专利名称：酵母细胞中硒化镉量子点提取、纯化方法
技术领域：
本发明属于微生物学、生物化学、纳米科学技术领域，更具体涉及一种酿酒酵母细 胞内合成的硒化镉量子点的提取、纯化方法，适用于其他微生物细胞内合成的其他类型量 子点或其他纳米材料的分离制备。
背景技术：
量子点是最近几年发展起来的一种新型纳米材料，其合成一直采用金属化合 物_元素有机合成法、水相无机合成法等经典的化学方法，合成出来就是比较纯的量子点。 1989 miNature上最早报道了可以在微生物中合成硫化镉量子点，此后生物合成量子点 发展迅速，不同类型的量子点也相继在细胞中合成出来。生物合成量子点的方法相对传统化学合成法优势明显，但唯一限制因素是在细胞 内合成的量子点不容易被有效地提取出来。量子点不像磁小体一样可以利用磁力来和细胞 组分分离。细胞内合成的量子点被生物大分子包裹和修饰，量子点的稳定性依赖于这些生 物大分子的稳定，一旦这些包裹或在量子点外修饰的生物大分子被破坏，那么细胞内合成 的量子点也就不复存在了。因此如何在保证量子点稳定性、天然结构不被破坏的前提下，有 效“温柔”地将细胞内合成的量子点提取并纯化出来，是当前量子点生物合成领域面临的一 大挑战。酵母菌是一类具有细胞壁的真核微生物，本实验室2009年发表于AZra/ ⑶i/ Functional Materials饱]19: 2359-2364)中，报道了利用酵母菌成功在活细 胞内合成硒化镉量子点，并进行了初步的量子点提取制备。由于酵母细胞壁较为坚韧，量子 点提取制备条件必须较为温和，否则荧光损失较大。传统的破除细胞壁的方法诸如反复冻 融、高压勻质、微波法等方法，对酵母细胞壁破碎效果不佳，而更为剧烈的方法如碱裂解法 又会破坏细胞内量子点。因此必须发展一种条件温和、细胞破碎程度高，又不影响量子点荧 光性质，且能保持量子点稳定性的酵母细胞裂解方法。除了细胞壁裂解的技术问题外，对细胞内合成的量子点提取另一限制因素是量 子点与细胞结构的分离。细胞内合成的量子点与细胞器结合紧密，即便细胞被破坏它们也 牢固地结合在细胞器或细胞碎片上。一套成熟的细胞内合成的量子点提取、纯化方案不仅 是进一步发展生物合成量子点这一绿色、环境友好的方法，对量子点的应用及生物合成量 子点机理的研究也具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种微生物细胞内合成的量子点的方法，主要是利用 生物化学的方法来提取并纯化酵母细胞内合成的硒化镉量子点。本分离纯化方法操作简 便，提取率高，产物稳定，重要的是实验安全，不涉及任何有毒或有危险的试剂，在一般生物 学实验室均可以完成。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种酵母细胞内合成的硒化镉量子点的提取、纯化方法，其步骤是
1)酵母细胞壁的裂解取已合成硒化镉量子点的酵母细胞培养液40-60mL[酵母细 胞内量子点合成方法参见本实验室2009年发表于Functional Materials的论 文(2009，19: 2359-2364)]，4000 g离心1-3 min，收集细胞沉淀，重悬于细胞裂解缓冲液 (Lysis buffer)中，按4000 U/101CI细胞的量加入细胞溶解酶(Lyticase)，30°C摇床，100 r/ min振荡孵育4-6 h至溶液变透明为止；
2)酵母细胞的破碎10000g离心9-11 min，收集1)步骤处理过的细胞，重悬于适量 (24-36 mL)细胞裂解缓冲液(Lysis buffer)中，加入蛋白酶抑制剂(Cocktail);400 W (X 作2 s,间歇2 s，200次；每20次停10 s)超声波处理裂解细胞；
3)硒化镉量子点的粗分离将2)步骤处理过的样品于4000g离心9-11 min,吸取含 量子点的黄色上清，将含量子点的粗提物与细胞碎片初步分离；
4)硒化镉量子点的细分离向3)步骤中离心收集的黄色上清中加入十二烷基硫酸钠 (SDS)至终浓度为2%，轻轻摇勻，室温(20-250C以下相同)静置9_11 min, 10000 g离心28-32 min，取上清用0. 22 mm滤膜过滤，然后用50 K MWCO超滤管进行超滤、水洗；
5)硒化镉量的纯化将4)步骤中获得的样品进行聚蔗糖400(Ficoll 400)密度梯度 离心，113000 g离心3-5 h，小心取出密度梯度离心后的黄色分层；50 K MWCO超滤管进行 超滤、水洗，即得到纯化的硒化镉量子点。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
本发明中所使用的试剂均无毒无刺激，不涉及化学合成量子点中所用到的氧化三正辛 基膦(TOPO)等易燃、易爆、有毒试剂，所以本方法不会对人造成危害，而且对实验条件要求 不高，在一般生物学实验室均可安全地操作，所涉及的生物化学提取纯化方法比较安全，提 取出来的硒化镉量子点在电镜下保持完整的颗粒结构，且粒径均一，能谱分析为硒和镉元 素。更为重要的是，本发明所提取的量子点在4°c可长期保存，保持较强的荧光性质。
图1为一种细胞溶解酶处理5 h后的酵母细胞荧光显微镜观察示意图。酵母细胞经细胞溶解酶处理5 h后，绝大部分细胞壁被破坏，有的细胞已经裂解。 图2为一种超声处理后的荧光显微镜观察示意图。细胞溶解酶消化后的细胞经400 W超声处理200次，细胞被破碎成碎片，量子点未 被破坏，荧光仍然存在。图3为一种酿酒酵母细胞合成CdSe量子点的分离纯化示意图。A粗分离效果。量子点与大量细胞碎片及少量未破碎的细胞分离开。B细分离效果。加入十二烷基硫酸钠后，经离心、微孔滤膜过滤和超滤后的样品。C密度梯度离心纯化后的结果。密度梯度离心后的硒化镉量子点分布较为集中。图4为一种纯化后硒化镉量子点样品的透射电镜示意图。将纯化后的样品滴到覆有超薄碳膜的铜网上，透射电子显微镜(Tecnai G2 20) 200 KV观察，可以观察到大量粒径较为均一的纳米颗粒物质。
具体实施例方式下面以酿酒酵母中合成的硒化镉量子点的提取纯化为例，参照附图进一步阐 述本发明。按照本实验室发表于/^z7Ciioaa/ ifeieria/s的论文(2009，19: 2359-2364)中方法制备合成好硒化镉量子点的酵母细胞。一种微生物细胞内合成的量子点的提取、纯化方法，其步骤如下
1、酵母细胞壁的裂解取已合成硒化镉量子点的酵母细胞培养液50 mL,4000 g离心2 min，收集细胞沉淀，重悬于30 mL细胞裂解缓冲液(Lysis buffer)中，按4000 U/101(l细胞 的量加入细胞溶解酶(Lyticase，Sigma, L4025), 30°C, 100 r/min振荡孵育5 h至溶液变 透明为止；
相关溶液组分如下 细胞裂解缓冲液(Lysis buffer) 1. 5 mL 1 mol/L pH 7. 5 磷酸缓冲液 4. 5 mL 4 mol/L Sorbitol 24 mL H2O
1 mol/L磷酸缓冲液pH 7. 5 80 mL 1 mol/L K2HPO4 19. 8 mL 1 mol/L KH2PO4 混合至pH 7. 5
2)酵母细胞的破碎10000g离心10 min，收集步骤1)中细胞溶解酶消化后的细胞 沉淀，细胞沉淀重悬于4. 5 mL细胞裂解缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂(Cocktail，Roche, 04693132001，使用量参照说明书);4°C，400 W(工作2 s，间歇2 s，200次；每20次停10 s) 超声波处理裂解细胞；
3)硒化镉量子点的粗分离将步骤2)中处理后的样品于4000g离心10 min,小心吸 取含量子点的黄色上清，上清即为硒化镉量子点粗提物；
4)硒化镉量子点的细分离向步骤3)收集的黄色上清中加入十二烷基硫酸钠(SDS， Sigma)至终浓度为2%，轻轻摇勻，室温静置10 min, 10000 g离心30 min，小心收集上清，然 后用0.22 mm滤膜将收集的上清过滤至50 K MWCO超滤管(MiIlipore，Amicon Ultra-15) 上层，用重蒸水稀释至10 mL,5000 g离心10 min ；用重蒸水将上层溶液稀释至10 mL，5000 g离心10 min，重复一次；
5)硒化镉量子点的纯化将步骤4)中超滤所得的样品进行聚蔗糖400(Ficoll 400， Pharmacia，17-0300-01)密度梯度离心，聚蔗糖密度梯度为8%、15%、30%、45%(均为质量体积 比)，113000 g离心4 h。离心完毕后，用针头吸取含硒化镉量子点的黄色溶液，用重蒸水稀 释至 10 mL，加至 50 K MWCO 超滤管(Millipore，Amicon Ultra-15)上层，5000 g 离心 10 min ；用重蒸水将上层溶液稀释至10 mL,5000 g离心10 min，重复一次，即得到纯化的硒化 镉量子点。以上描述是对本发明的解释，不是对本发明的限定，本发明所限定的范围参见权 利要求，在不违背本发明的精神的情况下，本发明可以做任何形式的修改。
权利要求
1. 一种微生物细胞内合成的量子点的提取、纯化方法，其步骤是1)酵母细胞壁的裂解取已合成硒化镉量子点的酵母细胞培养液，4000g离心1-3 min,收集细胞沉淀，重悬于细胞裂解缓冲液中，按4000 U/1010细胞的量加入细胞溶解酶， 30°C摇床，100 r/min振荡孵育4_6 h至溶液变透明为止；2)酵母细胞的破碎10000g离心9-11 min，收集1)步骤处理过的细胞，重悬于细胞 裂解缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂；400 W超声波处理裂解细胞；3)硒化镉量子点的粗分离将2)步骤处理过的样品于4000g离心9-11 min,吸取含 量子点的黄色上清，将含量子点的粗提物与细胞碎片初步分离；4)硒化镉量子点的细分离向3)步骤中离心收集的黄色上清中加入十二烷基硫酸钠 至终浓度为洲，轻轻摇勻，室温静置9-11 min, 10000 g离心^-3& η，取上清用0. 22 mm 滤膜过滤，然后用50 K MWCO超滤管进行超滤、水洗；5)硒化镉量子点的纯化将4)步骤中获得的样品进行聚蔗糖400密度梯度离心， 113000 g离心3-5 h，取出密度梯度离心后的黄色分层；50 K MWCO超滤管进行超滤、水洗， 即得到纯化的硒化镉量子点。
全文摘要
本发明公开了一种微生物细胞内合成的量子点的提取、纯化方法，其步骤是1)酵母细胞壁裂解取已合成硒化镉量子点的酵母细胞培养液，离心，沉淀重悬于细胞裂解缓冲液中，加入细胞溶解酶，振荡孵育裂解细胞壁；2)酵母细胞破碎离心收集处理过的细胞，重悬于细胞裂解缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂，超声波破碎细胞；3)硒化镉量子点粗分离将处理过的样品离心，收集上清；4)硒化镉量子点细分离向收集的上清中加入十二烷基硫酸钠，离心收集上清，上清进行过滤、超滤、水洗；5)硒化镉量子点纯化将获得的样品进行聚蔗糖密度梯度离心，超滤，水洗，得到纯化的硒化镉量子点。方法简便，提取率高，产物稳定，安全，不涉及有毒、危险试剂。
文档编号C01B19/04GK102030316SQ201010562410
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月26日 优先权日2010年11月26日
发明者庞代文, 张鹏, 李勇, 谢志雄 申请人:武汉大学