一种微型结构光照明超分辨荧光显微成像方法及装置与流程

本发明涉及一种微型的结构光照明荧光显微成像方法及装置，属于光学超分辨显微成像及荧光检测领域。

背景技术：

光学显微镜在生物、医学等领域有着十分重要的作用，显微能力的大小对科学的发展及人的思维有着极其重要的推动作用。普通光学显微镜由于其本身洐射极限的存在，成像横向分辨率在200nm左右，纵向分辨率在500nm～600nm。

超分辨光学显微技术以一种新的切入点，通过在普通光学显微镜的基础上加入对时间或空间上的调制，突破了光学衍射极限，将显微镜的光学分辨率提高到了100nm以内。在多种超分辨显微成像方法中，结构光照明超分辨荧光显微镜以其重构超分辨图像所需原始图像数量最少、采集数据时间短而成像速度高；以其激发光功率远低于其它超分辨成像方法，最适合用来动态的荧光快速超分辨成像。

结构光照明超分辨荧光显微成像过程中使用的结构光产生装置主要有光栅调制产生结构光、空间光调制器或数字微镜调制结构光照明图案。其中前者产生结构光条纹的相位和方向移动是借助光栅的移动和旋转实现的，所以机械运动限制了其成像速度和精度；后者利用数字控制的方式产生结构光图案在一定程度上提高了成像速度。两者如需进一步提高成像时间分辨率，都需要提高激发光的功率。但是这会加速荧光分子的光漂白效应，使观察样本快速失活。

此外它们还有一个共同的劣势：需要一定空间距离来产生干涉条纹。这使得整个结构光产生装置和整个结构光照明荧光显微系统体积较大，不利于空间荧光检测应用和紧急事件时移动便携检测。理论和实践都证明照明结构若以干涉为前提，则结构光照明超分辨荧光显微系统的体积缩小不可能太多；同时还不利于活细胞的荧光检测。因为较长的干涉距离会使结构光条纹的对比度较差，需要依靠提高激发功率来提高条纹对比度，以达到较好的成像目的。

技术实现要素：

针对以上结构光产生装置和结构光照明超分辨荧光显微系统体积大，且难以进一步缩小体积，精度和时间分辨率难以进一步提高的问题，我们提出一种覆盖式的非干涉方式的结构光产生装置和基于此的荧光超分辨显微系统。

首先本发明提出一种微型结构光产生装置。

该微型结构光产生装置由多边形棱台和多个线状激光器组成；其中，多边形棱台为透明材质的，多边形棱台下底面面积大于上底面面积，多边形棱台侧面与底面的夹角记为β，棱台的棱与所在侧面的底边夹角记为α；至少有两个多边形棱台侧面配有线状激光器，每个线状激光器均与对应侧面及对应侧面底边平行，入射光垂直所在侧面入射，线状激光能够在棱台的上下底面之间以β角度(小于棱台材料该激光波长的全反射角)“之字型”折线反射式横向传播，并且光每次反射到棱台的上底面会有一部分光因折射而泄露(如图2所示；为了清晰体现光线传播，图2中a仅画出了一条光线；图2中b为模拟的线状激光于装置中的传播图)。最终，装置上表面将产生清晰的条纹结构光(如图3中a所示)。

至少两个线状激光器不平行。

通过改变该多边形棱台材料的折射率，如多边形晶体或玻璃棱台，但是保持线状激光与侧面垂直入射，可以得到如图3中b和图3中c所示的条纹间距不变的侧移条纹结构光，即结构光产生了相位移动。

多个不平行的激光器可以产生结构完全相同但方向不同的条纹结构光。使用时使多个不平行的激光器轮流工作，使得产生的条纹结构光产生旋转；如采用3个不平行的激光器，则激光器2、激光器3产生的条纹结构光可以看作相对于激光器1产生的条纹结构光产生了旋转。

本发明的微型结构光产生装置得到了一个可以产生相移、可以改变结构光条纹方向的微型结构光产生装置。这种结构光产生装置明显的优势是，结构光条纹的相移和方向改变不需要要任何机械运动，且响应迅速。

再者本发明提出了一种新的结构光照明超分辨荧光显微系统。

如图4所示，本发明的结构光照明超分辨荧光显微系统包括：载物台(1)、上述的微型结构光产生装置(2)、样品(3)、物镜(4)、滤波片(5)、会聚透镜(6)、数字成像设备(7)和计算机(8)；微型结构光产生装置(2)放在载物台(1)上，样品(3)位于微型结构光产生装置(2)的上方，优选紧贴微型结构光产生装置(2)上底面，样品(3)的正上方依次为物镜(4)、滤波片(5)、会聚透镜(6)、数字成像设备(7)，其中数字成像设备(7)、微型结构光产生装置(2)都通过数据线连接到计算机(8)；计算机(8)通过控制微型结构光产生装置(2)中的激光器，在微型结构光产生装置上表面产生条纹结构光；微型结构光产生装置的上底面与紧贴样品(3)，以使条纹结构光直接照射到样品上；样品在条纹结构激光发光的激发下发射荧光；荧光经过物镜(4)、滤波片(5)、会聚透镜(6)，由数字成像设备(7)采集并转换为电信号给计算机(8)；计算记录图像。

依次使用上述三个激光器照明，可以得到3幅不同的图像；两次改变微型结构光产生装置的折射率，同时再依次使用上述三个激光器单独照明，又可以得到6幅图像；最后通过使用现在普通的超分辨图像处理算法处理这些9幅原始的图像，可以得到样品的超分辨图像。

本结构光产生装置可以采用多种方法改变折射率。如棱台采用铌酸锂材料，通过改变电压来改变材料的折射率；也可以采用在微型结构光产生装置的下表面贴上TEC温控装置，通过精确改变温度的方法改变材料的折射率。

本结构光立生装置可以采用的多边形棱台可以是正多边形棱台，也可以是非正多边形棱台，只要利用多边形棱台的侧面产生合适的条纹方向即可。

本结构光产生装置产生的结构光均匀性可由多种方式控制，如可以在图1b中正六边形棱台的剩余三个侧面(4、5、6)也安装相同的线状激光器。使用正六边形棱台中相对侧面的激光器同时工作(如激光器1和激光器4、激光器2和激光器5、激光器3和激光器6)，产生的条纹位置重合，从而实现均一光强的结构光条纹；也可以在结构光产生装置的上表面镀膜，使靠近激光器一侧的光透过率小而远处大，从而保证结构光条纹的均一性。

本微型结构光照明超分辨荧光显微系统可以是替换现有结构结构光照明超分辨显微镜的中的照明光源和结构光产生装置后的系统，包括共聚焦超分辨荧光显微系统。

本系统中微型结构光产生装置除了上表面紧贴样品下表面，也可以于样品有很小的间距，实现背照明结构光荧光显微；用于普通照明结构光照明荧光显微。

超分辨图像处理算法可以是目前已经用于结构光超分辨荧光显微系统的超分辨图像处理算法。

本发明为结构光照明超分辨荧光显微系微型化提供了一种新思路，去除了普通结构光照明超分辨荧光显微系统用于产生结构光的干涉光路，大大减小了结构光照明超分辨荧光显微系统的体积；并且使用时无任何机械运动，提高了系统的稳定性和精度；另外本系统由于各项操作均可以计算机控制，所以也使结构光照明超分辨荧光显微系统成像速度大大提高。

附图说明

图1微型结构光产生装置两种示意图；

图2微型结构光产生装置光线传播示意图；

图3微型结构光产生装置产生的条纹结构光示意图；

图4微型结构光照明超分辨荧光显微系统结构图；

载物台1、上述的微型结构光产生装置2、样品3、物镜4、滤波片5、会聚透镜6、数字成像设备7和计算机8。

具体实施方式

下面结合附图详细说明本发明的实施方式，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1

如图1中b所示，微型结构光产生装置包括六个完全相同的475nm线阵半导体激光器(激光器1、激光器2、激光器3、激光器4、激光器5、激光器6)和一个正六变形棱台。正六边形棱台的材料为铌酸锂材料，可以通过计算机控制加铌酸锂材料的电压，从而控制微型结构光的折射率，最终改变条纹结构光的相位移动。

如图4所示，本发明的结构光照明超分辨荧光显微系统包括：载物台1、微型结构光产生装置2、样品3、物镜4、滤波片5、会聚透镜6、数字成像设备7和计算机8；其中数字成像设备7、微型结构光产生装置2都通过数据线连接到计算机8。计算机8通过控制微型结构光产生装置2中的激光器，在微型结构光产生装置上表面产生条纹结构光；微型结构光产生装置的上表面与紧贴样品3，以使条纹结构光直接照射到样品上；样品在条纹结构激光发光的激发下发射荧光；荧光经过物镜4、滤波片5、会聚透镜6，由数字成像设备7采集并转换为电信号给计算机8。

下面给出具体操作步骤：

1)在不放置样品的情况下，通过计算机控制，同时打开激光器1和激光器4，调整，得到较好均一性和对比度的结构光条纹；再依次同时打开激光器2和激光器5、激光器3和激光器6，使得到的结构光条纹均一性和对比度与同时打开激光器1和激光器4时完全一致。

2)同时打开激光器1和激光器4，在通过微型结构光产生装置得到结构条纹，并且照射到样品上；激光发出的荧光，依次通过微型结构光产生装置、物镜、滤波片、聚光镜、最后到达数字成像设备；数字成像设备采集信息后在计算计上得到第1幅初始图像。

3)通过计算机两次次改变微型结构光产生装置的电压进而改变其折射率，每次结构光条纹均产生一个相位移动，分别记录此时计算机得到的第2幅和第3幅初始图像。

4)分别在仅打开第二组照明光源(激光器2和激光器5)和第二组照明光源(激光器3和激光器6)，重复步骤2)和步骤3)，依次得到其余6幅初始图像。

5)计算机采用普通的超分辨荧光显微成像处理算法处理这9幅图像，得到最终的超分辨荧光显微图像。