专利名称：一种通过环化方式构建测序文库的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种通过环化方式构建测序文库的方法。
背景技术：
过去几年间，第二代高通量测序技术取得了突飞猛进的发展。其中，基于连接酶来实现测序的方法具有准确率高的优点，但由于其单一读长短，限制了这类测序方法的应用。针对这种情况，近些年出现了通过构建具有特殊结构的测序文库来提高测序读长的方法，即在待测片段中插入一个或多个接头序列，从而使同一测序文库分子具有多个连接测序起始的位点，然后分别在这些不同的起始位点上进行连接测序，从而增加测序读长。这种方法的核心在于，如何实现在待测片段中定向插入一个或多个接头序列。 现有技术中是通过多次环化、酶切来实现的，其大致实现过程如下1)将待测片段与第一接头连接，所述第一接头包含限制酶的结合位点；2)环化来自步骤I)的产物以产生第一环形多核苷酸；3)用限制酶切割第一环形多核苷酸；4)连接第二接头，所述第二接头包含限制酶的结合位点；5)环化来自步骤4)的产物以产生第二环形多核苷酸；重复步骤3)到5)以在待测片段中插入多个接头。但是该方法对待测片段的大小均有一定的要求，如果待测片段过短，将降低环化的效率，甚至不能环化，或者环化后得到的是非目标产物，从而使得测序文库构建失败。即，现有技术中构建具有特殊结构的测序文库的方法，要求用于构建测序文库的原材料(源核酸)大于150bp，而且当建库方法中还包括片段化步骤时，原材料的大小还要进一步加大，一般要求原材料与片段化产物的大小比在10 I以上，才能保证经片段化步骤后得到的片段化产物的随机性，进而保证后续测序结果的准确性。由上可知，现有技术在构建上述具有特殊结构的测序文库时，很大程度上局限于原材料的大小，无法对小片段核酸分子通过环化方式完成文库构建，使得现有技术的实际应用范围较窄。因此需要一种新的通过环化方式构建测序文库的方法，能够突破对原材料大小的局限性，扩大测序文库构建方法的适用范围，并能进一步保证测序文库构建过程中环化的效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的通过环化方式构建测序文库的方法，旨在解决现有技术在构建测序文库时对原材料的大小具有较强的局限性，无法采用环化方式对小片段核酸分子进行测序文库构建的问题。为了实现发明目的，本发明提供了一种通过环化方式构建测序文库的方法，包括下述步骤A.将核酸片段与连接组件连接，并以不增加其大小的形式进行环化，得到第一环形分子；所述连接组件含有至少一个酶切识别位点；
B.基于步骤A所述酶切识别位点，利用内切酶对第一环形分子中的核酸片段进行酶切，并将酶切产物与桥联组件连接并环化，得到桥联环化物。其中，所述连接组件与核酸片段的大小比值大于等于4，即连接组件的大小至少是核酸片段的4倍。其中，所述连接组件的大小大于等于140bp ;更优选的，所述连接组件的大小大于等于400bp。上述任一方案中，所述连接组件包括接头和桥序列，所述接头和/或桥序列含有Hs型限制性内切酶识别位点。其中，所述步骤A包括以下步骤Al.将核酸片段与接头连接，得到含接头的核酸片段；A2.将含接头的核酸片段与桥序列连接并环化，得到第一环行分子。进一步的，所述接头包括第一接头和第二接头，所述第一接头含有IIs型限制性内切酶识别位点，所述步骤Al包括以下步骤All.将核酸片段与第一接头连接，得到含第一接头的核酸片段；A12.利用IIs型限制性内切酶酶切含第一接头的核酸片段，得到含第一接头的酶切产物；A13.将含第一接头的酶切产物与第二接头连接，得到含接头的核酸片段。更进一步的，所述步骤All包括以下步骤A111.对核酸片段进行处理，得到处理过的核酸片段；所述处理方法包括去磷酸化、末端补平、加A尾、加polyA尾中的至少一种；A112.将处理过的核酸片段与第一接头连接，得到含第一接头的核酸片段。其中，所述步骤A2包括以下步骤A21.利用特异性切割剂分别对含接头的核酸片段和桥序列进行切割，得到相对应的切割产物；A22.利用连接酶，将相对应的切割产物连接并环化，得到第一环形分子；所述接头和桥序列均含有用于切割的识别位点；所述特异性切割剂能够特异性的识别接头和桥序列的用于切割的识别位点，并对接头、桥序列进行切割。上述任一方案中，所述接头包括平末端接头、突出末端接头、分叉接头和含茎环结构的接头中的至少一种。上述任一方案中，所述连接组件含有至少2个IIs限制性内切酶识别位点，所述步骤B具体为利用连接组件含有的IIs限制性内切酶识别位点，通过相应的限制性内切酶，对第一环行分子中的核酸片段中对应的两个酶切位点进行切割，并将酶切产物与桥联组件连接并环化，得到桥联环化物。上述任一方案中，在步骤B之后还包括以下步骤 C.更换内切酶和桥联组件，对步骤B得到的桥联环化物进行酶切、连接和环化，以在核酸片段中插入至少两个桥联组件，得到环形测序文库。进一步的，所述桥联组件含有IIs型限制性内切酶识别位点。
进一步的，所述步骤B的桥联组件为第一桥联组件，其含有两个IIs型限制性内切酶识别位点，所述步骤C包括以下步骤Cl.利用IIs型限制性内切酶酶切桥联环化物中的核酸片段，该IIs型限制性内切酶能特异性的识别第一桥联组件中的一个Hs型限制性内切酶识别位点；C2.将第二桥联组件与步骤Cl的产物连接并环化，得到第二环形分子；C3.利用IIs型限制性内切酶酶切第二环形分子中的核酸片段，该IIs型限制性内切酶能特异性的识别第一桥联组件中的另一个Hs型限制性内切酶识别位点；C4.将第三桥联组件与步骤C3的产物连接并环化，得到环形测序文库。上述任一方案中，所述步骤C之后还包括以下步骤D.利用与环形测序文库中的连接组件和/或桥联组件互补的引物，对环形测序文库进行扩增，得到线形测序文库。上述任一方案中，所述步骤A之前包括以下步骤A’ .片段化源核酸，得到核酸片段。由上可知，本发明通过连接组件与核酸片段的连接，突破了构建测序文库时对原材料大小的限制，扩大了构建测序文库方法的适用范围，并能进一步提高测序文库构建过程中环化的效率。
图I是本发明一种实施例中的通过环化方式构建测序文库的方法流程图；图2是本发明一个实施例中各实验组的连接反应产物和连接反应产物经PS-DNase消化处理后回收的产物的电泳结果图；图3是本发明四个实施例中核酸片段与连接组件的连接环化示意图；图4是本发明一个实施例中核酸片段与连接组件连接的方法流程图；图5是本发明一个实施例中硫代磷酸脂键的结构示意图；图6是本发明一个实施例中的通过环化方式构建测序文库的方法示意图；图7是本发明另一个实施例中的通过环化方式构建测序文库的方法示意图；图8是本发明另一个实施例中的通过环化方式构建测序文库的方法示意图；图9是本发明另一个实施例中的通过环化方式构建测序文库的方法示意图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。图I示出了本发明的构建测序文库的方法的一种实施方案，包括下述步骤SI.将核酸片段与连接组件连接，并以不增加其大小的形式进行环化，得到第一环形分子；所述连接组件含有至少一个酶切识别位点；S2.基于步骤SI所述酶切识别位点，利用内切酶对第一环形分子中的核酸片段进行酶切，并将酶切产物与桥联组件连接并环化，得到桥联环化物。需要说明的是在步骤SI中，所述核酸片段可以是基因组中的任意片段，包括但不限于基因、基因的一部分、调控序列、内含子或内含子的一部分；也可以是基因组DNA、cDNA、RNA (包括但不限于mRNA和rRNA)或DNA与RNA的杂合分子；还可以是基因组DNA、cDNA、RNA(包括但不限于mRNA和rRNA)上特定区域的扩增片段。所述核酸片段可以是任意长度，包括但不限于 IObp 1000bp、20bp 900bp、30bp 800bp、30bp 700bp、30bp 600bp、30bp 500bp、30bp 400bp、30bp 300bp、30bp 250bp、30bp 200bp、10bp 150bp、10bp 100bp、20bp 130bp、30bp 100bp、40bp 150bp、50bp 200bp、60bp 300bp、70bp 250bp ;可以是单链核酸分子，也可以是双链核酸分子。优选的，所述核酸片段为双链核酸分子，大小在25bp IOObp之间。在步骤SI中，所述连接组件为序列信息已知的核酸分子，用于与核酸片段连接，使连接后得到的产物能够以不增加大小的形式进行环化，其含有至少一个酶切识别位点。所述以不增加大小的形式环化，是指环化前的底物无需借助与其他核酸分子的连 接来实现成环，即环化后得到的产物的大小小于等于环化前的底物。包括但不限于以下几种具体形式1)环化前的底物直接自身成环；2)环化前的底物的一端或两端，经酶切或特异性切割剂切割后，两端形成互补配合的末端，进而成环。所述酶切识别位点，用于在步骤S2中对核酸片段进行酶切。进一步的，所述连接组件上的酶切识别位点为Hs型限制性内切酶识别位点；所述IIs型限制性内切酶为切割位点在识别位点之外的限制性内切酶，包括但不限于Acu I, Alw I.Bbs I、BbV I, Bcc I、BceA I、BciV I、BfuA I、Bmr I、Bpm I、BpuE I、Bsa I、BseM II、BseR I、Bsg I、BsmA I、BsmB I、BsmF I、BspCN I、BspM I、BspQ I、BtgZ I、Ear I、Eci I、EcoP15 I、Fau I、Fok I、Hga I.Hph I、HpyAV、Mbo II.Mly I.Mme I.Mnl I、NmeAIII、Ple I.Sap I.SfaN I 和 TspDTI，优选为 Acu I. Bsg I、EcoP15 I 或 Mme I。在步骤SI中，所述第一环行分子为核酸片段与连接组件连接并以不增加大小的形式环化后得到的环形分子。在步骤S2中，基于连接组件含有的酶切识别位点，能利用相应的内切酶对第一环形分子中的核酸片段进行酶切，从而将核酸片段切成两段，并通过已知序列(连接组件)连接。在步骤S2中，所述桥联组件为序列信息已知的核酸分子，用于与步骤S2中所述的酶切产物连接。在步骤S2中，所述桥联环化物为步骤S2中的酶切产物与桥联组件连接并环化后得到的，在核酸片段中插入桥联组件的环形分子，其该环形分子可作为测序反应的测序文库。本方案通过连接组件与核酸片段的连接，保证了连接产物能以不增加连接产物大小的形式进行环化，并利用连接组件上的酶切识别位点，对第一环行分子中的核酸片段进行酶切，进而向核酸片段中定向插入已知序列(包括但不限于桥联组件)，从而完成测序文库的构建。本方案突破了构建测序文库时对原材料大小的限制，扩大了构建测序文库方法的适用范围，适用于任意长度的核酸片段，尤其适用于长度较短的核酸片段，避免了核酸片段因为片段过小而不能成环或成环效率低进而导致不能进行文库构建的现象。本方案可根据核酸片段的具体情况，采用不同的连接组件和具体的环化方式，具体将在后续的实施例中进一步阐述说明。
针对核酸片段的大小，连接组件可进行相应的变化，以保证它们的连接产物能够以不增加连接产物大小的形式进行环化。例如，当核酸片段为15bp的双链核酸分子时，连接组件可设计成大于等于135bp的核酸分子；当核酸片段为30bp的单链核酸分子时，连接组件可设计成大于等于120bp的核酸分子；当核酸片段为50bp的双链核酸分子时，连接组件可设计成大于等于IOObp的核酸分子；当核酸片段为70bp的双链核酸分子时，连接组件可设计成大于等于80bp的核酸分子；当核酸片段为IOObp的双链核酸分子时，连接组件可 设计成大于等于50bp的核酸分子。要想将线形核酸分子环化成环形核酸分子，要求线形核酸分子的大小在IOObp以 上，但是当线形核酸分子的大小在IOObp 150bp之间时，成环的效率极低，且在环化过程中所需的条件很苛刻，例如所需的连接酶的浓度较高、或者需其它的催化剂等，不适于工业应用；而当线形核酸分子的大小在150bp 400bp之间，线形核酸分子成环的效率仍然较低，且成环的效率随着线形核酸分子的大小的增加而不断增高；当线形核酸分子的大小大于等于400bp时，不同大小的线形核酸分子的成环效率差异不大。其中，在保证连接组件与核酸片段能够在常规条件下实现环化的前提下，即适于工业应用的前提下，所述连接组件与核酸片段的大小比值大于等于4。为了使连接组件能够适用于各种大小的核酸片段，优选的，连接组件的大小大于等于140bp ;这个实验方案中的连接组件能够保证任意大小核酸片段均能够在与之连接后，以不增加连接产物大小的形式进行环化。为了，更进一步的提高连接组件与核酸片段连接后得到的连接产物的成环效率，更优选的，连接组件的大小大于等于400bp。本发明设计了一具体的对比实验以支持上述结论。试剂核酸片段，由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2按I : I的摩尔比退火形成；连接组件1，由SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4按I : I的摩尔比退火形成；连接组件2，由SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6按I : I的摩尔比退火形成；连接组件3，由SEQ ID NO 7和SEQ ID NO :8按I : I的摩尔比退火形成；连接组件4，由SEQ ID NO 9和SEQ ID NO : 10按I : I的摩尔比退火形成；连接组件5，由SEQ ID NO : 11和SEQ ID NO : 12按I : I的摩尔比退火形成；连接组件6，由SEQ ID NO 13和SEQ ID NO : 14按I : I的摩尔比退火形成；T4DNA Ligase(Fermentas, EL0011,5U/U L)；Plasmid-Safe ATP-dependent DNase(Epicentre, E3101K)；E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit (OMEGA BIO-TEK, D6492-01)。实验方案本实验共分8组，如下表所示。表I各实验组的连接反应组分
实验组连接反应组分实验组连接反应组分
I核酸片段5核酸片段+连接组件4~
权利要求
1.一种通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤 A.将核酸片段与连接组件连接，并以不增加其大小的形式进行环化，得到第一环形分子；所述连接组件含有至少一个酶切识别位点； B.基于步骤A所述酶切识别位点，利用内切酶对第一环形分子中的核酸片段进行酶切，并将酶切产物与桥联组件连接并环化，得到桥联环化物。
2.根据权利要求I所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述连接组件与核酸片段的大小比值大于等于4。
3.根据权利要求I所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述连接组件的大小大于等于140bp。
4.根据权利要求3所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述连接组件的大小大于等于400bp。
5.根据权利要求I所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述连接组件包括接头和桥序列，所述接头和/或桥序列含有Hs型限制性内切酶识别位点。
6.根据权利要求5所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述步骤A包括以下步骤 Al.将核酸片段与接头连接，得到含接头的核酸片段； A2.将含接头的核酸片段与桥序列连接并环化，得到第一环行分子。
7.根据权利要求6所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述接头包括第一接头和第二接头，所述第一接头含有IIs型限制性内切酶识别位点，所述步骤Al包括以下步骤 All.将核酸片段与第一接头连接，得到含第一接头的核酸片段； A12.利用IIs型限制性内切酶酶切含第一接头的核酸片段，得到含第一接头的酶切产物； A13.将含第一接头的酶切产物与第二接头连接，得到含接头的核酸片段。
8.根据权利要求7所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述步骤All包括以下步骤 A111.对核酸片段进行处理，得到处理过的核酸片段；所述处理方法包括去磷酸化、末端补平、加A尾、加poly A尾中的至少一种； A112.将处理过的核酸片段与第一接头连接，得到含第一接头的核酸片段。
9.根据权利要求6所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述步骤A2包括以下步骤 A21.利用特异性切割剂分别对含接头的核酸片段和桥序列进行切割，得到相对应的切割产物； A22.利用连接酶，将相对应的切割产物连接并环化，得到第一环形分子； 所述接头和桥序列均含有用于切割的识别位点； 所述特异性切割剂能够特异性的识别接头和桥序列的用于切割的识别位点，并对接头、桥序列进行切割。
10.根据权利要求I所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述连接组件含有至少2个IIs限制性内切酶识别位点，所述步骤B具体为利用连接组件含有的IIs限制性内切酶识别位点，通过相应的限制性内切酶，对第一环行分子中的核酸片段中对应的两个酶切位点进行切割，并将酶切产物与桥联组件连接并环化，得到桥联环化物。
11.根据权利要求I至10中任一项所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，在步骤B之后还包括以下步骤 C.更换内切酶和桥联组件，对步骤B得到的桥联环化物进行酶切、连接和环化，以在核酸片段中插入至少二个桥联组件，得到环形测序文库。
12.根据权利要求11所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述桥联组件含有IIs型限制性内切酶识别位点。
13.根据权利要求11所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述步骤B的桥联组件为第一桥联组件，其含有两个IIs型限制性内切酶识别位点，所述步骤C包括以下步骤 Cl.利用IIs型限制性内切酶酶切桥联环化物中的核酸片段，该IIs型限制性内切酶能特异性的识别第一桥联组件中的一个Hs型限制性内切酶识别位点； C2.将第二桥联组件与步骤Cl的产物连接并环化，得到第二环形分子； C3.利用IIs型限制性内切酶酶切第二环形分子中的核酸片段，该IIs型限制性内切酶能特异性的识别第一桥联组件中的另一个Hs型限制性内切酶识别位点； C4.将第三桥联组件与步骤C3的产物连接并环化，得到环形测序文库。
14.根据权利要求11所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述步骤C之后还包括以下步骤 D.利用与环形测序文库中的连接组件和/或桥联组件互补的引物，对环形测序文库进行扩增，得到线形测序文库。
15.根据权利要求I至10中任一项所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述核酸片段大小为25bp lOObp。
16.根据权利要求I至10中任一项所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述步骤A之前包括以下步骤 A’ .片段化源核酸，得到核酸片段。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，提供了一种通过环化方式构建测序文库的方法。所述方法包括以下步骤A.将核酸片段与连接组件连接，并以不增加其大小的形式进行环化，得到第一环形分子；所述连接组件含有至少一个酶切识别位点；B.基于步骤A所述酶切识别位点，利用内切酶对第一环形分子中的核酸片段进行酶切，并将酶切产物与桥联组件连接并环化，得到桥联环化物。本发明的方法适用范围广，能够在小片段核酸分子中定向插入已知序列，从而构建测序文库，并能进一步提高建库过程中环化的效率。
文档编号C40B40/06GK102628079SQ20121009350
公开日2012年8月8日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者盛司潼 申请人:盛司潼