一种宫膜干细胞库的构建方法
【专利摘要】本发明提供一种宫膜干细胞库的构建方法，包括月经血采集、宫膜干细胞分离除菌、扩增及分析检测、长期保存及定期检测的步骤。本发明提供了简便易行的除菌方法，去除细菌等物质的宫膜干细胞通过扩增培养可以获得大量纯度较高的宫膜干细胞，并长期保存，为未来的临床及科研应用研究提供大量的宫膜干细胞资源。
【专利说明】一种宫膜干细胞库的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学领域，具体涉及干细胞库的构建，更具体涉及宫膜干细胞库的构建。
【背景技术】
[0002]1999年，《Science》将人类胚胎干细胞研究成果评为当年世界十大科技进展之首，2000年，《Time》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首，并认为胚胎干细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域。至此干细胞研究成为近年来生物学以及医学领域中最引人注目的热点之一。干细胞(stem cells, SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞,在一定条件下,它可以分化成多种功能细胞。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，改变了人类疾病的应对方法，医学界称为“万用细胞”。目前干细胞来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞，但这两种来源都存在着部分局限性，因此寻找一种克服肿瘤形成的潜在性、标本来源的缺乏及伦理学争议等弊端的干细胞来源具有重要意义。近年来，美国Musina领导的研究小组从健康女性的月经血中得到分离的干细胞。宫膜干细胞(MenSCs)避免了其他干细胞的不足，成为一种全新的具有重大研究和应用潜力的干细胞。
[0003]然而，经对现有技术文献的检索发现，报道的宫膜干细胞的获取方法中，并没有人针对分离过程中除菌的方法以及除菌的效果进行报道，不能保证宫膜干细胞分离的成功率，不利于后续过程的进行。
[0004] 本
【发明者】通过摸索，根据细胞与细菌、真菌等的密度差异，通过密度梯度离心以及一定范围内反复洗涤离心的方法，可以去除细菌、真菌等，进而降低宫膜干细胞染菌的可能性，提高分离的成功率。通过大规模扩增培养可以获得大量的宫膜干细胞，并长期保存，定期质量检测，以便为未来的临床以及科研应用研究提供大量的宫膜干细胞资源。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了克服宫膜干细胞分离过程中的不足，实现高效的宫膜干细胞分离和长期保存。
[0006]本发明提供一种宫膜干细胞库的构建方法，包括月经血采集、宫膜干细胞分离除菌、扩增及分析检测、长期保存及定期检测的步骤，该方法的特征在于:所述宫膜干细胞分离除菌包括用密度梯度离心或磁珠分选得到单个核细胞，并在密度梯度离心前后多次用缓冲液冲洗去除残余细菌和杂质，所述密度梯度离心法使用密度为1.077的细胞分离液，300-500Xg, 15°C -25°C离心20-40分钟，所述缓冲液冲洗中使用的缓冲液为含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS。
[0007]本发明的宫膜干细胞库的构建方法中，月经血的采集包括使用月事杯收集月经血，并保存在月经血保存液中，所述月经血保存液为添加肝素钠的PBS盐缓冲溶液或SPB盐缓冲溶液。[0008]本发明方法中，月经血保存液中还可添加抗菌物质，所述抗菌物质选自两性霉素、青霉素、头孢拉定、头孢唑啉、头孢羟氨苄、头孢呋辛、头孢噻吩、链霉素、妥布霉素、四环素、土霉素、玻乙红霉素、克拉霉素、乙酸螺旋霉素、阿奇霉素、罗红霉素、红霉素、克林霉素和林可霉素。月经血保存液中添加的抗菌物质优选两性霉素、青霉素、链霉素。
[0009]本发明方法中的扩增步骤包括将分离所得单个核细胞于α-MEM+10%-20%血清完全细胞培养液中培养48-72小时后，更换新鲜的培养液，以后每3天全换液一次，细胞长满约80% -90%时，用含EDTA的0.25%胰酶消化，然后进行传代培养。
[0010]本发明方法中的分析检测步骤包括无菌性检测、流式细胞仪检测、核型检测和分化能力检测。
[0011]本发明方法中的长期保存步骤包括将细胞以IX IO6至IX IO7细胞/ml的密度重悬在含细胞培养液、DMSO和血清的细胞冻存液中，采用程序降温盒在_80°C冰箱中过夜进行程序降温法保存，然后转移到_196°C液氮中长期保存。
[0012]在长期保存过程中，进行定期检测，包括细胞复苏后进行细胞活性检测、无菌性检测、流式细胞仪检测和分化能力检测。
[0013]细胞活性检测每隔12个月进行一次，将细胞复苏后用台盼蓝染色检测细胞存活率。
[0014]流式细胞仪检测包括细胞表面抗原⑶14、⑶29、⑶44、⑶45、⑶90、HLA的检测。
[0015]分化能力检测包括成骨分化能力、成脂分化能力和成软骨分化能力的检测。
[0016]本发明的宫膜干细胞库的构建方法中，扩增后的分析检测和长期保存过程中的定期检测都要进行无菌性检测，包·括真菌的检测和细菌的检测。
[0017]本发明的一个【具体实施方式】包括以下步骤:
[0018]1、月经血的收集
[0019]利用月事杯收集月经血，保存在月经血保存液(含肝素钠的PBS盐缓冲溶液或SPB盐缓冲溶液)中，于4°C条件下运送到GMP车间。
[0020]2、宫膜干细胞的分离和除菌
[0021]利用密度梯度离心或磁珠分选方法收集单个核细胞(PBMC)，通过多次PBS缓冲液反复冲洗，去除残留的细菌等物质。
[0022]3、宫膜干细胞的扩增
[0023]将分离得到的单个核细胞在α -ΜΕΜ+10%-20%血清完全细胞培养液中培养，48-72小时后更换新鲜的培养液。以后每3天全换液一次，细胞长满约80%-90%时，用0.25%胰酶(含EDTA)消化，传代。
[0024]4、宫膜干细胞的检测
[0025]将传代的细胞进行无菌性检测，流式细胞仪检测，成骨分化检测等一系列检测。
[0026]5、宫膜干细胞的冻存
[0027]将传代后的宫膜干细胞通过程序降温法保存，即将细胞以1父106_至1父107细胞/ml的密度重悬在含细胞培养液、DMSO和血清的细胞冻存液中，采用程序降温盒在_80°C冰箱中过夜，然后转移到_196°C液氮中长期保存。
[0028]6、宫膜干细胞的定期检测
[0029]每隔一定的时间(例如:12个月)，将宫膜干细胞复苏，进行细胞活率、无菌性、流式细胞仪、分化能力等各项检测，对保存的宫膜干细胞的质量进行监控。
[0030]发明人经过研究开发，提供了简便易行的除菌方法，在获得月经血样本后，经过密度梯度离心、磁珠分选等方法得到单个核细胞(PBMC)，再通过多次PBS洗涤离心的方法去除残余的细菌等物质，以提高获得无菌的宫膜干细胞的成功率。通过扩增培养可以获得大量纯度较高的宫膜干细胞，并长期保存，定期质量检测，以便为未来的临床及科研应用研究提供大量的宫膜干细胞资源。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为本发明实施例的人宫膜干细胞的获取方法及干细胞库的构建方法流程图。
[0032]图2为本发明实施例的人宫膜干细胞的生长曲线示意图。
[0033]图3为本发明实施例的人宫膜干细胞流式检测结果示意图。
具体实施例
[0034]以下用实施例对本发明的技术方案作进一步阐述。本【技术领域】普通技术人员应当认识到，这些实验例仅仅用于举例说明本发明而不对本发明的范围构成任何限制，对本发明所作的任何改变，只要不违背本发明的精神实质，都将落在权利要求范围内。
[0035]实施例中的操作都国家认证的GMP车间中进行。操作流程见图1。
[0036]实施例1、月经血的采集
[0037]供者签署知情同意书后，将利用月事杯收集到的5ml_15ml月经血保存在等体积的月经血保存液(PBS，并添加100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)中，4°C的条件下48小时内运送到国家认证的GMP车间。
[0038]实施例2、宫膜干细胞的分离
[0039]将5ml月经血混合液直接放在IOOmm的平皿中，补加5ml a -MEM (含20%的血清)，在37°C、5%C02的条件下静置培养。48小时后，更换IOml新鲜培养液。对弃除的上清液进行无菌性检测(见表1)。
[0040]表1对宫膜干细胞的无菌性检测
【权利要求】
1.一种宫膜干细胞库的构建方法，包括月经血采集、宫膜干细胞分离除菌、扩增及分析检测、长期保存及定期检测的步骤，其特征在于:所述宫膜干细胞分离除菌包括用密度梯度离心或磁珠分选得到单个核细胞，并在密度梯度离心前后多次用缓冲液冲洗去除残余细菌和杂质，所述密度梯度离心法使用密度为1.077的细胞分离液，300-500 X g，15°C -25°C离心20-40分钟，所述缓冲液冲洗中使用的缓冲液为含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS。
2.如权利要求1所述的宫膜干细胞库的构建方法，其中所述月经血采集包括使用月事杯收集月经血，并保存在月经血保存液中，所述月经血保存液为添加肝素钠的PBS盐缓冲溶液或SPB盐缓冲溶液。
3.如权利要求2所述的宫膜干细胞库的构建方法，其中所述月经血保存液中还添加抗囷物质，所述抗囷物质选自两性霉素、青霉素、链霉素。
4.如权利要求1所述的宫膜干细胞库的构建方法，其中所述扩增步骤包括将分离所得单个核细胞于α -ΜΕΜ+10%-20%血清完全细胞 培养液或无血清培养液中培养48-72小时后，更换新鲜的培养液，以后每3天全换液一次，细胞长满约80%-90%时，用含EDTA的0.25%胰酶消化，然后进行传代培养。
5.如权利要求1所述的宫膜干细胞库的构建方法，其中所述分析检测步骤包括无菌性检测、流式细胞仪检测和分化能力检测。
6.如权利要求1所述的宫膜干细胞库的构建方法，其中所述长期保存的步骤包括将细胞以IX IO6至IX IO7细胞/ml的密度重悬在含细胞培养液、DMSO和血清的细胞冻存液中，采用程序降温盒在_80°C冰箱中过夜进行程序降温法保存，然后转移到_196°C液氮中长期保存。
7.如权利要求1所述的宫膜干细胞库的构建方法，其中所述定期检测的步骤包括细胞复苏后进行细胞活性检测、无菌性检测、流式细胞仪检测和分化能力检测。
8.如权利要求7所述的宫膜干细胞库的构建方法，其中所述细胞活性检测每隔12个月进行一次，将细胞复苏后用台盼蓝染色检测细胞存活率。
9.如权利要求5或7所述的宫膜干细胞库的构建方法，其中所述流式细胞仪检测包括细胞表面抗原⑶14、⑶29、⑶44、⑶45、⑶90、HLA的检测。
10.如权利要求5或7所述的宫膜干细胞库的构建方法，其中所述分化能力检测包括成骨分化能力、成脂分化能力和成软骨分化能力的检测。
11.如权利要求1所述的方法，还包括:细胞收获之后，检测合格后冻存于管内，并填写细胞的详细信息，包括供者姓名、细胞代数、细胞培养液成分和浓度、细胞接种密度，冻存液成分和冻存日期，完整记录每一样本的真实冷冻状况，将信息准确无误地扫描入数据管理系统，完成细胞库信息录入和构建。
12.如权利要求11所述的方法，还包括:细胞冻存信息录入完毕后，自动化系统根据液氮情况自动寻找空缺位置，将细胞冻存于相应的空格中。
13.如权利要求12所述的方法，冻存空间具有良好的卫生环境，包括洁净区，通风，采光环境，并符合国家相关文件规定并定期从冻存环境中取出细胞进行复苏检测活性等指标。
【文档编号】C40B50/06GK103849944SQ201210514551
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月5日 优先权日:2012年12月5日
【发明者】刘召青, 陈彦田, 齐瀚实 申请人:上海坤爱生物科技有限公司