一种杀虫促生的粪便堆酵沤解剂及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种杀虫促生的粪便堆酵沤解剂及其应用。

背景技术：

蛔虫是人类最常见的寄生虫，感染发病率可达70％以上，尤其是在儿童中的发病率相对较高。蛔虫卵如被吞食，卵壳被消化，幼虫在肠内逸出，容易引起不同程度的感染，主要症状发热、食欲不振、善饥、脐周阵痛等症状，有时还可引起更严重的并发症。在粪便肥料化的过程中，蛔虫卵若不有效清除，蛔虫就会在土壤与植物根部孵化，造成病虫害，甚至进入植物果实，进而危急人类食品卫生安全。因此，粪便无公害化处理中，蛔虫卵死亡率是最重要的卫生指标，直接影响畜禽粪便的处理是否合规的评判。目前，畜禽粪便无害处理需遵循国标gbt36195-2018畜禽粪便无害化处理技术规范，要求蛔虫卵死亡率必须＞95％。

目前粪便中蛔虫卵的处理方法中，理化手段较为昂贵，无法大规模处理养殖场粪便。生物方法，简单环保，可通过微生物的生命活动，产生大量热量，提升体系温度，多可维持55℃、15d以上，从而使蛔虫在高温中死亡，达到粪便无害化处理技术标准。此外，在微生物发酵过程中，作为底物的粪便有机物，如蛋白、脂肪、淀粉、纤维等，也会被微生物产生的各种酶类降解，从而形成氨基酸、小分子碳水化合物等易于被植物吸收利用或者植物根部发挥促生作用的生长刺激物质，从而达到一定的促生长效果。生物杀虫法具有简单方便，低成本高效率，综合效益高等特点。

然后，多数粪便生物处理剂均为好氧条件下应用，在发酵2～3d后，需要翻抛，增加系统氧气量，有的对外界环境温度有要求，多为25℃～28℃以上，否则很多菌剂因子低温下无法生长而无法启动发酵过程，这也导致很多粪便处理剂中冬天就失效了。因此，需要研究一种适合粪便处理的、且综合利用好氧菌与厌氧菌的微生物菌剂十分重要。

技术实现要素：

本发明提供了一种杀虫促生的粪便堆酵沤解剂及其应用。所述粪便堆酵沤解剂在沤解粪便时，历经低温启动、腐熟高温维持、腐熟中温维持与后熟过程，最终实现有效的杀灭蛔虫卵，增加游离氨基酸总量，促进物料腐殖化的作用。

实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：

本发明提供了一种杀虫促生的粪便堆酵沤解剂，所述粪便堆酵沤解剂包括低温堆酵启动剂和高温沤解杀虫剂；所述低温堆酵启动剂包括丝状芽孢杆菌菌粉、植物内芽孢杆菌菌粉和载体x；所述高温沤解杀虫剂包括枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌粉、丁酸梭菌菌粉和载体y。

进一步的，所述丝状芽孢杆菌菌粉、植物内芽孢杆菌菌粉和载体x的质量比为1∶1∶20。

进一步的，所述枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌粉、丁酸梭菌和和载体y的质量比为1∶1∶15。

进一步的，所述丝状芽孢杆菌菌粉采用保藏编号为cgmccno.20918的丝状芽孢杆菌gbw-f006经发酵干燥得到，其菌含量为50～55×10⁸cfu/g；所述植物内芽孢杆菌菌粉采用保藏编号为cgmccno.20919的植物内芽孢杆菌gbw-f008经发酵干燥得到，其菌含量为45～50×10⁸cfu/g。

进一步的，所述枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌粉采用保藏编号为cgmccno.19824的枯草芽孢杆菌s2经发酵干燥得到，其菌含量为150～160×10⁸cfu/g；所述丁酸梭菌菌粉采用保藏编号为cgmccno.14499的丁酸梭菌gbw-n1经发酵干燥得到，其菌含量为40～50×10⁸cfu/g。

进一步的，所述载体x包括草木灰、腐植酸和沸石粉中的至少一种；所述载体y包括硅藻土、蛭石和风化煤中的至少一种。

本发明还提供了所述的粪便堆酵沤解剂在用于制备促进植物生长的微生物堆酵剂中的应用。

进一步的，所述粪便堆酵沤解剂的使用方法为：将所述低温堆酵启动剂接种到粪便和配合料中，发酵2.5-4d后再接种所述高温沤解杀虫剂，持续发酵3-4d后，70℃以上高温持续发酵3-5d，55℃以上高温持续发酵8-10d，后熟发酵6-7d后烘干至水分为27％～29％，粉碎分装后，直接混合到植物种植土壤中。

进一步的，所述粪便包括鸡粪、猪粪、牛粪。

进一步的，所述配合料的用量为粪便质量的30％～40％。

进一步的，所述粪便堆酵沤解剂的使用总接种量为0.20～0.50％。

最优的，所述粪便堆酵沤解剂的使用总接种量为0.30～0.40％。

进一步的，所述低温堆酵启动剂和高温沤解杀虫剂的接种量比例为1∶1～3∶5。

进一步的，所述低温堆酵启动剂的接种量为0.10％～0.25％，所述高温沤解杀虫剂的接种量为0.10％～0.25％。

最优的，所述低温堆酵启动剂的接种量为0.15％～0.20％，所述高温沤解杀虫剂的接种量为0.15％～0.20％。

进一步的，所述粪便堆酵沤解剂能够提高粪便堆沤温度，蛔虫卵死亡率、游离氨基酸总量。

进一步的，所述粪便堆酵沤解剂能够能够提高植物的产量和果实直径。

进一步的，所述植物包括黄瓜和樱桃。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：

1、本发明所述的杀虫促生的粪便堆酵沤解剂，综合应用了多种芽孢杆菌，具有多菌复合效应。

2、本发明所述发酵剂a包低温堆酵启动剂，包括耐受低温实现快速启动的丝状芽孢杆菌gbw-f006、产生木聚糖酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、磷酸酶等多种酶类的植物内芽孢杆菌gbw-f008，可使得体系不断降解底物，释放小分子糖、氨基酸、速效磷、速效钾等养分，为发酵剂中各种菌的繁殖提供养分，最终成为优势。

3、本发明所述发酵b为高温沤解杀虫剂，包括枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2和丁酸梭菌gbw-n1，枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2具有较强的产酶与抑菌特性，能在有机物料中迅速生长发酵，好氧反应生成大量热能，快速促进体系升温至71～76℃，而丁酸梭菌gbw-n1则因体系氧气逐渐稀薄而生长，产生丁酸为代表的大量有机酸，这些有激酸对于植物生长、植物果实果酸形成、土壤中某些结合态矿物元素的释放等，都有重要作用。

4、本发明所述的复合菌剂制备方法简单、合理，无需翻抛，使用方便，具有良好的工业化实施前景。

附图说明

图1：丝状芽孢杆菌gbw-f006的菌落、镜检菌体与芽孢；

图2：植物内芽孢杆菌gbw-f008的菌落、镜检菌体与芽孢；

图3：枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2的菌落、镜检菌体与芽孢；

图4：丁酸梭菌gbw-n1的菌落、镜检菌体与芽孢；

图5：粪便堆酵沤解剂两种接种发酵剂包对粪便的分步堆酵沤解流程图；

图6：不同粪便堆酵沤解剂用量对鸡粪粪便堆沤温度的影响；

图7：不同粪便堆酵沤解剂用量对鸡粪蛔虫卵死亡率的影响；

图：8：不同粪便堆酵沤解剂用量对鸡粪游离氨基酸总量的影响；

图9：灭活与活性粪便堆酵沤解剂对猪粪粪便堆沤温度的影响；

图10：灭活与活性粪便堆酵沤解剂对猪粪蛔虫卵死亡率的影响；

图11：灭活与活性粪便堆酵沤解剂对猪粪游离氨基酸总量的影响。

具体实施方式

结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。

实施例1

一、丝状芽孢杆菌gbw-f006的分离筛选与鉴定

1、丝状芽孢杆菌gbw-f006的分离与筛选

从河北沧州、邯郸、河南濮阳、安阳、山东青岛、海阳、青州、寿光的多地多年生蔬菜大棚内取作物根际土，于医学检验样品袋内4℃冷藏保存，并及时分离，涉及包含辣椒、西葫芦、花菜、甜瓜、番茄、黄瓜等56种作物。取土壤样品2g，放入18ml无菌水中，于30℃、200rpm/min震荡提取30min，样液于75℃水浴20min，然后进行梯度稀释，取各个梯度稀释液100μl在na平板上进行涂布，将涂布好的平板37℃倒置培养48h，用灭菌竹签挑去不同形态的单菌落，转接于na斜面上，37℃培养48h后镜检确定产芽孢，并将菌株于4℃保藏备用。

将低温驯化后获得的67株菌分别接种至改良营养肉汤(nb)培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，(nh4)2so42g，feso4·7h2o0.03g，mgso4·7h2o0.05g，ph7.2-7.4，蒸馏水1l)中，于15℃、200rpm/min震荡培养24h，在od600nm测定培养液吸光值。67株菌中，有60株在15℃下培养24h，od600nm的吸光值＜1.0，仅有7株菌在15℃下培养24h，od600nm的吸光值＞1.0，其中，菌株gbw-f006的15℃培养液od值最高，说明该菌具有很好的耐低温特性，该菌株分离自寿光上口镇李家南邵村李先洲家11年甜瓜根际土。

所述菌株gbw-f006在na培养基上的菌落、镜检菌体与芽孢如图1所示。gbw-f006在na培养基上的菌落如图1a，为乳白色，圆形，直径2-6mm，表面光滑无皱褶，不透明，边缘整齐，无晕环；gbw-f006在24h的10*100倍油镜镜检结果如图1b，菌体呈g⁺，为圆柱状，芽孢端生呈椭圆形，直径1-2μm。

2、丝状芽孢杆菌gbw-f006的16srrna序列测定

以所述菌株gbw-f006的dna为模板，使用16srdna通用引物进行扩增，扩增片段进行序列测定，将得到的菌株gbw-f006的16srdna测序结果与ncbigenbank中的序列进行blast比对分析，结果显示菌株gbw-f006与bacillusfilamentosus同源相似性为99.72％，因此确定该菌株为丝状芽孢杆菌。

3、丝状芽孢杆菌gbw-f006的菌种保藏

将筛选到的菌株gbw-f006进行菌种保藏，所述丝状芽孢杆菌gbw-f006的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年10月20日；丝状芽孢杆菌bacillusfilamentosus的保藏编号为：cgmccno.20918。

4、丝状芽孢杆菌gbw-f006的菌株特性

丝状芽孢杆菌gbw-f006在15℃～45℃温度范围内能生长繁殖，但其最适合生长温度在25℃～37℃，该菌最高可耐受9％nacl，该菌接触酶与氧化酶反应均为阳性，可水解脲酶，分解酪素，可利用柠檬酸盐。gbw-f006还可利用木糖、蔗糖、菊粉、葡萄糖、山梨醇、水杨苷、d-海藻糖、l-鼠李糖、l-阿拉伯糖等多种碳水化合物产酸，还可产α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、l-脯氨酸芳胺酶等。丝状芽孢杆菌gbw～f006分离自甜瓜根际土，在土中前3d内可持续萌发并略微增殖，经实验验证，其还可抑制好氧霍乱弧菌、厌氧产气荚膜梭菌与木贼镰刀菌、层出镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、白地霉和麦根腐平脐蠕孢等多种病原真菌，其中对木贼镰刀菌的抑制率高达92.9％。

二、植物内芽孢杆菌gbw-f008的分离筛选与鉴定

1、植物内芽孢杆菌gbw-f008的分离与筛选

从河北廊坊、山东济南、泰安、莱阳、淄博、聊城、寿光的多地多年生蔬菜大棚内取作物根部，装于医学检验样品袋内，4℃冷藏保存并及时分离，涉及丝瓜、甜瓜、尖椒、五彩椒、番茄、黄瓜等56种作物根部样本。取样品2g，放入18ml无菌水中，于30℃、200rpm/min震荡提取30min，样液于75℃水浴20min，然后进行梯度稀释，取各个梯度稀释液100μl在na平板上进行涂布，将涂布好的平板37℃倒置培养48h，用灭菌竹签挑去不同形态的单菌落，转接于na斜面上，37℃培养48h后镜检确定产芽孢，筛选到72株芽孢菌，并将菌株于4℃保藏备用。

灭菌的48孔培养板内每孔装有1ml含有色氨酸try诱导剂的改良lb培养基，灭菌后冷却，然后将所筛选到的72株芽孢菌分别接种于48孔板内，37℃200rpm/min震荡培养24h，经8000rpm离心5min，取无菌上清液200μl转移至96孔板内，按照salkowski比色法原理，芽孢菌发酵液在色氨酸诱导下会产生吲哚乙酸iaa，iaa与salkowski显色剂发生反应，产生红色，颜色越深说明iaa含量越高。筛选了72株芽孢菌，产iaa能力定性比较后显示菌株gbw-f008的红色反应最深，说明菌株gbw-f008产iaa能力在72株菌中最强，该菌株来源于泰安市高新区房村镇朱家庄村11年番茄棚，分离自番茄根部。

所述菌株gbw-f008在na培养基上的菌落、镜检菌体与芽孢如图2所示，gbw-f008在na培养基上的菌落如图2a，为白色，不透明，圆形，边缘整齐，表面湿润光泽，直径1-5mm；gbw-f008在24h的10×100倍油镜镜检结果如图2b，镜检菌体呈g+，菌体为圆柱状，直径2-3μm，芽孢近端生呈长椭圆形，周生鞭毛。

2、植物内芽孢杆菌gbw-f008的分子鉴定

以所述菌株gbw-f008的dna为模板，使用16srdna通用引物进行扩增后并测定其序列，将得到的菌株gbw-f008的16srdna测序结果与genbank中的序列进行blast比对分析，结果显示菌株gbw-f008与bacillusendophyticus的同源性最高，因此确定菌株gbw-f008为植物内芽孢杆菌。

3、植物内芽孢杆菌gbw-f008的菌种保藏

将筛选到的菌株gbw-f008进行菌种保藏，所述植物内芽孢杆菌gbw-f008的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年10月20日；植物内芽孢杆菌bacillusendophyticus的保藏编号为：cgmccno.20919。

4、植物内芽孢杆菌gbw-f008的菌株特性

植物内芽孢杆菌gbw-f008在20℃～42℃温度范围内能够生长繁殖，但其最适合生长温度在37℃，在ph4.5～9.6的改良nb培养基内均能正常生长，最适生长ph范围为6.5～7.5，该菌最高可耐受10％nacl，可产生脲酶，接触酶与氧化酶反应均为阳性，可利用柠檬酸盐；gbw-f008还可利用木糖、菊粉、葡萄糖、d-核糖、环糊精、古老糖、d-海藻糖等多种碳水化合物产酸，还可产α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、亮氨酸芳胺酶等。所述植物内芽孢杆菌gbw-f008可产淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶等多种酶类，木聚糖酶水解比值达3.97，且具有解磷解钾等能力，解有机磷比值高达2.31。

三、枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2的分离筛选与鉴定

1、枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2的分离筛选与纯化

取青岛胶州地区水产养殖土塘污泥各10g，于90ml无菌水中，30℃，150r/min摇床震荡30min，取土壤悬液按5％接种到盛有基本培养基的锥形瓶中，30℃，150rpm恒温摇床培养24h。挑取一环发酵液，在tsa培养基表面划线分离，于30℃恒温培养箱中倒置培养，如此反复多次，直至分离出单菌落。

将纯化后的单一菌株分别接种到装有100ml种子培养基(蛋白胨5g，酵母粉1g，k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，可溶性淀粉5g，蒸馏水1l，ph7.4～7.6)的250ml三角瓶中，30℃，150r/min恒温摇床培养24h，对所得培养液进行絮凝活性的测定。

所述絮凝活性的测定方法为：在100ml比色管中加入高岭土0.5g，80ml蒸馏水，2ml10g/l的cacl2和2ml的培养液，然后加蒸馏水至100ml刻度线，分别快速摇10次，静止30s后，慢摇20次，静置5min后，取上清液于分光光度计550nm处测定吸光度。设置空白对照，对照组为不加培养液的高岭土悬液，以确定培养液的絮凝程度。絮凝率e(％)＝[(a-b)/a]×100％，式中，a为对照上清液550nm处吸光度；b为样品上清液550nm处吸光度。不同菌株培养液絮凝对比后，取絮凝效果最好的菌株，其絮凝率可达71.1％，命名为s2。

菌株s2在tsa培养基上36℃培养16h，其菌落如图3a所示，菌落呈浅黄色，圆形，表面干燥，半透明，边缘不整齐呈不规则放射状，直径2.5-3.5mm，菌体如图3b所示，呈杆状，0.6-1.0μm×1.3-3.3μm，单个或成对排列，芽胞柱形，中生，胞囊不膨大，为革兰氏阳性菌。

2、枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2的16srrna序列测定

以所述菌株s2的dna为模板，16srrna通用引物进行扩增，扩增片段进行序列测定。菌株s2的16srdna测序结果与genbank中的序列进行比对分析，结果显示，菌株s2与bacillussubtilissubsp.inaquosorum的同源性最高，因此确定该菌株s2为枯草芽孢杆菌，且经过更进一步的鉴定，该菌为枯草芽孢杆菌沙漠亚种。

3、枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2的菌种保藏

将筛选到的枯草芽孢杆菌s2进行菌种保藏，所述枯草芽孢杆菌s2的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年05月15日；枯草芽孢杆菌bacillussubtilis的保藏编号为：cgmccno.19824。

4、枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2的的菌株特性

枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2具有广盐性，在0～50‰盐度范围内均能生长，最适生长盐度为0～20‰；在10～40℃温度范围都能正常生长，最适生长温度为20～30℃；枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2的β-木糖苷酶、苯丙氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、丙氨酸芳胺酶、亮氨酸芳胺酶、l-吡咯烷酮芳胺酶、β-n-乙酰氨基葡糖苷酶等反应均为阳性，可利用d-葡萄糖、d-甘露糖、菊粉、红四氮唑、环糊精、糖原、麦芽三糖、d-核糖、d-甘露醇、d-海藻糖、古老糖、肌醇等，水解七叶苷，且能在6.5％氯化钠中生长。枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2具有高产吲哚乙酸和很好的絮凝的能力，能够有效抑制弧菌以及裸藻门和甲藻门藻细胞数量，增加绿藻门和硅藻门藻细胞数量，并能有效去除水体弧菌以及抑制哈维氏弧菌和美人鱼发光杆菌。

四、丁酸梭菌gbw-gbw-n1的筛选、分离与鉴定

1、丁酸梭菌gbw-gbw-n1的分离筛选与纯化

将采集样品培养的菌悬液，梯度稀释后涂布于胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂(tsc)培养基上，多次分离纯化后得到单菌落，命名为gbw-n1，保存。

所述菌株gbw-n1的在tsc固体培养基上培养24h的菌落图4所示，其菌落图如4a，圆形，黑色，表面光滑，中间略凸起，边缘不整齐；所述菌株gbw-gbw-n1在tsc液体培养基上培养48h的菌体图4b所示，菌体呈杆状，1.1-1.2μm×2.1-3.6μm，单个排列，革兰氏阳性，芽胞呈梭状，中生，胞囊膨大。

2、丁酸梭菌gbw-n1的分子鉴定

以所述的菌株gbw-n1的dna为模板，使用16srrna通用引物进行扩增，扩增片段进行序列测定，将得到的菌株gbw-n1的16srdna测序结果与genbank中的序列进行比对分析，结果显示，菌株gbw-gbw-n11与clostridiumbutyricum同源性最高，因此确定该菌株gbw-n1为丁酸梭菌。

3、丁酸梭菌gbw-n1的菌种保藏

将筛选到的菌株gbw-n1进行菌种保藏，所述丁酸梭菌gbw-n1的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年08月07日；丁酸梭菌clostridiumbutyricum的保藏编号为cgmccno.14499。

4、丁酸梭菌gbw-n1的菌株特性

丁酸梭菌gbw-n1在ph值6～8的范围内均能生长，而最适的生长ph值为7.1-7.5；在溶氧含量1～5mg/l范围内都能正常生长，而最适的生长溶解氧浓度在2-4mg/l；能够产生尿素酶、β-葡萄糖苷酶和甘油，能够降解或分解动力-硝酸盐、西蒙式枸橼酸盐和半固体琼脂；在30～45℃温度范围内均能正常生长繁殖，而最适的生长温度在35～38℃。丁酸梭菌gbw-n1为厌氧菌，可在厌氧环境中萌发增殖，并发挥产酶、产酸、抑菌等益生功能。

实施例2

1、杀虫促生的粪便堆酵沤解剂的制备方法

所述杀虫促生的粪便堆酵沤解剂包括低温堆酵启动剂(发酵剂a包)和高温沤解杀虫剂(发酵剂b包)。

(1)低温堆酵启动剂(发酵剂a包)中包括菌含量为50～55×10⁸cfu/g的丝状芽孢杆菌gbw-f006菌粉、菌含量为45～50×10⁸cfu/g的植物内芽孢杆菌gbw-f008菌粉和载体x，制备方法如下：

丝状芽孢杆菌gbw-f006菌粉的制备：丝状芽孢杆菌gbw-f006的活化菌株，接种至一级种子罐中，保持罐内温度维持在36℃～38℃，罐内压力0.05mpa，罐内转速170～180rpm/min，培养12h～16h至对数生长期后转接二级发酵罐。二级发酵罐内维持发酵温度介于35℃～37℃，罐内压力0.12mpa，罐内转速195～200rpm/min，培养46h～48h，当od600nm不再增加，且镜检确定芽孢率＞98％且孢子成熟度达95％以上，即可停罐，一般发酵菌量为350×10⁸cfu/ml～375×10⁸cfu/ml。将所述丝状芽孢杆菌gbw-f006二级发酵液添加5％玉米芯粉，经喷雾干燥获得菌粉，该丝状芽孢杆菌gbw-f006半成品菌粉菌量为1000×10⁸cfu/g～1100×10⁸cfu/g。

一级种子罐配方为：蛋白胨5～6g，酵母粉1～1.2g，k2hpo41～15g，mgso4·7h2o0.5～0.8g，可溶性淀粉5～6g，ph7.4～7.6，蒸馏水1l。二级发酵罐培养液配方为：玉米浆干粉1～1.5g，棉籽蛋白粉2～2.5g，蛋白胨0.8～1g，酵母膏0.5～0.8g，kh2po40.1～0.3g，mgso4·7h2o0.05～0.08g，mnso4·h2o0.03～0.05g中性蛋白酶5万u/g0.1～0.2g，ph7.3～7.5，蒸馏水1l。喷雾干燥采用lpg-6000型喷雾干燥塔，进风135℃～140℃，出风70℃～75℃。

植物内芽孢杆菌gbw-f008菌粉的制备：植物内芽孢杆菌gbw-f008的活化菌株，接种至一级种子罐中，保持罐内温度维持在35℃～37℃，罐内压力0.05mpa，罐内转速165～175rpm/min，培养13h～15h至对数生长期后转接二级发酵罐。二级发酵罐内维持发酵温度介于36℃～38℃，罐内压力0.13mpa，罐内转速180～190rpm/min，培养46h～48h，当od600nm不再增加，且镜检确定芽孢率＞98％且孢子成熟度达95％以上，即可停罐，一般发酵菌量为360×10⁸cfu/ml～370×10⁸cfu/ml。将所述丝状芽孢杆菌gbw-f006二级发酵液添加6％～8％轻质碳酸钙，经喷雾干燥获得菌粉，该植物内芽孢杆菌gbw-f008的半成品菌粉菌量为900×10⁸cfu/g～1000×10⁸cfu/g。

一级种子罐配方为：牛肉膏5～6g，胰蛋白胨10～12g，氯化钠5～6g，(nh4)2so42.5～3.5g，mnso4·h2o0.05～0.08g，mgso4·7h2o0.05～0.08g，ph7.4-7.6，馏水1l。二级发酵罐培养液配方为：玉米淀粉8～10g，豆饼粉2～3g，k2hpo42～3g，mgso4·7h2o0.5～0.8g，mnso4·h2o0.5～0.8g，caco30.1～0.3g，fecl3·6h2o5～6mg，ph7.0～7.5，蒸馏水1l。喷雾干燥采用lpg-6000型喷雾干燥塔，进风126℃～135℃，出风65℃～70℃。

丝状芽孢杆菌gbw-f006与植物内芽孢杆菌gbw-f008的半成品菌粉与载体x混合质量比为：丝状芽孢杆菌gbw-f006半成品菌粉：植物内芽孢杆菌gbw-f008半成品菌粉：载体x＝1∶1∶20，混合后即为低温堆酵启动剂。

载体x为草木灰、腐植酸、沸石粉中的一种或几种。

(2)高温沤解杀虫剂(发酵剂b包)中包括菌含量为150～160×10⁸cfu/g的枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2菌粉、菌含量为40～50×10⁸cfu/g的丁酸梭菌gbw-n1菌粉和载体y。

枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2菌粉的制备：枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2的活化菌株，接种至一级种子罐中，保持罐内温度维持在37.2℃～37.6℃，罐内压力0.06mpa，罐内转速200～210rpm/min，培养12h～14h至对数生长期后转接二级发酵罐。二级发酵罐内维持发酵温度介于36.5℃～37.5℃，罐内压力0.14mpa，罐内转速210～215rpm/min，培养32h～34h，当od600nm不再增加，且镜检确定芽孢率＞99％且孢子成熟度达98％以上，即可停罐，一般发酵菌量为420×10⁸cfu/ml～450×10⁸cfu/ml。将所述枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2的二级发酵液添加5％～8％的支链淀粉，经喷雾干燥获得菌粉，其半成品菌粉菌量为2250×10⁸cfu/g～2400×10⁸cfu/g。

一级种子罐配方为：棉籽蛋白粉6～8g，酵母膏2～3g，玉米粉1.5～2g，磷酸氢二钾2～2.5g，mgso4·7h2o0.5～0.8g，ph7.4～7.6，蒸馏水1l。二级发酵罐培养液配方为：花生粕粉2～3g，蛋白胨0.8～1.2g，酵母浸粉0.5～0.8g，kh2po40.8～1.2g，mgso4·7h2o0.8～1.2g，mnso4·h2o0.5～0.8g，风味蛋白酶10万u/g0.5～0.8g，ph7.6～7.8，蒸馏水1l。喷雾干燥采用lpg-6000型喷雾干燥塔，进风140℃～145℃，出风73℃～75℃。

丁酸梭菌gbw-n1菌粉的制备：丁酸梭菌gbw-n1的活化菌株，接种至一级种子罐中，保持罐内温度维持在37.5～38.2℃，罐内压力0.05mpa，罐内转速30～45rpm/min，培养16h～18h至对数生长期后转接二级发酵罐。二级发酵罐内维持发酵温度介于36.5℃～37.5℃，罐内压力0.08mpa，罐内转速50～55rpm/min，培养51h～55h，当od600nm不再增加，且镜检确定芽孢率＞95％且孢子成熟度达95％以上，即可停罐，一般发酵菌量为120×10⁸cfu/ml～125×10⁸cfu/ml。将所述枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2的二级发酵液添加5％～8％的支链淀粉，经喷雾干燥获得菌粉，其半成品菌粉菌量为600×10⁸cfu/g～750×10⁸cfu/g。

一级种子罐配方为：大豆胨5～6g，酵母粉5～6g，焦亚硫酸钠1～1.5g，柠檬酸铁铵0.5～1.5g/l，ph7.4～7.6，蒸馏水1l。二级发酵罐培养液配方为：豆粕粉2～2.5g，，磷酸氢二钠0.5～0.8g，磷酸氢二钾，0.25～0.35g，硫酸锰0.05～0.08g，ph7.6～7.8，蒸馏水1l。喷雾干燥采用lpg-6000型喷雾干燥塔，进风85℃～90℃，出风50℃～55℃。

将枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2与丁酸梭菌gbw-n1的半成品菌粉与载体y混合均匀，三者的质量比为：枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2半成品菌粉：丁酸梭菌gbw-n1半成品菌粉：载体y＝1∶1∶15，混合后即为高温沤解杀虫剂。

载体y为硅藻土、蛭石、风化煤中的一种或几种。

2、杀虫促生的粪便堆酵沤解剂的应用方案

粪便堆酵沤解剂两种发酵剂包对粪便的分步堆酵沤解流程如图5所示，具体应用方案步骤介绍如下：

1)粪便：包括鸡粪、猪粪、牛粪等常规养殖粪便；

2)混合碳源与基底指标调节：杂木屑：水分＜8％，ph＜7，c/n＞450∶1；麦秸：水分＜10％，ph＜6.9，c/n60～70∶1；稻壳：水分＜10％，ph＜6，c/n70～80∶1；蘑菇培养基废料：水分＜10％，ph＜6，c/n30～35∶1；蔬菜碎渣基本指标为水分＞70％，ph＜6，c/n＝8～15；发酵前1吨粪便添加30％～40％配合料，组成为杂木屑、麦秸、稻壳、蘑菇培养基废料的两种或两种以上，均匀分配；

3)接种发酵剂a包：a为低温堆酵启动剂，其中的丝状芽孢菌gbw-f006能在15℃低温生长，植物内芽孢杆菌gbw-f008能在20℃低温生长，两者可促进体系进入微生物发酵状态，持续消耗体系氧气，产生38atp以上热量，促进体系升温，而且丝状芽孢菌gbw-f006还能持续产生抑菌物质，促进体系内粪便大肠杆菌等病菌的减少，也逐步减少了蛔虫卵的可用营养，而植物内芽孢杆菌gbw-f008则通过产生的木聚糖酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、磷酸酶等，不断释放小分子糖、氨基酸、速效磷、速效钾等养分，为发酵剂中各种菌的繁殖提供养分，最终成为优势菌群，此过程耗时约2.5d。接种发酵剂a包的接种量为0.1％～0.25％。

4)体系变化：经过养分调配于低温启动，体系的水分降为30％～35％，ph＜6.8，c/n＝30～35∶1。

5)接种发酵剂b包：b为高温沤解杀虫剂，其中枯草芽孢杆菌沙漠亚种s2具有较强的产酶与抑菌特性，能在有机物料中迅速生长发酵，好氧反应生成大量热能，快速促进体系升温至71～76℃，而丁酸梭菌gbw-n1则因体系氧气逐渐稀薄而生长，产生丁酸为代表的大量有机酸，这些有激酸对于植物生长、植物果实果酸形成、土壤中某些结合态矿物元素的释放等，都有重要作用；此外，残存的丝状芽孢杆菌、植物内芽孢杆菌及接种发酵剂a包的大量代谢物，也将在促进养分释放、助力菌体增殖方面，持续发挥作用，进而促进体系持续升温和蛔虫卵的死亡。此过程从3d开始，持续至6d。接种发酵剂b包的接种量为0.1％～0.25％。

6)腐熟剂高温维持：发酵7d-10d，＞70℃以上高温持续维持，蛔虫卵死亡率＞95％；

7)腐熟剂中温维持：发酵11d-20d，＞55℃以上高温持续维持，蛔虫卵死亡率＞95％；

8)后熟：发酵21d-27d，逐渐进入腐质化过程，胡敏酸/富咖酸(ha/fa)比值逐渐趋于稳定；

9)烘干：发酵28d后，采用回转滚筒式干燥机进行烘干水分至27％～29％；

10)粉碎：粉碎过8目筛；

11)指标测定：测定发酵废弃物的水分、有机质、n、p、k、蛔虫卵死亡率、粪大肠杆菌数等；

12)养分调配：根据成品需要，调配养分，然后分装成品。

实施例3

试验采用寿光中慧营里某养鸡厂2020年5月～7月份产生的白羽肉鸡粪便。将试验鸡粪混合均匀，均分为6组，每组2吨，各做3个重复。为了考察所述杀虫促生的粪便堆酵沤解剂的接种量对粪便处理效果的影响，对各组的设计如下：

表1不同粪便堆酵沤解剂接种量(％，m/m)分组

堆酵沤解试验为期1月，重点考察接种量对粪便处理后的对粪便堆沤温度、蛔虫卵死亡率、游离氨基酸总量等指标的影响，并将各组的发酵后产品应用于黄瓜底肥施肥，比较等量同法施用后黄瓜苗出苗率、黄瓜亩产等指标。粪便堆沤温度统一测定酵堆最高处50cm以下5个不同点的平均温度；蛔虫卵死亡率参考gb/t19524.2-2004肥料中蛔虫卵死亡率的测定；游离氨基酸参考gb/t30987-2020植物中游离氨基酸的测定；植物应用效果参考nyt1536-2007微生物肥料田间试验技术规程及肥效评价指南。

图6～8分别显示了不同粪便堆酵沤解剂用量对鸡粪粪便堆沤温度、蛔虫卵死亡率、游离氨基酸总量等指标的影响。试验结果显示，发酵第12d，也就是经历了分步接种低温堆酵启动剂a包和高温沤解杀虫剂b包后，又经历了4d的腐熟高温维持，进入中温维持的第二天，ab合计接种量为0.20％～0.50％的a2b2、a3b3、a4b4、a5b5组，实现粪便堆沤温度71.5℃～74.3℃，蛔虫卵死亡率96.1％～97.3％，均＞95％，均能达到国标要求，而ab合计接种量为0.10％的a1b1组与不接种对照组，此时粪便堆沤温度最高为50.2℃与58.7℃，蛔虫卵死亡率分别为85.1％和72.8％，并未达到国标要求。在发酵第12d，ab合计接种量为0.30％～0.50％的a3b3、a4b4、a5b5组，实现游离氨基酸总量为4.55％～4.61％，均＞4.5％，而ab合计接种量为0.20％的a2b2，游离氨基酸总量为4.45％，ab合计接种量为0.10％的a1b1组与不接种对照组，游离氨基酸总量分别为3.85％～3.65％，较低。12d以后，游离氨基酸总量持续增高，尤其是28d时，ab合计接种量为0.30％～0.50％的a3b3、a4b4、a5b5组，游离氨基酸总量最高达7.24％～7.38％。

将不同粪便堆酵沤解剂用量下处理后的鸡粪，应用于黄瓜种植后的生产指标如表2所示，ab合计接种量为0.20％～0.50％的a2b2、a3b3、a4b4、a5b5组，黄瓜种子发芽率均＞93％，显著高于ab合计接种量为0～0.10％的ck与a1b1组。而针对黄瓜亩产指标，则a2b2组黄瓜产量显著低于后面三组(p＜0.05)，ab合计接种量为0.30％～0.50％的a3b3、a4b4、a5b5组，黄瓜亩产均＞15700kg/亩，显著高于其他组(p＜0.05)，尤其是相对于对照组，增产率达25.8％～28.1％。

表2不同粪便堆酵沤解剂接种量处理的鸡粪对黄瓜出苗率和亩产量的影响

上述试验结果显示，ab合计接种量为0.20％～0.50％下，堆酵沤解12d，粪便堆沤温度均高于71℃，蛔虫死亡率指标，即可达到国家标准，而游离氨基酸总量则随着蛋白等物质的持续降解而逐渐增加，在28d发酵处理结束时，ab合计接种量为0.30％～0.50％的三组游离氨基酸总量达到最高，且这三组在黄瓜应用试验上，可实现25.8％～28.1％的亩产增幅，经济效益显著高于其他组。从应用成本、经济效益等多方面考虑，a包低温堆酵启动剂与b包高温沤解杀虫剂的合计用量，建议为0.30％～0.40％，即0.15％～0.20％a与0.15％～0.20％b。

实施例4

试验采用临沂莒南某养猪场2020年8月～9月份产生的杜洛克猪粪便。将试验猪粪混合均匀，均分为5组，每组2吨，各做3个重复。为了考察所述杀虫促生的粪便堆酵沤解剂的活性组与灭活组对粪便处理效果的影响，对各组设计如下，其中，对照ck组不接种发酵剂；m组接种合计0.30％的灭活发酵剂；n组接种合计0.30％的活性发酵剂；i组接种合计0.30％的发酵剂，其中只有0.15％的低温堆酵启动剂有活性，而0.15％的高温沤解杀虫剂是灭活的；j组接种合计0.30％的发酵剂，其中只有0.15％的高温沤解杀虫剂有活性，而0.15％的低温堆酵启动剂是灭活的。

表3不同粪便堆酵沤解剂分组

堆酵沤解试验为期1月，重点考察接种量对粪便处理后的粪便堆沤温度、蛔虫卵死亡率、游离氨基酸总量等指标的影响，并将各组的发酵后产品应用于樱桃树结果前的底肥施肥，比较等量同法施用后樱桃亩产、樱桃果实直径等指标。粪便堆沤温度统一测定酵堆最高处50cm以下5个不同点的平均温度；蛔虫卵死亡率参考gb/t19524.2-2004肥料中蛔虫卵死亡率的测定。游离氨基酸参考gb/t30987-2020植物中游离氨基酸的测定。植物应用效果参考nyt1536-2007微生物肥料田间试验技术规程及肥效评价指南。

图9～11分别显示了灭活与活性粪便堆酵沤解剂对粪便堆沤温度、猪粪蛔虫卵死亡率、游离氨基酸总量等指标的影响。试验结果显示，发酵3d时，粪便堆沤温度即拉开差距，其中接种活性低温堆酵启动剂和活性高温沤解杀虫剂的活性n组，温度最高，达58.3℃，其次是仅接种活性低温堆酵启动剂的i组，3d温度为43.5℃，其他各组在3d时的温度介于29.8℃～38.6℃，在6～12d时，随着高温沤解杀虫剂的接种，发酵温度逐渐升高，且逐渐维持，其中活性n组的温度介于71℃～73℃，最高达76℃；而仅接种活性低温堆酵启动剂的i组，由于其高温沤解杀虫剂处于灭活状态，缺乏后续升温杀虫能力，6-12d的堆温仅为51.5℃～54℃；仅接种活性高温沤解杀虫剂的j组，由于缺乏初期的启动与养分分解提供，6-12d的堆温为61.6℃～63.5℃；对照与灭活m组，最高温度均低于51.5℃，并未达到55℃以上的高温维持要求。

各组的发酵第12d，也就是经历了分步接种活性的低温堆酵启动剂和高温沤解杀虫剂，经历了4d的腐熟高温维持，进入中温维持的第二天，活性n组的蛔虫卵死亡率＞95％，达到国标要求，而ck与灭活组的蛔虫卵死亡率分别为73.6％～75.1％，并未达到国标要求；仅接种活性低温堆酵启动剂的i组或仅接种活性高温沤解杀虫剂的j组，各指标虽强于灭活组，但蛔虫卵死亡率在12d时介于82.6％～86.4％，28d时介于85.1％～93.8％，仍未达到国标要求。

活性n组的游离氨基酸总量，也从6d起逐渐身高，发酵28d达到最高值0.79％，比对照组0.42％提升了88.1％，差异显著(p＜0.05)，而灭活m组的游离氨基酸总量仅比对照提升了2.3％，无显著差异(p＞0.05)。相对而言，仅接种活性低温堆酵启动剂的i组或仅接种活性高温沤解杀虫剂的j组，各指标虽强于灭活组，但游离氨基酸总量分别相对于对照提升了9.5％～33.3％，增幅显著低于活性n组(p＜0.05)。

上述的结果表明，只有同时接种活性低温堆酵启动剂与活性高温沤解杀虫剂，才能起到提高粪便堆沤温度，最终实现达标且较高的蛔虫卵死亡率，实现游离氨基酸总量的大幅提升，最终成为卫生达标、养分增值的合规粪便处理产品。

将不同粪便堆酵沤解剂用量下处理后猪粪，应用于樱桃树种植后的生产指标如表4。

表4灭活与活性粪便堆酵沤解剂处理的猪粪对樱桃产量与果实直径的影响

结果显示，灭菌m组、仅接种活性低温堆酵启动剂的i组或仅接种活性高温沤解杀虫剂的j组，三组处理猪粪样品的蛔虫卵死亡率并不达标，虽较对照组在因一定程度提升堆温，提高了游离氨基酸养分含量，对樱桃生产指标提升有一定正向结果，但因发酵剂成分部分失活，蛔虫卵死亡率并不达标，对农田环境与食品安全存在潜在威胁；活性n组处理的猪粪，杀虫效果显著，蛔虫卵死亡率组发酵第12d即可达国标要求，安全可靠，还可显著提升猪粪中游离氨基酸总量，最终在樱桃的种植试验中，对樱桃产量的增幅达18.6％，对樱桃果实直径提升幅度达15％，差异显著(p＜0.05)。

试验总结：具有生物活性的杀虫促生的粪便堆酵沤解剂处理粪便时，分步接种低温堆酵启动剂和高温沤解杀虫剂，两者合计接种量为0.30％～0.50％时，低温启动后再经历腐熟高温维持，在发酵12d，基本达到95％以上蛔虫卵死亡率，迅速实现杀虫效果达成卫生指标。此外，经过腐熟中温维持与后熟过程，游离氨基酸总量持续增加，物料进一步腐殖化，这些都有利于植物各种生命活动或刺激物质的合成，最终实现促进植物生长的目的。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。