基于切向偏振的超分辨荧光显微方法及装置的制作方法

专利名称：基于切向偏振的超分辨荧光显微方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及荧光显微镜领域，具体涉及超分辨荧光显微方法及装置。
背景技术：
自从1873年阿贝第一次发现远场光学成像具有衍射限制现象以来，物理学界就 公认，远场光学显微镜的分辨率受限于光学衍射极限，该极限与光源的波长和数值孔径有 关。由于光学衍射的限制，理想点物经过光学系统成像不可能得到一个理想的像点，而是成 一个夫琅和费衍射像。一般的光学系统都是圆形的，夫琅和费衍射像就是所谓的艾里斑。在 像平面每个物点的像都是一个弥散斑，两个弥散斑靠近就不好区分，这样限制了系统的分 辨率，弥散斑越大，分辨率越低。因此，一个世纪以来，传统的远场光学显微镜的分辨率( 200nm) 一直是无法逾越的障碍。如何突破光学衍射极限进一步提高显微镜的分辨率，能够 在光学显微镜下观察更小尺度的物体是一个热门的话题。潜在的意义是可以在光学显微镜 下观察更小尺度的实时活体生物现象，探索生命奥秘。近年来，随着4 π共聚焦显微技术、受激发射损耗显微技术、光激活定位显微技 术、饱和结构照明显微技术等新的理论和技术的出现，远场光学显微成像的分辨率得到极 大的改进，可以在活细胞上看到纳米尺度的蛋白质。这些技术上的进步势必极大地推动生 命科学的发展。而这些技术之一、由专利号为US5731588的美国专利公开的受激发射损耗 显微镜(Stimulated Emission Depletion(STED)microscopy)被誉为最有应用前景的方 法。它是从物理上打破衍射光学极限的远场荧光显微技术，对传统物理学观点的极大挑战。 其具体原理为使用一种圆偏振的激光，仅激发一个点的荧光基团使其发荧光，然后再用一 个面包圈样的圆偏振光源抑制那个点周围的荧光强度，这样就只有中间一个小于衍射极限 的点发光并被观察到了。两束激光(即激发光与受激发射损耗激光)经过调制后同时照 射在样本上相同位置，其中，激发光使荧光物质发光，受激发射损耗激光(即STED激光)为 与激发光紧挨着的、环型的、波长较长的一束激光，使得激发光斑中大部分的荧光物质通过 光学非线性作用强行回到基态，从而抑制荧光发光以减少荧光发射光斑面积。激发光光斑 经STED激光的调制后，发射荧光分子的光斑大小大大的减少了，并且随着STED激光光强的 增加，能发射荧光光斑越小，其半高全宽可以达到衍射极限以下，分辨率不再受光的衍射所 限制，从而打破衍射极限。从1994年STED理论的提出，经过多年的实验后，直到2000年 Hell开发了超高分辨率显微技术，通过三维扫描可以得到IOOnm以下的超高分辨率三维图 像。尽管STED显微技术得到了一定的发展，然而到目前为止STED原理和方法还没有 得到广泛的应用，具体表现在(1)现有的脉冲STED测量系统光路复杂，使用的光学元器件 多，包括昂贵的脉冲激光器、复杂的电子控制系统等。(2)对系统的稳定性要求非常高，为 了保证分辨率，一般工作2 3个小时需要重新校准。(3)为了达到STED效果，STED激光 的光强密度要比激发光高出1000-10000倍，甚至更高，而如此高的光强对大部分生物样品 是一个致命的损伤。(4)理论上无限的分辨率事实上是有限的，因为在追求高分辨的同时
4也增大了荧光漂白，从而降低成像分辨率与成像质量。之后，为了扩大STED系统的焦深， 专利号为US7709809的美国专利提出了组合位相板的方式。为了提高系统稳定性，申请号 201010177761. 6的中国专利提出了一种实时补偿漂移的方法。而对于上述的STED工作功 率过高问题，一直没有得到很好的解决。如何降低STED激光的工作功率从而降低样品的漂 白，避免对样品的损坏，一直是STED显微技术的一个难题。现有的STED系统中是利用一种 圆偏振光聚集作为激发光，用另外一种波长的圆偏振光(STED光)经过涡旋位相板产生面 包圈去抑制荧光团发射荧光。其特点一是圆偏振激发光难以聚焦到衍射极限以下；二是 利用圆偏振光通过涡旋位相板形成面包圈去抑制激发光斑周围的荧光，其抑制效果只有靠 增加STED激光功率。

发明内容
本发明提供了一种基于切向偏振的超分辨荧光显微方法，在保证高分辨率的条件 下大大降低STED激光的功率，从而降低样品的漂白，避免对样品的损坏。一种基于切向偏振的超分辨荧光显微方法，包括以下步骤(1)将用于激发荧光样品产生荧光的激发光转换为切向偏振激发光；(2)对所述的切向偏振激发光进行0 2 π涡旋位相编码，得到位相编码切向偏振 激发光；所述的0 2 π涡旋位相编码是指对于横截面中心对称的圆形入射光束，采用一个 厚度沿角向逐渐增加，增加到一个光的波长量级时所对应的相位为2 π的涡旋分布的0 2 π位相板(Vortex 0 2 π PhasePlate)使该光束产生相对于初始相位的位相延迟，位相 延迟的大小由光束圆形横截面内过特定点的半径与+X轴的夹角决定，取值范围在0 2 π 之间，与该点到圆心的距离无关；(3)将所述的位相编码切向偏振激发光折转90°后进行消复色差聚焦，在荧光样 品上得到衍射极限以下的激发光斑；(4)将用于抑制荧光样品发出荧光的受激发射损耗激光(即STED激光)转换为切 向偏振STED激光；(5)将切向偏振STED激光折转90°后，与所述的位相编码切向偏振激发光汇合且 同轴，再进行消复色差聚焦，在荧光样品上聚焦形成中心点与激发光斑中心点重合的面包 圈状的聚焦光斑；(6)调整STED激光的工作功率以抑制激发光斑边缘的发光，使得聚焦在荧光样品 上的激发光斑中仅有中心点发射出荧光，激发光斑中发光点的面积缩小达到IOOnm以下的 超高分辨率；(7)收集发光点发出的荧光，在滤去背景噪声和背景杂散光后，探测得到荧光光 强；(8)移动用于固定荧光样品的纳米平移台对荧光样品扫描并探测相应的荧光光 强，再经数据处理后得到超高分辨率的显微图像。所述的切向偏振激发光或位相编码切向偏振激发光优选为进行中心遮挡滤光后 的环状光束。步骤(3)和(5)中，所述的聚焦通过消复色差高数值孔径聚焦透镜实现，所述的高 数值孔径通常为NA = 1 1. 4，优选为NA = 1. 4。
步骤(1)中，将激发光转换为切向偏振激发光通过偏振转换器来实现。步骤(2)中，0 2 π涡旋位相编码通过涡旋分布的0 2 π位相板(VortexO 2 31 Phase Plate)来实现。步骤(7)中，可通过将荧光透过窄带滤光器来滤去背景噪声，再聚焦到针孔上滤 去背景杂散光。本发明还提供了一种用于实现上述基于切向偏振的超分辨荧光显微方法的装置， 包括用于发出激发荧光样品产生荧光的激发光的第一光源；用于将所述的激发光转换 为切向偏振激发光的第一切向偏振转换器；用于将切向偏振激发光进行0-2 π涡旋位相编 码的涡旋分布的0 2 π位相板(Vortex 0 2 π PhasePlate)；用于将位相编码切向偏振 激发光进行90°折转的第一分光镜；用于发出抑制荧光样品发出荧光的STED激光的第二光源；用于将所述的STED激 光转换为切向偏振STED激光的第二切向偏振转换器；用于将切向偏振STED激光进行90° 折转的第二分光镜；用于将经第一和第二分光镜折转后汇合的同轴光聚焦到荧光样品上得到中心发 光点的消复色差透镜，由于两束同轴光聚焦在荧光样品上的同一点，激发光产生衍射极限 以下的实心荧光发射光斑，STED激光产生一个面包图形状的空心荧光抑制光斑，两光斑中 心点完全重合，实心荧光发射光斑与空心荧光抑制光斑重合部分的荧光发射被抑制，因此 实心荧光发射光斑只有中心点发射荧光成为发光点；用于收集和探测发光点发出的荧光并根据探测到的荧光光强获得超高分辨率的 显微图像的探测成像系统，所述的探测成像系统包括用于收集发光点发出的荧光的消复 色差透镜、用于滤去收集的荧光信号中背景噪声和背景杂散光的滤波器、用于对滤波后的 荧光信号进行探测的探测器、用于对探测得到的荧光光强进行处理和成像的成像器件；用于固定荧光样品的纳米平移台，通过移动纳米平移台对荧光样品进行扫描，从 而获得二维显微图像。通过对荧光样品进行三维扫描，可以获得三维显微图像。本发明装置中，所述的第一和第二光源可以为通用的产生准直激光的光源，优选 使用激光器。本发明装置中，所述的第一和第二切向偏振转换器可以为现有技术中实现切向偏 振光的转换的任何器件与装置，如由微结构光栅与干涉仪组成的空间光调制器等，优选为 瑞典(ARCoptix)公司的偏振转换器 Radial-Azimuthal Polarization Converter，可直接 将其它偏振光转换为切向偏振光。本发明装置中，所述的涡旋分布的0 2 π位相板(Vortex 0 2 π PhasePlate) 为厚度沿角向逐渐增加到一个光的波长量级所对应的相位为2π的位相板。所述的涡旋分 布的0 2 π位相板(Vortex 0 2 π Phase Plate)，对入射光的位相延迟量Δ α由如下
公式决定
△a = φ式中，为位相板平面上位置极坐标矢量与χ轴的夹角。所述的涡旋分布的0 2 π位相板(Vortex 0 2 π Phase Plate)优选采用美国RPC photonics公司的涡旋位相板(Vortex 0 2 π Phase Plate) VPP-1A，实际上也可采用 用作0 2 π涡旋操作的空间光调制器来实现相同的功能。本发明装置中，所述的消复色差透镜优选为高数值孔径消复色差透镜，所述的高 数值孔径NA = 1 1. 4。高数值孔径消复色差透镜进一步优选为1. 4ΝΑ, 100倍放大，具有 平场矫正功能；本发明装置中，所述的纳米平移台采用高精度纳米平移台，优选为德国PI公司的 高精度纳米平移台；本发明装置中，所述的滤波器包括窄带滤光器和空间滤波器，所述的窄带滤光器 用于窄带滤波除去背景噪声，可以根据所发荧光的范围进行选取；所述的空间滤波器可以 采用光纤或针孔，优选采用针孔，将收集的荧光聚焦后通过空间滤波器除去背景杂散光，所 述的针孔大小可以根据共焦的原则确定。本发明装置中，所述的探测器为单光子探测器，优选为高量子效率的雪崩二极管 单光子探测器。本发明装置中，所述的第一和第二分光镜优选采用二色镜，可以使激发光和STED 激光垂直折转，而使荧光直接透过，这样不需另外添加光学元件，发光点发出的荧光只需经 过激发荧光发射的光路中消复色差透镜的接收，再依次透过两个二色镜即可收集完成。本发明中，利用一束切向偏振激发光在涡旋分布的0 2 π位相板的操作下，聚焦 得到衍射极限以下的聚焦光斑；利用另一束切向偏振STED激光在荧光样品相同位置上聚 焦为面包圈，去抑制激发光斑边缘的发光。由于切向偏振STED激光特有的聚焦特性，它比 圆偏振光形成的面包圈收敛更快，因此在相对较低的STED工作功率下，可以达到与已有技 术相同的分辨率。综合上述两点优势，在保证分辨率的情况下，可以大大降低STED工作功 率，克服已有技术在STED工作功率过高方面的不足。本发明的工作原理如下将从两个激光器分别出射的激发光和STED激光，分别通过两个切向偏振转换器 转换为切向偏振光后，进一步将切向偏振激发光进行0 2 π涡旋位相编码，打破原有的干 涉场，使得汇聚光斑不出现中空现象，得到实心荧光发射光斑；将位相编码切向偏振激发光 和切向偏振STED激光调制为同轴出射光后，由高数值孔径的消复色差透镜聚焦在被测量 的荧光样品上，由于激发光是一个衍射极限以下的实心光斑，STED激光是一个面包圈状空 心光斑，两光斑中心点完全重合，而面包圈状空心光斑抑制激发光斑边缘的发光，因此两光 斑重叠部分被抑制，只有中心点发射出荧光，可以实现荧光光斑的减小，分辨率的提高；可 见，本发明采用切向偏振和进行0 2 π涡旋位相编码的激发光，本身就能得到衍射极限以 下的聚焦光斑，实现了高分辨率，而现有技术中采用圆偏振激光直接聚焦(没有任何位相 调制)作为激发光，不能将激发光聚焦到衍射极限以下；而且，本发明采用切向偏振STED光 不需要进行涡旋位相编码，直接聚焦就能得到面包圈光斑(空心光斑)，而其它STED偏振光 需要经过涡旋位相编码聚焦后才会有面包圈光斑。由于切向偏振STED激光特有的聚焦特 性，它比圆偏振光形成的面包圈收敛更快，因此在相对较低的STED工作功率下，可以达到 与已有技术相同的分辨率。这样一来，在保证分辨率的情况下，可以大大降低STED工作功 率。本发明将光束偏振理论与高数值孔径聚集理论结合起来，克服已有技术在STED工作功 率过高方面的不足。
相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果在保证高分辨率的情况下，大大降低了 STED的工作功率，从而降低样品的漂白， 避免对样品的损坏，克服了已有技术在STED工作功率过高方面的不足。此外，由于激发光和STED光都是切向偏振光，在高数值孔径透镜聚焦下，只有径 向(X，y方向)分量，都没有Z向(焦深方向)分量，而现有技术中其它偏振光在高数值孔 径聚焦下，都会有三个方向分量(x、y、z)，难以区分，因此，本发明对荧光偏振特性的研究提 供了更好的手段。


图1为本发明的基于切向偏振超分辨荧光显微装置示意图；图2为本发明中切向偏振光示意图；图3为本发明中涡旋分布的0 2 π位相板(Vortex 0 2 π Phase Plate)的示 意图；其中，a为涡旋分布的0 位相板的横向示意图，b为涡旋分布的0 位相 板的立体示意图；图4为位相编码切向偏振激发光与现有技术中其它偏振光经高数值孔径消复色 差透镜聚焦后焦平面上的光强剖面对比图；图5为切向偏振STED激光与现有技术中其它位相编码偏振光经高数值孔径消复 色差透镜聚焦后焦平面上的光强剖面对比图；图中第一激光器1 ；第二激光器2 ；第一切向偏振转换器3、第二切向偏振转换器6 ；涡 旋分布的0 2 π位相板4 ；第一二色镜5 ；第二二色镜7 ；高数值孔径消复色差透镜8 ；荧 光样品9 ；纳米平移台10 ；窄带滤光片11 ；消色差聚焦透镜12 ；针孔13 ；探测器14 ；切向偏 振激发光Rl ；切向偏振STED光R2 ；切向偏振激发光和切向偏振STED光的汇合R23 ；收集到 的荧光信号R4。
具体实施例方式下面结合附图和实施例来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。如图1所示的一种基于切向偏振超分辨荧光显微装置，包括第一激光器1、第二激光器2、第一切向偏振转换器3、第二切向偏振转换器6、涡旋 分布的0 2 π位相板4、第一二色镜5、第二二色镜7、高数值孔径消复色差透镜8、纳米平 移台10、窄带滤光片11、消色差聚焦透镜12、针孔13和探测器14。第一切向偏振转换器3和第二切向偏振转换器6为瑞典(ARCoptix)公司的偏振 转换器Radial-Azimuthal Polarization Converter，涡旋分布的0 2 π位相板4为美国 RPC photonics 公司的涡旋位相板(Vortex 0 2 π PhasePlate) VPP—1A。第一激光器1发出用于激发荧光样品9产生荧光的激发光，并经过第一切向偏振 转换器3转换为切向偏振激发光，切向偏振光的特点如图2所示，每点的偏振方向都是沿着 切线方向，所有点的偏振方向构成一个涡旋。其中切向偏振光光束内每一点的光偏振方向 可由以下单位矩阵表示 式中，识为光束垂直Z轴剖面内位置极坐标矢量与X轴的夹角。再将切向偏振激发光通过涡旋分布的0 2 π位相板4，将光线调制为0 2 π涡 旋位相，光线变为位相编码切向偏振激发光R1。涡旋分布的0 位相板4的主要原理 是使通过它的光束在不同位置产生不同的相位延迟以达到位相编码的目的。如图3所示是 涡旋分布的0 2 π位相板4的横向示意图和立体示意图。涡旋分布的0 2 π位相板4 对入射光的位相延迟量Δ α由如下公式决定 式中，识为位相板平面上位置极坐标矢量与X轴的夹角。位相编码切向偏振激发光Rl经过第一二色镜5折转90°，光线为R3。第二激光器2发出用于抑制荧光样品发出荧光的STED激光，经过第二切向偏振转 换器6转换为切向偏振STED激光R2，再经过第二二色镜7折转90°，与R3汇合成同轴光 线 R23。同轴光线R23经过高数值孔径消复色差透镜8，其中，激发光在高数值孔径消复色 差透镜8的像方焦平面上形成超分辨聚焦光斑(实心荧光光斑)，STED光在高数值孔径消 复色差透镜8的像方焦平面上形成面包圈的聚焦光斑(空心光斑)。两光斑中心点完全重 合。此处，高数值孔径消复色差透镜8采用NA = 1. 4的100Χ消复色差具有平场校正的显 微物镜，并且在物镜的像方(物镜聚焦光斑一侧)使用折射率η = 1.518的浸没油，目的是 为了使物镜达到1. 4的数值孔径，可以达到更好的聚焦效果。在这种情况下，R3和R2光束 在高数值孔径消复色差透镜8的像方焦平面上形成以几何光学理想焦点为中心的聚焦光 斑。聚焦光斑附近的光束电场分布可以由如下公式计算得到
r-cos 炉
E(r2 ,φ2,ζ2) = iC J^ sin(6>)^, (θ,φ)^, φ)
sin ζζ> 0
^a{θ,φ)^ikniz1 cos0+r2^Q^φ式中，(r2，朽，ζ2)是以理想焦点位置为原点的柱坐标系，C为归一化常数，A1为光束 R2或者R3光强分布参数,A2为数值孔径消复色差透镜8的结构参数。Δα为位相延迟量， 识为位相板平面上位置极坐标矢量与χ轴的夹角，i为虚数单位，k = 2 π / λ，n为介质折射 率，θ为消复色差透镜后的聚焦光线与光轴的夹角。采用上述公式可以分别计算得到焦平 面上的光斑的大小。其中光束R3聚焦后为一微小实心光斑，其半高全宽在衍射极限以下。图4为位相 编码切向偏振激发光与现有技术中其它偏振光经高数值孔径消复色差透镜8聚焦后焦平 面上的光强剖面对比图。由图4可以得出本发明的位相编码切向偏振激发光聚焦点半高全 宽最小，其半高全宽为0. 34个光波波长，在衍射极限0. 357个光波波长以下(这里数值孔 径都是NA= 1.4)。如再采用孔径遮拦进一步优化，可以达到0. 26个光波波长的半高全宽， 所以，在没有使用STED进行消光的条件下，就已经有衍射极限以下的高分辨率。尽管用带孔径遮拦优化后的聚焦切向偏振光有旁瓣，但这些旁瓣是在半高全宽为半波长以外，利用 共聚焦的接收方式可以滤去半波长以外的影响，因此在这旁瓣对系统分辨率不造成影响。 因此，利用切向偏振激发光可以实现衍射极限以下的聚焦。而切向偏振STED激光R2聚焦后为一面包圈的空心光斑，对激发光R3光斑边缘部 分进行进一步消光，进一步提高系统分辨率。本发明与以往技术不同的是，切向偏振STED 光不需要进行涡旋位相编码，直接聚焦就能得到面包圈光斑(空心光斑)，而其它STED偏振 光需要经过涡旋位相编码再聚焦后才会有面包圈光斑。图5为切向偏振STED激光与现有 技术中其它位相编码偏振光经高数值孔径消复色差透镜8聚焦后焦平面上的光强剖面对 比图。由图5可以看出，径向偏振与线偏振因为中心点能量不为零无法在STED显微技术中 使用，而用在STED显微技术中，本发明的切向偏振STED激光的能量最高处比圆偏振光的能 量最高处更接近中心点。如果从圆偏振光和切向偏振STED激光聚焦后的能量最高点到中 心能量最低点各作一条直线，可以发现切向偏振STED激光下直线的斜率更陡峭(斜率的绝 对值更大)，这说明切向偏振STED激光用作对激发光消光时的收敛比圆偏振光用作对激发 光消光时的收敛要快。也就是说在相同的功率条件下，切向偏振STED光对激发光的消光能 力更强，能得到更高的分辨率。因此，在相同的分辨率情况下，切向偏振光所需要的STED光 的工作功率更小，起到了降低STED光功率的效果。激发光R3经STED光R2调制后，激发荧光的面积大大缩小，达到直径在IOOnm以 下，中心点发射的荧光经过上述同一高数值孔径消复色差透镜8收集，透过第一二色镜5和 第二二色镜7，再经过窄带滤光片11滤波以滤去背景噪声，并经消色差聚焦透镜12聚焦到 针孔13上，荧光信号经过针孔13滤波进一步滤去背景杂散光后，透过针孔13入射到光电 探测器14上得到荧光样品上某一点的荧光信号的荧光光强，再通过移动纳米平移台10对 荧光样品扫描和对荧光强度后续数据处理，得到超高分辨率的显微图像。
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权利要求
一种基于切向偏振的超分辨荧光显微方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将用于激发荧光样品产生荧光的激发光转换为切向偏振激发光；(2)对所述的切向偏振激发光进行0～2π涡旋位相编码，得到位相编码切向偏振激发光；(3)将所述的位相编码切向偏振激发光折转90°后进行消复色差聚焦，在荧光样品上得到衍射极限以下的激发光斑；(4)将用于抑制荧光样品发出荧光的STED激光转换为切向偏振STED激光；(5)将切向偏振STED激光折转90°后，与所述的位相编码切向偏振激发光汇合且同轴，再进行消复色差聚焦，在荧光样品上聚焦形成中心点与激发光斑中心点重合的面包圈状的聚焦光斑；(6)调整STED激光的工作功率以抑制激发光斑边缘的发光，使得聚焦在荧光样品上的激发光斑中仅有中心点发射出荧光，激发光斑中发光点的面积缩小达到超高分辨率；(7)收集所述的发光点发出的荧光，在滤去背景噪声和背景杂散光后，探测得到荧光光强；(8)移动用于固定荧光样品的纳米平移台对荧光样品扫描并探测相应的荧光光强，再经数据处理后得到超高分辨率的显微图像。
2.如权利要求1所述的超分辨荧光显微方法，其特征在于，所述的切向偏振激发光或 位相编码切向偏振激发光为进行中心遮挡滤光后的环状光束。
3.如权利要求1或2所述的超分辨荧光显微方法，其特征在于，所述的步骤(3)和(5) 中的消复色差聚焦通过消复色差高数值孔径聚焦透镜实现。
4.如权利要求3所述的超分辨荧光显微方法，其特征在于，所述的高数值孔径为NA= 1 1. 4。
5.如权利要求4所述的超分辨荧光显微方法，其特征在于，所述的高数值孔径为NA=1. 4。
6.一种用于实现如权利要求1 5任一所述的超分辨荧光显微方法的装置，其特征在 于，包括用于发出激发荧光样品产生荧光的激发光的第一光源；用于将所述的激发光转换为切 向偏振激发光的第一切向偏振转换器；用于将切向偏振激发光进行0 2 π涡旋位相编码 的涡旋分布的0 2 π位相板；用于将位相编码切向偏振激发光进行90°折转的第一分光 镜；用于发出抑制荧光样品发出荧光的STED激光的第二光源；用于将所述的STED激光转 换为切向偏振STED激光的第二切向偏振转换器；用于将切向偏振STED激光进行90°折转 的第二分光镜；用于将经第一和第二分光镜折转后汇合的同轴光聚焦到荧光样品上得到中心发光点 的消复色差透镜；用于收集和探测发光点发出的荧光并根据探测到的荧光光强获得超高分辨率的显微 图像的探测成像系统；以及用于固定荧光样品的纳米平移台。
7.如权利要求6所述的装置，其特征在于，还包括用于对切向偏振激发光或位相编码切向偏振激发光进行中心遮挡滤光形成环状光束的光阑。
8.如权利要求6所述的装置，其特征在于，所述的消复色差透镜为高数值孔径的消复 色差透镜，所述的高数值孔径NA = 1 1. 4。
9.如权利要求8所述的装置，其特征在于，所述的高数值孔径NA=1.4。
全文摘要
本发明公开了基于切向偏振的超分辨荧光显微方法，包括将切向偏振激发光进行0～2π涡旋位相编码聚焦，在荧光样品上得到衍射极限以下的激发光斑；调整使切向偏振STED激光与位相编码切向偏振激发光汇合且同轴，在荧光样品上聚焦形成中心点与激发光斑中心点重合的面包圈状的聚焦光斑；调整STED激光的工作功率，使激发光斑中发光点的面积缩小达到超高分辨率；收集发光点发出的荧光，探测处理后得到超高分辨率的显微图像。本发明还公开了用于实现上述基于切向偏振的超分辨荧光显微方法的装置。本发明中，在保证高分辨率的情况下，大大降低了STED的工作功率，从而降低样品的漂白，避免对样品的损坏。
文档编号G02B21/00GK101907766SQ20101022501
公开日2010年12月8日 申请日期2010年7月9日 优先权日2010年7月9日
发明者刘旭, 匡翠方, 王婷婷, 郝翔 申请人:浙江大学