但在生产过程中会与管道、纤维等物质反应而影响纸张的生产；非氧化型杀菌剂对浮游生物和生物膜有较好的效果，不仅能限制和消除现有的生物膜，还能渗透到生物膜的内部进行进一步反应，但其仅局限于某些微生物，存在选择性，因其无法抑制纸浆中的全部微生物，从而残存的微生物依然会形成沉积，因此该方式难以彻底地清理沉积物和腐浆；且长期使用会形成耐药性，不利于工厂的长期选择；装置类方案精准智能，能够及时处理生物膜的集聚情况，但成本较高，能耗大，需要技术支持，并不适用于中小型纸厂。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种使用基因工程菌控制造纸过程生物膜污染的解决方案。将本发明提供的基因工程菌投入到造纸的浆料中，该菌可以成为整个纸浆系统微生物群中的优势菌株，以此菌为核心所形成在机架上的沉积物和腐浆等污染物的附着能力较低，通过简单的冲洗即可被清除，有效解决造纸系统因生物膜污染而导致的沉积问题。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供一种基因工程菌，其具有如下特性：

(1)将其添加至纸浆中，其具有成为该纸浆中优势菌的能力；

(2)其具有不形成生物膜的能力或其形成生物膜的能力受到抑制。

在本发明中，“成为纸浆中优势菌”指的是在整个纸浆系统的微生物类群中占据优势数量；本发明对该基因工程菌成为纸浆中优势菌的方式不作严格限制，例如可以通过具有抑制纸浆中其他菌生长的能力实现，还可以通过该基因工程菌的自身特性(例如抗生素抗性等)实现。

本发明通过使不具有形成生物膜能力或形成生物膜能力受到抑制的基因工程菌在纸浆中形成优势菌，而后当纸浆飞溅或残留在机架上时，该纸浆中的基因工程菌将首先在机架表面进行附着和生长，即便纸浆中存在其它弱势菌群，其也无法相对于该基因工程菌形成竞争。此时在机架表面形成的沉积物和腐浆主要由该基因工程菌形成，而该基因工程菌不具有形成生物膜能力或形成生物膜能力受到抑制，从而不会在机架表面形成生物膜或形成附着力较弱的生物膜，此时能够容易地通过清洗等方式去除这些沉积物和腐浆。

相较于现有的通过氧化或非氧化型杀菌剂去除沉积物和腐浆的策略，本发明利用上述基因工程菌，不需要额外使用氧化或非氧化型杀菌剂；特别是，本申请是通过使不具有形成生物膜能力或形成生物膜能力受到抑制的基因工程菌在纸浆中形成优势菌的方式来避免其它菌在机架表面形成沉积物和腐浆，该方式并非抑制其它菌生长并沉积，而是通过该基因工程菌具有的生长优势及生物膜突变特性来清理沉积物和腐浆，该方式既不受微生物选择性的影响，同时也不存在耐药性问题，特别是该方式对沉积物和腐浆的清理效果比较彻底，也不存在与管道、纤维等物质反应而影响纸张的生产等问题。且相较于使用装置类处理生物膜的策略，本发明的使用上述基因工程菌的方法成本更低，操作简单，适用范围更广，实用性更强。

进一步地，所述基因工程菌还具有抑制纸浆中其他至少一种菌生长的能力。

一方面，该能力能够使该基因工程菌迅速地成为纸浆中的优势菌；另一方面，在该基因工程菌成为优势菌后，其能够利用自身所产生的抗菌物质杀灭或抑制纸浆中其它菌的生长，进一步避免了其它菌在机架表面沉积形成难以去除的生物膜。

具体地，本发明提供的基因工程菌具有的特性(1)可以使其在纸浆中抑制其他菌体的生长，使其在初始含有多种混杂微生物的纸浆/白水系统中成为数量优势菌株，同时其具有的特性(2)使其无法形成生物膜，该特性使得当其投入到纸浆中进行造纸时，以此基因工程菌为核心所形成在机架上的沉积物和腐浆等污染物的附着能力就比较低，这样，这些沉积物和腐浆等污染物通过简单雾化水流冲刷即可从机架上掉落，有效解决机架腐浆的沉积问题；此外，纸机生产过程中，高速运转的网部辊子会连续不断地将纸浆液滴雾化飞溅到机架上，对前期附着的雾化液滴形成冲洗效应，促使其从机架上掉落，同样有利于解决机架腐浆的沉积问题。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述基因工程菌由野生型菌种经改造后得到；优选地，所述野生型菌种为瓦雷兹芽孢杆菌；

优选地，所述瓦雷兹芽孢杆菌为瓦雷兹芽孢杆菌fzb42。

瓦雷兹芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌株fzb42将全基因组10％的资源用于各类抗生素物质的合成。该菌共计可以合成13种抗生素，其中包括类脂肽类抗生素(如芽孢菌霉素d(bacillomycind)、芬芥素(fengycin)、表面活性素(surfactin)，bacillibactin)、聚酮类化合物(bacillaene，difficidin，macrolactin)、细菌素(plantazolicin,amylocyclicin)，另外还有拮抗效果强烈的二肽化合物如杆菌溶素(bacilysin)，等等。

基于本发明人前期对纸机中腐浆、白水微生物菌落的大量研究，瓦雷兹芽孢杆菌产生的上述抗生素能够广泛抑制纸浆中的各类细菌和真菌，从而特别利于其成为纸浆中的优势菌。特别是，瓦雷兹芽孢杆菌在添加至纸浆后，其能够持续地产生针对纸浆菌群的抗生素，从而能够最大程度地抑制纸浆中的其它菌；该方式通过基因工程菌具有的生长优势及生物膜突变特性来清理沉积物和腐浆，不仅选择性低、无耐药性问题，并且不会对造纸过程产生不利影响，因此有利于长期使用。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述基因工程菌中与生物膜形成相关的基因或操纵子被敲除或表达受到抑制。

进一步地，所述形成生物膜的能力包括生成胞外多糖和/或生成淀粉样蛋白。胞外多糖和淀粉样蛋白是细菌形成生物膜的主要成分，通过抑制这两种物质的产生能力可以较好地抑制基因工程菌的形成生物膜的能力。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，与生物膜形成相关的所述基因或操纵子包括eps操纵子和tapa-sipw-tasa操纵子中的至少一种。

在生物膜形成过程当中，芽孢杆菌有两个操纵子起到了至关重要的作用，一个是eps操纵子，负责生物膜胞外基质主要成分——胞外多糖的生成；另外一个操纵子是tapa-sipw-tasa，主要生成淀粉纤维样蛋白质(tasa)。胞外多糖和淀粉纤维样蛋白质能够将芽孢杆菌细胞包裹黏连在一起，是其生物膜结构性形成的基础。多项研究表明，当eps操纵子和tapa-sipw-tasa缺失时，芽孢杆菌不能形成明显的生物膜。

需要说明的是，本发明所提供的基因工程菌并不限于瓦雷兹芽孢杆菌，其他的细菌其只要其具有在同一生长基质例如纸浆下，其具有抑制该生长基质中其他菌生长的能力和其不具有形成生物膜的能力或其形成生物膜的能力受到抑制的两个特性，均可以用于到造纸领域中，这均属于本发明的保护范围。

此外，具有这两种特性的菌可以是从自然界中分离得到，也可以通过对野生型菌株进行人工突变或基因编辑技术等手段获取的，无论通过何种方式获取，均属于本发明的保护范围。

此外，如果采用人工突变或基因编辑技术等手段获取上述基因工程菌，原始的野生型菌株可以是上述两种特性都不具有，也可以是上述两种特性中仅具有一种。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述基因工程菌的基因组中上还插入有抗生素抗性基因；

优选地，所述抗生素用于抑制纸浆中其他菌的生长；

优选地，所述抗生素抗性基因选自：红霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因。

通过利用外源抗生素抗性基因，可以使得基因工程菌在投入到含有相应抗生素纸浆中后具有相应抗性，比其他不具有相应抗性的菌更易生长，更容易成为优势菌群。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述生长基质为纸浆。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述基因工程菌的保藏号为cctccno:m2019397。

该菌于2019年5月27日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno:m2019397。

第二方面，本发明提供了上述基因工程菌在造纸过程中的应用。

进一步地，所述基因工程菌用于抑制造纸机表面沉积物或腐浆附着。

发明人发现，飞溅或残留在机架上的纸浆是微生物生长的良好培养基，当微生物生长时，常常趋向于附着在物体表面形成生物膜，包括存在粘性的多聚体基质，逐渐向四周积累细小纤维和菌落，即形成所述的沉积物和腐浆。生物膜具有明显的高级结构，一旦形成，便会对其内部集团形成保护机制，可以保护细菌适应不同的环境以及对抗各种环境胁迫，使其难以被清理彻底。

基于此，将上述基因工程菌用于到造纸领域中，利用其具有的特性(1)和特性(2)，使其成为优势菌株，纸浆含有大量的该菌株，并利用其不具有成膜能力或成膜能力弱的特性，使其形成的沉积物和腐浆附着力降低，进而使得由其形成的沉积物和腐浆易于被冲洗。

第三方面，本发明提供了一种控制造纸过程生物膜污染的解决方案，其包括：往纸浆中添加上述的基因工程菌。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，基于每升纸浆，所述基因工程菌的添加量为10¹⁰-10¹²cfu/l；

优选地，所述基因工程菌以菌液的形式添加至所述纸浆中；

优选地，所述菌液的od600为2.8-3.2；

优选地，所述菌液的od600为3；

优选地，按菌液与所述纸浆的体积比为1:(2-100)的比例将所述菌液添加至所述纸浆中。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述解决方案还包括：在添加所述基因工程菌之前，往所述纸浆中添加抗生素；

其中，所述抗生素的类别与所述基因工程菌中所携带的抗生素抗性基因相对应；

优选地，所述抗生素选自红霉素和壮观霉素；

优选地，红霉素按0.5-5g/吨纸浆的添加量添加，壮观霉素按0.1-1g/吨纸浆的添加量添加；优选地，所述纸浆为阔叶材纸浆。

当然，纸浆并不限于阔叶材纸浆，还可以是其他纸浆例如针叶材纸浆、废纸浆，还可以是竹子、甘蔗渣、稻麦草、芦苇等非木材纸浆等，任何纸浆均适用本发明的解决方案。

在接种初期，即在接种基因工程菌前，往纸浆中加入抗生素，可以抑制其他不具有该抗生素抗性的微生物生长，由于所述基因工程菌携带相应的抗性基因，可以正常生长，有利于该基因工程菌快速建立优势类群的地位，成为优势菌，最大限度地发挥清洁生物膜的效用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实验例1中的野生型瓦雷兹芽孢杆菌标记afp荧光的检测结果，图中左侧平板为不含荧光的野生型fzb42稀释菌液(对照组)，右侧为振荡培养过程中取样稀释的菌液(实验组)。

图2为实验例2中不锈钢钢板点样图；图中a为对照组和实验组的点样图，a中左侧为对照组菌株点样，a中右侧为实验组菌株点样；b为a中的局部近景图。

图3为实验例2中的不同浓度样品经水雾第二次冲刷10min后的效果图；图中：上侧为原浓度样品；下侧为稀释十倍的样品。

图4为所构建的基因工程菌的基因敲除示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

构建基因工程菌：

(1)选择在同一生长基质下具有抑制该生长基质中其他菌生长的能力的优势菌株。

发明人根据前期研究，芽孢杆菌是纸机生物膜形成的主要菌种之一。基于此，本实施例使用芽孢杆菌，优选使用瓦雷兹芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌株fzb42。

实验室保藏的瓦雷兹芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌株fzb42(该菌株可以从德国菌种保藏中心(dsmz23117^t)购得)，经研究表明可将全基因组10％的资源用于各类抗生素物质的合成。迄今为止，发现该菌共计可以合成13种抗生素，其中包括类脂肽类抗生素(芽孢菌霉素dbacillomycind，芬芥素fengycin，表面活性素surfactin，bacillibactin)、聚酮类化合物(bacillaene，difficidin，macrolactin)、细菌素(plantazolicin,amylocyclicin)，另外还有拮抗效果强烈的二肽化合物杆菌溶素bacilysin，等等，这些抗生素能够广泛抑制各类细菌和真菌。因此，在初始接种量足够的情况下，fzb42产生的这些抗生素类物质，应该可以保证其自身在整个纸浆系统微生物类群中占据优势数量。

(2)通过基因工程技术构建不具有形成生物膜的能力或其形成生物膜的能力受到抑制的基因工程菌。

(a)基因敲除和抗性基因的插入，采用同源重组的方法进行：

分别对epsa基因连同其下游序列约2500bp，pcr扩增后插入商业载体pmd19，在插入序列中间位置，酶切插入ermb抗性基因。

同理构建用于敲除tapa基因的重组质粒，并插入spe抗性基因。将两个构建的重组质粒分别先后转化瓦雷兹芽孢杆菌fzb42，并筛选相应的抗性菌株，将最后测序确认为正确的转化子，命名为fbs296。

得到的基因工程菌的eps操纵子和tapa-sipw-tasa被敲除，如图4所示。该基因工程菌瓦雷兹芽孢杆菌(bacillusvelezensis)fbs296保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为：cctccno:m2019397；地址：中国武汉，武汉大学。

实施例2

本实施例提供的控制造纸过程生物膜污染的解决方案其包括如下步骤：

(1)接种的初期，在彻底清洗纸机之后，以红霉素4.5±0.5/吨浆料、壮观霉素0.8±0.1g/吨浆料的浓度在浆池中做浆料的预处理以抑制其他微生物的生长，为生物膜突变株的优势生长做准备。

(2)再将培养至od600为3.0的实施例1所制得的基因工程菌菌液用m9缓冲液洗涤两次，稀释十倍(10⁸cfu/ml)后，将稀释液与纸浆按体积比为1:2的比例混合，使其细菌终浓度为od6000.1。

(3)正常进料、运行纸机造纸。

通过上述解决方案，使得飞溅于机架等处的菌液-浆料混合物可在雾化水流冲刷下维持较为干净的状态，维持较长时间的清洁，大大延长纸机的刷机周期。

实施例3

本发明提供的控制造纸过程生物膜污染的解决方案方法如下，其包括如下步骤：

(1)将培养至od600为3.0的实施例1所制得的基因工程菌菌液用m9缓冲液洗涤两次，并稀释十倍(10⁸cfu/ml)，将稀释液与纸浆按体积比为1:2的比例混合，使其细菌终浓度为od6000.1。

(2)正常进料、运行纸机造纸。

通过上述解决方案，使得飞溅于机架等处的菌液-浆料混合物可在雾化水流冲刷下维持较为干净的状态，维持较长时间的清洁，大大延长纸机的刷机周期。

实验例1

gfp荧光标记做存活实验

将野生型瓦雷兹芽孢杆菌标记gfp荧光，记为fbs01mut，在lb培养液中摇至od600＝1.0后用m9缓冲液洗涤两次，分别以0.5％，4％、10％、20％，40％(v/v)的接种量接入浆浓为1％(w/v)的阔叶材纸浆，37℃，200rpm震荡培养。每24小时取样，使用涂板计数法绘制其生长曲线。实验结果显示，接种量在10％～20％之间即可有优良的生长情况。

通过紫外检测荧光，如图1所示，平板左侧为野生型菌株的稀释菌液(对照组)，平板右侧为培养过程中取样稀释的菌液(实验组)。实验组荧光明显，确定纸浆环境中生长的菌株的确为fbs01mut菌株。

实验例2

检测实施例1的基因工程菌的附着能力

将野生型fzb42(对照组)以及生物膜突变菌株fbs296(实验组，即实施例1得到的基因工程菌)分别在摇床中培养至od600＝3，然后用m9缓冲液洗涤两次，并处理成原浓度(10⁹cfu/ml)和稀释十倍(10⁸cfu/ml)两个浓度，以1:2(v/v)的比例接种到1％的阔叶材纸浆(另加1％淀粉、1‰lb培养液，灭菌)中。充分混合后，两种菌液的浓度分别被稀释至od600＝1及od600＝0.1，再把相同浓度下的两种菌-纸浆混合液(对照组和实验组)分别滴在同一块#316不锈钢板(此材料的表面光滑度等性能与纸机机架材料比较接近)上的左右两侧作对照，每边样品42滴左右，每滴50微升且均匀分布，间隔1cm左右。每隔6小时加一次样，共加三次共150微升。点样如图2a所示，左侧为野生型菌株fzb42(对照组)，右侧为突变型菌株fbs296(实验组)；图2b为a中的局部近景图。

为保持其湿度与温度，使用高低温湿热试验箱作为培养箱，温度设置为37℃。为模拟纸机中较高的湿度环境，将钢板放入下部盛有无菌水的半封闭塑料筐中，以维持湿度保持在95～100％状态。每6小时观察菌体生长情况、液滴湿度以及用水情况，及时采取措施。

生长一周后使用持续喷水雾、涡旋振荡器的方式做一定距离的冲洗和一定频率的震荡的处理，每次处理十分钟左右，浸润静置半小时后再次做相同处理，重复三次，观察并记录不锈钢板上混合物掉落的快慢和数量于表1，部分冲刷效果如图3所示。

表1纸浆生物膜挂壁冲刷实验数据

注：括号中数值为理论频数。

由表1数据可看出，od1.0浓度组对比非常明显，在第一次冲刷中突变组的掉落数即是野生组的五倍，并在三次处理之后掉落率达到了81％，有效地减少了钢板表面生物膜的黏附；稀释10倍的稀释组，在冲刷过程中，相较于野生组同样可更轻易、快速地去除混合物在钢板表面的附着。利用2x2卡方检验，两组实验中，处理组与对照组均有极显著差异(p<0.01)，说明实施例1的基因工程菌株可以明显减少生物膜的形成和降低在其不锈钢板上形成的沉积物的附着能力，使其更易清洗。

以上数据说明，将实施例1的基因工程菌添加至纸浆中，由其形成在机架上的沉积物可以更容易地被清洗掉，且采用本发明实施例的基因工程菌和相应的生物膜污染的解决方案，简易有效，成本低廉，解决了现有去除沉积物方法的专一性、耐药性等等问题，采用本发明的生物膜污染的解决方案进行造纸，清洁所形成的沉积物时更简便、快速，很好地延长了刷机周期，降低了生产成本，其具有广泛的适用性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。