日本血吸虫紫外线(uv)-照射致弱尾蚴的单链抗体库的制作方法

专利名称：：日本血吸虫紫外线(uv)-照射致弱尾蚴的单链抗体库的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程抗体领域，具体涉及日本血吸虫uv-致弱尾蚴单链抗体库的构建及鉴定方法。背景资料血吸虫病仍然在许多是一种严重危害人类身体健康和生命安全、阻碍疫区经济发展和社会进步的人兽共患病。Chitsulo等报道，全世界74个国家，6亿人受感染威胁，2亿人被感染，其中1.2亿人出现了症状，2000万人被严重感染。血吸虫病病情的控制至今仍然是世界上急待解决的一个严重的公共卫生问题。血吸虫疫苗的开发研制是血吸虫病防治研究的重点，照射致弱尾拗是目前能有效抗日本血吸虫感染的一种免疫原，经紫外线照射致弱的血吸虫尾蚴免疫宿主可诱导宿主产生较强的免疫保护力，有的减虫率高达90%，保护力持续时间长达6个月之久。实验证明，紫外线照射致弱尾蚴多次免疫动物后，其免疫保护机制转为抗体依赖性的体液免疫为主。随后又证实了IgG为其主要的效应抗体，尤其是提取纯化的亚型IgGl抗体可诱导更高的保护力。因此抗体在日本血吸虫紫外线照射尾蚴多次免疫免诱导的免疫保护机制中起着重要作用。但是由于照射致弱疫苗会造成宿主病理损害、其抗原材料来源有限、制备、保存等问题，限制了其在人体中的应用。噬菌体抗体库技术是20世纪90年代初发展起来的基因工程抗体技术，随着蛋白组学时代的到来，大量新发现基因的表达和功能的研究需要众多高亲和力、高特异性抗体。该技术可很好地解决此问题，并被认为是抗体工程领域的革命性进展。此技术用PCR将免疫球蛋白全套可变区基因扩增出来，克隆到表达载体中，通过与单链丝状噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白表达在噬菌体的表面，使之成为噬菌体抗体。由于此技术绕过细胞杂交，避免了杂交瘤细胞系不稳定的缺点，且操作简便，库容量大，成本低，还可不经免疫制备人源或鼠源性抗体，故被认为是继杂交瘤抗体之后的第3代抗体。单链抗体是具有与抗原特异性结合的最小功能单位，它以体积小、渗透性强等特点，可以很方便地导入细胞内，产生细胞内抗体，结合、封闭特定抗原，造成细胞的表型剔除，用以研究蛋白质功能，探索致病机制。它亦可作为人源性抗体，且其分子小、免疫原性低、用于人体不易产生抗异种蛋白反应，易于进行基因操作等特点，因而可开发出更加理想的分子疫苗。本发明利用紫外照射致弱尾蚴的体液免疫高保护力的特点和噬菌体抗体库诸多的优点，成功构建了紫外照射日本血吸虫致弱尾呦单链抗体库单链抗体(ScFv)表达文库。近几年来，构建噬菌体抗体库制备日本血吸虫特异性单链抗体技术的发展，已经为制备抗血吸虫感染基因工程全分子抗体奠定了扎实可靠的理论和实验基础2001年俞小淙等(俞小淙，蒋欣,等.抗日本血吸虫膜蛋白特异性单链抗体的构建及表达，中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2001，(3):9-14)成功地构建和表达了抗日本血吸虫膜蛋白特异性单链抗体。2003年，陈代雄等(陈代雄，詹希美，何蔼,等.抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建和初步应用，热带医学杂志，2003，3(4):391-395.)以FNO-PQ为靶抗原，从构建的抗日本血吸虫噬菌体抗体库中筛选、富集目的抗体克隆，成功地构建了抗日本血吸虫噬菌体单链抗体库，并从中筛选到抗日本血吸虫循环抗原的单链抗体。同年，徐劲等(徐劲,吴忠道,等.抗日本血吸虫卵单抗33F5可变区轻、重链基因的串联及克隆，中国血吸虫病防治杂志，2002，14(3):173-175.)制备了抗日本血吸虫虫卵尿素溶性抗原单克隆抗体22F5的基因工程单链抗体，宋晓彤等(宋晓彤,冯振卿，等.日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单链抗体基因的构建和表达，中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2002，(3):26-28)构建了日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单链抗体(ScFv)基因。此后，朱毅等(朱毅,等.日本血吸虫单克隆抗抗独特型抗体NP48单特异性双链抗体的构建表达与初步鉴定，中国血吸虫病防治杂志，2005,(4):241-245)2005年构建和表达日本血吸虫单克隆抗抗独特型抗体NP48单特异性双链抗体，并初步鉴定表达产物活性。2006年，岳国峰(岳国峰，等.人源日本血吸虫Fab抗体库的构建及抗独特型抗体的筛选、鉴定，南京医科大学学报，2006，36(11):997-1000.)等成功构建了人源日本血吸虫Fab抗体库，并从中获得人源日本血吸虫抗独特型抗体B6，为研制用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定了基础。2007年，雷黎等(雷黎，赵志荣等.人源性抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定，中国人兽共患病学报，2007，23(4):386-389).从对血吸虫感染有一定抗性成年人外周血淋巴细胞中扩增出人IgG轻链和重链Fd段基因片段，成功地构建了人源性抗日本血吸虫Fab段噬菌体抗体库。何卓等(本课题组)构建日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)单链抗体(ScFv)表达文库，并对文库进行筛选获得针对日本血吸虫病疫苗候选分子S正A26-28kDa的特异性单链抗体。单链抗体库及其特异性的单链抗体应用于血吸虫病研究领域具有重要的意义，它为曰本血吸虫病的诊断、预防及治疗提供了更经济的途径。
发明内容本发明的目的在于针对现有血吸虫辐射致弱疫苗的不足，结合单链抗体的诸多优点，提供一种富含高效日本血吸虫紫外照射致弱尾蚴单链抗体的库源，可进一步筛选用于血吸虫病诊断和治疗的特异性单链抗体，并研究这些抗体的免疫学特性、生物学活性和功能。所述日本血吸虫单链抗体库是采用噬菌体抗体库技术构建的抗日本血吸虫紫外照射致弱尾蚴的全套单链抗体库，其库容量达到1.9乂108，.重组效率为100%。本发明的另外一个目的在于提供一种高效的构建日本血吸虫紫外照射致弱尾蚴单链抗体的库的方法，包括以下步骤1)紫外照射致弱尾拗动物模型的建立；2)UV致弱尾蚴血清中IgG的测定及其无菌血清的制备；3)总RNA的抽提和mRNA的分离；4)cDNA第一链的合成及全套VH和VL基因的PCR扩增；5)全套单链抗体ScFv基因的拼接和PCR扩增；6)全套单链抗体ScFv基因的噬菌体展示；7)库容量及重组率的检测；8)多样性的鉴定及保护性的鉴定。其中1)步骤中紫外照射条件为紫外灯与待照尾蚴玻片距离14cm，波长254nm，400uw照射1分钟立即贴腹感染。7)步骤中检测结果为库容量达到1.9X108，重组效率为100%。8)步骤中保护性鉴定方法为选用经紫外照射致弱血清被动转移试验，通过用100条紫外照射致弱尾蚴感染Balb/c雌性小鼠共五次，每次间隔两周。保护性鉴定结果为小鼠可获得42.5%的减虫率，21.6%的肝减卵率。。本发明的紫外照射致弱日本血吸虫尾蚴单链抗体库具有以下优势1、利用了噬菌体抗体库技术及单链抗体的众多优点，构建的日本血吸虫紫外照射致弱尾蚴单链抗体库可以弥补辐射致弱疫苗应用的局限性，为开拓新的疫苗发展策略和新疫苗的设计提供借鉴。2、为进一步筛选用于血吸虫病诊断和治疗的特异性单链抗体、进行抗原表位分析和疫苗研制提供了库源；同时也为研究这些抗体的免疫学特性、生物学活性和功能奠定了基础。3、可以从紫外照射致弱尾蚴单链抗体库中获得的高特异性的单链抗体作为探针来筛选cDNA文库，以获得保护性抗原的编码基因序列，加快血吸虫基因疫苗生产的步伐。4、可用紫外照射致弱尾坳单链抗体作为载体制备各种免疫毒素或介导效应细胞的双特异性抗体，为血吸虫的免疫治疗提供新的方法。图1是本发明UV致弱尾蚴感染BALB/C小鼠脾脏RNA琼脂糖凝胶电泳分析RNA凝胶电泳图显示，RNA有完整的三条带，由上往下依次为rRNA28S，rRNA18S，扁A5S。图2是本发明VH和VL基因的PCR扩增凝胶电泳图显示，VH片段大约为420bp,VL片段大约为360bp。结果与理论值相符，显示成功扩增出VH和VL基因片段。图3是本发明ScFv基因的拼接凝胶电泳图显示，ScFv片段长约780bp，与理论值相符，证实ScFv基因拼接成功。图4是本发明重组噬菌体载体的PCR鉴定结果凝胶电泳图显示，随机挑选的10个菌落，提取质粒后，以VH(back)和VL(for)为引物，1-10号菌均扩增出长约为780bp的片段，证实紫外线照射致弱尾蚴单链抗体库的重组率为100%。图5是本发明构建的UV-致弱尾蚴ScFv库的多样性鉴定凝胶电泳图显示，用BstNI酶切质粒，1-10号质粒的酶切图谱具有多样性，说明紫外线照射致弱尾蚴单链抗体库的多样性好，因此从库中筛选到目的ScFv的机率也越大。图6是本发明是UV-致弱尾呦血清被动转移试验不同组别肝脏虫卵结节的情况其中图A,正常鼠肝脏阴性对照；B，NS阳性对照组肝脏；C，UV-致弱尾呦鼠血清转移组肝脏；D,正常尾呦感染鼠血清转移组肝脏。结果显示，C和D组与生理盐水对照组小鼠肝脏比较，虫卵结节较少，肝脏颜色较浅，较鲜艳。实验证实，紫外照射致弱尾呦动物模型有效好的保护力，其单链抗体库中含高效和一定保护力的单链抗体。图7是本发明UV-致弱尾蚴血清中IgG与血吸虫不同阶段抗原反应的变化趋势图UV致弱尾蚴血清中IgG的变化趋势:用间接ELISA检测UV-致弱尾蚴感染的血清中IgG对血吸虫不同阶段抗原(A为尾蚴抗原、B/C分别为童虫和成虫抗原、D为虫卵抗原)的反应性。如图显示，小鼠经UV致弱尾蚴5次感染以后，血清中针对血吸虫不同阶段抗原的IgG水平的总趋势随着免疫次数的增加而增加；除虫卵抗原以外，针对其它抗原的特异IgG在第十周的效价均达到1:12800。针对成虫和童虫抗原的IgG效价变化趋势一至，均在第4周开始升高，第8周达高峰，第10周与第8周持平；针对尾蚴抗原的IgG第6周开始升高，第10周达到高峰；针对虫卵抗原的IgG前6周无显著性变化，第8周升高，第10周IgG到峰值，效价为1:3200，远低于针对其它抗原成分的效价。从图中可以看出，UV致弱尾呦多次感染小鼠后能诱导高滴度的IgG水平，其中以成虫、童虫最为明显，尾蚴、虫卵次之。图8是不同感染剂量组的UV致弱尾呦血清中IgG的动态变化图用伺接ELISA检测不同剂量组(A组-100条，B组-200条，C组-300条)的UV-致弱尾蚴感染血清针对尾呦抗原的特异性IgG抗体变化，检测稀释度为1:100。如图所示不同感染剂量组中以A组感染100条UV致弱尾蚴剂量最佳。具体实施方式下面对本发明日本血吸虫uv-致弱尾蚴单链抗体库的实施例进行详细说明实施例一日本血吸虫uv-致弱尾蚴单链抗体库的构建1、紫外照射致弱尾蚴动物模型的建立将Babl/c雌性小鼠42只，按感染剂量不同分三组，每组14只。(A组-100条，B组-200条，C组-300条)共感染五次，每次间隔两周。紫外灯的测试条件紫外灯管长15cm，将探测头固定在紫外灯中心点7.5cm处，暗室下测试不同距离下的照射强度，每个距离测试三次，取平均值。感染条件紫外灯与待照尾蚴玻片距离14cm，波长254nm，400uw照射1分钟立即贴腹感染。每次感染后3天，取小鼠尾静脉血ELISA法测定效价。紫外灯的照射强度测定紫外灯管长15cm，将探测头固定在紫外灯中心点7.5cm处，暗室下测试不同距离下的照射强度，每个距离测试三次，取平均值。数据见表1。由表可见，紫外线的强度与距离成反比；照射最佳条件为待照尾蚴玻片放在紫外灯7.5cm处的中心位置，二者垂直距离14cm,波长254nm，400uw1分钟。表l不同距离下紫外线强度测试表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、UV致弱尾蚴血清中IgG的测定及其无菌血清的制备间接ELISA测定血清效价用包被稀释液将H本血吸虫不同阶段的抗原稀释到50ug/ml，包被100ul/孔4。C过夜；5%脱脂牛奶封闭，37°C2h。洗涤，加入1:100-12800倍比稀释鼠血清，37'C2h;洗涤，加入HRP标记抗鼠IgG(工作浓度1:5t)00)100ul/孔，37。C2h;洗涤，加入底物显色10min;2M硫酸终止.E960酶标仪波长450nm测定吸光值。待测样本OD450值与阴性对照OD45o值的比值P/N〉2.l判为阳性；抗体的效价达到l:12800后，将小鼠眼球放血，用50mlEP管收集，置37。C水浴2h，4500rpm常温离心，分离血清，0.45滤膜过滤除菌和RBC碎片，分装成0.4毫升/管，-2(TC保存。3、总RNA的抽提和raRNA的分离取效价达l:12800以上的小鼠脾脏混合，Trizol试剂提取脾脏总RNA。用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察RNA的完整性。紫外分光光度计测定A260/A28()比值，鉴定RNA的质量。小鼠脾细胞RNA质和量的鉴定RNA凝胶电泳结果显示，RNA有完整的三条带，rRNA28S，rRNA18S，rRNA5S。紫外分光光度计检测A260/A28()的比值为1.851,浓度为9069.3ug/ml。证明总RNA纯度好，RNA的质和量均达到实验要求。4、cDNA第一链的合成及全套VH和VL基因片段的扩增按照MBI公司RT试剂盒说明书以小鼠脾脏RNA为模板，oligo(dt)18为引物，M-mulv反转录酶反转录合成cDNA第一链。然后再以cDNA为模板，分别用VH和VL上下游引物，扩增全套VH和VL基因。反应条件为94。C预变性3min;94°C，30sec，65°C，45see，72°C，45sec;共30个循环。然后72°C延伸7min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用Takara胶回收试剂盒回收VH和VL目的片段。全套VH和VL基因的扩增两步法RT-PCR，扩增得到VH和VL片段。凝胶电泳结果显示，VH片段大约为420bp，VL片段大约为360bp。结果与理论值相符，显示成功扩增出VH和VL基因片段。5、全套单链抗体ScFv基因的拼接和PCR扩增以等量(50ng)的VH和VL胶回收产物互为模板和引物，重叠PCR法扩增将VH和VL片段随机拼接成ScFv，反应条件为94。C预变性3min;94°C，30sec,65°C，45sec,72°C，45sec;共7个循环，然后72°C,3min。反应完毕后，50ul反应体系中补加VH(back)和VL(for)各lul，lOXbuffer0.5ul，在ddH20为2.5ul，使整个反应体系为55ul,PCR扩增，条件为94。C预变性3min:94°C，30sec，65°C，45sec，72°C，45sec:共30个循环。然后72°C延伸7min。凝胶电泳检测PCR产物，并用Takara胶回收试剂盒回收ScFv目的片段。.ScFv基因的拼接将纯化的等量VH和VL基因互为模板和引物，经重叠PCR法拼接并扩增得到ScFv基因片段。凝胶电泳结果显示，ScFv片段长约780bp，与理论值相符，证实ScFv基因拼接成功。6、全套单链抗体ScFv基因的噬菌体展示将纯化的ScFv片段用SfiI，Notl双酶切后的产物(约150ng)与经同种双酶切预切的pCANTAB5E噬菌体载体(约250ng)按l:3摩尔比混合后，16。C连接过夜。用20ulddH20溶解乙醇纯化的连接产物，取10ul纯化产物电转化至50ul感受态TGl细胞，电转化杯宽O.lcm，电转化条件1.8KV,4.7ms，电转化后立即加入lml预温的2xYT-G培养液，于37°C250rpm培养lh，取少量菌液，用2xYT培养液以10倍梯度Mfi，分别取100ul涂布SOBAG平板，30。C培养过夜，计算菌落数，测定库容。剩下的菌液以100ul每板涂布SOBAG平板，30。C培养过夜，2xYT洗下菌落后，加入甘油使终浓度为20%，混匀后于-70。C低温冰箱保存。留取一部分菌液(约5ml)，用2xYT培养液将菌液稀释至OD60(r0.3，记下终体积。加入氨苄青霉素使终浓度为100ug/ml，加入葡萄糖使终浓度为2%。37°C250rpm培养lh。加M13K07(加入量为5xl0、5x0.5x终体积)，37°C,250rpm培养lh。1000gxlOmin离心沉淀，小心去掉上清，用10ml2xYT-AK重悬沉淀，37°C，250卬m培养过夜。1000gx20min离心沉淀细菌。取上清到聚丙烯离心管中，即为重组的初级噬菌体表面展示抗体库，将上清用O.45um孔径的过滤器过滤。4'C保存。实施例二日本血吸虫uv-致弱尾蚴单链抗体库的鉴定1、库容量及重组率的检测将ScFv-pCANTAB5E连接产物转化细菌TG1,10倍梯度稀释后涂布SOBAG平板，过夜培养后，按SOBAG平板的菌落数计算库容量。随机挑取SOBAG平板上的菌落10个，分别加入5ml的2xYT培养基中，37°C培养过夜，碱裂解法提取质粒，以质粒为模板，以VH(back)和VL(for)为模板，进行PCR扩增，反应模式为94CC预变性3min;94°C，30sec，65°C，45sec，72°C，45sec，共30个循环；72°C延伸7min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。检测是否含有插入子，算出实际库容量。结果为W稀释的SOBAG平板上，菌落数为19，故库容为1.9X108。随机挑选的10个菌落，提取质粒后，以VH(back)和VL(for)为引物，均扩增出长约为780bp的片段，证实紫外线照射致弱尾蚴单链抗体库的重组率为100%，实际库容为1.9X108。2、多样性的鉴定将上述挑选的10个菌落的质粒，用BstNI酶切，凝胶电泳鉴定酶切产物，观察每个质粒酶切片段的差异来确定单链抗体库的多样性。结果显示用BstM酶切质粒，酶切图谱具有多样性，说明紫外线照射致弱尾蚴单链抗体库的多样性好，因此从库中筛选到目的ScFv的机率也越大。3、保护性的鉴定一一被动转移试验将6周左右，雌性BALB/C鼠共21只分三组，UV-血清组，感染血清组，NS对照组，每组7只；将己收集的无菌紫外致弱尾蚴血清、45天正常尾蚴感染血清及无菌生理盐水，按组别注射至小鼠尾静脉，每组分三次，感染前两小时注射一次，感染后1周和3周再各注射一次，每次注射0.4毫升。正常尾蚴攻击，尾蚴数为40士2条。攻击感染45天后处死小鼠，与NS对照组比较，分别计算减虫率和减卵率。免疫保护效果评价指标如下-.1)经左心室一肝门静脉灌注收集血吸虫成虫计算减虫率。减虫率(％)=(1-免疫组检获成虫数/对照组检获成虫数)X100%2)每只肝脏称重、研磨，加入10n/。NaOH于37'C消化过夜。取50ul涂片两张，镜检全部虫卵数，计算每克肝虫卵数。减卵率(％)=(1-免疫组每克肝组织虫卵数/对照组每克肝组织虫卵数)X100%被动转移实验结果将建库时收集的无菌UV-致弱尾拗血清在攻击感染前以及感染后一周,三周，共三次转移至小鼠体内，得到42.5%减虫率，显著高于感染组的减虫率22.PA;肝减卵率为21.6%,与感染组的26.6%相比两组别之间无显著性差异(P>0.05)。但两组和生理盐水对照组小鼠肝脏比较，虫卵结节较少，肝脏颜色较浅，较鲜艳。实验证实，紫外照射致弱尾蚴动物模型有效好的保护力，其单链抗体库中含高效和一定保护力的单链抗体。表4血清被动转移小鼠的减虫效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>VMS,vaccinatedmiceserumUV致弱尾呦鼠血清；IMS,Infectedmiceserum45天感染鼠血清；NS为生理盐;*小鼠死1只P!P"分别为1，2组与3组的比较ps为1，2组间的比较。表5血清被动转移小鼠的减卵效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>VMS,vaccinatedmiceserumUV致弱尾呦鼠血清；IM&Infectedmiceserum45天感染鼠血清NS为生理盐水；*小鼠死1只；P'P2分别为1，2组与3组的比较13为1,2组间的比较。权利要求1、建立的一种日本血吸虫单链抗体的库，其特征在于是采用噬菌体抗体库技术构建的抗日本血吸虫紫外照射致弱尾蚴的全套单链抗体库，其库容量达到1.9×108，重组效率为100％。2、一种构建权利要求1所述日本血吸虫单链抗体的库的方法，其特征在于包括以下步骤1)紫外照射致弱尾蚴动物模型的建立；2)UV致弱尾蚴血清中IgG的测定及其无菌血清的制备；3)总RNA的抽提和mRNA的分离；4)cDNA第一链的合成及全套VH和VL基因的PCR扩增；5)全套单链抗体ScFv基因的拼接和PCR扩增；6)全套单链抗体ScFv基因的噬菌体展示；7)库容量及重组率的检测；8)多样性的鉴定及保护性的鉴定。3、根据权利要求l所述的一种日本血吸虫单链抗体的库的构建方法，其特征在于l)步骤中紫外照射条件为暗室条件下，待照尾蚴玻片放在紫外灯7.5cm处的中心位置，二者垂直距离14cm，波长254nm，400uw照射1分钟立即贴腹感染。4、根据权利要求l所述的一种日本血吸虫单链抗体的库的构建方法，其特征在于7)步骤中检测结果为库容量达到1.9X108，重组效率为100%。5、根据权利要求l所述的一种日本血吸虫单链抗体的库的构建方法，其特征在于8)步骤中保护性鉴定方法为选用经紫外照射致弱血清被动转移试验，通过用IOO条紫外照射致弱尾蚴感染Balb/c雌性小鼠共五次，每次间隔两周。6、根据权利要求l所述的一种日本血吸虫单链抗体的库的构建方法，其特征在于8)步骤中保护性鉴定结果为小鼠可获得42.5%的减虫率，21.6%的肝减卵。7、根据权利要求1所述的包含日本血吸虫紫外照射致弱尾蚴的全套单链抗体。全文摘要本发明涉及基因工程抗体领域，利用紫外照射致弱尾蚴的体液免疫高保护力的特点和噬菌体抗体库的优点，首次成功的构建了日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体(ScFv)表达文库。日本血吸虫UV-弱尾蚴单链抗体库的库容量为1.9*10⁸，重组率100％，多样性100％，建库时的UV-致弱尾蚴血清被动转移试验得到42.5％减虫率和21.6％的肝减卵率，证实了此库中含高效和一定保护力的单链抗体。构建日本血吸虫紫外照射致弱尾蚴单链抗体库，提供了一个富含高效日本血吸虫紫外照射致弱尾蚴单链抗体的库源，弥补了辐射致弱疫苗应用的局限性，为开拓新的疫苗发展策略和新疫苗的设计提供借鉴。文档编号C40B40/02GK101240452SQ20081003065公开日2008年8月13日申请日期2008年2月20日优先权日2008年2月20日发明者周帅锋,汪世平申请人:汪世平;周帅锋