跨越血-脑脊液屏障的肽的制作方法

跨越血-脑脊液屏障的肽的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种能跨越血-脑脊液屏障的肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述肽能从血液循环中跨越血-脑脊液屏障，从而在脑脊液中富集。本发明还公开了一种获得跨越血-脑脊液屏障的肽的方法。将本发明所述的肽作为靶向功能基可以应用于药物载体的构建，从而使药物载体富集于脑脊液，可用于脑部疾病的诊断及治疗。
【专利说明】跨越血-脑脊液屏障的肽

【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白质多肽【技术领域】，涉及能跨越血-脑脊液屏障的多肽，包括所述 肽的分子结构及其在制备脑靶向制剂中的应用。

【背景技术】
[0002] 随着人类社会的老龄化，脑部疾病的发病率正呈逐年上升的趋势，正严重危害着 人类的生命和健康。通常脑部疾病包括中枢神经系统疾病（帕金森病、老年性痴呆）、脑肿 瘤、脑血管病变、脑部病毒和细菌感染等疾病。
[0003] 血-脑屏障（BBB)是存在于血液与脑组织间的屏障系统，它能将脑组织非必需或 是有害的物质隔离在外，起到保护脑组织的作用。血脑屏障上的脑毛细血管内皮细胞和胶 质细胞共同构成了紧密连接，即是一道BBB的机械屏障。研究显示，脑毛细血管内皮细胞膜 上还存在一些特殊的酶系统，能使某些药物降解，如多巴胺脱羧酶能使L-多巴和L-5-羟色 胺酸脱羧生成不易透过BBB的L-多巴胺和L-5-羟色胺，从而构成BBB的酶屏障；脑毛细血 管内皮细胞膜上的P-糖蛋白等还起着外排泵的作用，它能选择性地将脑内有害物质或过 剩物质泵出脑外，限制物质的脑内递送。血脑屏障的上述功能维持了正常生理状态下脑组 织内环境的恒定，但在疾病治疗过程中却限制了药物的透过。据有关统计，目前临床常规制 剂给药后，大约有98%的化学药物和几乎100%的蛋白多肽或基因药物由于血脑屏障的作 用而难以入脑，很大程度上限制了脑部疾病的治疗。
[0004] 血-脑脊液屏障（BCSFB)位于脑室脉络丛的毛细血管和脑脊液之间，其结构基础 是脉络丛上皮细胞间隙的顶部有闭锁小带。脉络丛的毛细血管内皮细胞上有窗孔，并且也 没有形成如BBB -般的紧密连接，因此该屏障与血脑屏障相比具有一定的通透性，这也为 药物入脑发挥疗效提供的可能性。
[0005] 目前已有通过瞬时开放血-脑脊液屏障来增加药物入脑的策略，但该方法不具备 选择性并且常具有侵入性，并且有可能导致大量潜在的神经毒素和其他化学物质进入脑 内，这将对CNS的稳态产生不利影响，并产生不希望出现的副作用。相比之下，纳米载体，例 如脂质体和纳米粒，可以提供更好的选择。已经有越来越多种类的纳米位和脂质体可供选 择以用于治疗。这些脂质体或纳米粒的表面通常被修饰，使得该构建体可以通过特定的机 制靶向中枢神经系统。筛选可以穿过血-脑脊液屏障的肽，可以帮助药物更具有选择性，从 而提供更好的治疗效果，同时降低全身毒性。
[0006] 噬菌体展示肽库技术是一种筛选功能性多肽的生物技术，它将随机多肽文库表达 于丝状噬菌体的表面，通过多轮的"亲和一洗脱一扩增"步骤，实现高通量亲和筛选。有研究 通过噬菌体展示技术筛选出与内皮细胞特异性结合的多肽，其中最具代表性的是可与肿瘤 血管内皮细胞特异结合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD)三肽序列，R⑶结合的长循环纳 米载药系统表现出良好的肿瘤祀向性。Pasqualini等获得一种与肺细胞特异性结合的肽， 通过与抗腺病毒抗体连接而靶向于细胞膜上二肽酶的递药系统。Wan Xiaomei等也获得一 种能经鼻腔嗅粘膜入脑的七肽序列。研究显示，经噬菌体展示筛选获得的多肽亲和力高、特 异性强、安全性好、生物降解和生物相容性优良、合成方便，并易于在末端进行修饰。
[0007] 与本发明相关的现有技术还有：Ito, et al. The effect of RGD peptide-conjugated magnetite cationic liposomes on cell growth and cell sheet harvesting. Biomaterials, 2005, 26:6185 ；Trepel M，et al. Molecular adaptors for vascular-targeted adenoviral gene delivery. Hum Gene Ther，2000,11:1971 ;Xiao_Mei Wan et al. Identification of nose-to-brain homing peptide through phage display. Peptides，2009, 30:343。
[0008] 但目前为止，尚未见通过噬菌体展示技术筛选经血液循环跨越血脑脊液屏障的靶 向功能基的相关研究和报道。


【发明内容】

[0009] 本发明的一方面涉及一种能跨越血-脑脊液屏障的肽，其中所述肽的氨基酸序列 为TPSYDTYAAELR。所述肽是利用噬菌体展示十二肽库（Ph.D.-12? Phage display p印tide library)，筛选出的能跨越血-脑脊液屏障的多肽序列。
[0010] 本发明另一方面涉及一种获得跨越血-脑脊液屏障的肽的方法，所述方法包括i) 静脉给予噬菌体随机展示肽库，随后从脑脊液中回收噬菌体；ii)将回收到的噬菌体进行 扩增并再次重复i)的步骤，直至获得能跨越血-脑脊液屏障的共有肽序列。
[0011] 本发明的另一方面涉及所述肽在制备靶向制剂中的应用。所述靶向制剂如，载药 纳米粒、脂质体、泡囊或胶束等。所述多肽可修饰于上述纳米粒、脂质体、泡囊或胶束表面， 从而获得修饰由本发明所述肽的靶向制剂。将多肽修饰于这些制剂表面可通过静电吸附、 亲和连接或共价连接等，均为本领域技术人员所熟知。
[0012] 本发明的目的通过下述技术方案予以实现：
[0013] 首先，采用噬菌体展示肽库逐轮筛选出能跨越血-脑脊液屏障的肽，其包括步骤： 采用体内筛选方法，静脉给予噬菌体随机展示肽库，一定时间后，从脑脊液中回收噬菌体， 扩增后再次重复一轮体内筛选过程，并进行多轮体内筛选，最终获得能跨越血-脑脊液屏 障的噬菌体单克隆；测序后即可获得肽的氨基酸序列。噬菌体体内筛选方法，以及噬菌体单 克隆的测序方法为本领域技术人员所熟知。
[0014] 所述噬菌体随机展示肽库可以是市售的噬菌体随机展示肽库，例如噬菌体展示环 七肽库，噬菌体展示七肽库，噬菌体展示十二肽库，或其他适当的噬菌体展示随机肽库。
[0015] 所述噬菌体随机展示肽库可以静脉给予适当的动物，例如，大鼠、小鼠、兔子、狗、 羊、猴、鸡等。从脑脊液中回收噬菌体可以通过抽取适当体积的脑脊液，随后与处于对数生 长期的噬菌体宿主菌大肠杆菌共孵育，从而达到回收噬菌体的目的。脑脊液的抽取方法为 本领域技术人员所熟知。噬菌体的回收为本领域技术人员所熟知，并将在下文中进一步详 细描述。
[0016] 经体内外实验评价，结果证实，本发明所述多肽具有跨越血-脑脊液屏障并富集 于脑脊液中的特性。本发明所述多肽可用于修饰载药纳米粒、脂质体、泡囊或胶束，构建成 脑靶向递药系统，该递药系统能够提高药物的脑内递送，增强对于脑部疾病的治疗效果，降 低全身性的毒副作用。
[0017] 本发明筛选获得的SEQ ID NO: 1的多肽，经过生物信息学分析比对显示，与美国国 立生物技术信息中心（NCBI)GenBank DNA序列数据库和Swiss-Prot蛋白数据库中的已知 基因和蛋白无同源性。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0019] 1、本发明筛选得到的多肽，分子量小，生物相容性好，合成方便，成本低廉。
[0020] 2、本发明筛选得到的多肽可以用于脑部疾病靶向治疗载体的构建。

【专利附图】

【附图说明】
[0021] 图1显示了噬菌体体内筛选第一轮至第三轮筛选回收率。
[0022] 图2显示了经尾静脉注射后，噬菌体单克隆12-1与随机肽库噬菌体在大鼠 CSF中 的富集效果。
[0023] 图3显示了 TPS肽在裸鼠体内的活体分布。裸鼠尾静脉注射FITC标记的TPS肽， 以含FITC的PBS尾静脉注射给予对照组裸鼠作为对照。

【具体实施方式】
[0024] 下文所述实施例是为了帮助本发明的内容能被更容易地理解，仅为了进一步说明 本发明，而不意在限定本发明的范围。
[0025] 下文所述实施例中所用的缓冲液、培养基等说明如下：
[0026] LB液体培养基：10g/L细菌培养用胰蛋白胨（Oxford)，5g/L细菌培养用酵母提取 物（Oxford)，5g/L NaCl(Sigma)。
[0027] 顶层琼脂糖培养基：LB培养基+7g/L琼脂糖（Sigma)。
[0028] LB/IPTG/Xgal 琼脂平板：0· 05g/L IPTG，0· 04g/L Xgal，15g/L 琼脂粉（sigma)。
[0029] TBS 缓冲液：50mmol/L Tris-HCl 与 150mmol/L NaCl 加去离子水定容， 0· 103X IO6Pa 高压灭菌 30min。
[0030] IPTG/X-gal :1. 25g IPTG 和 Ig X-gal 溶于 25mL N, N-二甲基甲酰胺。溶液-20°C 避光保存。
[0031] PEG/NaCl :20% (w/v)PEG_8000,5mol/L NaCl,热压灭菌，室温贮存。
[0032] PBS :分别配制0· 2mol/L的Na2HPO4溶液和0· 2mol/L NaH2PO4溶液，常规方法灭菌， 然后每次取81mL Na2HPO4溶液和19mL NaH2PO4溶液混匀，即得pH7. 4的PBS溶液IOOmL ; 0.2mol/L PBS(4°C下贮存），加入 0.85g NaCl，即为 0.2mol/L PBS。如配制 0.01mol/L PBS 则取 50mL0. 2mol/L PBS，加 8. 5g NaCl，用双蒸水定容至 IL 即为(λ 01mol/L PBS。
[0033] TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，pH8· 0mmol/L EDTA。
[0034] 实施例I噬菌体展示随机十二肽库的体内筛选
[0035] 选用NEW ENGLAND Biolabs的Ph. D-12?肽库。第一轮筛选方法如下：将NEW ENGLAND Biolabs的Ph. D-12?肽库稀释至I X IO12Pfu滴度，稀释液为TBS缓冲液（三羟甲 基胺基甲烷，Tris;50mM Tris，150mM氯化钠），大鼠尾静脉注射。12小时后将大鼠麻醉， 无菌条件下抽取脑脊液50 μ L。取适量脑脊液用LB液体培养基培养的处于对数生长期的 ER2738大肠杆菌通过滴定法确定噬菌体的滴度，其余的扩增后用于下一轮筛选。以此进行 三轮筛选，测定每一轮筛选获得的噬菌体滴度，并从最后一轮结果中随机挑取出噬菌体单 克隆备用。
[0036] 实施例2噬菌体滴度的测定
[0037] 将实施例1中每轮筛选获得的噬菌体用LB液体培养基进行10倍比的稀释，取 10 μ L稀释后的噬菌体与200 μ L对数生长期的大肠杆菌ER2738菌液混匀，加入到50°C 预热的LB顶层琼脂（顶层琼脂：每升含IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g氯化钠，Ig氯 化镁和7g琼脂粉，高压灭菌后备用）后迅速倒入含有异丙基-β -D-硫代半乳糖苷和 5_溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷（IPTG/Xgal)的LB板，过夜，通过噬菌体蓝斑数来计数。
[0038] 滴度计算公式：噬菌体滴度（pfu) = 100X噬菌斑数X稀释倍数，即每ImL中噬 菌体形成单位。
[0039] 展示脑靶向性多肽噬菌体的富集：如图1所示，经过三轮筛选后，由十二肽库筛选 得到的噬菌体的回收率均比第一轮有了显著提高（P〈〇. 01)，表明回收得到的噬菌体得到了 明显的富集。
[0040] 实施例3噬菌体DNA提取及测序
[0041] 从实施例1的第三轮筛选结果中，分别随机挑选出多个噬菌体单克隆，通过DNA提 取后测序获知展不肤的序列。
[0042] 将噬菌体单克隆各自进行扩增：将ER2738过夜培养物按1:100稀释后接种于LB 培养基，分出ImL到培养管中，将需要鉴定的噬菌体单克隆按每管一个克隆接种，37°C摇床 培养5h。培养液离心后将500μ L上清转入干净离心管内，得扩增噬菌体贮液。每个管内 加入200 μ L聚乙二醇/氯化钠（PEG/NaCl)，颠倒混匀后室温放置15min ;离心lOmin，弃去 上清液。将沉淀物重悬于100 μ L碘化物缓冲液中（碘化物缓冲液：IOmM Tris-HCl pH8.0， ImM乙二胺四乙酸一EDTA，4M NaI)。加入250μ L乙醇；室温温育lOmin。短时间的室温温 育使单链噬菌体DNA沉淀，而大多数噬菌体蛋白可以保持在溶液中。离心lOmin，弃上清，用 70 %乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。沉淀重悬于30 μ L TE(K)Mm Tris-HCl pH8. O，ImM EDTA) 中。
[0043] 取5 μ L上述模板溶液以进行自动循环双脱氧测序，以-96作为自动测序的引物。 (―96gIII 测序引物：5，-? CCC TCA T AG TTA GCG TAA CG-3，，100pmol/yL，lpmol/mL)。 该引物距目的片段相距96bp，测序结果如表1中SEQ ID NO: 1?10所示。
[0044] 表I. SEQ ID NO: 1?10噬菌体展示肽的氨基酸序列测序结果。
[0045]
[(

【权利要求】
1. 一种能跨越血-脑脊液屏障的肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. -种获得跨越血-脑脊液屏障的肽的方法，所述方法包括i)静脉给予噬菌体随机展 示肽库，随后从脑脊液中回收噬菌体；ii)将回收到的噬菌体进行扩增并再次重复i)的步 骤，直至获得能跨越血-脑脊液屏障的共有肽序列。
3. 如权利要求2所述的方法，其中所述噬菌体随机展示肽库是噬菌体展示七肽库、噬 菌体展示环七肽库、噬菌体展示十二肽库。
【文档编号】C40B50/06GK104371006SQ201410403086
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】李婧炜 申请人:李婧炜