专利名称：：鉴定人早期癌症、癌症发展和复发标志物的方法
技术领域：
：本发明提供了鉴定癌症分泌的标志蛋白的方法。具体说，本发明采用的基因捕获技术能检测基因表达的变化。
背景技术：
：癌症死亡率主要由于诊断太晚所致，癌症发展到晚期时现有的治疗方法已无效。虽然采用质谱和其它技术的蛋白质组学能够特征鉴定血清、血浆和尿中的蛋白质，但对大多数癌症类型而言，仍然缺少有用的早期标志物(Rai等，」"".7V7爿c^/.Scz..(2004)1022:286-294;Diamandis，A^/.Omcer(2004)96:353-356)。组织学曾采用抗肿瘤细胞提取物的单克隆抗体来鉴定候选的肿瘤标志物(Fidler，Ca"ceriaewr/2(1978)38:2651-2660)。对这些候选物的筛选和评价已成为鉴定新型肿瘤标志物的传统方法。然而，这种技术有局限性，在评价大量候选标志物时劳动强度高而且耗时。对特定癌症类型的灵敏和特异性标志物的鉴定也很困难。对大多数癌症类型的诊断、预后、分期、复发和检测残留的很少癌症的标志物鉴定仍有困难。目前用于分析血清的SELDI-TOF质谱技术无法检测到浓度低于1pg/mL的任何血清组分(Lai等，/VocA/a仏XcW.C/iX4(2002)99:3651:3656)。但此浓度范围比循环系统中已知肿瘤标志物的浓度高约1000倍(表l)(Lai，同上)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>参考文献Diamandis，同上。基因-捕获载体可标记内源基因，使得能够检测基因表达的变化。标记基因使得能够研究相应基因的特异性启动子和功能。然而，基因-捕获载体(大部分是质粒或逆转录病毒的载体)的局限性是效率低、表达时期短暂或限于分裂细胞。近年来开发的基于HIV-1的慢病毒载体克服了这些障碍，已逐渐提高了其在体外基因递送中的应用。这些载体能导致在体内中枢神经系统(CNS)、造血系统、视网膜、肌肉、肝脏和胰岛的细胞中长期的基因表达(Lai，同上)。HIV-1慢病毒载体可整合到分裂和未分裂的细胞基因组中，而稳定表达转基因。已经开发了两种基于HIV-1的慢病毒载体衍生物pZR-l和pZR-2，用于哺乳动物细胞的体外和体内基因捕获(Lai，同上)。这些慢病毒基因-捕获载体所含的报道基因或是P-内酰胺酶或是绿色荧光蛋白(GFP)，插入在3'长末端重复序列的U3区中。采用方便的感染技术很容易将这两种捕获载体整合到宿主基因组中，而导致GFP或P-内酰胺酶表达。这种技术有助于快速富集和克隆捕获的细胞。这种报道基因可由上游细胞特异性启动子驱动(Lai，同上)。
发明内容本发明方法利用基因捕获技术来鉴定作为各种程度人类恶性癌症，如早期癌症、癌症发展和复发标志物的分泌蛋白。在一个代表性实施方式中，用上述GFP-基因-捕获载体转染恶性人癌(细胞)的初始变体使之向正常状态回复(Jiang等，/Voc.Awoc./orCa"cerTay.(2004)45:937)。鉴定表达GFP的细胞系，测定它们是否分泌GFP-捕获蛋白。将分泌GFP-连接蛋白的细胞克隆植入小鼠中，测定血清中是否分泌了GFP-连接蛋白。在体内评估这类克隆，鉴定这种非恶性变体的特异性连接GFP的分泌蛋白。后续实验利用动物使该非恶性人癌变体再次回复成各种阶段恶性细胞来鉴定(标志)癌症发展的特异性分泌GFP的连接变体。对恶性程度低的人癌细胞变体进行平行体外实验(Jiang，同上)，以比较体内和体外向恶性细胞发展的人细胞分泌GFP的连接蛋白。在一方面，本文提供了鉴定癌症分泌的标志蛋白的方法，该方法包括a)用含有报道基因的HIV-1慢病毒-基因-捕获载体转染恶性程度不同、已经向非恶性状态回复的多种人癌细胞；b)鉴定能在体外分泌报道物连接蛋白的含有表达报道物的细胞系；c)将已鉴定到报道物表达细胞系各克隆植入动物中；d)鉴定在血清中分泌报道物连接蛋白的植入的报道物表达细胞系克隆；和e)鉴定步骤d)中恶性程度从低到高各阶段人癌细胞特异性分泌的报道物连接蛋白；其中，鉴定到的蛋白质是各癌症阶段的标志。在一实施方式中，所述方法还包括:f)鉴定非恶性人癌细胞再次回复成各阶段恶性细胞的癌症发展的特异性分泌的报道物连接蛋白；其中，鉴定到的蛋白质是癌症发展和复发的标志。该方法还可包括g)比较向恶性发展的恶性程度低的人癌细胞中体外和体内分泌的报道物连接蛋白。在一些实施方式中，所述报道物是GFP，步骤b)还包括bl)用RFP转化向正常状态回复的转染癌细胞；b2)分离和克隆GFP+细胞；b3)培养GFP+克隆；b4)鉴定GFP+荧光克隆；和b5)从鉴定到的荧光克隆中鉴定分泌GFP-蛋白的细胞。该方法在步骤d)之后还可包括，制备体内分泌报道物-或GFP-蛋白的细胞文库。本发明方法中的报道基因可以是GFP或p-内酰胺酶。含有报道基因的HIV-1慢病毒基因-捕获载体可以是HIV-1慢病毒-GFP-捕获载体如pZR-l或pZR-2。植入的克隆可选自前列腺癌、睾丸癌、肺癌、肝细胞瘤、绒毛膜癌、乳腺癌或结肠癌细胞。在另一方面，本文提供了用本发明方法鉴定的蛋白质。在还有一方面，本文提供了包含各种恶性程度的人癌细胞文库，其中所述细胞含有随机捕获的基因，各自含有报道基因。在一些实施方式中，所述报道基因表达绿色荧光蛋白(GFP)。考虑到，人癌细胞亚组含有能编码分泌蛋白的报道物捕获基因。在一实施方式中，该报道物捕获基因能在体外表达分泌的蛋白质。在一些实施方式中，该报道物捕获基因能表达体内分泌的蛋白质。当癌细胞具有特定的恶性程度时，该报道物捕获基因能表达体外或体内分泌的蛋白质。有时，癌细胞具有的恶性程度能够侵入(组织)或转移。在这类细胞中，报道物捕获基因有时能表达体外和体内分泌的蛋白质，而可在移植有表达该报道物捕获基因的细胞的啮齿动物血清中可以检测到。在一方面，本文提供了能够表达用本文所述任何方法鉴定到的癌症发展标志蛋白的分离基因的文库，其中在肿瘤发展的特定步骤中所述基因不含报道基因或基因-捕获载体。附图的简要说明图1是说明本发明实施方式的实验流程图。图2描述了Lai(同上)所述的HIV-1慢病毒基因-捕获载体系统的组件。(J)载体构建物。(Z)基因-捕获载体含有报道基因GFP(ZR-2)，后接剪接接受位点。0'0HIV-1慢病毒对照载体BLAK，(3-内酰胺酶编码基因；SA，剪接接受位点。(5)辅助(包装)构建物。(C)编码水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)的包膜构建物(Lai,同上)。实施本发明的方式本发明方法利用了含有报道基因的HIV-1慢病毒基因-捕获载体，将其转染到恶性程度不同的人癌细胞中。在一方面，鉴定已向正常状态回复的因而可认为是"非恶性"的人癌细胞的特异性蛋白。随着细胞从此种非恶性阶段向恶性阶段轻微发展，可转染恶性程度低的人癌细胞。这种再次回复成各种恶性阶段的非恶性人癌细胞适合于鉴定癌症的发展和复发。因此，术语"不同恶性程度"指处于不同恶性阶段和/或非恶性阶段的癌细胞。本发明的基因-捕获载体优选为HIV-1慢病毒基因-捕获载体。这类载体含有报道基因，如绿色荧光蛋白(GFP)或p-内酰胺酶。也可采用其它报道基因。所述报道基因可表达另一种荧光团，如蓝色荧光蛋白(BFP)或红色荧光蛋白(RFP)。将编码报道物的核苷酸序列操作性连接于该慢病毒基因-捕获载体的所有方法都属于本发明范围。优选表达GFP的报道基因。本发明方法首先包括体外步骤。在体外，即在无血清培养基中鉴定分泌报道物连接蛋白的表达报道物的细胞系。培养表达此报道物-慢病毒载体的癌细胞，优选向正常状态回复的癌细胞，并分析其报道物(优选GFP荧光)的表达情况。分离和培养通过报道物鉴定到的培养(细胞)。浓縮分泌该报道物连接蛋白培养细胞的培养液，然后可用天然聚丙烯酰胺凝胶分离此浓縮培养液中的组分，进行电泳和荧光分析，测定连接该报道物的分泌蛋白的位置。然后进一步评估体内分泌可鉴定的报道物连接蛋白的(细胞)克隆。体内评估包括将鉴定为分泌报道物连接蛋白的细胞植入实验室动物如裸小鼠中。实验室动物一般是啮齿动物，如小鼠、大鼠或家兔，但也可以是其它哺乳动物如猴。优选(细胞能)分泌可检测量的报道物连接蛋白，以便鉴定该细胞。在动物中培养该细胞，收集血清，用与上述体外分析相类似的方法进行分析。本发明还分析了能分泌报道物连接的分泌蛋白的细胞的不同恶性程度和发展程度。宜用报道物，优选与连接该蛋白的报道物不同的报道物转化该细胞。例如，如果慢病毒基因-捕获载体含有GFP报道基因，宜用不同的报道基因如RFP转化细胞。可使与报道物连接的分泌蛋白有关的癌细胞在体内再次回复成其恶性状态，由于这种发展，可观察到不同于该基因捕获载体中所含报道基因的另一种报道基因的表达。因此，可收集肿瘤发展不同阶段的血清样品，用上述方法分析是否存在该报道物连接的分泌蛋白。可利用这些数据，随着人细胞再次回复成恶性细胞，鉴定体内各特定恶性阶段以及体外持续存在的候选标志物。实施例1载体构建物和病毒生产质粒NL-neo是基于NL4~3的分子克隆，带有一个(核苷酸)缺失而使位点变为5g/H位点。将携带neo基因序列和衍生自pBKCMV(司查塔基公司(Stratagene))的SV40早期启动子的1,169-bp片段插入5amHI位点和Wol位点之间。为了构建基于慢病毒的基因捕获载体，将绿色荧光蛋白(GFP)插入3'长末端重复序列U3区的Wol和Z&al位点之间，得到ZR-2载体(图l)(Lai，同上)。将剪接接受位点安置在此报道基因之前，以便由上游细胞特异性启动子(控制其)表达。为了有效地翻译该融合转录物，基因盒中的聚腺苷酸化信号将阻止该融合基因的转录(Lai，同上)。将内部SV40早期启动子驱动的细菌neo基因放置在此慢病毒基因-捕获载体的5amHI和^oI位点之间，以便进行G418选择(Lai，同上)。因而，产生的pZR-2是自身失活的(SIN)慢病毒基因-捕获载体，此载体中3'LTR的U3区缺失，被EGFP基因取代。因为SIN前病毒中的长末端重复序列的转录失活应能防止复制活性病毒的迁移(Lai，同上)，所以此慢病毒基因-捕获载体的这些修饰应能提高载体介导基因递送的安全性，并促进基因转导到未分裂细胞中(Lai，同上)。为了制备HIV-1假型，用转染试剂盒(司查塔基公司)将辅助质粒DNA(5Hg)、Env血浆DNA(5pg)和载体质粒DNA(5pg)共同转染到亚汇合的293T细胞中(Lai，同上)。在转染前24-30小时将细胞接种到6孔板中，每孔约2x106个细胞。转染后60-65小时收获病毒母液，通过0.45屮m孔径滤器过滤、分装、冻存于-8(TC(Lai，同上)。实施例2恶性程度不同的人肿瘤细胞如(Jiang，同上)所述获得各种人(肿瘤细胞)克隆。实施例3用慢病毒-GFP载体转染用慢病毒基因-捕获载体ZR-2转导恶性程度不同的人肿瘤细胞。在含有2.2ml培养基的12孔培养皿中，在包被有聚L-赖氨酸(贝克顿迪金森公司(BectonDickinson))的12-mm圆形盖玻片上培养细胞。为了产生捕获细胞系，如(Lai，同上)所述用慢病毒ZR基因捕获载体37'C培育细胞3-5小时。G418选择后，将抗性细胞集落转移到24孔板中，扩增至汇合，在荧光显微镜下观察GFP表达。用该捕获载体转导的细胞中，多达100。/。为GFP阳性，表明转导的效率很高(Lai，同上)。实施例4同位植入-前列腺用氯胺酮-赛拉嗪-乙酰丙嗪-混合物麻醉小鼠，仰卧放置。恰好在耻骨联合上方作弓形皮瓣切口暴露前列腺。小心分离前列腺周围筋膜，用一对小手术剪作一小切口，暴露前列腺的两个背侧叶。将表达慢病毒GFP的前列腺癌细胞(106)注射到一叶或两叶中。用6-0缝合线缝合腹部。所有操作过程都在7x解剖显微镜下进行。实施例5同位植入-乳腺然后，如下所述进行同位植入手术用氯胺酮-赛拉嗪-乙酰丙嗪-混合物麻醉小鼠，仰卧放置。将右侧第二个乳房用于同位植入。沿乳头内侧作小切口。钝性剥离暴露乳房脂肪垫。然后注入表达慢病毒GFP的细胞。用6-0丝线缝合皮肤。所有操作过程都在5x解剖显微镜下进行。实施例6同位植入-结肠作腹中线小切口，从腹部取出肠子的结盲肠部分。去除结肠浆膜，注入1()S个表达GFP慢病毒的肿瘤细胞。然后将肠子放回腹腔，用6-0手术丝线缝合腹壁。实施例7荧光显微术用装有氙灯电源的尼康(Nikon)显微镜进行光学和荧光显微术。也可采用装有汞灯电源的莱卡(Leica)LZ12型立体荧光解剖显微镜。这两种显微镜都装有GFP滤片(色谱技术公司(ChromaTechnology),佛蒙特州布莱特尔博罗(Brattleboro,VT))。用ImageProPlus3.0版软件(媒体控制公司(MediaCybernetics),马里兰州施尔福施普林格(SilverSpring,MD))处理显微镜照片的亮度和对比度。实施例8荧光成像为了同时观察GFP和RFP荧光，通过D425/60带通滤光片和470DCXR双色镜产生激发光。通过宽带滤光片GG475(佛蒙特州布莱特尔博罗的色谱技术公司)收集发射的荧光。在光盒(光线工具研究公司(LightoolsResearch),加州因悉尼塔(Encinitas，CA))中进行低倍放大成像。用狭缝纤维光学器件通过干扰滤光片(440+/-20nm)在光盒中激发产生GFP和RFP肿瘤的荧光。通过520nm宽带滤光片观察荧光。在浜松(Hamamatsu)C58103-芯片冷色CCR相机(浜松光学系统公司(HamamatsuPhotonicsSystems),新泽西州布里奇沃特(Bridgewater，NJ))上捕获显微镜和光盒的图象。实施例9鉴定体外分泌的GFP-连接蛋白在24孔板中培养表达RFP的向正常状态回复(13)并表达GFP慢病毒载体的癌细胞克隆。收集各孔的条件培养液，先用荧光计分析GFP荧光(激发光490nm/发射光510nm)。在六孔板中用此条件培养液培养含有GFP荧光的培养细胞。浓縮分泌GFP连接蛋白-培养细胞的条件培养液。然后将此浓縮培养液加到天然聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。在荧光灯下拍摄该凝胶的照片，测定GFP-连接分泌蛋白的位置。对分泌可鉴定的GFP-连接蛋白的克隆作进一步体内评估(见下)。实施例10鉴定体内分泌的GFP-连接蛋白如上所述，将向正常状态回复经鉴定能在体外分泌特异性GFP-连接蛋白(如上所述)的表达RFP的癌细胞克隆同位植入裸小鼠中。如上所述，分析植入细胞已生长动物的血清中的GFP-连接蛋白。利用RFP荧光鉴定，使可在血清中鉴定到GFP连接分泌蛋白的癌细胞在体内再次回复成其恶性状态。收集不同肿瘤发展阶段的血清，如上所述分析其中是否存在GFP-连接的分泌蛋白。随着此种人细胞再次回复成恶性细胞，分析恶性程度和发展程度不同的细胞分泌的、作为体内特定恶性阶段和体外持续存在的候选标志物的GFP连接分泌蛋白的总量。实施例11数据分析适当时，用配t检验和方差分析(ANOVA)评估具体分泌型GFP连接蛋白的存在与恶性状态之间的统计学显著性。最初恶性阶段定义为l)原发性肿瘤小于5mm;2)原发性肿瘤小于1cm;3)存在侵入性局部区域癌症；4)存在远距离转移。累积数据表示为平均值土SD，和相应的/7值。实施例12研究用动物采用约500只无胸腺远交肌/""裸小鼠(雄性，5-6周龄)分析植入恶性程度不同细胞的GFP捕获的分泌蛋白。同位植入手术(SOI)通过同位植入手术(SOI)将稳定表达GFP的、以前在裸小鼠中皮下生长的细胞或组织块(lmn。植入裸小鼠中。适当暴露待植入器官后，用8-0号手术缝合线穿透此组织块将其连接在合适的同位器官上。用7-0号手术缝合线缝合一层皮肤切口。在手术中，用氯胺酮-赛拉嗪-乙酰丙嗪-混合物麻醉。所有上述手术方法均在7x放大的显微镜(莱卡MZ6，德国奴斯洛克(Nussloch，Germany))下进行。最后，将50(il含106-107个细胞的悬液注入宿主器官中。皮瓣窗口模型通过上腹壁上的皮瓣开口观察同位(植入的)GFP表达细胞。在手术过程中，用氯胺酮-赛拉嗪-乙酰丙嗪-混合物麻醉。分离皮下结缔组织游离皮瓣。可打开皮瓣通过几乎透明的小鼠体壁暴露内部器官。这种方法不仅能减少要拍摄图像的器官的深度，而且大大减少了绿色荧光的散射。我们发现，用小心的无菌操作技术打开和关闭该窗口每周三次不会引起死亡或感染。可用新孢霉素局部处理该皮瓣。将动物放置在有屏蔽设施的层流清洁架中，饮用水中含有氨苄青霉素。权利要求1.一种鉴定癌症分泌的标志蛋白的方法，所述方法包括a)用含有报道基因的HIV-1慢病毒-基因-捕获载体转染恶性程度不同、已经向非恶性状态回复的多种人癌细胞；b)鉴定能在体外分泌报道物连接蛋白的报道物表达细胞系；c)将已鉴定到的各报道物表达细胞系的克隆植入动物中；d)鉴定在血清中分泌报道物连接蛋白的植入的报道物表达细胞系克隆；和e)鉴定步骤d)中恶性程度从低到高的各阶段的人癌细胞特异性分泌的报道物连接蛋白；其中，鉴定到的蛋白质是各癌症阶段的标志。2.如权利要求1所述的方法，还包括f)鉴定非恶性人癌细胞再次回复成各阶段恶性细胞的癌症发展的特异性分泌的报道物连接蛋白；其中，鉴定到的蛋白质是癌症发展和复发的标志。3.如权利要求2所述的方法，还包括g)比较向恶性发展的恶性程度低的人癌细胞中体外和体内分泌的报道物连接蛋白。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述报道物是GFP，其中步骤b)还包括bl)用RFP转化向正常状态回复的转染癌细胞；b2)分离和克隆GFP+细胞；b3)培养GFP+克隆；b4)鉴定GFP+荧光克隆；和b5)从鉴定到的荧光克隆中鉴定分泌GFP-蛋白的细胞。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，在步骤d)之后还包括，制备体内分泌报道物-或GFP-蛋白的细胞文库。6.如权利要求l、2或3所述的方法，其特征在于，所述报道基因是GFP或(3-内酰胺酶。7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述含有报道基因的HIV-1慢病毒基因-捕获载体是HIV-1慢病毒-GFP-捕获载体。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述HIV-1慢病毒-GFP-捕获载体是pZR-l或pZR-2。9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述植入克隆选自前列腺癌、睾丸癌、肺癌、肝细胞瘤、绒毛膜癌、乳腺癌或结肠癌细胞。10.—种用前述权利要求中任一项所述方法鉴定的蛋白质。11.一种包含各种恶性程度的人癌细胞的文库，其中所述细胞含有随机捕获的基因，各自含有报道基因。12.如权利要求11所述的文库，其特征在于，所述报道基因能表达绿色荧光蛋白(GFP)。13.如权利要求ll所述的文库，其特征在于，所述细胞的亚组含有能编码分泌蛋白的报道物捕获基因。14.一种权利要求13所述细胞文库的报道物捕获基因文库，其中所述报道物捕获基因能够表达体外分泌的蛋白质。15.—种权利要求13所述细胞文库的报道物捕获基因文库，其中所述报道物捕获基因能够表达体内分泌的蛋白质。16.如权利要求ll所述的文库，其特征在于，当所述癌细胞具有特定的恶性程度时，所述报道物捕获基因能够表达体外或体内分泌的蛋白质。17.如权利要求16所述的文库，其特征在于，所述癌细胞具有的恶性程度能够侵入或转移。18.如权利要求17所述的细胞文库，其特征在于，所述报道物捕获基因能够表达体外和体内分泌的蛋白质，并且在移植了表达该报道物捕获基因的细胞后在啮齿动物血清中可以检测到。19.一种能够表达用权利要求1-9中任一项所述方法鉴定的癌症发展标志蛋白的分离基因的文库，其中在肿瘤发展的特定步骤中所述基因不含报道基因或基因-捕获载体。全文摘要本发明描述了一种鉴定癌症恶性程度相关分泌蛋白的方法。先利用含有可插入荧光蛋白基因的载体捕获蛋白质进行鉴定。通过荧光鉴定此分泌蛋白。分离到此分泌蛋白即可鉴定肿瘤的具体恶性程度，从面确定它们可否用作癌症发展的标志物。文档编号C40B40/08GK101305094SQ200680036304公开日2008年11月12日申请日期2006年9月29日优先权日2005年9月30日发明者L·科佩洛维奇,Y·谭,徐明旭申请人:抗癌股份有限公司;以局长为代表的美国政府，卫生署和人类服务部