一种具有类漆酶活性的铂纳米颗粒及制备方法及用途与流程

本发明属于纳米颗粒制备技术领域，具体的是涉及一种具有类漆酶活性的铂纳米颗粒及制备方法。

背景技术：

漆酶(也叫蓝酶，laccase)，是一种含铜的多酚氧化酶，是多酚氧化酶的一种，也是氧化还原酶，主要以酚类化合物和芳香胺类化合物为底物，同时伴随分子氧还原成水(Galhaup,C.,Wagner,H.,Hinterstoisser,B.&Haltrich,D.Increased production of laccase by the wood degrading basidiomycete Trametes pubescens[J].Enzyme and Microbial Technology 2002,30:529-536)。众所周知，工业催化严重污染环境以及其苛刻的反应条件等缺点，使得漆酶这样一种清洁高效的氧化还原酶，在生物催化反应中占据了十分关键的地位，具有很重要的基础研究意义和巨大的商业价值。然而，漆酶价格昂贵且其pH和温度的适用性比较窄，遇到酸、碱、热等非生理条件容易发生结构变化而失去催化活性，不利于工业应用。因此，研发具有漆酶特性，稳定性高、价格低廉的模拟酶体系显得十分必要。

以纳米材料为基础构建的模拟酶体系即纳米酶，在模拟酶的大家族中是一支最新并且最具应用前景的生力军。与天然酶相比，纳米材料具有成本低、稳定性高、易于处理和储存、催化活性可调节等优点(Wei,H.；Wang,E.Nanomaterials with enzyme-like characteristics(nanozymes):next-generation artificial enzymes.Chem.Soc.Rev.2013,42,6060–6093.)。在纳米材料中，铂纳米颗粒已经被公认为是一种高度理想的催化剂，已被发现具有类过氧化酶、氧化酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等活性但类漆酶活性尚未有报道。因此，开发方便有效的具有类漆酶活性的铂纳米颗粒制备方法具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种工艺简单、周期短、条件易控、温和，便于大工业生产的具有类漆酶活性的铂纳米颗粒的制备方法。

本发明的第二个目的是提供一种具有类漆酶活性的铂纳米颗粒。

本发明的第三个目的是提供一种具有类漆酶活性的铂纳米颗粒的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种具有类漆酶活性的铂纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)脱氧核苷酸的退火：

将2.5-250μL 2-200μM的脱氧核苷酸水溶液和50-200μL 5-60mM pH为3.0-9.0的缓冲液混匀；升温至85-100℃，维持3-10min，降至室温；

脱氧核苷酸的序列可选自下述序列之一：

Gb，其中b＝10-200；

Cc，其中c＝10-200；

Ad，其中d＝10-200；

Te，其中e＝10-200；

(AC)f，其中f＝5-100；

(AT)g，其中e＝5-100；

(AG)h，其中h＝5-100；

(GC)i，其中i＝5-100；

(GT)j，其中j＝5-100；

(GA)k，其中k＝5-100；

(CG)l，其中l＝5-100；

(CA)m，其中m＝5-100；

(CT)n，其中n＝5-100；

(TA)o，其中o＝5-100；

(TC)p，其中p＝5-100；

(TG)q，其中q＝5-100；

(2)铂纳米颗粒的制备：

将2-15μL 100-1000μM氯铂酸盐水溶液加入到步骤(1)获得的退火的脱氧核苷酸水溶液中，在20-30℃下混匀，静置0.5-4h，加入6-24μL 0.6-2.4mM还原剂水溶液，混匀，在20-30℃下静置10-15h，得到具有类漆酶活性的铂纳米颗粒液体。

优选地，脱氧核苷酸水溶液的浓度为10μM。

缓冲液的浓度最好是10mM，缓冲液的pH为5.0，

缓冲液优选：磷酸盐缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物缓冲溶液、乙酸钠缓冲溶液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲溶液或3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲溶液。

氯铂酸盐水溶液的浓度最好是300μM。

氯铂酸盐优选：氯铂酸钠或者氯铂酸钾。

还原剂优选：硼氢化钠或二甲胺硼烷。

上述方法制备的具有类漆酶活性的铂纳米颗粒。

上述具有类漆酶活性的铂纳米颗粒对漆酶底物催化氧化的用途。

本发明的方法简单、周期短、条件易控、温和，便于大工业生产制备；具有类漆酶活性的铂纳米颗粒的平均粒径为1.0-10nm，催化活性高。可以替代漆酶用于生物检测、污染物降解等相关领域。

附图说明

图1是实施例1中合成的具有类漆酶活性的铂纳米颗粒的透射电镜图；

图2是实施例1中氨基安替比林溶液浓度为40μM，对二氯苯酚溶液分别为0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM的动力学曲线图；

图3为图2的双倒数曲线图。

具体实施方式

下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但不对本发明作任何限制。

实施例1

一种具有类漆酶活性的铂纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)脱氧核苷酸C₁₀(CCCCCCCCCC)的退火：

将5μL 10μM的脱氧核苷酸C₁₀水溶液和200μL 10mM pH为5.0的磷酸盐缓冲溶液混匀；升温至95℃，维持5min，降至室温；

(2)铂纳米颗粒的制备：

将5μL 300μM氯铂酸钾水溶液加入到步骤(1)获得的退火的脱氧核苷酸水溶液中，在28℃下混匀，静置3h，加入10μL 1.5mM二甲胺硼烷水溶液，混匀，在28℃下静置12h，得到具有类漆酶活性的铂纳米颗粒液体。用透射电镜扫描获得平均粒径为3.4nm。(见图1)检测：

测定铂纳米颗粒的类漆酶活性：

在6个4mL比色皿中，均加入50μL实施例1获得的具有类漆酶活性的铂纳米颗粒液体、750μL 10mM pH为7.0的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物缓冲溶液、6μL 40μM氨基安替比林水溶液后，再向1-6个比色皿中依次分别加入为0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM的对二氯苯酚水溶液，加入三蒸水使终体积为3000μL，混合反应10min，采用紫外分光光度计扫描510nm处的吸收光谱，得到吸光度，通过Lineweaver–Burk方程计算出其米氏常数。(见图2和图3)

具有类漆酶活性的铂纳米颗粒表现出高的酶活性，对二氯苯酚的Km值为0.12mM。

实验证明，用三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲溶液或3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲溶液替代实施例1中的磷酸盐缓冲溶液，其它同实施例1，可以制备出相应的具有类漆酶活性的铂纳米颗粒液体。

实施例2

一种具有类漆酶活性的铂纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)脱氧核苷酸C₁₀₀的退火：

将2.5μL 200μM的脱氧核苷酸C₁₀₀水溶液和50μL 60mM pH为3.0的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物缓冲溶液混匀；升温至85℃，维持10min，降至室温；

(2)铂纳米颗粒的制备：

将2μL 1000μM氯铂酸钠水溶液加入到步骤(1)获得的退火的脱氧核苷酸水溶液中，在20℃下混匀，静置4h，加入6μL2.4mM硼氢化钠水溶液，混匀，在20℃下静置15h，得到具有类漆酶活性的铂纳米颗粒液体。用透射电镜扫描获得平均粒径为2.6nm。

检测：

测定铂纳米颗粒的类漆酶活性：

在6个4mL比色皿中，均加入50μL实施例2获得的具有类漆酶活性的铂纳米颗粒液体、750μL 10mM pH为7.0的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物缓冲溶液、6μL 40μM氨基安替比林水溶液后，再向1-6个比色皿中依次分别加入为0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM的对二氯苯酚水溶液，加入三蒸水使终体积为3000μL，混合反应10min，采用紫外分光光度计扫描510nm处的吸收光谱，得到吸光度，通过Lineweaver–Burk方程计算出其米氏常数。

具有类漆酶活性的铂纳米颗粒表现出高的酶活性，对二氯苯酚的Km值为0.27mM。

实施例3

一种具有类漆酶活性的铂纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)脱氧核苷酸C₂₀₀的退火：

将250μL 2μM的脱氧核苷酸C₂₀₀水溶液和200μL 5mM pH为9.0的乙酸钠缓冲溶液混匀；升温至100℃，维持3min，降至室温；

(2)铂纳米颗粒的制备：

将15μL 100μM氯铂酸钾水溶液加入到步骤(1)获得的退火的脱氧核苷酸水溶液中，在30℃下混匀，静置0.5h，加入24μL0.6mM二甲胺硼烷水溶液，混匀，在30℃下静置10h，得到具有类漆酶活性的铂纳米颗粒液体。用透射电镜扫描获得平均粒径为2.2nm。

检测：

测定铂纳米颗粒的类漆酶活性：

在6个4mL比色皿中，均加入50μL实施例3获得的具有类漆酶活性的铂纳米颗粒液体、750μL 10mM pH为7.0的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物缓冲溶液、6μL 40μM氨基安替比林水溶液后，再向1-6个比色皿中依次分别加入为0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM的对二氯苯酚水溶液，加入三蒸水使终体积为3000μL，混合反应10min，采用紫外分光光度计扫描510nm处的吸收光谱，得到吸光度，通过Lineweaver–Burk方程计算出其米氏常数。

具有类漆酶活性的铂纳米颗粒表现出高的酶活性，对二氯苯酚的Km值为0.32mM。

用G₁₀、G₁₀₀、G₂₀₀、(GC)₅、(GC)₅₀、(GC)₁₀₀、(GT)₅、(GT)₁₀₀、(GA)₅、(GA)₁₀₀、(CT)₅、(CT)₅₀、(CT)₁₀₀、(CA)₅、(CA)₁₀₀、(CG)₅、(CG)₁₀₀、A₁₀、A₁₀₀、A₂₀₀、(AC)₅、(AC)₅₀、(AC)₁₀₀、(AG)₅、(AG)₁₀₀、T₁₀、T₁₀₀、T₂₀₀、(TA)₅、(TA)₅₀、(TA)₁₀₀、(TC)₅、(TC)₁₀₀、(TG)₅、(TG)₁₀₀；分别替换实施例1中的C₁₀，其它同实施例1，所获得的具有类漆酶活性的铂纳米颗粒的平均粒径见表1。并用同实施例1相同的方法测定对二氯苯酚的Km值，见表1。

表1

结论：本发明的方法制备的具有类漆酶活性的铂纳米颗粒对二氯苯酚的Km值小，说明具有类漆酶活性的铂纳米颗粒与对二氯苯酚的亲和力高，反应速率快，催化活性高。

用对苯二酚，邻苯二酚，对苯二胺，儿茶酚，2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，多巴胺，抗坏血酸，对氨基苯酚，邻氨基苯酚，二茂铁，丁香醛连氮替代实施例1中检测中的对二氯苯酚，其它同实施例1的检测，结果显示，本发明的具有类漆酶活性的铂纳米颗粒与上述物质中的任意一个物质都亲和力高，反应速率快，催化活性高。