一种印度梨形孢作为玉米肥料的用途的制作方法

本发明具体涉及一种印度梨形孢作为玉米肥料的用途，属于玉米肥料
技术领域：
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背景技术：
：植物内生真菌印度梨形孢(piriformosporaindica，p.indica)是印度科学家于1998年在印度沙漠中发现的。印度梨形孢是一种具有广泛宿主的植物内生真菌。它能促进植物的生长和提高产量，可提高植物对营养的吸收和对生物和非生物的胁迫，如抵抗干旱和水涝。能够诱发植物产生系统抗病性，显著提高植物对多种病害的抗病性，减轻发病水平，因而印度梨形孢定殖后能提高植株的系统抗病性和抗逆性。印度梨形孢可以在人工培养基上生长并能顺利完成其生活史，这一性状使其商品化开发应用成为可能，更具商业开发和产业化应用前景。印度梨形孢可进行离体培养，易于规模化制剂制备，寄主范围更加广泛，具有广谱生物学效应特性，在生物功能上，p.indica与丛枝菌根真菌(arbuscularmycorrhizalfungi，amf)极为相似，能促进植物生长，加快植物对氮、磷等矿物质的吸收，提高作物对逆境胁迫的忍耐性，诱导植物产生系统抗性。但amf不能进行纯培养，而p.indica可以在人工培养基上进行纯培养。自p.indica被发现以来，关于该菌的寄主、促进植物生长、提高植物抗逆抗病性、增加植物产量、提高果实品质等的研究报道层出不穷，近年来广大科研人员侧重于p.indica与植物互作分子机理的研究。这些研究主要来源于德国、印度等首次报道该菌的国家，以及伊朗、墨西哥、美国等后来才逐渐开始研究该菌的国家；目前国内浙江大学、福建农林大学的相关科研人员也正在进行相关研究。但所做发酵优化并不全面，且未见将p.indica开发制备成生物肥料和应用于玉米大田的研究报道。技术实现要素：因此，本发明的内容是印度梨形孢作为玉米肥料的用途，具体是研究印度梨形孢作为生物肥料应用于玉米种植。印度梨形孢采用液体发酵技术，发酵技术参数包括ph值、培养温度、搅拌速度。技术参数与梨形孢生物量的回归方程模型为：y＝0.57-0.010×a-0.046×b-0.018×c-0.060×a×b-0.051×a×c+0.038×b×c-0.082×a2-0.13b2-0.072×c2其中y为梨形孢生物量，a为ph值，b为培养温度，c为转速，转速是代表搅拌速度的参数。本发明的有益效果在于：本发明在前期研究工作的基础上，进一步采用响应面法优化印度梨形孢发酵技术参数为：ph6.02、培养温度27.55℃、转速为178.2rpm。在此条件下，提高了菌体生物量。为应用于大田实践奠定了基础。通过大田试验，显著提高玉米主根长和玉米产量。进一步可制备成绿色、安全、无污染的抗逆、促生型生物肥料，解决长期以来不合理施用化肥造成的土壤板结、环境污染等问题，弥补现有的各种生物肥料施用范围局限、肥效不稳定等缺陷，为发展生态农业提供一条新途径。附图说明图1为实施例中培养温度与初始ph及其交互作用对印度梨形孢生物量影响的响应面和等高线图；图2为实施例中转速与初始ph及其交互作用对印度梨形孢生物量影响的响应面和等高线图；图3为实施例中转速与温度及其交互作用对印度梨形孢生物量影响的响应面和等高线图；图4为实施例中印度梨形孢玉米根部定值扩增结果示意图；具体实施方式下面结合附图对本发明的具体实施方式进行说明：本实施例中，首先对印度梨形孢进行发酵优化扩大培养，进而施用于大田玉米种子、三叶期、五叶期等各时期，并对印度梨形孢定值于玉米根部进行检测，最后测定玉米生物总鲜量、玉米产量，确定其对玉米生长量的影响。为印度梨形孢应用于大田玉米农业提供参考。材料与方法材料：印度梨形孢(piriformosporaindica)为实验室保存。供试玉米品种为先玉335，市场购买种子。方法：响应面法优化设计：通过前期单因素优化结果，选取影响显著的3个因素：a(初始ph值)，b(培养温度)，c(转速)，以印度梨形孢生物量为指标，根据box-behnken设计原理，设计响应曲面分析试验，其因素水平编码表见表1。表1印度梨形孢共生玉米根形态学观察及真菌18srdna扩增鉴定：在玉米生长七叶期，随机选取玉米根系，用自来水冲洗干净后再用蒸馏水冲洗3遍，剪成1cm长小段，经10％naoh浸泡4h后洗净，再经1％hcl浸泡5min后洗净，最后用0.05％乳酸石炭酸棉蓝染色液染色制片，于体视显微镜下观察印度梨形孢真菌定殖情况并拍照。另外，取玉米七叶期根系，蒸馏水冲洗、医酒精消毒3遍后，采用ctab法提取总dna的，pcr扩增引物为its1：5’tccgtaggtgaacctgcgg3′和its4its4：5’tcctccgcttattgatatgc3′。pcr反应条件为94℃预变性4min，然后进入循环，94℃变性1min，55℃退火40s，72℃延伸90s，共35个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，imagelab3.0软件分析。印度梨形孢大田施肥及玉米生物量和产量的测定：农田选取地点为定襄县宏道镇东街村，种植时间为2016年4月22日，种植数量为120株，命为a区b区、c区(各40株)。其中a区种子拌菌液。2016年5月15日，三叶期a区和c区浇灌稀释菌液，另40株出苗后施菌液，还有40作为空白对照。2016年5月28日，五叶期a区和c区浇灌稀释菌液。2016年9月15日，收获玉米，称各区玉米总鲜重、玉米棒重、株高和叶长，并进行数据分析。结果与分析响应曲面试验结果与分析：box-behnken设计试验结果：以ph值(x1)、温度(x2)、搅拌速度(x3)为自变量，以印度梨形孢生物量为响应指标，采用box-behnken方法设计响应面分析试验，试验设计及实施结果见表2。表2实验号a(ph值)b(温度)c(搅拌速度)实测值预测值16.0028.00200.000.5940.569426.0028.00200.000.5910.569436.2028.00100.000.460.47362546.2028.00300.000.3060.33662556.0026.00100.000.4770.46787565.8030.00200.000.3770.381576.0030.00100.000.2750.30112585.8028.00100.000.4230.39237595.8026.00200.000.3130.35275106.0028.00200.000.5340.5694116.0030.00300.000.3320.341125125.8028.00300.000.4730.459375136.2026.00200.000.4570.4525146.0028.00200.000.5940.5694156.2030.00200.000.280.24025166.0028.00200.000.5340.5694176.0026.00300.000.3840.357875响应面设计结果及方差分析：根据表2的试验结果，利用designexpertv8.0.5.b软件对试验数据进行分析，所得主要分析结果见表3。表3注：*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001二次模型中回归系数的显著性检验(表3)表明：因素b对印度梨形孢生物量影响效果的线性效应显著，因素a和c效应不显著；因素a2、b2、c2对结果的曲面效应显著，因素ab、ac交互影响显著。对试验数据进行多次拟合回归，以梨形孢生物量(y)为因变量，初始ph(a)、温度(b)、转速(c)为自变量建立回归方程模型为：y＝0.57-0.010×a-0.046×b-0.018×c-0.060×a×b-0.051×a×c+0.038×b×c-0.082×a2-0.13b2-0.072×c2。另外，由表3可知，实验因素对印度梨形孢生物量影响显著程度由大到小依次为温度＞转速＞初始ph；模型的回归f值为12.93，p＝0.0014(p＜0.05视为模型显著)，表明该模型极显著；多元相关系数r2＝0.9832，调整r2＝0.9603，表明模型对试验实际情况拟合较好，失拟项差异不显著(p0.2277＞0.05)，表示该方程试验拟合效果好。响应面图及等高线图分析：根据回归方程得出不同因子的响应面和等高线结果见图1至3。响应面图和等高线均可阐明该模型。在响应曲面图中，单因素影响效果与曲面陡峭相关，曲面越陡峭，影响越显著。等高线图与响应面图相对应，响应值越大曲线越接近中心。各因素交互作用与等高线形状相关，圆形则为不显著，椭圆为显著。通过designexpert(v8.0.5.b)软件分析，印度梨形孢生物量的最佳培养条件为初始ph为6.02、培养温度27.55℃、转速为178.2rpm，此条件下菌体生物量的理论值为0.6259。在该条件下进行3次试验验证，菌体生物量平均值为0.6129，与预测值的误差仅为2.07％，表明该模型可靠性高，应用响应曲面法优化印度梨形孢的培养条件是可行的。印度梨形孢共生玉米根形态学观察及真菌18srdna扩增鉴定：印度梨形孢共生玉米根形态学观察结果：在玉米生长七叶期，选取印度梨形孢真菌与玉米共生根系，经台盼蓝染色，在6.3×25体视显微镜下可清晰的观察到该真菌在紫根部的细胞间和细胞内非常密集地定殖有椭圆形的厚垣孢子，主要在根系成熟区的表皮层，分生区和伸长区少有定殖。p.indica主要定殖于植物根系的表皮细胞，在细胞内或细胞间形成致密菌丝组织，在定殖过程中，首先由附着在植物根部表皮的厚垣孢子萌发产生菌丝，紧接着萌发自不同孢子的菌丝迅速联接起来，在根表形成菌丝网络，在孢子萌发后菌丝穿透根部表皮细胞壁或通过细胞间隙进入根组织内部。通用引物its1和its4扩增结果：以提取的所有供试真菌dna为模板，用通用引物its1和its4扩增的rdnaits，电泳图谱显示扩增出的片段大约380bp，从分子水平上鉴定p.indica侵染玉米根部。结果见图4。印度梨形孢大田施肥及玉米生物量和产量的测定：印度梨形孢对供试的玉米(先玉335)植株的生长有显著的影响。玉米在生长各时期株高均显著高于对照，接种印度梨形孢的玉米具有较长的主根，更绿更宽的叶片，更粗壮的茎秆，更多量的生物总量和玉米产量。从表4可知，从种子拌菌到三叶期和五叶期菌肥浇灌，与对照相比，拌种加灌菌处理下，玉米生物量增加了24％；玉米鲜重增加了38％；三叶期主根长增加了26％；株高增加了9％；叶长增加了17％。灌菌处理下，玉米生物量增加了6％；玉米鲜重增加了18％；三叶期主根长增加了15％；株高增加了7％；叶长增加了4％。可见印度梨形孢可显著促进玉米的生长和提高产量，其中拌种加灌菌效果更显著，提高更高，印度梨形孢可伴随玉米种子的萌发而定值于根部，后期的根部浇灌也具同样的效果，施印度梨形孢菌肥宜在早期促进效果更佳。表4表中多重均值比较采用lsd方法；同列标有不同小写字母的表示差异显著(p＜0.05)。以上是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12