一种多孔中空碳酸钙载药微球的制备方法与流程

本发明属于药物缓释载体，涉及一种多孔中空碳酸钙载药微球的制备方法，属于生物医学工程领域，可用于生物材料中药物缓释载体材料。可赋予各种口服药物载体，具有ph敏感性以及生物降解性。

背景技术：

近几十年来，药物载体，如微胶囊、纳米管和空心纳米颗粒在肿瘤治疗中吸引了相当大的关注，因为他们可以被动地溢出进入肿瘤组织和积累，从而有效地减少副作用，增强药物的药物动力学特性，延长循环半衰期,提高利用率，安全性和有效性的药物。迄今为止，诸如脂质体、树状大分子、聚合物纳米颗粒、磷酸钙、硅氧化物、氧化锌和碳酸钙(caco3)，已被开发用于药物传递。在这些纳米载体中，caco3纳米颗粒或纳米球具有很高的药物传递潜力，是因为caco3在自然界中是人体骨骼或动物外壳的主要成分，具有良好的生物相容性和生物降解性。此外，碳酸钙的制备工艺简单、温和。总的来说，caco3基纳米载体在药物传递方面具有以下几个潜在优势：(1)具有良好的生物相容性，无明显毒性或免疫应答；(2)对低ph值敏感，特别适合肿瘤环境；(3)生物环境中的生物降解性；(4)制备简便，成本低。迄今为止，多孔碳酸钙纳米或微粒子的合成方法已有很多，包括模板法、乳液液膜法、共沉淀法、溶剂/水热法、凝胶结晶法、盐析法等。在这些方法中，模板法是常用的一种。其主要原理是在所选择的模板剂表面包覆一层碳酸钙，形成核-壳结构，然后通过溶剂溶解、高温煅烧或化学反应等方法去除模板，使颗粒形成中空结构。目前已使用的模板有:聚乙二醇(peg)、二氧化碳(co2)、十二烷基磺酸钠(sds)、聚苯乙烯磺酸钠(pss)、聚丙烯酰胺(pam)、可溶性淀粉和莲藕等。模板的形状和大小对药物载体的结构和大小有重要影响。模板法简单，不需要特殊溶剂，制备条件温和。然而，利用上述模板制备的caco3结构可控性差，得到的空穴太小，一些分子量较大的蛋白质药物很难进入多孔caco3中。因此，寻求创新模板获得孔洞较大的空心微球具有重要意义，可以进一步扩大caco3材料在药物载体方面的应用范围。

技术实现要素：

本发明提供成本低，制备工艺简单，不需要化学致孔剂的一种多孔中空碳酸钙载药微球的制备方法。

本发明在温和可控的条件下，通过安全简单的方法利用酵母菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌细胞作为生物模板，利用逐层自组装技术(lbl)在细胞表面封装4-6层的（pdda/pss）膜，与钙结合后，通过沉淀法制备[细胞@(ppda/pss)n]@caco3混合微球，在高温烧结除去细胞模板获得多孔中空的碳酸钙微球。

本发明所述的多孔中空碳酸钙载药微球的制备方法，步骤如下：

（1）微生物细胞（酵母菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）的培养：将菌种加入5ml液体培养基，放入设置为180rpm温度37℃的恒温摇床中培养16h，待菌长到10⁶cfu/ml浓度后3000rpm离心5min，去掉上清液，取沉淀后放置于0.9%nacl溶液中重悬备用；

（2）菌种表面层层自组装涂层制备：在上述菌液中加入20ml浓度为1.0g/ml聚二烯二甲基氯化铵溶液（pdda）溶液，在37℃的恒温摇床中180rpm摇15min，之后6000rpm离心5min，然后去掉上清液后，加入20ml浓度为1.0g/ml聚（苯乙烯磺酸）pss溶液，摇匀打散后，在37℃的恒温摇床中180rpm摇15min，之后6000rpm离心5min，重复此步骤4-6次。

（3）钙盐预处理：上述处理后的菌种细胞转入烧杯中，加入100ml浓度为0.33mca²⁺溶液，置于水浴锅磁力37℃搅拌2小时，充分混匀。

（4）碳酸钙外壳制备：在上述溶液中逐滴加入150ml浓度为0.33m的co3^2-溶液，加完后磁力搅拌16h。用纯水反复清洗，之后干燥研磨。如此便得到菌种细胞表面的纳米碳酸钙外壳。

（5）多孔中空碳酸钙微球制备：将上述纳米碳酸钙外壳颗粒放入管式炉中，于500℃中烧结4小时，以去除内层中的菌种细胞，得到中空多孔的碳酸钙微球。

步骤（1）所述的酵母菌细胞为啤酒酵母菌，其培养基主要成分为胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，葡萄糖10g，然后溶于1000ml去离子水中，用灭菌锅115℃灭菌半小时，冷却后放入4℃冰箱备用；所述的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养基主要成分是胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl8g，然后1000ml去离子水中，用灭菌锅121℃灭菌半小时，冷却后放入4℃冰箱备用。

步骤（2）所述pdda重均分子量为100000，pss重均分子量为70000。

步骤（3）所述的ca²⁺合适浓度为0.33m，可溶性钙盐均可，不限于cacl2，ca(no3)2。

步骤（4）所述的co3^2-合适浓度为0.33m，可溶性碳酸盐均可（例如na2co3,(nh4)2co3等）。

通过以上制备方法所述的工艺步骤，制得的多孔中空碳酸钙微球呈球形，形貌规整，平均粒径为3μm。

本发明先是培养出合适浓度的菌细胞（10⁶cfu/ml），然后通过层层组装技术将pdda和pss交替沉积到细胞表面，增大了细胞表面的电荷，增加了钙离子结合位点，然后与钙离子共同作用后，加入碳酸根粒子经过共沉淀制得细胞聚电解质碳酸钙复合粒子，然后在管式炉中烧结去除细胞以及聚合物得到多孔中空碳酸钙微球。

本发明在温和、稳定的条件下，以酵母菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌细胞为模板得到了具有较高载药能力、ph敏感性以及可降解性的具有较好生物相容性的碳酸钙载药微球，成本低，制备工艺简单，可实现安全、高效、大规模生产。本发明为制备多孔中空的无机载药材料提供了一种新思路，在药物载体方面具有广泛的应用价值。

以下结合由附图所示实施例的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。

附图说明

图1是细胞以及烧结的碳酸钙微球sem图；不同烧结温度下caco3微球的电镜图。未烧结的caco3细胞微球,a）未烧结的caco3细胞微球；

图2是600℃烧结的caco3微球的电镜图。

图3是700℃烧结的caco3微球的电镜图。

图4是750℃烧结的caco3微球的电镜图。

图5是800℃烧结的caco3微球的电镜图。

图6是900℃烧结的caco3微球的电镜图。

图7是碳酸钙微球xrd图；其中：a）烧结caco3微球；b）未烧结caco3微球；c）caco3粉末的xrd图。

图8是碳酸钙微球载阿霉素后缓释曲线；阿霉素在不同环境下的累积释放曲线（a）ph=4.8,（b）ph=7。

图9是碳酸钙微球的降解性能。a）-e）在ph=4.8pbs环境中降解不同时间的caco3-hnps的扫描电镜观察；f）-j）在ph=7pbs环境。

具体实施方式

实施例1

将酵母菌加入5ml液体培养基，放入设置为180rpm温度37℃的恒温摇床中培养16h，待菌长到10⁶cfu/ml浓度后3000rpm离心5min，去掉上清液，取沉淀后放置于0.9%nacl溶液中重悬备用；在上述菌液中加入20ml浓度为1.0g/ml聚二烯二甲基氯化铵溶液（pdda）溶液，在37℃的恒温摇床中180rpm摇15min，之后6000rpm离心5min，然后去掉上清液后，加入20ml浓度为1.0g/ml聚苯乙烯磺酸溶液，摇匀打散后，在37℃的恒温摇床中180rpm摇15min，之后6000rpm离心5min，重复此步骤4次。上述处理后的菌种细胞转入烧杯中，加入100ml浓度为0.33mca²⁺溶液，置于水浴锅磁力37℃搅拌2小时，充分混匀。在上述溶液中逐滴加入150ml浓度为0.33m的co3^2-溶液，加完后磁力搅拌16h。用纯水反复清洗，之后干燥研磨。如此便得到菌种细胞表面的纳米碳酸钙外壳。将上述纳米碳酸钙外壳颗粒放入管式炉中，于500℃中烧结4小时，以去除内层中的菌种细胞，得到中空多孔的碳酸钙微球，用sem观察微球表面形貌（如附图1）。然后通过x射线衍射仪对微球做晶型测试，得到其xrd图（附图2）；取dox溶液10ml，再向其中加入5mgcaco3微球，室温下100rpm震荡24h，之后离心取适量的上清液，用酶标仪在490nm处测试其吸光度，带入标准曲线中，差值计算载药量，每个样品设置三组平行样。称取1mg装载dox的caco3微球浸入到5mlpbs溶液中（ph=4.8或7），室温下60rpm震荡，间隔一定的时间取0.2ml溶液出来用酶标仪在490nm下测吸光度，同时补充相同量的新鲜的pbs溶液进去。用origin软件统计药物累积释放量。每个样品设置三组平行样(附图3)。称取相同质量的中空caco3微球（0.2g）放入盛有5mlpbs溶液（ph=4.8或7）的离心管中，在设置温度为37℃的恒温振荡器中以60rpm的速度持续振荡。每隔一星期取出一个样品离心之后干燥，称取重量并与原始的0.2g相比较得到这一时间段内微球的降解情况，实验时常持续7周，然后干燥后做sem，得到其sem图（附图4）。

实施例2

将上述所酵母菌加入5ml液体培养基，放入设置为180rpm温度37℃的恒温摇床中培养16，待菌长到10⁶cfu/ml浓度后3000rpm离心5min，去掉上清液，取沉淀后放置于0.9%nacl溶液中重悬备用；在上述菌液中加入20ml浓度为2.0g/ml聚二烯二甲基氯化铵溶液（pdda）溶液，在37℃的恒温摇床中180rpm摇15min，之后6000rpm离心5min，然后去掉上清液后，加入20ml浓度为2.0g/ml聚苯乙烯磺酸pss溶液，摇匀打散后，在37℃的恒温摇床中180rpm摇15min，之后6000rpm离心5min，重复此步骤4-6次。上述处理后的菌种细胞转入烧杯中，加入100ml浓度为0.5mca²⁺溶液，置于水浴锅磁力37℃搅拌2小时，充分混匀。在上述溶液中逐滴加入150ml浓度为0.5m的co3^2-溶液，加完后磁力搅拌16h。用纯水反复清洗，之后干燥研磨。如此便得到菌种细胞表面的纳米碳酸钙外壳。将上述纳米碳酸钙外壳颗粒放入管式炉中，于550℃中烧结4小时，以去除内层中的菌种细胞，得到中空多孔的碳酸钙微球，用sem观察微球表面形貌。然后通过x射线衍射仪对微球做晶型测试，得到其xrd图；取dox溶液10ml，再向其中加入5mgcaco3微球，室温下100rpm震荡24h，之后离心取适量的上清液，用酶标仪在490nm处测试其吸光度，带入标准曲线中，差值计算载药量，每个样品设置三组平行样。称取1mg装载dox的caco3微球浸入到5mlpbs溶液中（ph=4.8或7），室温下60rpm震荡，间隔一定的时间取0.2ml溶液出来用酶标仪在490nm下测吸光度，同时补充相同量的新鲜的pbs溶液进去。用origin软件统计药物累积释放量。每个样品设置三组平行样。称取相同质量的中空caco3微球（0.2g）放入盛有5mlpbs溶液（ph=4.8或7）的离心管中，在设置温度为37℃的恒温振荡器中以60rpm的速度持续振荡。每隔一星期取出一个样品离心之后干燥，称取重量并与原始的0.2g相比较得到这一时间段内微球的降解情况，实验时常持续7周，然后干燥后做sem，得到其sem图。

实施例3

将上述所大肠杆菌加入5ml液体培养基，放入设置为180rpm温度37℃的恒温摇床中培养16h，待菌长到10⁶cfu/ml浓度后3000rpm离心5min，去掉上清液，取沉淀后放置于0.9%nacl溶液中重悬备用；在上述菌液中加入20ml浓度为1.0g/ml聚二烯二甲基氯化铵溶液（pdda）溶液，在37℃的恒温摇床中180rpm摇15min，之后6000rpm离心5min，然后去掉上清液后，加入20ml浓度为1.0g/ml聚苯乙烯磺酸pss溶液，摇匀打散后，在37℃的恒温摇床中180rpm摇15min，之后6000rpm离心5min，重复此步骤4-6次。上述处理后的菌种细胞转入烧杯中，加入100ml浓度为0.33mca²⁺溶液，置于水浴锅磁力37℃搅拌2小时，充分混匀。在上述溶液中逐滴加入150ml浓度为0.33m的co3^2-溶液，加完后磁力搅拌16h。用纯水反复清洗，之后干燥研磨。如此便得到菌种细胞表面的纳米碳酸钙外壳。将上述纳米碳酸钙外壳颗粒放入管式炉中，于500℃中烧结4小时，以去除内层中的菌种细胞，得到中空多孔的碳酸钙微球，用sem观察微球表面形貌。然后通过x射线衍射仪对微球做晶型测试，得到其xrd图；取dox溶液10ml，再向其中加入5mgcaco3微球，室温下100rpm震荡24h，之后离心取适量的上清液，用酶标仪在490nm处测试其吸光度，带入标准曲线中，差值计算载药量，每个样品设置三组平行样。称取1mg装载dox的caco3微球浸入到5mlpbs溶液中（ph=4.8或7），室温下60rpm震荡，间隔一定的时间取0.2ml溶液出来用酶标仪在490nm下测吸光度，同时补充相同量的新鲜的pbs溶液进去。用origin软件统计药物累积释放量。每个样品设置三组平行样。称取相同质量的中空caco3微球（0.2g）放入盛有5mlpbs溶液（ph=4.8或7）的离心管中，在设置温度为37℃的恒温振荡器中以60rpm的速度持续振荡。每隔一星期取出一个样品离心之后干燥，称取重量并与原始的0.2g相比较得到这一时间段内微球的降解情况，实验时常持续7周，然后干燥后做sem，得到其sem图。

实施例4

将上述所金黄色葡萄球菌加入5ml液体培养基，放入设置为180rpm温度37℃的恒温摇床中培养16h，待菌长到10⁶cfu/ml浓度后3000rpm离心5min，去掉上清液，取沉淀后放置于0.9%nacl溶液中重悬备用；在上述菌液中加入20ml浓度为1.0g/ml聚二烯二甲基氯化铵溶液（pdda）溶液，在37℃的恒温摇床中180rpm摇15min，之后6000rpm离心5min，然后去掉上清液后，加入20ml浓度为1.0g/ml聚苯乙烯磺酸溶液，摇匀打散后，在37℃的恒温摇床中180rpm摇15min，之后6000rpm离心5min，重复此步骤4-6次。上述处理后的菌种细胞转入烧杯中，加入100ml浓度为0.33mca²⁺溶液，置于水浴锅磁力37℃搅拌2小时，充分混匀。在上述溶液中逐滴加入150ml浓度为0.33m的co3^2-溶液，加完后磁力搅拌16h。用纯水反复清洗，之后干燥研磨。如此便得到菌种细胞表面的纳米碳酸钙外壳。将上述纳米碳酸钙外壳颗粒放入管式炉中，于500℃中烧结4小时，以去除内层中的菌种细胞，得到中空多孔的碳酸钙微球，用sem观察微球表面形貌。然后通过x射线衍射仪对微球做晶型测试，得到其xrd图；取dox溶液10ml，再向其中加入5mgcaco3微球，室温下100rpm震荡24h，之后离心取适量的上清液，用酶标仪在490nm处测试其吸光度，带入标准曲线中，差值计算载药量，每个样品设置三组平行样。称取1mg装载dox的caco3微球浸入到5mlpbs溶液中（ph=4.8或7），室温下60rpm震荡，间隔一定的时间取0.2ml溶液出来用酶标仪在490nm下测吸光度，同时补充相同量的新鲜的pbs溶液进去。用origin软件统计药物累积释放量。每个样品设置三组平行样。称取相同质量的中空caco3微球（0.2g）放入盛有5mlpbs溶液（ph=4.8或7）的离心管中，在设置温度为37℃的恒温振荡器中以60rpm的速度持续振荡。每隔一星期取出一个样品离心之后干燥，称取重量并与原始的0.2g相比较得到这一时间段内微球的降解情况，实验时常持续7周，然后干燥后做sem，得到其sem图。