一种用单条染色体构建文库方法
【专利摘要】本发明提供一种用单条染色体构建文库方法，本发明采用分轮扩增的办法，消除了PCR随机偏向性问题；内切酶可选余地大，灵活，粘性末端连接效率高；使用人为设计的接头作特异引物，可用较高的退火温度，消除了非特异性扩增问题，采用超声随机打断后，通过加A反映，然后加接头的做法，属于本发明的扩展，与高通量测序技术相结合进行物种的基因组从头测序，将消除基因组测序中多染色体高杂合度不能正确组装和染色间组装错误问题，为基因组测序开辟广阔的前景。
【专利说明】一种用单条染色体构建文库方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用单条染色体构建基因组文库的方法，尤其涉及一种用单条染色 体构建文库方法。
【背景技术】
[0002] 基因组序列信息是了解物种遗传信息的最基本、最全面、最重要的途径。随着新一 代测序技术或称为高通量测序技术的出现，不少物种的全基因组测序已经完成，为这些物 种基因资源的开发利用提供了便利，也为其他物种的基因组测序提供了有益的参照。如今， 高通量测序技术成本不断下降，越来越多的物种可望用高通量测序技术实现全基因组从头 测序。然而，由于目前常用的高通量测序技术的读长短，基因组的正确组装仍是巨大的挑 战，尤其是杂合度高的植物只能得到基因组框架图而非精细图。解决基因组测序杂合度问 题的最佳途径是单染色体测序。如果能解决单染色体建库的技术问题，那么任何物种的全 基因组测序就有了希望。因此，本发明以已经分离出的牡丹第5号染色体为例，探索用单条 染色体构建全染色体文库的技术途径，为单染色体测序提供技术准备。
[0003] 本发明采用内切酶消化后引入接头而后通过基因组无偏PCR扩增的建库方法。首 先用识别四个碱基的II型限制性内切酶对单条染色体进行消化，使其成为带有粘性末端 的小片段，用连接酶向片段的两端加上预先设计好的接头，然后利用接头做引物进行多轮 PCR扩增，实现单染色体片段的倍增，从而达到高通量测序的要求。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的不足，而提供一种用单条染色体 构建文库方法。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种用单条染色体构建文库方 法，酶切时采用了来自NEW England Biolabs的Acil限制性内切酶；HinPll限制性内切酶； HpyOMIV限制性内切酶；Mspl限制性内切酶，浓度均为lOunit/μ L。这四种酶为同尾酶， 即识别序列不同，但是所切出的粘性末端相同。使用同尾酶的好处是可以设计通用的接头 和引物，即方便又经济。为了使内切酶消化后的DNA片段适合高通量测序的读长，本发明采 用双酶切体系。
[0006] 在连接实验中，选用了 T4DNA连接酶，这种酶在16-20°c的条件下活性较大，连接 效率较好。
[0007] 在PCR过程中，采用了保真性较好KOD-plus，浓度为limit/μ L，这种聚合酶产自 Toyobo,其保真性是普通聚合酶的几百倍。
[0008] 在接头的选择上以广泛使用的Sau3Al接头为基础，进行了适当的改良，使其与粘 性末端匹配更好。接头的序列如下：
[0009] 正向接头 5' -GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3'
[0010] 反向接头 5，-CGCTGAGCTCGAATTCGACCC-3，
[0011] 正向接头的相对分子质量5868. 8,每OD的质量为27. 9微克，长度为19个碱基， 每OD的摩尔数为4. 7nmol。反向接头的相对分子质量6367. 3, OD的质量为28. 5微克，长 度为21个碱基，每OD的摩尔数为4. 7nmol。双链接头的相对分子质量为12236. 1，在制作 接头时加入等摩尔数的正反向寡核苷酸片段，先在94°C的条件下充分变性，然后再自然降 温至室温，降低错配的可能性。
[0012] 本发明的实验步骤如下。
[0013] ⑴双内切酶消化
[0014] 酶切的体系如下：
[0015]
【权利要求】
1. 一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 对单染色体中的蛋白酶K灭活，加入酶切体系，酶切。 (2) 加入等量的正反向单链接头，制作通用接头。加入适量的接头到酶切产物中，使接 头与酶切片段连接。 (3) 向连接产物中加入PCR扩增体系，利用小循环多次扩增的方式进行扩增，期间对每 轮的产物合管混合后再分管以降低PCR偏好。
2. 根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤（1) 中，蛋白酶K的灭活条件为95°C 10_20min。
3. 根据权利要求2所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤（1) 中，采用的限制性内切酶为同尾酶，方便接头的设计。
4. 根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤（1) 中，利用T4DNA连接酶缓冲液替换原限制性内切酶的缓冲液。
5. 根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤（1) 中，酶切的体系为 限制性内切酶1 ιμ?_ 限制性内切酶2 1ML T4DNA连接酶缓冲液 3 μ L 染色体DNA 1ML 无菌水 4 ML 。
6. 根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤（1) 中，酶切的条件为37°C 3小时处理，并65°C lOmin灭活限制性内切酶。
7. 根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤（2) 中，接头的序列为 正向接头 5' -GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3' 反向接头 5' -CGCTGAGCTCGAATTCGACCC-3'。
8. 根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤（2) 中，接头的制作条件为94°C 5-10min，52°C 20-30min处理之后在室温下放置2-3h。
9. 根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤（2) 中，连接的体系为 酶切体系 1〇μ L DNA接头 2μ L T4DNA连接酶 1μ L T4DNA连接酶缓冲液 2μ L 。
10. 根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤 ⑵中，连接的条件为16-20°c恒温连接10小时。
11. 根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤 (3)中，采用小循环多次扩增的方式进行扩增，产物合管混合后再分管以降低PCR偏向。
12. 根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步 骤⑶中，PCR 扩增的程序为 94°C 3min，lcycle ;94°C 30S，52°C 40S，72°C 50S，10cycle ; 72°C 10min4°C 00,lcycle〇
13. 根据权利要求1-12中任一所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于： 所述实验材料为单条染色体。
【文档编号】C40B50/06GK104294370SQ201410474304
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月18日 优先权日:2014年9月18日
【发明者】刘艳磊 申请人:北京众科生物科技服务有限公司