专利名称：一种可用于快速诊断的免疫胶体金颗粒制备方法
技术领域：
本发明涉及一种在颗粒形态控制、颗粒尺寸控制、粒径均一性等方面比背景技术 均有较大程度提升的一种可用于快速诊断的免疫胶体金颗粒制备方法，属免疫胶体金颗粒 制备技术领域。
背景技术：
胶体金技术的起源可追溯到1971年，Faulk等应用电镜免疫胶体金染色法(IGS) 观察沙门菌，将胶体金首先引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法， 广泛应用于电镜水平研究、光显微细胞化学、免疫沉淀及蛋白质染色等技术，并且被引进免 疫诊断领域中，尤其在医学检验的快速诊断领域显示出了巨大的发展前景。免疫胶体金技术在快速诊断领域的应用主要由于该技术与其他检测方法相比，具 有无可比拟的优势简便快捷，不需要任何仪器和设备，并可在几分钟之内出检测结果；结 果可靠，灵敏准确；成本低廉，需用样本量少。胶体金技术已广泛用于医学检验的快速诊断应用中，如早孕检测、传染病的快速 诊断等，但医学检验技术需要有较高的特异性与灵敏度，因此其应用对胶体金的颗粒大小 和粒径均一性要求较高。已有研究表明，胶体金颗粒粒径在l(T40nm左右时，方法的特异性 与灵敏度较好，而现有胶体金颗粒制备普遍使用的工艺为柠檬酸三钠还原法，所获得的胶 体金颗粒在此粒径范围内的尺寸大小不易控制，粒径分布不够均一，严重影响了其在快速 诊断中的应用。
发明内容
设计目的避免背景技术中的不足之处，设计一种颗粒形态控制、颗粒尺寸控制、 粒径均一性等方面较现有方法均有较大程度提升的一种可用于快速诊断的免疫胶体金颗 粒制备方法。设计方案为了实现上述设计目的。本申请用氯金酸作为还原原料进行金颗粒的 制备。用硼氢化钠作为强还原剂，在较短的时间内快速还原氯金酸，形成小粒径的金种。用 十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)作为保护剂，控制金种形成过程，以保证胶体金颗粒均勻生 长。大粒径(>30nm)胶体金颗粒的合成用盐酸羟胺和抗坏血酸作为还原剂，因其还原条件 较为温和，可促进金离子在金种上缓慢沉积，较易形成均一的胶体金颗粒。本申请针对背景 技术存的不足，设计了一种可用于快速诊断的免疫胶体金颗粒制备方法，主要包括以下步 骤
1、在温度为35°C的水浴条件下，先后加入氯金酸(HAuC14)、十六烷基三乙基溴化铵 (CTAB)和超纯水，使得溶液中氯金酸浓度为0. 25mmol/L,CTAB浓度为75mmol/L，搅拌混勻， 4^6min后，再加入终浓度为0. 6mmol/L的NaBH4,快速搅拌2 3min，然后缓慢搅拌；
2、继续水浴2 12h，使溶液中NaBH4挥发完全，即完成3 4nm金颗粒的合成；
3、当合成粒径在30nm以下的胶体金颗粒时，以已合成的3、nm金颗粒为金种进行合成以1:200的比例稀释金种溶液，依次添加CTAB和氯金酸，使得溶液中的CTAB浓度为 16mmol/L,氯金酸浓度为0. θΠ. llmmol/L,定容至略少于目标体积，然后加入终浓度为 6mmol/L抗坏血酸，最后加入占最终合成的胶体金溶液总体积1/1000的金种稀释液，此步 骤中氯金酸加入量的不同可合成30nm以下不同尺寸范围的金颗粒；
4、当合成粒径在30nm以上的胶体金颗粒时，以已合成的30nm金颗粒为金种进行合成 以1:200的比例稀释金种溶液，依次加入盐酸羟胺(NH3OH ·Ηα)和氯金酸，使得溶液中的盐 酸羟胺浓度为7. 76 18. lOmmol/L，氯金酸浓度为0. 78 1. 81mmol/L，搅拌混勻；
5、待反应5 8h后，每隔Ih加入少许氯金酸，加三次；
6、继续反应2h，得到胶体金溶液。本发明与背景技术相比，一是所获得的金颗粒粒径大小较均一、形态均保持正球 形，可满足胶体金快速诊断试剂应用所需的较高特异性和较高灵敏度要求；二是制备条件 较容易控制，批间重复性较好；三是制备方法步骤简单，容易进行放大；四是不仅克服了传 统制备方法所获得的胶体金颗粒形态不规则、大小不均一的缺陷，同时对工艺技术进行改 进，使得所制备胶体金颗粒能自由调整颗粒大小，以适用于不同的检测项目，使得检测结果 更加准确可靠。
图1是本发明方法制备制备的30nm胶体金颗粒电镜图。图2是柠檬酸三钠还原法制备的30nm胶体金颗粒电镜图。图3是本发明方法制备制备的40nm胶体金颗粒电镜图。图4是柠檬酸三钠还原法制备的40nm胶体金颗粒电镜图。
具体实施例方式实施例1 一种可用于快速诊断的免疫胶体金颗粒制备方法，主要包括以下步骤 ⑴在温度为35°C的水浴条件下，先后加入氯金酸(HAuCl4)、十六烷基三乙基溴化铵(CTAB) 和超纯水，搅拌混勻，4-6min后，再加入NaBH4,快速搅拌2 3min，然后缓慢搅拌；⑵继续水 浴2 12h，使溶液中NaBH4挥发完全，即完成3 4nm金颗粒的合成；⑶当合成粒径在30nm 以下的胶体金颗粒时，以已合成的3 4nm金颗粒为金种进行合成以1:200的比例稀释金 种溶液，依次添加CTAB和氯金酸，定容至略少于目标体积，然后加入抗坏血酸，最后加入金 种，此步骤中氯金酸加入量的不同可合成30nm以下不同尺寸范围的金颗粒；⑷当合成粒径 在30nm以上的胶体金颗粒时，以已合成的30nm金颗粒为金种进行合成以1:200的比例稀 释金种溶液，依次添加盐酸羟胺(NH3OH · HCl)和氯金酸，搅拌混勻；(5)待反应5 8h后，每 隔Ih加入少许氯金酸，加三次；继续反应2h，得到胶体金溶液。例1 胶体金种颗粒的合成首先，配制氯金酸和CTAB的混合溶液，使得溶液中氯 金酸浓度为0. 25mmol/L, CTAB浓度为75mmol/L ；然后，一次性加入终浓度为0. 6mmol/L的 NaBH4，搅拌混勻，即可得到平均粒径为3 4nm的胶体金种颗粒，用以合成其它粒径的颗粒。例2 :10nm粒径胶体金颗粒的合成首先，以1:200比例稀释金种溶液；然后，依 次添加CTAB、氯金酸、抗坏血酸和占最终合成的胶体金溶液总体积1/1000的金种稀释液的 混合溶液，使得溶液中的CTAB浓度为16mmol/L，氯金酸浓度为1. llmmol/L，抗坏血酸浓度为6mmol/L ；最后，每隔Ih加入少许氯金酸，分三次添加，使得最终溶液中氯金酸浓度增加 0. 25mmol/L,即可反应得到平均粒径为IOnm的胶体金颗粒。例3 :15nm粒径胶体金颗粒的合成首先，以1:200比例稀释金种溶液；然后，依 次添加CTAB、氯金酸、抗坏血酸和占最终合成的胶体金溶液总体积1/1000的金种稀释液的 混合溶液，使得溶液中的CTAB浓度为16mmol/L，氯金酸浓度为0. 32mmol/L，抗坏血酸浓度 为6mmol/L;最后，每隔Ih加入少许氯金酸，分三次添加，使得最终溶液中氯金酸浓度增加 0. 25mmol/L,即可反应得到平均粒径为15nm的胶体金颗粒。例4 :20nm粒径胶体金颗粒的合成首先，以1:200比例稀释金种溶液；然后，依 次添加CTAB、氯金酸、抗坏血酸和占最终合成的胶体金溶液总体积1/1000的金种稀释液的 混合溶液，使得溶液中的CTAB浓度为16mmol/L，氯金酸浓度为0. 13mmol/L，抗坏血酸浓度 为6mmol/L ；最后，每隔Ih加入少许氯金酸，分三次添加，使得最终溶液中氯金酸浓度增加 0. 25mmol/L,即可反应得到平均粒径为20nm的胶体金颗粒。例5 :25nm粒径胶体金颗粒的合成首先，以1:200比例稀释金种溶液；然后，依 次添加CTAB、氯金酸、抗坏血酸和占最终合成的胶体金溶液总体积1/1000的金种稀释液的 混合溶液，使得溶液中的CTAB浓度为16mmol/L，氯金酸浓度为0. 07mmol/L,抗坏血酸浓度 为6mmol/L;最后，每隔Ih加入少许氯金酸，分三次添加，使得最终溶液中氯金酸浓度增加 0. 25mmol/L,即可反应得到平均粒径为25nm的胶体金颗粒。例6 :30nm粒径胶体金颗粒的合成首先，以1:200比例稀释胶体金种溶液；然后， 依次添加CTAB、氯金酸、抗坏血酸和占最终合成的胶体金溶液总体积1/1000的金种稀释液 的混合溶液，使得溶液中的CTAB浓度为16mmol/L，氯金酸浓度为0. 04mmol/L，抗坏血酸浓 度为6mmol/L ；最后，每隔Ih加入少许氯金酸，分三次添加，使得最终溶液中氯金酸浓度增 加0. 25mmol/L,即可反应得到平均粒径为30nm的胶体金颗粒，见附图1和2。例7 :35nm粒径胶体金颗粒的合成首先，以1:200比例稀释胶体金种溶液；然后， 依次加入盐酸羟胺和氯金酸，使得溶液中的盐酸羟胺浓度为18. lOmmol/L，氯金酸浓度为 l.Slmmol/L;最后，每隔Ih加入少许氯金酸，分三次添加，使得最终溶液中氯金酸浓度增加 0. 25mmol/L,即可反应得到平均粒径为35nm的胶体金颗粒。例8 :40nm粒径胶体金颗粒的合成首先，以1:200比例稀释胶体金种溶液；然 后，依次加入盐酸羟胺和氯金酸，使得溶液中的盐酸羟胺浓度为7. 76mmol/L，氯金酸浓度为 0. 78mmol/L ；最后，每隔Ih加入少许氯金酸，分三次添加，使得最终溶液中氯金酸浓度增加 0. 25mmol/L,即可反应得到平均粒径为40nm的胶体金颗粒，见附图3和4。比较例
以现有普遍使用的柠檬酸三钠还原法作对照，比较两种方法制备所得的胶体金颗粒质 量。柠檬酸三钠还原法反应条件为在煮沸条件下，加入氯金酸，同时立即加入2%柠 檬酸三钠，继续煮沸5分钟。胶体金颗粒镜检结果显示(图广4)，本发明所制备的胶体金 颗粒均一性较好，均保持正球形态，而对照方法制备的胶体金颗粒均一性较差，形态较不规 则。可见本发明所提供的免疫胶体金制备方法能够合成出形态规则、均一性较好的胶体金 颗粒，结果稳定可靠。需要理解到的是上述实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描 述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路
5的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入本发明的保护范围内。
权利要求
一种可用于快速诊断的免疫胶体金颗粒制备方法，主要包括以下步骤⑴在温度为35℃的水浴条件下，先后加入氯金酸(HAuCl4)、十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)和超纯水，搅拌混匀，4 6min后，再加入NaBH4，快速搅拌2~3min，然后缓慢搅拌；⑵继续水浴2～12h，使溶液中NaBH4挥发完全，即完成3~4nm金颗粒的合成；⑶当合成粒径在30nm以下的胶体金颗粒时，以已合成的3~4nm金颗粒为金种进行合成以1:200的比例稀释金种溶液，依次添加CTAB和氯金酸，定容至略少于目标体积，然后加入抗坏血酸，最后加入金种，此步骤中氯金酸加入量的不同可合成30nm以下不同尺寸范围的金颗粒； ⑷当合成粒径在30nm以上的胶体金颗粒时，以已合成的30nm金颗粒为金种进行合成以1:200的比例稀释金种溶液，依次添加盐酸羟胺(NH3OH·HCl)和氯金酸，搅拌混匀；⑸待反应5～8h后，每隔1h加入少许氯金酸，加三次；⑹继续反应2h，得到胶体金溶液。
全文摘要
本发明涉及一种可用于快速诊断的免疫胶体金颗粒制备方法，在温度为35℃的水浴条件下,先后加入氯金酸、十六烷基三乙基溴化铵和超纯水,搅拌混匀,4-6min后，再加入NaBH4,快速搅拌2-3min,然后缓慢搅拌；继续水浴2～12h,使溶液中NaBH4挥发完全,即完成3-4nm金颗粒的合成；当合成粒径在30nm以下的胶体金颗粒时，以已合成的3~4nm金颗粒为金种进行合成以1:200的比例稀释金种溶液,依次添加CTAB和氯金酸,定容至略少于目标体积,然后加入抗坏血酸,最后加入金种,此步骤中氯金酸加入量的不同可合成30nm以下不同尺寸范围的金颗粒；当合成粒径在30nm以上的胶体金颗粒时,以已合成的30nm金颗粒为金种进行合成以1:200的比例稀释金种溶液,依次添加盐酸羟胺和氯金酸,搅拌混匀；待反应5～8h后,每隔1h加入少许氯金酸,加三次；继续反应2h,得到胶体金溶液。
文档编号B22F9/24GK101934380SQ20101050697
公开日2011年1月5日 申请日期2010年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者奚建宏, 康俊, 李国强, 王锐 申请人:杭州启泰生物技术有限公司