专利名称：：作为昆虫防治剂的dsRNA的制作方法
技术领域：
：本发明涉;5Lfr昆虫物种中双链RNAUsRNA)介导基因沉默的领域。更具体地，本发明涉及设计用于表达对应于新靼基因的dsRNA的遗传构建体。这些构建体在RNAi介导的害虫防治中尤其有用。本发明还涉及用于防治昆虫的方法、用于防止昆虫4曼害的方法以及4吏用RNAi下调昆虫中基因表达的方法。
背景技术：
：昆虫及其它害虫可通过其叮咬或螫刺而导致损伤甚至死亡。而且，许多害虫传播导致疾病的细菌及其它病原体。例如，蚊子传播导致疟疾、黄热病、脑炎和另一些疾病的病原体。腺鼠疫(或黑死病)由感染大鼠和另一些啮齿动物的细菌所引起。用于防治微观害虫侵害的组合物已经以抗生素、抗病毒和抗真菌的组合物的形式41供。用于防治害虫(如线虫和昆虫)侵害的方法通常采用化学组合物的形式，将所述化学组合物应用于害虫停留的表面上，或者以丸剂、粉剂、片剂、糊剂或胶嚢剂的形式施用于被侵扰动物。重要农作物的昆虫害虫防治是非常重要的领域，例如破坏茄科植物的昆虫害虫，尤其是鞘翅目害虫的防治，所述茄科植物尤指马铃薯(^/fl朋附似6m训附)，以及番(5Wa/iw附(vco/;w'cm附)、痴子(5W"ww附附c/owge/ifl)、辣椒(iS^/fl/iw附c/w/ci//m)和痴属植物(伞J如，5V)/a/iw附aoi/m^m附、51.6w仿0Cfls/"/iw挑(一种野生马铃著)、5".c"n/—/^//"附、5".flto"g/fls/i'、欧白英(51.rf"/owi"ra)、5./做"<7/她附、51.ayiAms,ii附和5*.加'《i/欲w附)。在过去的几十年中，用于防治植物中昆虫侵害的更有效方法和组合物的开发已取得显著选艮。化学杀虫剂在根除害虫侵害中已非常有效。使用印,提取物进行生物防治已显示出对植物鞘翅目害虫有作用。基于印楝的市售杀虫剂将印楝素作为主要的活性成分。这些杀虫剂适用于广语的昆虫。它们作为昆虫生长调节剂；印楝素通过抑制一种昆虫激素(蜕皮素)的产生而阻止昆虫蜕皮。4吏用来自苏云金芽孢杆菌粉虫变种(5""7/ms幼wnVig/ews/svarietiestenebrionis)和圣地亚哥变种(varietiessandiego)的Cry3A蛋白以^_衍生的杀虫蛋白进行生物防治是化学防治的可替代方法。所述股(5aci7/"s^i/nVig/e"^)毒素蛋白对于防治马铃薯叶曱幼虫是有效的，该毒素蛋白或者作为在植物上喷洒的制剂或者在马铃薯的叶中表达。一种可替代的生物制剂是dsRNA。在过去的几年里，借助RNA干扰或"RNAi"下调多细胞生物中的基因(也称为"基因沉默")已成为成熟的技术。RNA干扰或"RNAi，，4^列特异性下调基因表达的方法(也称为"基因沉默"或"RNA介导的基因沉默，，)，其由序列与待下调乾基因区域互补的双链RNA(dsRNA)起始(Fire，A.TrendsGenet.Vol.15，358-363，1999;Sharp,P.A.GenesDev.Vol.15，485誦4卯，2001)。在过去的几年里，借助RNA干扰(RNAi)下调多细胞生物的耙基因已成为成熟的技术。可参考国际申请WO99/32619(卡内基学院)和WO00/01846(本申请人)。dsRNA基因沉默应用于许多不同的领域中，例如在临床应用(WO2004/001013)和植物中dsRNA介导的基因沉默。在植物中，还已将用于基因沉默的dsRNA构建体i殳计成可被切割及加工成小干扰RNA(siRNA)。尽管本领域已普遍了解植物、秀丽隐杆线虫(C.degans)和哺乳动物细胞中的RNAi技术若干年，然而对于使用RNAi下调昆虫中基因表iiil今几乎是未知的。自从WO00/01846和WO99/32619申请的提交和公布以来，仅有少量涉及使用RNAi保护植物免受昆虫侵害的其它申请被公布。这些包括国际申请WO01/37654(DNAPlantTechnologies)、WO2005/019408(BarIlan大学)、WO2005/049841(CSIRO,BayerCropscience)、WO05/047300(犹他大学研究基金会)和美国申请2003/00150017(Mesa等)。本发明提供了用于RNAi介导的昆虫害虫防治的乾基因和构建体。相应地，本发明提供了通过抑制、延迟或降低特定害虫中耙基因的表达来防治害虫侵害的方法和组合物。
发明内容本发明描述了用于防治作物昆虫害虫的不基于化合物、不基于蛋白质的新方法。其活性成分^1核酸(双链RNA(dsRNA))，所述核酸可用作杀虫制剂(例如，作为叶的喷雾剂)。所述dsRNA的序列对应于昆虫必需基因的部分或全部，并通过RNA干扰(RNAi)导致昆虫乾标的下调。由于mRNA的下调，所述dsRNA阻止昆虫耙蛋白的表达，并因此导致昆虫死亡、生长停滞或不育。本发明的方法可实际应用在需要抑制昆虫的生存、生长、发育或繁殖或者降低昆虫的致病性或感染性的任何
技术领域：
。本发明的方法还实际应用于需要特异性下调昆虫中一种或多种乾基因表达的情形。特别有用的实际应用包括但不限于(1)保护植物免受昆虫害虫侵害；(2)在人和动物中的药物或兽医用途(例如，控制、治疗或预防人和动物中的昆虫感染)；(3)保护物品免遭昆虫破坏；(4)保护易腐的物品(如食品、种子等)免遭昆虫破坏；以及通常需要防治昆虫和/或需要防止昆虫引起破坏的任何应用。根据一个实施方案，本发明涉及控制细胞或生物上昆虫生长的方法，或者防止昆虫侵害对昆虫感染敏感的细胞或生物的方法，其包括将昆虫与双链RNA接触，其中所述双链RNA包含退火的互##:，其中一条退火互##:包含与昆虫乾基因核香^列之至少一部分互补的核苷^列，该双链RNA被昆虫摄取并因此控制生长或防止侵害。因此，本发明提供了分离的新的昆虫乾基因核苷酸序列，所述分离的核苷酸序列包M自以下的至少一种核酸序列(i)如下表示的任意序列SEQIDNO1，3,S'7.9.",13,15,17,19.21,23,49至158,159，160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220'225,230,240至247,249，251,253,255,257，259，275至472,473,478,483,488,493,498,503,508至513,515、517，519,521,533至575,576,581,586,591,596，601,603,605,607,609，621至767，768,773,778,783,788,793，795,797,799,801,813至肪2,863,868，873,878,883,888,890,892'894,896,908至1040，1041,1046,1051,1056,1061,1066至1071,1073,1075,1077,1079,1081,1083，1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101,"03,1105,1107,"09,1111,"13,1161至1571,1572，1577,1582，1587,1592，1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642，1647，1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686.1688,1690,1692,1694，1696,1698,1700,1702,1704，1730至2039,2040,2045,2D50,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085，2090，20站，2100,2102，2104,2106,2108，2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359，2364,2366，2368.2370,2372'2384或2460,2461,2466,2471,2476,2481或2486,或其互补序列，(ii)与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、90%，更优选至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO1,3,5.7,9,",13,15,17'19，21,23,49至158,159,160-163,168,173,178,183，188,193,198,203,208,215,220,225,230,240至247,249,251，253,255，257.259,275至472，473,478，483,488,493,498,503,508至513，515,517,519,521、533至575,576,581,5肪，591,596,601,603，605,607,609,621至767,768,773，778,783,788,793,795,797,799,801，813至862,863,868,873,878,883,888,8恥，892,894,896,908至1040,1041,化46,1051,1056,1061，1066至1071,1073，1075,1077.1079，1081,1083,1085，1087,1089,1091,1093,1095,1097，1099，1101,1103,1105,1107,1109,1111'1113,1161至1571'1572,1577,化82,1587，1592,1597'1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642，1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,化84,1686,1688,1690,1692,1694,1696.1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040,2045,2050,2055，2060,2065,2070,2075'2080,2085,2090,2095,2100'2102,2104,2106,2108,2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366，2368,2370,2372,2384至2460，2461,2466,2471,2476,2481或2486,或其互补序列，以及(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列SEQIDNO1,3，5,7,9,11,13,15,17,19,21，23，49至158.159,160-163，168,173,178,183，188,193,1幼，203,208,215,220,225,230，240至247,249,251.253,255,257,259,275至472,473,478，483,488,493,498,503,508至513,515,517,519,521,533至575,576,581,586,591,596,601,603,605,607,609,621至767,768,773，778,783'788,793,795,797,799,801,813至肪2,863，86B，873,878,8B3,888,890,892,894,896,的8至1040,1041,1046，1051,1056,1061,1066至1071,1073,1075,1077，1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101,1103,1105,1107,1109,1111,1113,1161至1571,1572,1577,1582,1587'1592,1597,1602，1607,1612，1617,1622,1627,1632，1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682，1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700，1702,1704,1730至2039,2040,2045，2050,2055,2060，2065,2070,2075,2080,2085,2090,2095，2100,2102,2104,2106,2108，2120至2338,2339，2344,2349,2354,2359,2364,2366,23幼，2370,2372,2384至2460,2461,2466,2471,2476,2481或2486,或其互补序列，或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的直系同源物SEQIDN049至158、275至472、533至575、621至767、813至862、卯8至1040、1161至1571、1730至2039、2120至2338、2384至2460,或其互补序列，所述核酸序列可用于制备本发明的用于控制昆虫生长的双链RNA。本发明使用的"防治害虫"意指杀死害虫，或阻止害虫发育或生长，或防止害虫感染或侵害。本文使用的防治害虫还包括控制害虫的后代(卵的发育)。本文使用的害虫防治还包括抑制昆虫的生存、生长、发育或繁殖，或降低昆虫的致病性或感染性。本文所述的化合物和/或组合物可用于维持生物健康，并可以治疗性、预防性或全身性地使用来防治害虫或者阻止昆虫生长或发育或者感染或侵害。本发明涉及的特定害虫是昆虫害虫。因此，本文使用的"防治昆虫，，还包括控制昆虫的后代(例如昆虫害虫的卵的发育)。本文4吏用的防治昆虫还包括抑制昆虫的生存、生长、发育或繁殖，或者降低昆虫的致病性或感染性。在本发明中，防治昆虫可以抑制昆虫中的生物活性，其导致一种或多种以下特征昆虫进食减少，昆虫生存力降低，昆虫死亡，抑制昆虫的分化和发育，以下的缺失或能力下降昆虫有性繁殖、肌肉形成、保幼激素形成、保幼激素功能调节、离子调节和转运、细胞膜电势的维持、M酸的生物合成、氨基酸降解、精子形成、信息素合成、信息素的感知、触角形成、翅的形成、足的形成、发育和分化、卵的形成、幼虫的成熟、消化酶的形成、血淋巴的合成、血淋巴的维持、神经传递、细胞分裂、能量代谢、呼吸、凋亡以及真核细胞的细胞骨架结构(如肌动蛋白和微管蛋白)的任何组分。本文所述的化合物和/或组合物可用于维持生物健康，并可以治疗性、预防性或全身性地使用来防治昆虫，或阻止害虫生长或发育或者感染或侵害。因此，本发明可以使先前的敏感生物对昆虫侵害产生抗性。本文使用的表述"与……的至少一部分互补"是指所述核苷酸序列与靶标的核苷酸序列在超过两个核苷酸的长度上，例如超过至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个连续核香酸的长度上完全互补。根据又一实施方案，本发明涉及用于下调昆虫中耙基因表达的方法，其包括将所述昆虫与双链RNA接触，其中所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条退火互补链包含与待下调昆虫靼基因核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列，其中所述双链RNA被昆虫摄取并因此下调昆虫靶基因的表达。在无数量词修饰时，"乾基因，，是指"至少一种"乾基因。同样地，靶生物是指"至少一种"靶生物，RNA分子或宿主细胞是指"至少一种"RNA分子或宿主细胞。这在后面还有详述。根据一个实施方案，本发明的方法依赖于昆虫摄取其外部的双链RNA(例如，通过进食)，而不需要在昆虫细胞中表ii^链RNA。另外，本发明还包括如上所述的方法，其中所述昆虫与包含该双链RNA的组合物接触.可通过原核的(例如但不限于细菌)或真核的(例如但不限于酵母)宿主细胞或宿主生物来表达所述双链RNA。所述昆虫可以是任何昆虫，意指属于动物界、特别是节肢动物门、尤其是昆虫纲或蛛形纲的任何生物。本发明的方法适用于对利用RNA干扰进行的基因沉默敏感的所有昆虫，以及能够从其邻近环境将双链RNA内化的所有昆虫。本发明还适用于处于其任何发育阶段的昆虫。因为昆虫具有无生命的外骨骼，所以它们不能以均一的速率生长，而是通过周期性蜕落其外骨骼进行分阶段生长。该过程称作"蜕皮"。蜕皮之间的阶段称作"龄"，而这些阶段可以作为本发明的靶标。同时，昆虫的卵或活的幼虫也可作为本发明的靶标。发育周期中的所有阶段(包括有翅昆虫中的变态)均可以作为本发明的乾标。因此，单个阶段(如幼虫、蛹、若虫等发育阶段)均可以作为靶标。在本发明的一个实施方案中，所述昆虫可以属于以下的目蜱螨目、掩蛛目、虱目、鞘翅目、弹尾目、革翅目、网翅目、M目、双翅目、纺足目、蛘蝣目、愛蠊目、半翅目、同翅目、膜翅目、等翅目、鳞翅目、食毛目、长翅目、脉翅目、蜻蜓目、直翅目、竹节虫目、積翅目、原尾目、嗜虫目、蚤目、虱目、缨尾目、抢翅目、缨翅目、毛翅目和缺翅目。在本发明优选的非限制性实施方案和方法中，所述昆虫选自(l)植物昆虫害虫，例如但不限于褐飞虱属物种(7Vi7fl/7flrvfltospp.))(例如，褐飞虱(iV./wgews))、灰飞虱属物种(￡fl<ufe//7/iaxspp.)(例如，灰飞虱(￡.)、黑尾叶蝉属物种(7V印/^&"^spp.)(例如，二点黑尾叶蝉(iV.v//TScews)，或黑尾叶蝉(TV.d""/cc/w)，或二条黑尾叶蝉(^附;^印/""s))、白背飞氛属物种(5V^flte/^spp.)(例如，白背飞虱(51./wiriy^ni))、杆长椿属物种(5fc训sspp.)(例如，美洲谷軒长棒(A/ewc丰mis1/e"co/^er"s))、黑棒属物种(5^ftVio/7/wmspp.)(例如,稻黑漆(S.ve簡/rf"/flte))、^il"属物种(Jc簡to7fM附spp.)(例如，拟^i^(A似/flM))、稻弄^t^物种(P"m"mspp.)(例如，直紋稻弄蝶(P.gM加to))、禾草螟属物种(C緒(spp.)(例如，二化螟(C.#/5/71^5/&)、台湾稻螟(CIfl"nW//"s)或稻多丽螟(Cl/w(ycAijs"s))、禾4螟属物种(Oi/tofnieflspp.)(例如，稻杆螟(C/w(vc/io^i))、蛀茎>|^蛾属物种(5^flw/"spp.)(例如，稻蛀茎^LM(5"./"/e""s))、蛀禾螟属物种(I>y/wo^"spp.)(例如，白稻螟(7:,'""W"to)或三化螟(r.iViceW"/fls))、纵巻叶野螟属物种(Of"/^"/"CT^c/sspp.)(例如，稻纵巻叶野螟(C.w^/Z""/,'s))、潜錄属物种(J^WM^"spp.)(例如，日本稻潜錄(A)或玉米斑潜錄(A/mmVw"/s))、杆草螟属物种(spp.)(例如,小蔗螟(D.swcc/mm/i's)或西南玉米杆草螟(/)gra/wfoVwe//"))、A^I7l"^！属物种(例如，绿稻毛虫(A^fle"M""s))、黄夜蛾属物种(Xfl/f^w^Mspp.)(例如，犁紋黄夜蛾(Xfrfl"svew"))、灰翅夜蛾属物种(5^一p^Yispp.)(例如，草地贪夜蛾(X/n^^en/fl)、甜菜^LM(X)、海灰翅夜蛾(51./lYtorato)或西部黄条^M(5*.praeyicfl))、秘夜蛾属物种(A^/h'附w"spp.)(例如，粘虫(Pse"fl/"/"Js印enito))、铃夜蛾属物种(He//ovc/7flspp.)(例如，谷实夜蛾(E^fl))、CV/"s/7/s属物种(CV，/fls//sspp.)(例如，葡萄肖叶甲(C:^wi/ie")、稻7K象属物种(1/ssw7^/^wsspp.)(例如，稻水象曱(丄.)、稻象属物种(五c/^Vioc"e附Msspp.)(例如，稻象(五.n、稻铁甲属物种(DiWW/印"spp.)(例如，水稻铁甲(".)、；^负泥虫属物种(Ow/e附flspp.)(例如，7^负泥虫(a(wjzfle))、米象属物种(57鄉/ri7"sspp.)(例如，米象(5".)、尸flc/^鄉/os/s属物种(例如，稻瘿蚊(户.oo^"e))、毛眼水蝇属物种(^^/"///"spp.)(例如，麦叶毛眼水錄(E^7&0/fl)或日稻毛眼水錄(及柳幼h7))、CM"iyj^属物种(例如，稻杆潜錄(C.w^"e))、根萤叶甲属物种("/WwftV^spp.)(例如，玉米根叶曱(v/rg^mv,Vg(^m)、北美玉米根叶曱(Z).^w^n')、黄瓜十一星叶曱卡^根亚种(D.w/i&c/ifi/ww"flto/^HwW/)、墨西哥玉米才艮叶曱(/)v/化(^ni^fle)、条紋黄瓜叶甲(2X6fl/teflto))、杆野螟属物种(OrfnViiVispp.)(例如，玉米螟(awi/6i7fl//s))、地虎属物种(spp.)(例如，小地老虎"一7柳))、五/flS腳/7fl/戸属物种(例如，南美玉米苗斑螟(￡)、梳爪叩头虫属物种(Me/朋Wwsspp.)(线虫)、圆头犀金龟属物种(0;c/o"/^"/flspp.)(例如，北部伪装金龟(C.6wefl/i's)或南部伪^^金龟(C.,'附w"c"/flto))、弧丽金龟属物种(spp.)(例如，日本弧丽金龟(尸.)、跳曱属物种(0^etocwe附flspp.)(例如，玉米铜色浪匕甲(CI/;m//cw7Vi))、龙颈象属物种(5^/le朋/7/lC"SSpp.)(例如，玉米长咮象IMfl,Vfc))、缢管蜂属物种(及/^/m/^,i^"/wspp.)(例如，玉米辨(及.挑似V/Zs))、圆尾对属物种(J/iMrfl/)/i/sspp.)(例如，玉米根对(A歸iVf,VW,Ws))、黑埴属物种(胁/flwc;p/MSspp.)(例如，红足黑埴(Af./e廳m^r謂))、特异黑蝗(Af.&j^^"ftVi//s)或迁飞黑埴(AT.s""g"//M>^s))、种錄属物种(母/e附，spp.)(例如，种錄(E//fl似m))、呆蓟马属物种(Jw"/7/^^njwspp.)(例如，黄呆蓟马(A幽cmras))、火蚊属物种(5We朋戸'sspp.)(例如，盗议(51.附/^"))、叶螨属物种(r欲考由sspp.)(例如，二点叶螨(i:""/cfl《)、i^、叶螨(r."'""flto/膽))、铃夜蛾属物种(例如，谷实^M或棉铃虫(双"rw/gera))、i^"/w印/^ra属物种(例如，红铃麦蛾(P.g^sj;/^//"))、金刚钻属物种(五"nVisspp.)(例如，翠紋钻夜蛾viV^//"))、实夜蛾属物种(好^V^/sspp.)(例如，烟芽^Mv/rescms))、花象属物种(/4/i幼o朋wwsspp.)(例如，墨西哥棉铃象(A)、i^ei^ato附0sce"s属物种(例如，棉伪斑腿盲蝽(尸.wn'fl似s))、结翅粉氛属物种(7W"/e"nflfesspp.)(例如，结翅粉虱(7:"6w说o"e"s)、温室粉虱(Z做/wmr/or"附))、小粉虱属物种(5e"f/w"spp.)(例如，银叶粉虱(5."rge"ftyi///))、对属物种(J/^/sspp.)(例如，棉蜂(Ag仍《Kp/,'))、草盲蝽属物种(A)^"sspp.)(例如，美国^t草盲蝽(丄./iVim/w/s)或美洲牧草盲椿(LZies/^nw))、美洲蝽属物种(f"sc/^似sspp.)(例如，斑点美洲棒cwi印era附))、CM^YK^nwi属物种(例如，赛氏蝽(C幼j;/))、绿棒属物种(7V^"mspp.)(例如，稻绿蝽(TV.v/nV/"/"))、蓟马属物种(2^7>wspp.)(例如，烟蓟马(7:似6fld))、花蓟马属物种(/^""*/|>!&//"spp.)(例如，烟褐蓟马(F./jisca)或西方花蓟马(F.ocdflfewtofc))、马铃薯叶甲属物种(Z^pft'"Wflrwjrspp.)(例如，马铃薯叶甲(丄.flf"e/ii//"eflto)、伪马铃薯叶甲或胡颓子叶茄叶甲(Z.)、合爪负泥虫属物种(Z^附"spp.)(例如，三条负泥虫(1.加7/"e"似))、茄跳甲属物种(￡/wYrivspp.)(例如，美国马铃薯跳甲c"c"附w/s)、烟草跳曱(五./i,W,:^"/i&)或块茎跳甲(￡"似6en's))、豆芫菁属物种(五p/aiMtospp.)(例如，北美豆芫菁(五.v/加to))、猿叶曱属物种(尸A"W卵spp.)(例如，辣才M^叶甲(尸.coc似eflnV^))、嘴^*虫属物种(五/w7flcAwflspp.)(例如，墨西哥豆鉱虫(五.vanV幼's))、爿c/^"属物种(例如，居屋艾蟋(A.domesticus))、绿小叶蝉属物种(五挑/wfl""spp.)(例如，蚕豆小绿叶蝉(E/由e))、瘤对属(M，sspp.)(例如，桃奸(M/7簡'面))、薯个木虱属物种(户"r"加V加spp.)(例如，马铃薯木虱(P.cocA^e///))、宽胸金针虫属物种(CVmWmwspp.)(例如，南部马铃薯线虫(Cl/fl///)或烟草线虫(CIvm/^Wi>is))、麦蛾属物种(iV^/^i"/附"e"spp.)(例如，马铃薯麦蛾(户.))、长管辨属物种(Macr舰》A"附spp.)(例如，大戟长管对(M.ewp/iw^Vie))、T7纱""to属物种(例如，红肩漆象(Z/wi//,Vtov/mw))、麦蛾属物种(尸緣onVii固spp.)(例如，马铃薯麦蛾(P.o/^irw/e//"))、铃夜蛾属物种(例如，谷实夜蛾)、A^y^7'fl属物种(例如，番茄囊蛾(L(^o/^ra/ce//"))、金针虫属物种(Z/附卵/附spp.)(线虫)、Mfl/irf"ai属物种(例如，烟草天蛾(A/:sd似)或番痴天域(M拜'M《we附acM/ato))、斑潜錄属物种(l/wVwy^"spp.)(例如，蔬菜斑潜)、三叶草斑潜錄(￡加/o肌)或南美斑潜錄(1.A"fVto6i^wsfe))、果錄属物种(Z)nwo/7A,7/flspp.)(例如，黑腹果錄(2).附e/"/K^fl对w)、D.3^M6fl、拟暗果錄(IX/wewi/卯6scw")或拟果錄(si/iiw/flws))、步曱属物种(C"ni6"sspp.)(例如，粒步甲(C^Yi"M/fl似s))、摇蚊属物种(C7h'訓o聽sspp.)(例如，摇蚊(C.)、祁首蚤属物种(Cte朋ce/^"/,Vfesspp.)(例如，猫样首蚤(C.))、非耳味象属物种(D/"/wcp^spp.)(例如，才艮象鼻虫(D.fl66Mv/"似s))、齿小囊属物种(/^spp.)(例如，美松齿小囊(//;/"/))、拟谷盗属物种(7>幼0//"附spp.)(尔J如，赤*乂谷盗(r.cflstofiew附))、舌錄属物种(Gtoss!Viflspp.)(例如，刺舌錄(Gwws/tows))、按蚊属物种(v4wop/^/aspp.)(例如，甘比亚按蚊(j.g"附61V1e))、铃夜蛾属(例如，棉铃虫(Eflr附&eni))、Jcjr幼仍z》/^w属物种(例如，豌豆辨(A/;/柳附))、蜜蜂属物种(J/;/sspp.)(例如，意大利蜜蜂(A附^/^fl))、Ho附fl&flfcCfl属物种(例如，琉璃叶蝉(Eco叹"/flte))、伊蚊属物种(Jefi^spp.)(例如，埃及斑紋(Ae.aegypti))、凌d我属物种(5wn勿，xspp.)(例如，家蚕(及won'))、飞埴属物种(丄MW对"spp.)(例如，飞蝗(丄./w/gmtonVi))、牛蜱属物种(5rW//ll7MSSpp.)(伞J如，微'J、牛蜱(丑.附/cn^/MS))、JCfl/^A<WCITlVl属物种(例如，红毛巧克力捕鸟蛛(j.^附^/fl"fl))、甲蠊属物种(D,]p/o/"mispp.)(例如，太平洋折翅蠊(Z)./wwctoto))、袖蝶属物种(HWcwi/wsspp.)(例如，瓦氏袖蝶或诗神袖蝶(好.)、象虫属物种(spp.)(例如，欧洲栎象(Cg/fl/lrf/"W))、/Vwte//fl属物种(例如，菜蛾(P.j^/^te//"))、钝眼蜱属物种(爿附6/"/w附flspp.)(夯!j如,彩饰花碑(」win'c^i似iM))、作蚕属物种(v4"teni^1spp.)(众寸如，天要(j.j;a/iifl附fl/))和阿^^物种(Jr挑i》ei^sspp.)(众lj如,^"扰阿坟(j.SM厶a幼a似s))J(2)能够4曼扰或损伤人和/或动物的昆虫，例如但不限于具有可见于半翅目和某些膜翅目以及双翅目(如蚊子、蜜蜂、黄蜂、虱、蚤和蚂蚁)的刺吸式口器的昆虫以;5U^形纲动物(Arachnidae)(如蜱和螨)蜱螨目(蜱和螨)，例如代表性的科软蜱科(J/^is,W"e)、皮刺螨科(Dww做w:wV/"e)、硬蜱科(Zw必rf"e)、痒螨科(i^w印ftV/ae)或济螨科(5^/r印ftV/"e)，以及代表性的物种花蜱属物种(Jw6/"附wflspp.)、暗眼蜱属物种(J朋""to/"spp.)、锐缘蜱属物种(爿rgflsspp.)、牛蜱属物种(,7"sspp.)、姬螯螨属物种(C7^/"/e//flspp.)、足螨属物种(C^鎖Vptospp.)、蠕形螨属物种(spp.)、革蜱属物种(Dei7w"c^"torspp.)、皮刺螨属物种(Der廳"戸wsspp.)、血蜱属物种(Zr"e腳/7一fl/i'sspp.)、璃目艮蜱属物种(母fl/o附附"Spp.)、硬蜱属物种(/X0^fesSpp.)、Z^肌"CflfMS属物种、中气门亚目物种(A/^仍^^挑fltospp.)、背胆螨属物种(A^to^/r^spp.)、钝缘蜱属物种(O"/幼0^r仍spp.)、禽刺螨属物种(spp.)、残咮蜱属物种(0to6/wsspp.)、耳痒螨属物种(Oto&ctesspp.)、肺刺螨属物种(/Viei/附0"戸WSSpp.)、痒螨属物种(户SW丰eSSpp.)、扇头蜱属物种(及Ai》/cep/^/"sspp.)、济螨属物种(5Wm/7tospp.)或恙螨属物种(7Ywif6/cw/"spp.);虱目(吸吮和叮咬的虱)，例如4戈表性物种牛毛虱属物种(丑ov/co/flspp.)、血虱属物种(Hfle廳鄉/""sspp.)、颈虱属物种(1//fog"fl幼附spp.)、鸡虱属物种(M(Wi，wspp.)、人虱属物种(/W/cw/"sspp.)、瘘岭辨属物种(i^附/^/gi/sspp.)、根瘤奸属物种(iV^/Zoveraspp.)或管虱属物种(5We/io/wtesspp.);双翅目(蝇)，例如代表性的物种伊蚊属物种(爿e&sspp.)、按蚊属物种(^io//^/esspp.)、丽錄属物种(CVi鄉Awflspp.)、金绳属物种(C7^戸考/flspp.)、斑虻属物种(C7^仰/wspp.)、锥錄属物种(CW緒o考/"spp.)、库蚊属物种(C"/e;cspp.)、库蠓属物种(CW/co,Vfesspp.)、黄錄属物种(C"tei"c6raspp.)、皮绳属物种(D"麵励/"spp.)、胃錄属物种(Gfl欲印緒msspp.)、舌蝇属物种(G7柳/""spp.)、黑角蝇属物种(仏e臓to綠spp.)、麻虻属物种(^^T"e附tfto/^似spp.)、虱埯属物种(^ffi》/w6osaispp.)、皮錄属物种(母/wflfe簡aspp.)、绿錄属物种(￡m"7iVispp.)、角蝇属物种(Z^/7emwVispp.)、蜱錄属物种"戸spp.)、狂錄属物种(Oerf簡spp.)、绿錄属物种(iVmew/daspp.)、白蛉属物种(iVi/eAotowwsspp.)、伏錄属物种(/V^環/flspp.)、麻蝇属物种(S"r考Aflgflspp.)、蚋属物种(57挑"//"附spp.)、替錄属物种(iSto附dj;sspp.)、虻属物种(r"6awMSspp.)、r"""iVi属物种或大蚊属(rzyw/flspp.);i毛目(叮咬的虱)，例如代表性的物种Da廳/iVi0属物种、猫毛風属物种(i^,/co/flspp.)、份tenw/aww属物种或啮毛虱属物种(7Wc/^&ctesspp.);蚤目(无翅昆虫)，例如角叶蚤属物种(spp.)、圣属物种(spp.)或客蚤属物种spp.);臭虫科(臭虫)，例如代表性的物种臭虫属物种(C7膨a:spp.)、7hY卿/"fle属物种、及/^f/"/"s属物种或锥棒属物种(7Wflto附flspp.)以及(3)导致对基层(substrate)或物品的不利破坏的昆虫，如攻击食品、种子、木材、涂料、塑料、衣物等的昆虫。(4)与公共健康和卫生相关的昆虫或蛛形纲动物，包括住屋昆虫和体外寄生虫，例如但不限于蝇、叶螨、蓟马、蜱、红色家禽螨、蚂蚁、蟑埤、白蚁、蟋蟀(包括住屋蟋蟀)、囊虫、书虱、甲虫、蠼螋、蚊子和蚤。更优选的乾标是蟑螂(蜚蠊目)，例如但不限于小蠊属物种(必tote/tospp.)(例如，德国小蠊(g^7ii"/i/c")、大^b^物种(T^ri》/flwC"spp.)(例如，美洲大蠊(i^ri》/朋"fltt膨"'amfl)和澳洲大蠊(尸w》/朋C"fl"对m/iVjw/"e)、蜚蠊属物种(丑/fl""spp.X例如，东方蜚蠊(丑/flft"))和皮蠊属物种(5^//flspp.)(例如,长须蜚蠊(5""/^//ato"gi》fl//wi))，蚂蚁(蚁总科)，如但不限于火蚁属(5We"o/w/sspp.)(例如，红火蚁(5"o/em/w/s/"v/"fl))、小家i5L^物种(A/<9/wion'MWspp.)(伞j如，'J、家议(M(9wo附on'"附//iflnww/s))、弓背蚊属物种(Ca附/wwott/sspp.)(#1如，弓背蚊属物种(木匠蚁))、毛蚊属物种spp.)(例如，黑毛蚊(/"W'MS/M》er))、铺道iSL^物种(r(^IYWIWI'M附Spp.)(伞lj如，铺道蚊(T^rfl/wor/i/附cflgsp&M/M))、红议属物种(A^r附/ctfspp.)(伞lj如，小红蚊(J^r/w/cflra6ni))、议属物种(For挑/c"spp.)(木蚊)、举腹i5L^物种(Oe附她gfl他rspp.)(例如，举腹议(Oe附fltogfl欲r//"eo/她))、虹臭蚊属物种(/nVtowyr膨xspp.)(例如，阿根廷蚊(7nV/柳jT附exA謂船))、大头议属物种(i^iWo/espp.)(大头议)和Dfls戸wft7/a属物种(例如，D^y附M说/fl(议蜂))，白蚁(等翅目和/或白蚁科)，例如但不限于丫白蚊属物种U附/tei7M^spp.)(例如佛罗里达黑翅散白议(J/fM'tenwesyZonVfe/isis))、散白4SL^物种(ieft'cw/i'&r附esspp.)(例如，黄^L散白议(Weft'cu/i'te/Tiiesy"v,)w)、西部散白蚊(ieft'c//tei7MesA^/^nw))、乳白蚊属物种(Co/^如7w^spp.)(例如，台湾乳白蚊(G/;toter附es/fM7ii仍"wws))、楹白iS^物种(Twc/s/fennesspp.)(例如，小楹白蚊(T/ic/s/tei7wes附/"w))、新白蚊属物种(7V^tei7wesspp.)(例如，森#^"白议(7V(^te簡escow/icxws))。受益于本发明的"敏感生物"包括对害虫侵害敏感的任何生物。许多不同生物的害虫，所述生物例如动物(如人、家畜(如宠物(如猫、犬等))和牲畜(包括绵羊、奶牛、猪、鸡等))。由此，在本发明的优选但非限制的实施方案中，所述昆虫或蛛形纲动物选自(l)蜱螨目包括蜱亚目(蜱)的螨类(2)蛛形纲蜘蛛目(蜘蛛)和盲蛛目(盲蜘蛛)，实例包括黑寡妇掩蛛(丄fl^Ywfe""s/wfl"fl"s)和棕色B急遍掩蛛(丄oxosce/esrgc/Mse)(3)虱目虱，如体虱(iW/cw/"s/rw附a聽s)(4)蜚蠊目蟑螂，包括德国小蠊、大蠊属的美洲大蠊和澳洲大蠊、蜚蠊属的东方蜚蠊以及皮蠊属的长须蜚蠊。最优选的乾标是德国小蠊。(5)鞘翅目甲虫，实例包括长囊总科；大小囊属物种("em/ctow"sspp.)(BlackTurpentineBeetle、南部*>小囊(SouthernPineBeetle)、IPS雕刻小蠹(IPSEngraverBeetle));地趙甲虫(CarpetBeetles)(圆皮囊属物种(J威rniwsspp.)、毛皮囊属物种(J加^iwsspp.));OldHouseBorer(天牛科家天牛(掛to紐/es1));家俱窃囊(^4"o6/m附/7ww"afw附)；拟谷盗属物种(面象虫)；谷斑皮囊(7>og<wfei*wigiYi/i"n'w附)；Oo^fle/^'tosa"'"纖ewsis(银谷盗(ToothedGrainBeetle))等(书虫)(6)革翅目蠼螋类(7)双翅目蚊(蚊科)和蝇(短角亚目)，实例是An叩hehnae(如按^t^物种)和库蚊亚科(如Jeflfes/w/v"s);虻科如rfl6a/iws/ww"iy^"(马蝇)、附0m'似iis附wsito/is1(舌錄)、drainflies(毛緣科)以及有瓣蝇类(Calyptratae)如家蝇(A/wsc"^附e幼'ai)、肉蝇(麻錄科)等(8)异翅亚目臭虫，如温带臭虫(C7附ex/e""/"n'附)(床虱)(9)膜翅目黄蜂(细腰亚目)，包括蚂蚁(蚁总科)、蜜蜂(蜜蜂总科)红火蚁、小家蚁、弓背议属物种(木匠蚁)、黑毛蚁、铺道蚁、小红议、蚊属物种(木议)、举腹蚁、阿根廷蚁、大头议属物种(大头蚊)和Z)fls戸M说/"0c"V/e牆,/s(议蜂)等(10)等翅目白蚁，实例包括佛罗里达黑翅散白蚁(J/ff/te/7ff^/7wiVfe"s&)、黄肢散白蚊、西部散白蚁(及，/^^wiw)、台湾乳白蚊、小楹白蚊、森^#白议(A^ter附Mcwmeja^))和白议科(11)鳞翅目蛾，实例包括谷蛾科和织蛾科(如衣蛾(ri'"^/")以及螟蛾科(如紫li^螟(/>m//s/"W"fl//s))等(12)啮虫目书虱(啮虫目)(13)圣目圣，如致摔圣(户"/ex/m'to/is)(14)胸味亚目辨虫(辨科)(15)衣鱼目囊虫，实例是小灶衣鱼(r/^nfiM/fl甴附erf/ai)和衣鱼(Z^/;/s附flswcc/iflnVifl)本发明优选的植物病原性昆虫是植物害虫并选自马铃薯叶曱属物种(例如，马铃薯叶甲、伪马铃薯叶曱或胡颓子叶茄叶甲)、褐飞虱属物种(例如，褐飞虱)、灰飞虱属物种(例如，灰飞虱)、黑尾叶蝉属物种(例如，二点黑尾叶蝉，或黑尾叶蝉，或二条黑尾叶蝉)、白背飞虱属物种(例如，白背飞虱)、禾草螟属物种(例如，二化螟、台湾稻螟或稻多丽螟)、蛀茎夜蛾属物种(例如，稻蛀茎夜蛾)、蛀禾螟属物种(例如，白稻螟或三化螟)、根萤叶甲属物种(例如，玉米才艮叶甲、北美玉米根叶甲、黄瓜十一星叶甲食根亚种、墨西哥玉米^f艮叶甲)、杆野螟属物种(例如，玉米螟)、呆蓟马属物种(例如，黄呆蓟马)、/^"/"o;p/w"属物种(例如，红铃麦蛾)、实夜蛾属物种(例如，烟芽夜蛾)、结翅粉虱属物种(例如，结翅粉虱、温室粉虱)、小粉虱属物种(例如，银叶粉虱)、圩属物种(例如，棉辨)、草盲蝽属物种(例如，美国牧草盲蝽或美洲牧草盲蝽)、美洲漆属物种(例如，斑点美洲蝽)、CMwYc/^m属物种(例如，赛氏蝽)、绿蝽属物种(例如，稻绿蝽)、蓟马属物种(例如，烟蓟马)、花蓟马属物种(例如，烟褐蓟马或西方花蓟马)、瘤辨属物种(例如，桃蜂)、长管奸属物种(例如，大戟长管辨)、杆长蝽属物种(例如，美洲谷杆长蝽)、绿蝽属物种(例如，拟*)、禾草螟属物种(例如，稻杆螟(C./w(vc/io;幼))、稻水象属物种(例如，稻水象甲)、缢管蜂属物种(例如，玉米蜂)和圆尾蜂属物种(例如，玉米根蜂(Aifl,V//nw//c/s))。根据一个更具体的实施方案，本发明的方法适用于马铃薯叶甲属物种。马铃薯叶甲属属于叶曱科或叶曱类。叶甲(如跳甲和玉米根虫)和象甲(如苜蓿叶象甲)是特别重要的害虫。跳甲包括多种小型食叶甲虫，其以多种草、谷类和草;^tl物的叶为食。跳曱包括多个属(例如，Attica、Apphthona、Argopistes、Disonycha、茄跳甲属、长跗跳甲属、4跳曱属(Prodagricomela)、Systena和黄条跳甲属)。蔬菜黄条跳甲(Phyllotretacruciferae)(也叫作油菜跳甲(RapeFleaBeetle))是特别重要的害虫。玉米才艮虫包括叶甲属的物种(例如，黄瓜十一星叶曱(D.undecimpunctataundecimpunctata)、黄瓜十一星叶甲食才艮亚种、D.longicornis、玉米根叶甲和条紋黄瓜叶曱)。玉米根虫对玉米和瓜类(curcubit)造成广泛破坏。黄瓜十一星叶曱(WesternSpottedCucumberBeetle)是美国西部的瓜类害虫。苜蓿叶象曱(亦称三叶草象甲)属于叶象属(紫苜蓿叶象(H.postica)、埃及苜蓿叶象(H.bruimeipeimis)、H.nigrirostris、三叶草叶象(H.punctata)和H.meles)，并被i人为是重要的豆类害虫。埃及苜蓿叶象是美国西部的重要苜蓿害虫。马铃薯叶甲属物种超过30种。因此，本发明包括用于防治马铃薯叶曱属物种的方法，更特别地用于杀死昆虫、或阻止马铃薯叶甲属昆虫发育或生长、或者防止昆虫感染或侵害的方法。4^发明所防治的特定马铃薯叶甲属物种包括马铃薯叶曱(丄印ftV^似rafl(Say))和伪马铃薯叶甲(丄印ft'"o組sfly'ww"fl(Say))。CPB(ColoradoPotatoBeetle,马铃薯叶甲)对我们本国的马铃薯、其它栽培和野生的有块茎和无块茎的马铃薯物种(例如，S.demissum(墨西哥马铃薯野生种)、富利亚薯(S.phurejaa.o.))以及另一些茄属植物物种是(严重的)害虫，所述植物物种包括(a)作物物种番茄(若干番茄属物种)、茄子、胡椒(若干辣椒属物种)、烟草(若千烟草属物种，其包括观赏性植物)和醋栗(酸浆属物种)；(b)杂草/草本植物物种，北美刺龙葵(S.carolhiense)、欧白英(S.dulcamara)、颠茄(颠茄属物种)、曼陀罗(曼陀罗属物种)、天仙子(天仙子属物种)和黄花刺茄(S.rostratum)。FPB(FalsePotatoBeetle,伪马铃薯叶甲)主要发现于北美刺龙葵上，也发生在欧白英、醋栗和酸浆(酸浆属物种)上。术语"昆虫，，包括所有类型以及所有发育阶段的昆虫，包括卵、幼虫或若虫、蛹和成虫阶段。本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是马铃薯叶甲，所述植物是马铃薯、茄子、番茄、胡椒、烟草、醋栗或者稻、玉米或棉花。本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是辣才艮猿叶甲，所述植物是芥菜、大白菜、芜菁、羽衣甘蓝或小白菜。本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是墨西哥豆瓢虫，所述植物是豆类、菜豆、四季豆、食荚菜豆、利马豆、绿豆、青豆、牛眼豆、绒毛豆、大豆、Sn豆、木豆、三叶草或苜蓿。本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是墨西哥棉铃象，所述植物是棉花。本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是赤拟谷盗，所述植物以贮藏谷物的形式，如面粉、谷类、粗粉、饼干、豆类、调味品、面食、点心粉、干的宠物食品、干花、巧克力、坚果、种子甚至干的博物馆标本。本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是桃蚜，所述植物是树木如李属，特别是桃、杏和李子；茄科、藜科、菊科、十字花科和葫芦科的蔬菜作物，其包括但不限于朝鲜蓟、,夢、豆类、甜菜、嫩茎花椰菜、抱子甘蓝、巻心菜、胡萝卜、花椰菜、哈蜜瓜、芽菜、玉米、黄瓜、茴香、无头甘蓝、大头菜、芜菁、茄子、莴苣、芥菜、菜秋葵、欧芽、欧洲防风草、豌豆、胡椒、马铃薯、萝卜、菠菜、南瓜、番茄、芜菁、豆瓣菜和西瓜；农田作物例如但不限于烟草、糖用甜菜和向日葵；花作物或其它观赏性植物。本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是褐飞虱，所述植物是稻类植物。本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是二化螟，所述植物是稻类植物、大麦(bareley)、高粱、玉米、小麦或草。本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是菜蛾，所述植物是芸苔属物种，例如但不限于巻心菜、大白菜、抱子甘蓝、无头甘蓝、油菜籽、嫩茎花椰菜、花椰菜、芜菁、芥菜或萝卜。本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是居屋艾蟠，所述植物是本文所述的任何植物或任何有机体。在本文中，术语"植物，，包括期望被处理从而阻止或降低昆虫生长和/或昆虫侵害的任何植物材料。这包括整^^t物、幼苗、增殖或繁殖材料(如种子、插条、接穗、外植体等)，以及植物细胞和组织培养物等。所述植物材料应当表达RNA分子或者具有表达RNA分子的能力，所述RNA分子包含至少一种核苷酸序列，该核苷酸序列是害虫至少一种乾基因的有义链核苷酸序列之至少一部分的RNA互补序列或代表了其RNA等价物，从而所述RNA分子通过植物与害虫的相互作用被害虫摄取，所述RNA分子能够通过RNA干扰来抑制乾基因或者下调乾基因的表达。所述乾基因可以是本文所述的任何耙基因，例如对于害虫的生存、生长、发育或繁殖必需的乾基因。本发明涉及昆虫中可被下调的任何目的基因(本文可称作"乾基因")。术语"下调基因表达"和"抑制基因表达，，可互换使用，其指在耙基因的蛋白质产物和/或mRNA产物水平上可测量的或可观察的基因表达减少或者完全消除可检测的基因表达。优选地，所述下调不显著地直接抑制昆虫其它基因的表达。当与正常的基因表达比较时，dsRNA对基因表达的下调效果可计算为至少为30o/。、40%、50%、60%，优选70%、80%，或者更优选卯％或95°/。.取决于耙基因的性质，可通过对细胞或整只昆虫进行表型分析或者使用分子技术测量mRNA或蛋白质的表达来验证昆虫细胞中基因表达的下调或抑制，所述分子技术如RNA溶液杂交、PCR、核酸酶保护实验、Northern杂交、逆转录、使用微列阵监测基因表达、抗体结合、酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、放射免疫测定(RIA)、其它免疫测定或荧光激活细胞分析(FACS)。"乾基因，，基本上可以是由于其干扰昆虫的生长或致病性或感染性而期望祐^抑制的几乎任何基因。例如，如果本发明的方法用于阻止昆虫生长和/或侵害，则优选地选择对昆虫的生存、生长、发育或繁殖必需的乾基因，或者参与昆虫的致病性或感染性的任何基因，从而对乾基因的特异性抑制导致致死性表型或者降低或阻止昆虫侵害。根据一个非限制性的实施方案，所述耙基因是当4吏用本发明的方法下调或抑制其表达时，昆虫被杀死或者昆虫的繁殖或生长被阻止或阻滞的那些基因。认为这类乾基因是昆虫生存所必需的，并称作必需基因。因此，本发明包括本文所述的方法，其中所述耙基因是必需基因。根据另一非限制性的实施方案，所述耙基因是当使用本发明的方法将其下调时，昆虫的侵害或感染、昆虫造成的破坏和/或昆虫侵害或感染宿主生物和/或导致此类破坏的能力有所降低。一般地，术语"侵害"和"感染"始终可互换使用。认为这类乾基因参与昆虫的致病性或感染性。因此，本发明延伸至本文所述的方法，其中所述靶基因参与昆虫的致病性或感染性。选^^后一类型耙基因的优势在于阻断了昆虫进一步感染植物或植物部分，并抑制其形成后代。根据一个实施方案，乾基因是保守基因或昆虫特异性基因。另外，在本发明的方法中可以使用能够指导RNAi或RNA介导的基因沉默或者抑制昆虫乾基因的任何适当的双链RNA片段。在另一实施方案中，选择实质性参与害虫(如昆虫)生长、发育和繁殖的基因。示例性的基因包括但不限于核糖体蛋白的结构亚基和P-外^L体基因(如CHD3基因)。核糖体蛋白如S4(RpS4)和S9(RpS9)是参与蛋白质生物合成的核糖体的结构组分，并且U质小核糖体亚基的组分，核糖体蛋白如L9和L19是参与蛋白质生物合成的核糖体的结构组分，并且定位于核糖体。秀丽隐杆线虫中的P-外祐本基因编码蛋白质，所述蛋白质形成膜泡外衣的多聚复合体的亚基。已在多种生物中发现类似的序列，如拟南芥(Arabidopsisthaliana)、黑腹果錄(Drosophilamelanogaster)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。在多种生物中发现相关的序列，如马铃薯叶曱、辣根猿叶甲、墨西哥豆胍虫、墨西哥棉铃象、赤拟谷盗、桃奸、褐飞虱、二化螟、菜蛾和居屋艾蟠。本发明使用的其它乾基因可包括例如在生存、生长、发育、繁殖和感染性中扮演重要角色的基因。这些乾基因包括例如持家基因、转录因子和害虫特异性基因或者线虫或果蝇中致死性敲除突变。本发明4吏用的乾基因还可以是来自其它生物的基因，例如来自昆虫或蛛形纲动物(例如，马铃薯叶甲属物种、猿叶甲属物种、食M虫属物种、花象属物种、拟谷盗属物种、瘤辨属物种、褐飞虱属物种、禾草螟属物种、iV"te/to属物种或^c/^"属物种)的基因。优选的乾基因包括表1A中指定的基因以及来自其它靶生物(如来自其它害虫)的直向同源基因。在本发明的方法中，使用dsRNA抑制昆虫生长或干扰昆虫的致病性或感染性。因此，本发明涉及包含退火互^^的分离的双链RNA，其中一条退火互补链包含与昆虫靶基因的靶核苷酸序列之至少一部分互补的核苷^列。所述乾基因可以是本文所述的任意耙基因，或者其发挥同样功能的一部分。根据本发明的一个实施方案，提供了包含退火互补链的分离的双链RNA，其中一条退火互补链包含与昆虫乾基因核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列，其中所述乾基因包^自以下的序列(i)与如下表示的任意序列具有至少75%—致性的序列SEQIDNO1，3,5,7，9,11,13,15,17,19'21,23,49至15B,159,160-163,168，173,178,化3，188'193,198,203，208,215,220，225,230,247,249,251,253,255，257,259,275至472'473,478,483,488，493,4幼，503,513,515,517,519,521,533至575，576，581,586,591,596,601,603，605，607,609,621至767'768，773，778,783,788,793,795,797,799,801,813至862,863,868,873,878,883,888,890,892，894,的6,恥8至1040,1041,1046,1051，1056,1061,1071，1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087，1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101,1103,"05,1107,1109,1111，1113,1161至1571,1572，1577,1582，1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637，1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688，1690,1692,1694,1696.1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040,2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075，2080,2085,2090,2095,2100,2102,2104,2106,2108,2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359，2364,2366,2368，2370,2372,2384至2460,2461，2466,2471，2476或2481,或其互补序列，以及(ii)包含以下任意序列之至少17个连续核普酸的序列SEQIDNOl、3、5、7、9,U'13'15'I7'I9'21,23,49至158,159,160-163,168,173，178,183,188,193,198,203,208，2化，220,225,230,247,249,251,253，255，257,259,275至472,473,478,483,488,493，498,503,513,515，517,519,521，533至575,576，581，586,591,596，601,603,605,607，609,621至767,768,773,778，783,788,793,795,797,7的，801,813至862,863,868,873,878,幼3,888.890,892,894,896,卯8至1040,1041，1046,1051，1056，1061,1071,1073,1075,1077,1079,1081'1083,1085,1087,1089,1091,1093，1095,1097,1099,1101,1103,1105,1107,1109,"11，"13，1161至1571,1572,1577'1582，1587,1592'1597，1602,1607.1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662，1667，1672，1677,1682,1684,1686,16幼，1690，1692,1694,16郎，1698，1700,1702.1704,1730至2039,2040,2045,2050,2055,2060,2065,2070'2075,2080,2085，2090,2095，2100,2102，2104，2106,2108,2120至2338,2339,2344.2349,2354,2359'2364,2366，2368,2370,2372,2384至24即，2461,2466,2471,2476或2481,或其互补序列，或者，其中所述昆虫乾基因是包含以下任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的昆虫直系同源物SEQIDNO49至158、275至472、533至575、621至767、813至862、卯8至1040、1161至1571、1730至2039、2120至2338、2384至2460或其互补序列。取决于用于测量基因沉默的测定，与已用对照dsRNA处理的害虫相比，生长抑制可定量为大于约5%、10%,更优选约20%、25%、33%、50%、60%、75%、80%，最优选约90%、95%或约99%。根据本发明的另一实施方案，提供了分离的双链RNA，其中至少一条所述退火互补链包含如下表示的任意序列之至少一种核苷酸序列的RNA等价物SEQIDNOl、3、5、7,9,11,13,15，17,19,21.23,49至158,159.160-163,168,173，178,183,188,193,198,203,208，215,220,225,230,247，249,251,253,255,257，259,275至472,473，478,483,488,493,498,503,513,515.517,519,521，533至575,576,581,586,591,596，601，603,605,607,609,621至767,768，773,778,783,788,793,795，797,799,801,813至862,863,868,873,878,883,888,890,892,894,的6,908至1040,1041,1046,1051,1056,1061,1071,1073,1075,1077,1079，1081，1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101,"03，1105,1107，"09，"U,1113,"61至1571，1572'1577,1582,1587,1592,化97,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662'1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690.1692，1694,1696，1698，1700,1702,1704,17加至2039,2040,2045.2050,2055,2060,2065,2070，2075,2080,2085.2090,2095,2100,2102,2104,2106.2108,2120至2338,2339'2344,2349，2354,2359,2364,2366,2368.2370,2372.2384至2460.2461,2466,2471,2476或2481，或者其中至少一条所述退火互补链包含其长度为至少17个>5^对、优选其长度为至少18、19、20或21,更优选至少22、23或24个>^^的RNA等价物的片段。如果本发明的方法用于在宿主细胞或宿主生物中或者对宿主细胞或宿主生物特异性控制特定昆虫的生长或侵害，则优选所述双链RNA不与任何宿主基因具有任何显著的同源性，或者至少不与宿主的任意必需基因具有任何显著的同源性。在这种情况下，优选所述双链RNA与宿主细胞任意基因的核酸序列一致性低于30%,更优选低于20%，更优选低于10%，甚至更优选低于5%。序列一致性百分比应当在所述双链RNA的全长区域上计算。如果可获得宿主生物的基因组序列数据，则可以4吏用标准生物信息学工具^M目互校验与所述双链RNA的序列一致性。在一个实施方案中，所述dsRNA与宿主序列之间不存在超过21个连续核苷酸的序列一致性，即在这种情况下，优选宿主生物的基因组中不存在所述dsRNA的21个连续>5^对。在另一实施方案中，所述dsRNA与宿主物种任意核苦酸序列之间在24个连续核苷酸上的序列一致性低于约10%或低于约12.5%。所述双链RNA包含退火的互4h^，其中一条退火互^h^包含对应于待下调之乾基因的乾核普酸序列的核苷酸序列。所述双链RNA的另一条链能够与上述第一M进行威基配对。所述昆虫乾基因的"靶区域"或"乾核苷酸序列"可以是基因的任何适当的区域或核苷酸序列。所述乾区域应包含乾基因的至少17、至少18或至少19个连续核苷酸，更优选至少20或至少21个核苷酸，并且更优选所述靶基因的至少22、23或24个核香酸。优选(至少部分的)所述双链RNA与昆虫乾基因的靶区域具有100%的序列一致性。然而应当理解的是，在所述双链区域的全长上具有100%序列一致性不是功能性RNA抑制的必要条件。还发现，相对于把序列来说带有插入、缺失和单点突变的RNA序列对RNA抑制是有效的。术语"对应于"或"与……互补，，在本文可互换使用，并且当这些术语用于指所述双链RNA和乾基因的靶区域之间的序列对应性时，应解释为并非绝对需要100%的序列一致性。然而，所述双链RNA和靶区域之间的序列一致性百分比通常为至少80%或85%—致，优选至少卯％、95%、96%—致，或者更优选至少97%、98%—致，以及更优选至少99%—致。当两条核酸链的至少85%碱基配对时，它们是"基本上互补的"。本文使用的术语"互补的"涉及DNA-DNA互补性和DNA-RNA互补性。类似地，术语"RNA等价物，，实际上指在DNA序列中M"T"可以被通常存在于核糖核酸中的对应M"U"所替代。尽管所述dsRNA包请"寸应于乾基因中靶区域的序列，然而整个dsRNA都对应于乾区域的序列却不是绝对必需的。例如，所述dsRNA可在乾标特异性序列的侧翼包含短的非靶区域，只要该序列不实质性影响该dsRNA的RNA抑制性能即可。所述dsRNA可包含一个或多个替代4^J^而优化RNAi的性能。对于本领域技术人员来说，如何依次改变所述dsRNA的每个^并测试所得dsRNA的活性(例如，在适当的体外测试系统中)从而优化给定dsRNA的性能是显而易见的。所述dsRNA还可以包含DNA威基、非天然的碱基或者糖-裤酸主链的非天然主链连接或修饰，从而例如提高保藏期间的稳定性或者增强对核酸酶降解的抗性。先前已有报道，对于有效的基因沉默来说，形成约21bp的小干扰RNA(siRNA)是理想的。然而，在申请人的应用中已显示，dsRNA的最小长度优选至少约80-100bp以便被某些害虫有效摄取。有迹象表明，在无脊推动物(如自由生活的秀丽隐杆线虫或植物寄生性的南方根结线虫(Afc/wVto^"e/"c^"/to))中，这些较长的片^bfc基因沉默中更加有效，这可能由于无脊推动物摄^it些较长的dsRNA更为有效所致。最近还提出，与常规的21聚体(21-mer)siRNA相比，由27聚体平端组成的合成RNA双链体或者具有29bp的茎和2-nt3'突出端的短发夹(shorthairpin,sh)RNA纟且成的合成RNA双链体是RNA干扰更有力的诱导物。因此，基于上述已鉴定耙标、并且为27聚体平端RNA分子或者具有29bp的茎和2-nt3，突出端的短发夹RNA分子的分子也包括在本发明的范围内。因此，在一个实施方案中，所述双链RNA片段(或区域)本身的长度优选为至少17bp，长度优选为18或19bp，更优选至少20bp，长度更优选至少21bp,或至少22bp，或至少23bp，或至少24bp、25bp、26bp或至少27bp。"双链RNA片段，，或"双链RNA区域，，是指对应于(部分)乾基因的双链RNA小实体'通常，所述双链RNA优选为约17-1500bp，更优选约80-1000bp，最优选约17-27bp或约80-250bp;如双链RNA区域约为17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、27bp、50bp、80bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、卯0bp、100bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp或1500bp。所述双链RNA的长度上限可取决于i)昆虫摄取该dsRNA的需要，以及ii)该dsRNA在细胞内部加工成指导RNAi的片段的需要。所选长度还可受RNA合成方法以及向细胞递送RNA的模式的影响。优选地，本发明方法中待使用的双链RNA的长度小于10,000bp，更优选1000bp或更小，更优选500bp或更小，更优选300bp或更小，更优选100bp或更小。对于任何给定的乾基因和昆虫来说，所述dsRNA进行有效抑制的最佳长度可通过实验来确定。所述双链RNA可以是完全或部分双链的o部分双链RNA可在双链部分的一端或两端包含短的单链突出端，只要所述RNA仍能被昆虫摄取并指导RNAi即可。所述双链RNA还可包含内部的非互补区。本发明的方法包括向同一昆虫同时或依次提供两种或更多种不同的双链RNA或RNA构建体，从而实现下调或抑制多种耙基因或者更有效地抑制单种耙基因。或者，通过提旨中多种乾序列的一种双链RNA来命中多个把标，并且多于一个拷贝的对应于乾基因的双链RNA片段的存在可更有效地抑制单个耙标。因此，在本发明的一个实施方案中，所述双链RNA构建体包含多个dsRNA区域，每个dsRNA区域的至少一^^包含与昆虫耙基因的乾核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列。根据本发明，所述RNA构建体中的dsRNA区域可以与同样或不同的靶基因互补，和/或所述dsRNA区域可以与来自相同或不同昆虫物种的靶标互补。术语"命中，，是指所述dsRNA的至少一条链与耙基因或核苷酸序列互补，并由此可与之结合。在一个实施方案中，所述双链RNA区域包含与乾基因互补的核苷酸序列的多个拷贝。或者，所述dsRNA命中同一耙基因的多于一种耙序列。因此，本发明包括分离的双链RNA构建体，其包含与昆虫乾标的核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列的至少两个拷贝。在本文中，本发明的术语"多种(个)，，意指至少2种(个)、至少3种(个)、至少4种(个)、至少5种(个)、至少6种(个)等。"另一耙基因"或"至少另一种耙基因"是指例如第二、第三或第四种靶基因等。本发明的方法开发并使用了命中多于一种上述乾标的dsRNA或者针对上述不同乾标的不同dsRNA的组合，因此，本发明涉及分离的双链RNA构建体，其包含如下表示的至少一种核普^列之RNA等价物的至少两个拷贝SEQIDNO1，3,5，7,9'11,13，15,17,19,21,23,49至158,159,160-163,168,173，178,183,188，193,198，203,208,215,220,225,230,247,249'251,253,255、257，259，275至472,473,478,483，488,493,498,503,513,515,517,519,521,533至575'576.581,5肪,591,5诉,601,603,605,607'609'621至767，768,773,778，783,788.793,795,797，799,801,813至862,863,868，873,878，883,888，890,的2,894,896,908至1040,1041,1046,1051、1056,1061'1071，1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087，1089,1091,1093,1095,1097,1099."01,"03,1105."07,"09,"11，1113,1161至1571,1572'1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647，1652,1657,1662，1667,1672,1677'1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,化96,1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040,2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080，2085,2090,2095，2100,2102,2104'2106,2108,2120至2338，2339,2344,2349，2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460,2461,2466.2471,2476或2481，或者其长度为至少17个>5^对、优选其长度为至少18、19、20或21个>5^对，更优选至少22、23或24个>5^^之片段的1>^等价物的至少两个拷贝，。优选地，所述双链RNA包含核苷酸序列SEQIDNO159或160的RNA等价物，或者其长度为至少17、优选至少18、19、20或21、更优选至少22、23或24个^^JJ寸的片段。在另一实施方案中，本发明涉及分离的双链RNA构建体，其包含核苷酸序列SEQIDNO159或160的RNA等价物的至少两个拷贝。因此，本发明延伸至本文所述的方法，其中所述dsRNA包含退火的互补链，其中一条退火互补链包含与昆虫乾基因的耙核苷酸序列之至少一部分互补并包含彼此独立选择的至少两种核苷酸序列的RNA等价物的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述dsRNA包含独立选自如下表示的序列之至少两种、优选至少三种、四种或五种核苷酸序列的RNA等价物SEQ1DNO1,3,5,7,9,",13,15,17,19,21,23,49至158'159,160-163,168'173，178,183,188，193,198，203.208,215,220,225,230，247,249,251,253,255、257，259'275至472,473,478,483，488,493,4幼，503,513,515,517,519,521,533至575,576,5B1，586,591,596,601,603，605,607，609,621至767,768,773,778，783.788,793,795,797,799,801,813至862,863,868，873,878，883，888,890,舰，894,896,908至1040,1041,1046,1051、1056,1061,1071,1073,1075,1077,1079、1081,1083,1085,1087，10的，1091,1093'1095,1097,1099,簡,"03,"D5，1107,1109,"11，1113,1161至1571,1572，1577,1582,1587,1592,1597'1602,1607,1612,1617,化22,化27,1632,1637,1642,f647、1652,1657,1662，1667,1672，1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,16站，1698,1700,1702,1704,1730至2039，2040,2045,2050,2D55,2060,2065，2070,2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102,2104,2106,2108,2120至2338，2339,2344,2349，2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460,246t,2466,2471，2476或2481，或者其长度为至少17个>8^1^对，优选至少18、19、20或21、更优选至少22、23或24个碱M的片段。所述至少两种核香酸序列可以来源于本文所述的乾基因。根据一个优选的实施方案，所述dsRNA命中对昆虫生存、生长、发育或繁殖必需的至少一种靶基因，并命中参与上文所述的致病性或感染性的至少一种基因。或者，所述dsRNA命中同类的多种基因，例如所述dsRNA命中至少两种必需基因或者至少两种参与同样细胞功能的基因。根据又一实施方案，所述dsRNA命中至少两种乾基因，所述乾基因参与不同的细胞功能。例如，所述dsRNA命中参与蛋白质合成(例如核糖体亚基)、细胞内蛋白质转运、细胞核mRNA剪接或者参与表1A中所述功能之一的两种或更多种基因。优选地，本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫乾基因包^i^自以下的序列(i)与如下表示的任意序列具有至少75%—致性的序列SEQIDNO1，3,5，7,9,11,13,15，17'19，21,23,49至158,159,160-163,168'173,178'183,化8'193,1明，203,208,215,220,225，230,247,249,251,253,255,257，259,275至472,473,478,483,488,493,498,503,513,515，517,519,521，533至575,576，581,586,591,596,601,603,605,607,609,621至767,768,773,778，783,788,793,795，797,799,801,813至862,863，868,873,878,883,888,的O,的2,894，896，908至1040'1041,1046,1051,1056,1061，1071，1073,1075,1077,1079，10&，1083,1085,1087,1089,1091，1093,1095,1097,1099,1101,1103，"05,"07,"09,川1,"13,1161至1571，1572,1577,1582,1587,1592，1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632，1637，1642,1647，1652,1657,1662,1郎7,1672,1677,1682,1684.1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700，1702,1704,1730至2039,2040,2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085,20的，2095,2100，2102,2104,2106，2108,2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366，2368,2370,2372,2384至2460,2461，2466,2471,2476或2481，或其互补序列，以及(ii)包含以下任意序列之至少17个连续核苷酸的序列SEQIDNO1、3、5、7、9,"，13，15,17,19，21，23，49至158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,20&,215'220,225,230,247,249，251,253,255,257,259，275至472,473，478,483,4幼，493,498,503,513,515,517,519,521,533至575,576,581，586,591,596,601，603，605,607,609，621至767，768,773,778,783,788'793,795,797,799,801,813至郎2,863,868，873'878，883,888,890,892，的4，的6,908至1040,1041,1046,1051，1056,1061,1071,1073,1075,1077,1079,1081，1083,1085,1087,1089,1091,1093，1095,1097,10的，1101，1103,1105,1107,1109,1111,1113，1161至1571,1572,1577,1582,1587'1592，1597,1602,1607,1612，1617,1622,1627,1632,1S37,1642,化47,1652,1657,1662.1667,1672,1677，1682,1684,1686,1688，1690，1692，1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040,2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090，2095,2100,2102,2104,2106,2108,2120至2338,2339,2344,2349,2354，2359,2364，2366,2368.2370,2372,2384至2460，2461，2466,2471,2476或2481，或其互补序列，或者其中所述昆虫耙基因是包含以下任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的昆虫直系同源物SEQIDNO49至158、275至472、533至575、621至767、813至862、卯8至1040、1161至1571、1730至2039、2120至2338、2384至2460或其互补序列。所述双链RNA中的dsRNA区域(或片段)可如下进行组合a)当组合那些靶向单一牝基因的多个dsRNA区域时，在RNA构建体中可以以原始的顺序(即，该区域在乾基因中出现的顺序)对它们进行组合，b)或者，可以不管所述片段的原始顺序，将它们随机地或有目的地以任意顺序组合成双链RNA构建体，c)或者，一种片段可以在所述dsRNA构建体中重复若干次，例如1~10次，例如l、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，或者d)所述dsRNA区域(靶向一种或不同的耙基因)可以以有义或反义的方向进行组合。另外，所述待组合的乾基因可选自以下种类的一种或多种基因e)上述"必需的"基因或"致病性基因"包括对于一种或多种靶昆虫来说关键性的基因，当其被沉默时导致致死的或严重的(例如，进食、繁殖、生长)表型。选择强致死性乾基因导致有效的RNAi效果。在本发明的RNA构建体中，靶向相同或不同的(非常有效的)致死基因的多个dsRNA区域可以进行组合，以进一步增强RNAi作用在防治害虫中的效力、功效或速度。f)"弱"基因包括在本文所述的细胞途径之一中具有特别感兴趣的功能、但当其被单独沉默时导致弱表型效果的靼基因。在本发明的RNA构建体中，靶向一种或不同弱基因的多个dsRNA区域可以进行组合从而获得较强的RNAi效果。g)"昆虫特异性"基因包括在非昆虫生物中没有显著同源性对应物的基因，其可以通过生物信息同源性检索来确定，例如通过BLAST检索。选择昆虫特异性乾基因导致物种特异性的RNAi作用，而在非靶生物中没有作用或没有显著的(不利)作用。h)"保守基因"包括在靶生物和非靶生物之间(在氨基酸水平上)保守的基因。为了降低对非靶物种的可能的作用，分析这些有效但保守的基因，并选择这些保守基因可变区域的乾序列作为RNA构建体中的dsRNA区域的乾标。此时，在核酸序列水平评估保守性。因此，这些可变区域包括保守耙基因中最不保守的部分(核^f列水平)。i)"保守途径，，基因包括参与相同生物学途径或细胞过程的基因，或者包括在不同昆虫物种中具有相同功能的基因，其导致特异性且有力的RNAi作用并更有效地防治昆虫；j)或者，本发明的RNA构建体靶向来自不同生物学途径的多种基因，其导致广泛的细胞RNAi作用并更有效地防治害虫。根据本发明，所有双链RNA区域包含与本文所述任何耙基因之至少一部分核苷酸序列互补的至少一M。然而，如果一个双链RNA区域包含与本文所述任一乾基因的核香酸序列一部分互补的至少一M，则另一个双链RNA区域可包含与任何其它昆虫粑基因(包括已知乾基因)的一部分互补的至少一M。根据本发明的另一实施方案，4^供了本文所述的分离的双链RNA或RNA构建体，其还包含至少一种另外的序列以及任选地包含接头。在一个实施方案中，所述另一序列选自(i)有利于大，生产所述dsRNA构建体的序列；(ii)提高或降低所述dsRNA稳定性的序列；(iii)允许结合蛋白质或其它分子从而有利于昆虫摄取所述RNA构建体的序列；(iv)适配子序列，其结合昆虫表面上或细胞质中的受体或分子，从而有利于昆虫的摄取、胞吞和/或转M;或者(v)催化dsRNA区域加工的其它序列。在一个实施方案中，所述接头是条件性自切割RNA序列，优选pH敏感性接头或疏水敏感性接头。在一个实施方案中，所述接头是内含子。在一个实施方案中，所述双链RNA构建体的多个dsRNA区域通过一个或多个接头进行连接。在另一实施方案中，所述接头存在于所述RNA构建体中使得所述dsRNA区域与另一目的区域分隔的位点。本发明提供了用于所述dsRNA构建体的不同类型接头。在另一实施方案中，所述双链RNA构建体的多个dsRNA区域不使用接头而进行连接。在本发明的一个具体实施方案中，所述接头可用于隔开害虫中多个较小的dsRNA区域。有利的是，在该情形中所述接头序列可以在特定的条件下促使将长的dsRNA拆分为较小的dsRNA区域，这导致在这些条件下释放单独的dsRNA区域，并且这些较小的dsRNA区域导致更有效地基因沉默。适当的条件性自切割接头的实例是在高pH务ff下自切割的RNA序列。这些RNA序列的适当实例由Borda等(NucleicAcidsRes.2003May15;31(10):2595-600)描述，该文献通过参考并入本文中。所述序列源自锤头核酶HH16的催化核心。在本发明的另一方面，接头定位于所述RNA构建体中使得所述dsRNA区域与例如另一目的序列分隔的位点，所述另一目的序列优选地向所述RNA构建,供某种额外的功能。在本发明的一个具体实施方案中，本发明的dsRNA构建体包^^适配子从而有利于昆虫摄取该dsRNA。设计所述适配子使之结合昆虫摄取的物质。这样的物质可来源于昆虫或植物。适配子的一个具体实例是结合跨膜蛋白(例如，昆虫的跨膜蛋白)的适配子，或者，所述适配子可以结合昆虫摄取的(植物)代谢物或营养物。或者，所述接头在内体中进行自切割'这在本发明的构建体通过l&^作用或转胞吞作用被昆虫摄取并因此在昆虫的内体中被区室化时可能是有利的。所述内体可具有低的pH环境，导致所述接头被切割。当通过细胞壁转运从一个细胞向另一细胞转移时，例如当穿过昆虫害虫的细胞壁时，上述在疏水条件中自切割的接头对于本发明的dsRNA构建体尤其有用。内含子也可用作接头。本文使用的"内含子"可以是信使RNA的任何非编码RNA序列。用于本发明构建体的适当的具体内含子序列为(1)富含U(35-45%);(2)平均长度为lOObp(在约50和约500bp之间变化)，可随机选择其碱基对或者可以基于已知的内含子序列；(3)在5，端以-AG:GT-或-CG:GT-起始，和/或(4)在其3'端具有-AG:GC-或-AG:AA。约1个>5*^^至约10,000个>5^对的非互补RNA序列也可用作接头。不希望拘泥于任何特定的理论或机制，认为昆虫从其邻近的环境摄取长的双链RNA。双链RNA被摄取进入肠道并转移至肠上皮细胞，然后通过内源核酸内切酶的作用在细胞内加工成为短的双链RNA(称为小干扰RNA(siRNA))。然后，所得的siRNA通过形成多组分的RNA酶复合体(称为RISC或RNA干扰性沉默复合体)来介导RNAi。为了实现在昆虫细胞内下调靶基因，加至细胞壁外部的双链RNA可以是可被摄取进入细胞然后在细胞内加工成siRNA从而介导RNAi的任何dsRNA或dsRNA构建体，或者加至细胞外部的RNA本身可以是可被摄取进入细胞从而指导RNAi的siRNA。siRNA通常是短的双链RNA，其长度范围为19~25个碱基对，或2024个碱基对。在优选的实施方案中，可使用对应于待下调靶基因的siRNA，其具有19、20、21、22、23、24或25个碱基对，尤其是21或22个碱基对。然而，本发明不意在限于这样的siRNA的用途。siRNA可以在双链部分侧翼的一端或两端包含单链突出端。在一个特别优选的实施方案中，所述siRNA可包含3，突出的核苷酸，优选两个3，突出的胸苷(dTdT)或尿苷(UU)。如果紧接所述dsRNA双链部分所包含序列的上游乾基因序列是AA，则在siRNA中可包含3，TT或UU突出端。这使得所述siRNA中的TT或UU突出端与乾基因杂交。尽管所述siRNA的另一端也可包含3，TT或UU突出端，然而所述siRNA双链部分所包^^序列的下游乾序列中包含AA不是必需的。在本文中，RNA/DNA嵌合体形式的siRNA也涵盖在内。这些嵌合体包括:例如，包含具有3，DNA>5^突出端(例如，dTdT)的双链RNA的siRNA(如上所述)，以及其中一个或多个RNA威基(或核糖核苷酸)或者甚至整M上所有核糖核普酸被替换为DNA碱基(或脱氧核糖核苷酸)的多核苷酸形式的双链RNA'所述dsRNA可由通过(非共价)碱基配对退火到一起的两条单独的(有义和反义)RNA链形成。或者，所述dsRNA可具有折回的茎-环或发夹结构，其中所述dsRNA的两条退火链是共价连接的。在该实施方案中，所述dsRNA的有义链和反义链由部分自我互补的单个多核苷酸分子的不同区域形成。如果所述dsRNA欲通过体内表达(例如在如下所述的宿主细胞或生物中)或通过体外转录进行合成，则具有该结构的RNA是方便的。除了不应当破坏所述分子的双链部分介导RNAi的能力以外，连接所述两条RNA链的"环"的确切性质和序列对于本发明来说通常是不重要的。用于RNAi中的"发夹"或"茎-环"RNA的特征通常是本领域已知的(参见，例如CSIRO名下的WO99/53050，其内^if过参考并入本文中)。在本发明的另一些实施方案中，所述环结构可包含接头序列或如上所述的其它序列。所述双链RNA或构建体可以通过本身已知的方式进行制备。例如，在一个方法中，可以分别合成两条单独的RNA链，然后退火从而形成双链。在另一实施方案中，可以在宿主细胞或生物中从适当的表达载体通过细胞内表达来合成双链RNA或构建体。以下将进一步详细地讨论该方法。昆虫接触的所述双链RNA的量要能够实现特异性下调所述一种或多种乾基因。所述RNA可以以每个细胞递送至少一拷贝的量被引入。然而，在某些实施方案中，较高剂量(例如，每个细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)的双链RNA可得到更有效地抑制。对于任意给定的昆虫基因乾标来说，可通过常规实验来确定有效抑制的最佳dsRNA量。所述昆虫可以以允许昆虫直接摄取所述双链RNA的任何适当的方式与所述双链RNA接触。例如，所述昆虫可以接触纯净或基本纯净形式的所述双链RNA,例如含有所述dsRNA的水溶液。在该实施方案中，可以仅用含有所述双链RNA的水溶液将所述昆虫"浸湿"。在另一实施方案中，可通过用包含所述双链RNA的液体组合物向昆虫喷洒从而使所述昆虫与所述双链RNA进行接触。或者，所述双链RNA可以与所述昆虫的食物组分(如哺乳动物病原性昆虫的食物组分)连接，从而增强该昆虫对所述dsRNA的摄取。还可以将所述双链RNA掺入所述昆虫生长的培养基中，或者被该昆虫侵扰的物品或基层中(或其上)，或者浸入对昆虫侵害敏感的基层或物品中。根据另一实施方案，所述dsRNA表达在细菌或真菌的细胞中，并且所述细菌或真菌的细胞被所述昆虫摄取或摄食。如实施例中举例说明的，可以改造细菌从而产生本发明的任何dsRNA或dsRNA构建体。这些细菌可被昆虫摄食。一S^C摄取，所述dsRNA可以起始RNAi应答，其导致靶mRNA降解并削弱或杀死摄食昆虫。48200780002294.X说明书第32/311页序列。200780002294.X说明书第32/311页序列。所述双链RNA或构建体可以通过本身已知的方式进行制备。例如，在一个方法中，可以分别合成两条单独的RNA链，然后退火从而形成双链。在另一实施方案中，可以在宿主细胞或生物中从适当的表达载体通过细胞内表达来合成双链RNA或构建体。以下将进一步详细地讨论该方法。昆虫接触的所述双链RNA的量要能够实现特异性下调所述一种或多种乾基因。所述RNA可以以每个细胞递送至少一拷贝的量被引入。然而，在某些实施方案中，较高剂量(例如，每个细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)的双链RNA可得到更有效地抑制。对于任意给定的昆虫基因乾标来说，可通过常规实验来确定有效抑制的最佳dsRNA量。所述昆虫可以以允许昆虫直接摄取所述双链RNA的任何适当的方式与所述双链RNA接触。例如，所述昆虫可以接触纯净或基本纯净形式的所述双链RNA,例如含有所述dsRNA的水溶液。在该实施方案中，可以仅用含有所述双链RNA的水溶液将所述昆虫"浸湿"。在另一实施方案中，可通过用包含所述双链RNA的液体组合物向昆虫喷洒从而使所述昆虫与所述双链RNA进行接触。或者，所述双链RNA可以与所述昆虫的食物组分(如哺乳动物病原性昆虫的食物组分)连因此，在更具体的实施方案中，所述双链RNA或RNA构建体通过原核的(如细菌)或真核的(如酵母)宿主细胞或宿主生物来表达。才艮据该实施方案，可以使用能够表达dsRNA或dsRNA构建体的任何细菌或酵母细胞。所述细菌选自革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，例如但不限于埃希氏菌属物种(五sc/^nV^/flspp.)(例如，大肠杆菌(五.、芽孢杆菌属物种(必"c,7/"sspp.)(例如，苏云金芽孢杆菌(及^wn'"g/e/w/s))、才艮瘤菌属物种(及A&oWm附spp.)、專L杆菌属物种(1fl"o6ac/〃Msspp.)、乳球菌属物种(Z^ctoc^cc"sspp.)等。所述酵母可选自酵母属物种(5Vicc/r<WYWf3;cesspp.)等。某些细菌与宿主植物具有非常紧密的相互作用，例如但不限于共生的根瘤菌与豆科植物(Legminosea)(例如，大豆)。这样的重组细菌可以与种子混合(例如，作为涂层)并用作土壤改良剂。因此，本发明还包括包含本文所述的任何核苷酸序列或重组DNA构建体的细胞。本发明还包括原核细胞(例如但不限于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞)和真核细胞(例如但不限于酵母细胞或植物细胞)。优选地，所述细胞是细菌细胞或酵母细胞或藻类细胞。在另一些实施方案中，所述昆虫可以与本文进一步描述的组合物接触。除了所述dsRNA或DNA,所i^M合物还可包含赋形剂、稀释剂或载体。这样的组合物的优选特征在以下更详细地讨论。或者，可以将产生dsRNA的细菌或酵母细胞直接喷洒到作物上。因此，如上所述，本发明提供包含本发明的RNA构建体和/或DNA构建体和/或表i^J建体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞是细菌或酵母的细胞，也可以是例如病毒。可以使用特异性感染昆虫的病毒(如杆状病毒)。这确保了对哺乳动物(尤其是人类)的安全性，因为所述病毒不会感染哺乳动物，所以不会发生不希望的RNAi作用。优选地，所述细菌细胞或酵母细胞在用作生物杀虫剂前应被灭活，例如当该试剂用于人类或其它哺乳动物可能接触的环境(如厨房)时。可通过任何方法实现灭活，如通过热处理、苯酚或甲醛处理，或通it^!L械处理，在一个可替代的实施方案中，可利用灭活的病毒(如适当修^饰的杆状病毒)来递送本发明的dsRNA区域用于介导昆虫害虫的RNAi。可能的应用包括集中的温室培育(例如从GMO角度而言意义较小的作物)以及更广泛的农田作物(如大豆)。该方法具有几个优势，例如因为不存在可能的植物宿主切割(dicing)的问题，所以它允许将大的dsRNA片段递送i^摄食害虫的肠内腔；使用细菌作为杀虫剂不涉及产生转基因作物，尤其是对于某些难以获得转基因变体的作物；存在广泛和灵活的应用，因为可以在同一块农田上同时处理不同的作物和/或可以同时乾向不同的害虫，例如通过组合那些产生不同dsRNA的不同细菌。本发明的另一方面是本文公开的昆虫乾基因的耙核苷酸序列。所述乾核苷酸序列对于设计本发明的dsRNA构建体特别重要。这些乾核苷酸序列的长度优选至少17、优选至少18、19、20或21、更优选至少22、23或24个核苷酸。优选乾核普酸序列的非限制性实例在实施例中给出。根据一个实施方案，本发明提供了编码本文所述的双链RNA或双链RNA构建体的分离的核普酸序列。根据一个更具体的实施方案，本发明涉及由如下表示的任意序列组成的分离的核酸序列SEQIDNO49至158、275至472、533至575、621至767、813至862、卯8至1040、1161至1571、1730至2039、2120至2338、2384至2460，或者其至少17、优选至少18、19、20或21、更优选至少22、23或24个核苷酸的片段。本领域技术人员A〖人识到，可以找到这些乾基因的同源物，并且这些同源物也用于本发明的方法。如果蛋白质或核苷酸序列显示"显著"水平的序列相似性或更优选地序列一致性，则它们可能是同源的。真正同源的序列通过从共同的祖先基因趋异从而具有相关性。序列同源物可以有两种类型(i)当同源物存在于不同物种中时，它们被称为直系同源物(orthologue)。例如，小鼠和人中的a-珠蛋白基因是直系同源物。(ii)旁系同源物是在一个物种内部的同源基因，例如小鼠中的a-和J3-珠蛋白基因是旁系同源物(paralogue)。优选的同源物是包含与选自如下表示的序列具有至少约85%或87.5%，更优选约卯％，更优选至少约95%以及最优选至少约99%—致性的序列的基因:SEQIDNO1,3,5,7,9,11,13,15,17，19,21,23,49至158,159,160-163,168.173,178,183,188,193,198,203，208.215,220.225,2加'247,249,251,253,255,257,259,275至472,473,478,483,4幼，493,498,503,513,515,517,519,521>533至575,576,581,586,591.596,601,603,605，607,609，621至767，768,773,778,783,788，793,795,797,799,801,813至862,863，868,873,878，肪3,幼8，B90,的2,抑4，&96，恥8至化40,1041,1046，1051,1056,1061,1071，1073,1075，1077，1079,1081,1083,1085，1087,10的，1091,1093，1095，1097,1099,1101,"03."05，1107,"09，11",1113,1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592,1597'1602，1607，1612,1617,1622,1627,1632,1637.1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040,2045,2050,2055，2060,2065,2070,2075,2080，2085,2090,2095，2100,2102,2104,2106,2108,2120至2330,2339,2344,2349,2354,23胡'2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460,2461,2466，2471,2476或2481,或其互补序列。用于确定序列一致性的方法是本领域常规的，其包括使用Blast软件和^M丑OS151软件(77^五w，cfl"M/ec"/flr历oto^y5V/hiwe5Wte(2000)，Rice，P.Longden，I.andBleasby，A.TrendsinGenetics16,(6)pp276-277)。本文4吏用的术语"一致性"是指序列之间在核苷酸水平上的关系。通过在比较窗中对最优比对的序列(例如，两条或更多)进行比较来确定"一致性百分比，，，其中所述比较窗中的序列部分与最优序列比对的参考序列相比可包含插入或缺失。所述参考序列不包含插入或缺失.所述参考窗选自至少10个连续核苷酸至约50、约100或者至约150个核苷酸，优选约50~150个核苷酸。然后，通过测定所述窗中的序列之间一致的核苷酸数目并将该数目除以所述窗中的核苷酸数并乘以100来计算"一致性百分比"。另一些同源物是包含如下表示的任意序列的等位基因SEQIDNO1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,49至158,159.160-163,168,173，178,183,1朋，193,198,203，208,215,220'225，230,247,249,251,253,255,257,259,275至472,473，478,483，488,493,498，503，513,515,517'519,521,533至575，576,581,586、591，596,601,603,605'607,609,621至767,768,773,778,783,7肪，793,795,797,799,801，813至862,863,868,873，878,883,8幼，890,的2.894,896,恥B至1040,1041,1046,1051，1056，1061,1071,1073,1075,1077,1079，1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101，1103,1105,"07,"09，""，1113,1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602，1607,1612，16订，1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1明7,1672,1677,1682,1684,1686,1688,16恥.1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730至2039.2040,2045,2050，2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085，2090,2095,2100,2102,2104,2106,2108,2120至2338,2339，2344,2349,2354.2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460,2461.2466，2471,2476或2481。另一些优选的同源物是与包含如下表示的任意序列的基因相比包含至少一种单核苷酸多态性(SNP)的基因:SEQIDNO1.3,5,7，9,11,13,15，17,19,21，23,49至158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198，203,208,215,220,225，230,247,249,251，253,255.257，259,275至472'473,478,483,488,493,498,503,513,515,517,519,521,533至575,575,581,5秘，591,5诉,抑1,603.805,607,609,621至767，768,773,778,783,788,793,795,797,799,801,B13至B62,&63,868,873,B78,883,幼8,的O,的2,894,的6,908至1040,1041,1046,1051,10邻，1061,1071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097，1099,1101、1103,1105，"07,1109,"11，1113,1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592,1597，1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632，1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688，1690,1692,1694,1696,1698'1700,1702'1704,1730至2039，2040,2045，2050，2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090,2095，2100,2102,2104，2106,2108,2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460,2461,2466,2471,2476或2481。根据另一实施方案，本发明包括那些包含如下表示的任意核普^列的基因的昆虫直系同源物的乾基因SEQIDNO1,3,5,7,9,",13,15,17，19,21,23，49至158，159,160-163,168,173,178,183'188,193,198,203.208,215,220,225,230,247,249,251,253,255,257,259,275至472'473,478,483,4&8，493,498,503,513,515,517,519,521,533至575，576,581,幼6，591,596,601,603,605,607,609,621至767,768,773,778，7&3，788,793,7诉，797，799,801,813至862,863,868,873,878,883,8朋，890，的2，894，896,908至1040,1041,1046,1051,化56,1061,1071,1073,1075,1077,1079'■，1083,1085,1087,10的，1091,1093,化95,1097，1099,1101."03,1105,1107'1109,1111，1113，1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667，1672,1677,1682,1684.1686,1688,1690，1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040.2045,2050,2055，2060,2065,2070,2075,2080,20B5,2090,2095，2100,2102,2104,2106,2108,2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359，2364,2366,2368,2370,2372.2384至2460,2461,2466,2471,2476或2481。举例来说，直系同源物可包含如下表示的任意核苷酸序列SEQIDNO49至123、275至434、533至562、621至738、813至852、卯8至1010、1161至1437、1730至1987、2120至22卯以及2384至2438，或其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸的片段。表4中给出了包含本发明所^列之一的至少17bp片段的昆虫或蛛形纲直系同源物基因或序列的非限制性列表。根据另一实施方案，本发明包括那些包含如下表示的任意核苷^列的基因的线虫直系同源物的耙基因1、3、5,7'9,11,13,15.17,19，21,23,49至158,159,160-163,168,173,178,183,188,193,198,203,208,215,220,225,230，247,249.251,253，255,257,259,275至472,473,478,483.488,493,498,503,513，515,517,519,521,533至575，576，581,586,591,596,601,603,605，607,609,621至767，768,773，778，783,788，793,795,797，799，801,813至862.863.868,873,878,883,888'890,892，894,896,908至1040,1041,1046,1051,1056,1061,1071,1073,1075,1077'1079,1081,1083，1085,1087.1089，1091,1093,1095,1097,10的，1101,1103,"05,1107,"09,1111,1113，飾至1571,1572,1577,1582，1587,1592,1597,1602，1607,1612,1617,化22,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1幼4,1幼6，1688，1690,1692,1694，1696,1698，1700,1702,1704,1730至2039,2040,2045,2050,2055,2060.2065,2070,2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102,2104,2106,2108，2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460,2461,2466,2471,2476或248。举例来说，线虫直系同源物可包含如下表示的任意核苷^t列SEQIDNO124至135、435至446、563至564、739至751、853、854、1011至1025、1438至1473、1988至2001、2291至2298、2439或2440，或者其至少17、18、19、20或21个核苷酸的片段。根据另一方面，本发明因此包括本文所述的用于控制线虫在生物中生长的任何方法，或者用于防止线虫侵害对线虫感染敏感的生物的任何方法，所述方法包括将线虫细胞与双链RNA接触，其中所述双链RNA包含退火的互^M，其中一条退火互补链包含与靶基因的核苷酸序列之至少一部分互补的核苷M列，其包含如下表示的任意序列之至少17、18、19、20或21个核苷酸的片段SEQIDNO124至135、435至446、563至564、739至751、853、854、1011至1025、1438至1473、1988至2001、2291至2298、2439或2440，所述双链RNA被线虫摄取并因此控制生长或防止侵害。表5中给出了包含本发明的序列之一的至少17bp片段的线虫直系同源物基因或序列的非限制性列表。根据另一实施方案，本发明包括那些包含如下表示的任意核苷^f列的基因的真菌直系同源物的耙基因1、3、5、7、9,11,13,15,17,19'21,23,49至158,159,160-163,168,173，178,183,188.193,198,203，208，215,220,225,230'247,249,251,253,255，257,259,275至472,473，478,483，488,493,498,503,513,515,517,519,521,533至575,576，581，5郎，591,5恥，601,603,605,607,609,621至767,768,773,778,783,788,793,795,797,799,的1,813至862,863'868,873,878,883,888,890,892,894,896,908至1040,1041,1046,1051,1056,1061，1071,1073,1075,1077,1079,1081,1083,1085.1087，1089,1091，化93,1095'"1097,1099,"01,1103,1105，1107,1109，"11,1113,1161至1571,1572.1577，1582，1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622，1627,1632,化37,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686，1688,16的，1692,1694，1696,化98，1700,1702，1704,1730至2039'2040，2045'2050.2055,2060，2065,2070,2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102,2104,2106.2108,2120至2338，2339,2344,2349,2354,2359,2364，2366,2368,2370,2372,2384至2460,2461,2466,2471,2476或2481。举例来说，真菌直系同源物可包^下表示的任意核苷^f列SEQIDNO136至158、447至472、565至575、752至767、855至862、1026至1040、1475至1571、2002至2039、2299至2338、2441至2460，或者其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸的片段。根据另一方面，本发明因此包括本文所述的用于控制真菌在细胞或生物上的生长、或者用于防止真菌侵害对真菌感染敏感的细胞或生物的任何方法，该方法包括将真菌细胞与双链RNA接触，其中所述双链RNA包含退火的互^h^，其中一条退火互4h^包含与耙基因的核苷酸序列之至少一部分互补的核普酸序列，其包含如下表示的任意序列之至少17、18、19、20或21个核苷酸的片段SEQIDNO136至158、447至472、565至575、752至767、855至862、1026至1040、1475至1571、2002至2039、2299至2338、2441至2460,所述双链RNAjMl真菌^L取并因此控制生长或防止侵害。表6中给出了包含本发明的序列之一的至少17bp片段的真菌直系同源物基因或序列的非限制性列表。术语"调节序列，，涉及较宽的范围，其指能够实现与其有效连接之序列的表达的调节性核酸。上述术语包括激活或增强核酸表达的启动子和核酸或其合成的融合分子或衍生物，称为激活子或增强子。本文使用的术语"有效连接，，是指在"启动子"序列与目的核酸分子之间的功能性连接，使得所述"启动子"序列能够起始核酸分子转录而产生适当的dsRNA。优选的调节序列是启动子，其可以是组成型或诱导型启动子。优选的启动子是诱导型启动子，从而严格控制所述RNA分子的表达。优选可通过使用适当的化学试剂(如IPTG)来诱导的启动子。或者，将编码硬述RNA分子的转基因置于强组成型启动子的控制下。优选地，所使用#任何启动子将指导所述RNA强烈表达。所使用启动子的性质可部分地由用于产生所述RNA的特定宿主细胞来决定。在一个实施方案中，所述调节序列包含噬菌体启动子，如T7、T3、SV40或SP6启动子，最优选T7启动子。在本发明的另一些实施方案中，使用用于表达RNA的另一些启动子，其包括但不限于来自RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III的启动子。也可以酌情使用来源于酵母或病毒基因的其它启动子。在一个可替代的实施方案中，所述调节序列包含启动子，该启动子选自公知的tac、trc和lac启动子。适用于细菌宿主的诱导型启动子包括|3-内酰胺酶启动子、大肠杆菌X噬菌体PL和PR启动子以及大肠杆菌半乳糖启动子、阿拉伯糖启动子和碱性磷酸酶启动子.因此，本发明还包括用于得到本发明的任何RNA分子或RNA构建体的方法。该方法包括以下步骤在允许所述核酸或重组(DNA)构建体转录从而产生下调目的耙基因的RNA(当所述宿主细胞被乾生物摄食时，或者当宿主细胞或从其来源的1l:取物被乾生物^L取时)的条件下，将本发明的分离的核酸或重组(DNA)构建体引入(例如，通过转化、转染或注射)本发明的宿主细胞中。任选地，也可以将一种或多种转录终止序列或"终止子，，引入本发明的重组构建体中。术语"转录终止序列，，包括转录单元末端的控制序列，其发出初级转录物的3，加工和多聚腺苷酸化作用以及转录终止的信号。所述转录终止序列用于防止转录的连读，从而所述RNA分子在宿主细胞中或者由宿主细胞正确地产生。在一个实施方案中，所述终止子包括T7、T3、SV40或SP6终止子，优选T7终止子。也可以酌情4吏用来源于酵母或病毒基因的其它终止子。可以将另外的调节元件(如转录或翻译的增强子)引入所表达构建体中。本发明的重组构建体还可包含在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点。一个实例是表#建体需要作为细胞中的附加型遗传元件(例如，质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持的情形。优选的复制起点包括但不限于H-ori和colElori。所述重组构建体任选地可包^^择性标记基因，本文使用的术语"选择性标记基因"包括赋予细胞一种表型的任何基因，该基因在所述细胞中表达从而有利于鉴定和/或选择用本发明的重组(表达)构建体转染或转化的细胞。适当的选择性标记的实例包括抗氨节青霉素的基因(Ampr)、抗四环素的基因(Tcr)、抗卡那霉素的基因(Kanr)、抗膦丝菌素的基因和抗氯霉素的基因(CAT)。另一些适当的标记基因提供了代谢性状，例如manA。还可使用可见的标记基因，其包括例如卩-葡糖醛酸酶(GUS)、荄光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。在本发明的另一些实施方案中，使用可用于表达dsRNA的另一些启动子，其包括但不限于来自RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、T7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶的启动子。这些启动子通常用于体外产生dsRNA，然后将所述dsRNA包含在杀虫剂(antiinsecticidalagent)中，例如在杀虫剂液体、喷雾剂或粉末中。因此，本发明还包括用于产生本发明的任何双链RNA或RNA构建体的方法。该方法包括以下步骤a.将本发明的分离的核酸或重组DNA构建体与无细胞组分接触；或者b.将本发明的分离的核酸或重组DNA构建体引入(例如，通过转化、转染或注射)细胞，以上在允许所述核酸或重组DNA构建体转恭W而产生所述dsRNA或RNA构建体的M下进行。任选地，本发明的重组构建体中还可以引入一种或多种转录终止序列。术语"转录终止序列"包括转录单元末端的控制序列，其发出初级转录物的3，加工和多聚腺普酸化作用以及转录终止的信号。可将另一些调节元件(如转录或翻译的增强子)引入所Wi^J建体。本发明的重组构建体还可包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点。一个实例^^#建体需要作为细胞中的附加型遗传元件(例如，质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持。优选的复制起点包括但不限于打-ori和colElori。所述重组构建体任选地可包a择性标记基因。本文使用的术语"选择性标记基因"包括赋予细胞以表型的任何基因，该基因在所述细胞中表达从而有利于鉴定和/或选择经本发明的重组(表达)构建体转染或转化的细胞。适当的选择性标记的实例包括抗氨节青霉素的基因(Ampr)、抗四环素的基因(Tcr)、抗卡那霉素的基因(Kanr)、抗膦丝菌素的基因和抗氯霉素的基因(CAT)。另一些适当的标记基因提供了代谢性状，例如manA。还可使用可见的标记基因，其包括例如P-葡糖醛酸酶(GUS)、荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。本发明涉及用于阻止昆虫在植物上生长或用于防止昆虫侵害植物的方法。根据本发明的方法待处理的植物包括选自以下的植物苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、，勞、鳄梨、香蕉、大麦、豆、甜菜、黑莓、蓝莓、嫩茎花椰菜、抱子甘蓝、巻心菜、蓖麻、胡萝卜、木薯、花椰菜、谷类、芽菜、樱桃、柑桔、克莱门氏小柑橘(clemintine)、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、茄子、菊苣、桉树、无花果、葡萄、葡萄柚、落花生、醋栗、猕猴书L莴苣、韭、柠檬、莱姆酸橙、松树、玉米、芒果、瓜、小米、蘑菇、燕麦(nutaot)、菜秋葵、洋葱、橙、观赏性植物或花或树、番木瓜、欧芽、豌豆、桃、花生、豌豆(peat)、胡椒、柿子、菠萝、车前草、李子、石榴、马铃薯、南瓜、菊苣、萝卜、油菜籽、悬钩子、稻、黑麦、高粱、黄豆(soy)、大豆(soybean)、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、红薯、橘子、茶、烟草、番茄、藤>^汰物、西瓜、小麦、山药或西葫声；优选马铃薯、茄子、番茄、胡椒、烟草、醋栗、稻米或棉花植物)，或者种子或块茎(例如，苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、芦,、鳄梨、香蕉、大麦、豆、甜菜、黑莓、蓝莓、嫩茎花椰菜、抱子甘蓝、巻心菜、蓖麻、胡萝卜、木薯、花棬菜、谷类、芽菜、樱桃、柑桔、克莱门氏小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、茄子、菊苣、桉树、无花果、葡萄、葡萄柚、落花生、醋栗、猕猴桃、莴苣、韭、柠檬、莱姆酸橙、松树、玉米、芒果、瓜、小米、蘑菇、燕麦(nutaot)、菜秋葵、橙、观赏性植物或花或树、番木瓜、欧芽、豌豆、桃、花生、豌豆(peat)、胡椒、柿子、菠萝、车前草、李子、石榴、马铃薯、南瓜、菊苣、萝卜、油菜籽、悬钩子、稻、黑麦、高粱、大豆、大豆、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、红薯、橘子、茶、烟草、番茄、藤4^t物、西瓜、小麦、山药或西葫,。所述耙生物摄取(优选摄食)靶向RNA的量要实现特异性下调一种或多种耙基因。所述RNA可以以每个细胞递送至少一拷贝的量在宿主细胞中表达。然而，在某些实施方案中，较高剂量(例如，每个靶生物细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)的双链RNA可得到更有效的抑制，对于任意给定的乾基因和靶生物来说，可通过常规实验来确定有效抑制的耙标RNA分子的最佳量。所述靼生物可以以任何适当的方式与表达所述RNA分子的宿主细胞接触，从而允许靶生物摄食。优选地，表达所述dsRNA的宿主细胞可以与所述耙生物的食物组分连接，从而增强该靶生物对所述dsRNA进行摄取。还可以将表达所述dsRNA的宿主细胞引入所述靼生物生长的培养基中，或者被害虫生物侵扰的物品或基层中(或其上)，或者浸入对害虫生物侵害敏感的基层或物品中。在可替代的实施方案中，可使用源自表达所述RNA分子的宿主细胞的适当提取物来实现下调乾生物中的把基因。此时，所述提取物可以通过裂解表达所述RNA分子的宿主细胞的任何适当的方法来产生。例如，可以使用如超声处理、弗氏压碎(Frenchpress)、冻融和溶菌酶处理的技术(参见SambrookandRussell-MolecularCloningAlaboratorymanual画thirdedition以M15-4中提供的参考文献)来制备宿主细胞粗提物(裂解物)。可以酌情对该^^物进行进一步纯化，只要所述i^取物介导把基因表达的靶向下调的能力不受不利影响即可。例如可以使用亲和纯化。向所述提取物添加某些成分以防止RNA分子降解可能也是合适的。例如，可以向源自表达RNA的宿主细胞的提取物添加RNA酶抑制剂。在一个实例中，所述乾生物可以接触纯净或1^纯净形式的表达RNA的宿主细胞，例如含有所述细胞提取物的水溶液。在该实施方案中，可以简单地用含有所述宿主细胞提取物的水溶液将所述耙生物(尤其是害虫生物，如昆虫)"浸湿"。在另一实施方案中，可通过用包含所述细胞提取物的液体组合物向所述把生物喷洒从而使所述耙生物与所i^达RNA分子的宿主细胞进行接触。如果4吏用本发明的方法来特异性控制特定害虫的生长或侵害，则优选宿主细胞中表达的RNA不与非害虫生物的基因具有任何显著的同源性，尤其是不与非害虫生物的任何必需基因具有任何显著的同源性。因此，所述非害虫生物通常是对害虫侵害敏感的生物，为此根据本发明的方法保护所述非害虫生物免受所述害虫侵害。因此，例如，非害虫物种可包括植l或哺乳动物物种。优选地，所述哺乳动物物种为人类。所述非靶物种还可包括除了人以外的动物，其可以暴露于所述保护免受侵害的生物或基层。实例包括鸟类(其可以以被保护的植物为食)以及牲畜和家畜(如猫、犬、马、牛、鸡、猪、绵羊等)。在这种情况下，优选所述dsRNA与敏感生物或非靶生物的任一基因的核酸序列一致性低于30%，更优选低于20%，更优选低于10%，甚至更优选低于5%。序列一致性百分比应当在所述耙标RNA的全长区域上来计算。如果可获得本发明待保护生物或任一非靶生物的基因组序列数据，则可以使用标准生物信息学工具iM目互校验与所述乾标RNA的序列一致性。在一个实施方案中，所述RNA分子与非害虫生物的基因之间不存在21个连续核苷酸上的序列一致性，即在这种情况下，优选所述非害虫生物的基因组中不存在所述RNA的21个连续核苷酸。在另一实施方案中，所述RNA与非害虫(敏感的)物种的任一核苷^列之间在24个连续核苷酸上的序列一致性低于约10%或低于约12.5%。特别地，可以特别注意非害虫物种的直向同源基因，因为所述害虫生物的必需基因常可成为本发明的方法的耙标。因此，在一个实施方案中，所述RNA分子与非害虫物种直向同源基因的对应核苷酸序列具有低于12.5%的序列一致性。在另一实施方案中，本发明涉及用于控制昆虫生长和/或防止或降低昆虫侵害的组合物，该组合物包含至少一种双链RNA，其中所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条退火互补链包含与昆虫乾基因的核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列。本发明还涉及包含本文所述的至少一种核普酸序列或至少一种重组DNA构建体的组合物。本发明还涉及包含至少一种细菌细胞或酵母细胞的组合物，所述细菌细胞或酵母细t所述的至少一种双链RNA或双链RNA构建体，或者表ii^文所述的至少一种核苷酸序列或重组DNA构建体。任选地，所述组合物还包含至少一种适当的栽体、赋形剂或稀释剂。所述耙基因可以是本文所述的任一乾基因。优选地，所述昆虫耙基因是昆虫生存、生长、发育或繁殖所必需的。另一方面，本发明涉及如上所述的组合物，其中所述昆虫乾基因包含与选自如下表示的的任意序列具有至少75%，优选至少80%、85%、90%,更优选至少95%、98%或99%的一致性的序列SEQIDNO1.3,5,7,9,",13,15,17,19,21,23，49至158.159,160-163,168，173,178,183,188,193，198,203,208,215,220,225,230.240至247,249,251,253,255，257，259,275至472,473,478,483,4B&,493,498,503,508至513,515,517,519,521，533至575,576,581,586.591,596.601,603,605,607,609,621至767,768,773,778,783，788，793,795,797,799,801,813至862,863，868'873,878,883，888,890,892,894,896.恥8至1040,1041,1D46,1051,1056,1061,1066至1071'1073,1075'1077,1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093.1095,1097,1099.1101，"03,1105."07,"09,"11,"13,1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602'1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686,1688，1690,16921694,1696,1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040,2045.2050,2055206Q2065,2070,2075,2080,2085,2090,2095'2100，2102,2104,2106，2108,2120至2338'2339,2344,2349,2364,2359,2364,2366,2368,2370'2372,2384至2460,2461,2466,2471,2476，2481或2486,或其互补序列，或者其中所述昆虫乾基因是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的昆虫直系同源物SEQIDNO1,3,5,7'9,11,13，15,17,19,21,23,49至158,159,180-163,168,173,178,183,188'193，198，203，208,215,220,225,230.240至247,249,251,253,255,257,259,275至472,473,478，483.488,493,49B,503,50B至51S,515,517，519,521,53S至575,576,5B1,5眺，591，5挑，601,603,605,607，609，621至767,768,773,778,783,7幼，793'795,797,799,801,813至862'挑3,868,873，878,883，888，的0,892，894,896,9D8至104D，1041,1046,1051,1056,1061,1066至1071'1073,1075,1077，1079,1081,1083,1085,1087,1089,1091，1093，1095,1097,1099,1101,1103，1105，1107,1109,"11,"13,1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617，1622,1627,1632,1637,1642,1647.1652,1657，1662，1667,1672,1677，1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700，1702,1704'1730至2039,2040,2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075.2080,2085,2090,2095,2100,2102，2104,2106,2108'2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368'2370,2372,2384至2460,2461，2466,2471,2476,2481或2486,或其互补序列。本发明还涉及组合物，其包含至少一种双链RNA、至少一种双链RNA构建体、至少一种核苷酸序列、至少一种重组DNA构建体和/或至少一种表W发明的dsRNA的宿主细胞(例如，细菌细胞或酵母)，或者编码本发明的dsRNA的病毒，任选地还包含至少一种适当的载体、赋形剂或稀释剂。所述组合物可以采用向昆虫应用的任何适当的物理形式。例如，所述组合物可以采用固体形式(如粉剂、丸剂或辨剂)、液体形式(如，喷雾剂)或凝胶形式。根据非常优选的实施方案，所述组合物采用适于昆虫摄食的形式。所述组合物可包含另外的组分，所述组分作用于在组合物长期储存期间稳定所述dsRNA和/或防止dsRNA降解。所述组合物还可包含增强或促进昆虫摄取所述dsRNA的组分。这些可包括例如通常促进RNA摄取i^细胞的化学试剂，例如lipofectamin(脂转染胺)等。所述组合物还可包含在长期储存期间保持所述宿主细胞生存力的組分。所述组合物可釆取向昆虫、基层、细胞(例如，植物细胞)或者被昆虫感染的或对昆虫侵害敏感的生物应用的任何适当的物理形式。在一个实施方案中，所述组合物可以采用喷雾剂的形式。因此，使用者可以直接用该组合物喷洒昆虫或基层。因此，本发明涉及喷雾剂，其包含含有至少一种细菌细胞或酵母细胞的组合物，所述细菌细胞或酵母细胞表达本文所述的至少一种双链RNA或双链RNA构建体，或表达本文所述的至少一种核苷酸序列或重组DNA构建体。更特别地，本发明涉及如上定义的喷雾剂，其中所述细菌细胞包含如下表示的任意序列之至少一种序列SEQIDNO1,3,5、7,"1.13、15.17,19'21,23，49至158,159,160-163,168，173,178,183,188，193,198，203，208,215，220.225,230，240至247,249,251,253,255,257，259,275至472，473,478,483,幼8，493,4幼，503，50B至513,515,517，519,521，533至575,576,586，591,596，601,603，605,607，609,621至767,768,773,778，783,788,793,795,797,799,801,813至862,863，868,873,878,883,888,890,892，894,896,恥8至104C)，湖,1046，1051,1056,1061,1066至1071'1073,1075,1077,1079,1081,10B3,1D85,1087,■,1091.1093，1095,1097,1099,1101,1103,1105,"07,1109,"11,"13,1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657，1662,1667,1672,1677,1幼2,1684,1686,化88，1690,1692，1694,1696'1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040,2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102，2104,2106'2108,2120至2338,2339,2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370,2372,2384至2460,2邻1,2466,2471，2476、2481或2486，或其至少17个连续核苷酸的片段。优选地，所述喷雾剂包含至少一种如下表示的任意序列SEQIDNO1,3,5、7,9,".13，15,17,19,21,23'49至158,159,160-163,168,173,178,"183,188,193,198,203,208,215'220,225,230，240至247,249,251,253,255.257,259,275至472，473,478，4B3.488，493，4幼，503，50B至513，515,517,519,521，533至575,576，58、586，591，596，601,603,605,607，609,621至767,768,773,778，783,788,793，795,797,799,801,813至862,秘3，868,873,878,883,888，890,的2，894,8恥，908至1040,1041,1046'1051,1056,1061,1D66至1071'1073,1075,1077，1079,1081,1083,1D85,1087,1D89,1091.1093,1095,1097,1099,1101,1103,1105,1107,1109,"11，1113,1161至1571,1572'1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632,1637.1642,1647,1652,1657，1662，1667,1672,1677，1682,1684,1686,化88'1690.1692，1694,1696,1698.1700,1702,1704,1730至2039,2040,2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090,2095,2100,2102,2104,2106,2108,2120至2338,2339，2344,2349,2354,2359，2364,2366,2368，2370,2372,2384至2460,2461，2线2471'2476、2481或2486，或其至少17个连续核苷酸的片段。本发明还涉及喷雾剂，其包含本文所述的至少一种组合物或者包含至少一种宿主细胞，还包含至少一种佐剂以及任选地至少一种表面活性剂。杀虫剂的有效性可取决于所述喷雾剂应用的有效性。佐剂可以减少或消除喷雾剂应用的许多问题，所述问题与杀虫剂的稳定性、溶解度、不相容性、悬浮、泡沫形成、飘移、蒸发、挥发、降解、粘附、渗透、表面张力和覆盖范围有关。将佐剂设计成实现特定的功能，包括润湿、分散(spread)、粘着、降低蒸发、降低挥发、緩冲、乳化、散布(disperse)、降低喷雾剂飘移以及减少泡沫形成。没有一种佐剂可以实现所有这些功能，然而常常可以将不同的相容性佐剂进行组合来同时实现多种功能。这些化学品(也叫作润湿剂和分軟剂)从物理上改变了喷雾剂液滴的表面张力。为了使杀虫剂正确地发挥其功能，喷雾剂液滴必须能够使叶子润湿并在叶上均匀散开。表面活性剂扩大了杀虫剂覆盖的范围，从而增加了害虫接触化学试剂的机会。将杀虫剂施加于蜡质或具毛的叶时，表面活性剂尤为重要。不进行适当的润湿和分散,则喷雾剂液滴常常流失或者不能充分地覆盖这些表面。然而，过多的表面活性剂可导致过度的流失或沉淀损失，因此降低了杀虫剂的功效。杀虫剂配方常包含表面活性剂以改进该杀虫剂活性成分的悬浮。这尤其用于可乳化浓缩物(EC)配方。本文使用的术语"佐剂"指添加至杀虫剂产品或杀虫剂喷雾剂混合物以改进喷雾箱中产品的混合和稳定性以及应用的任何非杀虫剂材料。本文另外使用的术语"表面活性剂"指改变44面张力的化学试剂。表面活性剂可以影响液体的润湿和分狀，并且可以改变杀虫剂在水中的分散、悬浮或沉淀。存在非离子型表面活性剂(不带电荷)、阴离子表面活性剂(负电荷)和阳离子表面活性剂(正电荷)。在特别的实施方案中，所述喷雾剂中包含的所述宿主细胞是灭活的，例如通过热灭活或者机械破坏(如本文所详细讨论地)来实现。所述赋形剂的性质和所述组合物的物理形式可根据期望处理的基层的性质而变化。例如，所述组合物可以是被刷至或喷洒至待处理的物品或基层上或者压印至待处理的物品或基层中的液体，抑或是应用于待处理的物品或基层的涂层或粉末。因此，在一个实施方案中，所述合物在适当的表面上采用涂层的形式，其粘附昆虫并最终被接触该涂层的昆虫所摄取。根据一个优选的实施方案，所U层是意在针对昆虫害虫侵害而进行处理的植物或作物。然后，所述组合物被昆虫内化或摄食，在其中该组合物可以介导RNA干扰，从而防治昆虫。所述喷雾剂优选为加压的/气雾状的喷雾剂或泵式喷雾剂。所述颗粒可以采取适当的大小，从而其粘附于待处理的基层或者粘附于昆虫，例如粘附于昆虫和/或蛛形纲动物的外骨骼，并可以从此处被吸收。在一个实施方案中，所述组合物采用饰剂的形式。设计所述斜剂使之引诱昆虫与所述組合物接触。一旦接触后，所a合物被昆虫内化(例如通过摄食)并介导RNAi从而杀死昆虫。所述辨剂可包f&物，如基于蛋白质的食物，例如鱼粉。也可以使用硼酸作为饵剂。所述辨剂可取决于作为靶标的物种。还可以使用引诱剂。所述引诱剂可以是信息素，例如雄性或雌性信息素。作为一个实例，本发明可使用《昆虫信息素及其在害虫管理中的应用(InsectPheremonesandtheiruseinPestManagement)》(Howseetal，ChapmanandHall,1998)中提及的信息素。所述引诱剂将昆虫引诱至所述辨剂，并可以靶向特定昆虫或可以引诱所有昆虫。所述饰剂可采用任何适当的形式，如固体、糊剂、丸剂或粉剂形式。所述辨剂还可被昆虫携带回群体。然后，该辨剂可以作为群体中其它成员的食物来源，因而对大量昆虫并且可能对整个昆虫害虫群体实现有效控制。使用双链RNA或表达本发明的dsRNA的细菌是有利的，因为RNAi介导的对害虫影响的延迟作用使辨剂被携带回幹体，从而实现了在接触昆虫方面的最大影响。另外，与所述昆虫接触的组合物可残留在该昆虫的角质层上。当清洁(一只昆虫清洁其自身或昆虫相互清洁)时，所述组合物可以被摄取，并可以因此介导其在昆虫中的作用。这需要所述组合物足够稳定，从而即使暴露于外界环境条件一段时间(例如，可以是几天)后，所述dsRNA或表达dsRNA的宿主细胞仍保持完好并能够介导RNAi。所述辨剂可以以适当的"外罩，，或"陷阱"来提供。这样的外軍和陷阱是市售的，并且现有的陷阱可适于包含本发明的组合物。本发明的范围包括可吸引昆虫进入的任何外革或陷阱。所述外罩或陷阱可以例如是盒形的，并且可以例如以预成型状态提供或者可以由可折叠纸板形成。用于外罩或陷阱的适当的材料包括塑料和纸板，尤其是瓦楞纸板(corrugatedcardboard)。这样的外罩或陷阱的合适尺寸为例如7-15cm宽，15-20cm长以及l-5cm高。所述陷阱的内表面可覆盖粘性物质，使得昆虫一旦1该陷阱则被限制移动。所述外罩或陷阱可包含适当的槽，所述槽的内部可以在适当的位置装有所述何剂。陷阱不同于外革是因为昆虫在l后不能轻易地逃离陷阱，而外革作为"饲喂处"，其向昆虫蛛形纲动物提供较佳的环境，在其中它们可以进食并且感觉远离捕食者的安全感。因此，本发明的另一方面提供了针对昆虫的外軍或陷阱，其包含本发明的组合物，该组合物可以合并本文所述组合物的任何特征。本发明的"组合物，，可以是"组合试剂盒(kit-of-parts)"，其包含一个容器中的所述双链RNA以及一个单独容器中的针对含有RNA的实体(如dsRNA或dsRNA构建体、DNA构建体、表狄建体)的适当稀释剂、赋形剂或栽体；或者包含一个容器中的宿主细胞以及一个单独容器中的针对该宿主细胞的适当稀释剂、赋形剂、栽体或防腐剂。本发明还涉及提供单独的双链RNA或宿主细胞，而没有任何其它组分。在这些实施方案中，所述dsRNA或宿主细胞可以以浓缩形式来提供，如浓缩的7JC溶液。它甚至可以以冷冻形式或者以冻干形式来^供。后者对于长期保藏来，沈可能更稳定，并且可以在临使用前被解冻和/或用适当的稀释剂复原。本发明还包括在基层上控制害虫生物的生长和/或防止敏感生物被害虫生物侵害的方法，其包括向所^层应用本文所述的有效量的任何组合物和/或喷雾剂。本发明还包括用于治疗和/或预防由靶生物导致的疾病或病症的方剂，其中由所述组合物或喷雾剂造成的所述乾生物中乾基因的表达下调对于治疗和/或预防由乾生物导致的疾病是有效的。优选的靶生物是害虫，尤其是本文详细描述的昆虫。本发明还涉及本文所述的任何双链RNA、双链RNA构建体、核苷酸序列、重组DNA构建体或组合物的医学用途。昆虫和另一些节肢动物可通过其叮咬或螫刺而导致损伤甚至死亡。在美国，每年由于蜜蜂和黄蜂螫伤而死亡的人比被蛇咬伤而死亡的人更多。许多昆虫可以传播导致疾病的细菌和其它病原体。在每次国家间大规模战争期间，由于昆虫传播的疾病而受伤或死去的人比由于子弹和炸弹而受伤或死去的人更多。叮^A和家畜的昆虫大多是具有如半翅目和某些^翅目昆虫中所见的刺吸式口器的昆虫。叮咬引起的主要不适是由昆虫注入对象的酶所致。蜱和恙螨是不同种类的螨(蛛形纲)，其以动物血液为食。蜱还可以传播导致疾病的病毒和另一些病原体，所述疾病包括莱姆病和落矶山斑渗热。另一些种类的螨可引起人、犬、猫和其它动物的兽疥癣。半翅目包括床虱、接吻虫(kissingbug)和猎棒(assassinbug)，所有这些昆虫具有用于刺入其宿主的味。所有昆虫中最疼痛的叮咬是猎椿的叮咬。在中美州和南美洲，接吻虫参与导致查加斯病。某些蛾的毛虫可以"螫剌"。双翅目是影响人类的最重要的昆虫目。叮咬飞虫(bitingflies)包括多种蚊、蚋、bitinggnats、虻等。这些叮咬飞虫中有许多是疾病的传播者，如传播非洲睡眠病的舌蝇。具有舐吸式口器的蝇(如家蝇)也传播导致伤寒热及另一些疾病的细菌和其它病原体。蛆是这两种侵入动物活组织的飞虫的幼虫。蚊子传播导致痴疾、黄热病、脑炎和另一些疾病的病原体。疟疾由原生动物寄生物导致，所述原生动物寄生物的部分生活周期生活在按蚊属蚊中，部分生活周期生活在人中。鼠疫也叫作腺鼠疫或黑死病，由感染大鼠及另一些啮齿动物的细菌导致。该疾病针对人的主要转播者是东方具带病蚤(Orientalratflea)(蚤目)。许多蜜蜂、黄蜂和蚂蚊(膜翅目)可通过其螫刺导致疼痛甚至死亡。死亡通常是对毒物的变态>^应的结果。其它重要的螫刺动物包括大黄蜂(hornets)、小黄蜂(yellowjackets)和胡蜂(paperwasps)。非洲化蜜蜂(Africanizedhoneybee)或"杀A^蜂"("killer"bee)是人类驯化的蜜蜂品系。这两种品系在外观上几乎相同。然而，非洲化蜜蜂品系更具攻击性，并且以更大的数目进行攻击。在一个具体的实施方案中，所述组合物是分别用于治疗或预防人类或动物的昆虫疾病或感染的药物组合物或兽用药组合物。这样的组合物包含至少一种双链RNA或RNA构建体，或者编码所述双链RNA或RNA构建体的核苷酸序列或重组DNA构建体(其中所述双链RNA包含退火的互#^，其中一条退火互补链包含与导致所述疾病或感染的昆虫乾基因的乾核苷酸序列互补的核苷酸序列)以及适用于药物用途的至少一种栽体、赋形剂或稀释剂。所述组合物可以是适于局部使用的組合物，如应用在动物或人的皮肤上，例如应用于皮肤的液体组合物(滴剂、亂欧剂、气雾剂)，或者通过刷、或喷雾剂、乳剂、软骨等用于局部应用，或者作为透皮贴剂。或者，所述昆虫dsRNA由细菌(例如，乳杆菌属)或真菌(例如酵母属(Sacharomyces)物种)产生，其可以包含在食物中并作为抗御昆虫感染的口服疫苗。也可以制备成其它常规的药物剂型，包括片剂、胶囊、阴道松剂、透皮贴剂、栓剂等。所选形式取决于靼昆虫的性质以及期望治疗的疾病的性质。在一个具体的实施方案中，所述组合物可以是涂层、糊剂或粉剂，其可以应用于基层从而保护所M层免受昆虫和/或蛛形纲动物的侵害。在该实施方案中，可使用所述组合物保护对昆虫侵害或昆虫造成的破坏敏感的任何基层或物品，例如食物及其它易腐物品，以a层(如木材)。白蚁、粉囊甲虫和木匠蚁可破坏房屋及其它木制品。散白蚁(subterraneantermite)和台湾乳白议(Formosantermite)是美国南部和热带地区最严重的房屋害虫。昆虫可以袭击任何收获的植物或动物产品。面象虫、谷类象鼻虫、M及其它储藏品害虫以储藏的粮食、谷类、宠物食品、巧克力粉以及厨房食品拒中未得到保护的几乎所有其它食物为食。衣服蛀虫的幼虫蛀蚀由动物产品(如毛皮、丝和羊毛)制成的衣月艮。地趙甲虫的幼虫蛀蚀动物和植物产品，包括皮革、毛皮、棉花、储存的粮食甚至博物馆标本。书虱和囊虫是图书馆的害虫。这些昆虫社蚀书装订处的淀粉胶。^V房屋的其它昆虫包括蟑螂，其摄食几乎任何东西。蟑螂不被认为是疾病的特定传播者，但是它们污染食物并带有令人不悦的气味。它们非常令人讨厌，许多害虫防治公司致力于尝试对它们进行防治。在房屋、食品商店和饭店中的最常见的蟑螂包括德国小蠊、美洲大蠊、东方蜚蠊和长须蜚蠊。所述组合物的赋形剂和物理形式的性质可取决于期望处理的基层的性质而有所变化。例如，所述组合物可以是被刷或喷洒至待处理的物品或基层上的液体，或者压印至待处理的物品或基层中的液体，或者是应用至待处理的物品或基层的涂层。本发明还包括用于处理和/或防治昆虫对基层侵害的方法，其包括向所4层应用有效量的任何本文所述的组合物或喷雾剂。本发明还包括用于治疗和/或预防昆虫疾病或病症的方法，其包括向组合物或喷雾剂包含至少一种双链RNA或双链RNA构建体，其包含退火的互4h^，其中一条退火互补链包含与导致所述昆虫疾病或病症的昆虫的昆虫乾基因核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列。根据一个更具体的实施方案，所述待施用的组合物或喷雾剂包含和/或表达至少一种细菌细胞或酵母细胞，所述细菌细胞或酵母细胞表达本文所述的至少一种双链RNA或双链RNA构建体；或者包含和/或表ii^文所述的至少一种核苷酸序列或重组DNA构建体，所述RNA或核苷酸序列与导致所述昆虫疾病或病症的昆虫的昆虫乾基因之至少一部分核苷酸序列是互补的。在本发明的另一实施方案中，所述组合物用作植物或者植物的增殖或繁殖材料(如种子)的杀虫剂。举例来说，所述组合物可通过向植物组织喷洒或应用或者在幼苗出苗前后向土壤喷洒或混合而用作杀虫剂。在另一实施方案中，本发明提供了用于处理和/或阻止昆虫生长和/或昆虫侵害植物或者植物的增殖或繁殖材料的方法，其包括向植物或者向植物的增殖或繁殖材料应用有效量的任何本文所述的组合物或喷雾剂。在另一实施方案中，本发明涉及任何双链RNA或RNA构建体、或者编码所述双链RNA或RNA构建体的核苷酸序列或重组DNA构建体、或者表i^4^发明的dsRNA的至少一种宿主细胞(例如，细菌或酵母)、或者编码本文所述的dsRNA的病毒、或者包含上述的任何组合物或喷雾剂的用途，其用于控制昆虫生长，用于防治昆虫侵害对昆虫感染敏感的植物，或用于处理植物的昆虫感染。针对特定昆虫导致的昆虫感染而i^行处理的特定植物如前所述，并包含在所述用途中。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及包含至少一种宿主细胞，或表i^^发明的dsRNA的至少一种宿主细胞(例如，细菌或酵母)，或编码本文所述的dsRNA的病毒，或者涉及包含上述的任何组合物的喷雾剂的用途，该喷雾剂用于控制昆虫生长，用于防治昆虫侵害对昆虫感染敏感的植物，或用于治疗植物的昆虫感染。优选地，所述宿主细胞包含如下表示的任意序列之至少一种SEQIDNO1,3,5,7,9,",13,15,17,19,21,23,49至158.159,160-163,168，173,"178,183,188,193,198,203,208'215,220,225,230.240至247,249,251,253,255,257.259,275至472,473,478,483，4BB,493,498,503.508至513,515,517,519,521'533至575,576.581,586,591,596.601,603,605,607,609,621至767,768,773,778,783,788，793,795,797.799,801,813至862,8W,868，873,878,883'888,890,的2,894，896,908至1040,1041,1046,1051,1056,1061,1066至1071,1073,1075，1077,1079，1081,1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095，1097,1099.1101,1103，1105,1107,"09，1111,1113,1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622，1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672,1677,1682,1684,1686.1688,1690.1692簡,1696,1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040，2045,2050，2055206Q2065,2070,2075.2080,2085,2090,2095,2100,2102,2104,2106,2108,2120至2338,2339，2344,2349,2354,2359,2364,2366,2368,2370'2372,2384至2460,2461,2466，2471,2476，2481或2486，或其至少17个连续核苷酸的片段。另一方面，本发明还提供了用于防止或保护植物免受害虫侵害的方法组合和组合物。例如，一种方法提供了使用转基因方法与使用双链RNA分子以及与一种或多种对乾标害虫具有毒性的Bt杀虫蛋白或化学的(有机的)化合物的组合物的方法组合。另一方法提供了使用转基因方法与使用在细菌或酵母中表达双链RNA分子以及在同样的细菌或酵母中或者在不同的细菌或酵母中表达所述Bt杀虫蛋白的方法的组合。例如根据这些方法，可以使用基于RNAi的方法或技术来靶向或杀死一种昆虫，而使用Bt杀虫剂或化学的(有机的)杀虫剂可以把向或杀死另一种昆虫。因此，本发明还涉及本文所述的用于处理植物的任何组合物、喷雾剂或方法，其中所述组合物包含表达所述RNA分子的细菌细胞或酵母，并且还包含杀虫剂或者包含含有或表达杀虫剂的细菌细胞或酵母细胞(可以与上面提及的是同一细菌或酵母细胞或者不同的细菌或酵母细胞)，所述杀虫剂选自化学的(有机的)杀虫剂、马铃薯糖蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽a菌杀虫蛋白。优选地，所述苏云金芽M菌杀虫蛋白选自Cryl、Cry3、TIC851、CryET170、Cry22、二元杀虫蛋白CryET33和CryET34、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101以及二元杀虫蛋白PS149B1。所述喷雾剂可用于温室中或农田上。对于水基喷雾剂来^L包含细菌的生物杀虫剂(例如，作为可乳化的混悬液)的通常应用率为25-100升/公项(10-40升/英亩)每公顷包含约2.5-5升的配制产品(可乳化的混悬液)，其中所述配制产品包含约25%(体积/体积)的'细菌细胞，加75%(体积/体积)的'其它成分，。细菌细胞的量以单位来计，例如一个单位定义为1ml中109个细菌细胞。取决于每公项的作物密度和每,物的叶面积，l升的配制产品包含0.001~10000个单位的细菌，优选地至少0.001、0.003、0.005、0.007、0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.3、0.5、0.7，更优选至少l、3、5、7、10、30、50、70、100、300、500、700，或者更优选至少IOOO、3000、5000、7000或者10000个单位的细菌。例如，马铃薯作物植物的通常植物密度约为每平方米4.5tt^t物或者每公项45,000沐植物(成排种植，排与排之间距离为75cm，每排的植物之间距离为30cm)。因此，本发明涉及喷雾剂，其包含至少0.001、0.003、0.005、0.007、0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.3、0.5、0.7，更优选至少1、3、5、7、10、30、50、70、100、300、500、700，或者更优选至少1000、3000、5000、7000或者10000个单位的细菌，所述细菌表ii^文所述的至少一种dsRNA分子或dsRNA构建体。本发明还涉及用于处理植物中昆虫感染的试剂盒，其包含先前所述的至少一种双链RNA、或双链RNA构建体、或核苷酸序列、或重组DNA构建体、或宿主细胞、或组合物或喷雾剂。所述试剂盒可以与适当的使用说明书一^^^供。该说明书可印刷在提供其它组分的合适的包装上，或者可作为单独的实体来提供，例如可以采用纸页或小册子的形式。该说明书可以巻起或折叠(例如在储存状态时)，然后可以将其展开从而指导所述试剂盒其余组分的用途。参考以下非限制性实施例将进一步理解本发明。图l-LD:使用以dsRNA处理的人工饲料喂食的马铃薯叶曱的存活。使用以50jil局部应用的dsRNA(靶标或gfp对照)溶液处理的饲料喂食第二幼虫阶段的昆虫，7天后，将饲料替换为包含局部应用的dsRNA的新鲜饲料。在第2、5、7、8、9和13天评估存活昆虫数。相对于第0天(测定开始时)来计算存活幼虫的百分比。乾标LD006:(SEQIDNO178);乾标LD007(SEQIDNO183);乾标LD010(SEQIDNO188);乾标LD011(SEQIDNO193);扭标LD014(SEQIDNO198);gfpdsRNA(SEQIDNO235)。图2-LD:使用以dsRNA处理的人工饲料喂食的马铃薯叶甲的存活。使用以50jul局部应用的dsRNA(靶标或gfp对照)溶液处理的铜料喂食第二幼虫阶段的昆虫。7天后，将飼料替换成仅为新鲜饲料。在第2、5、6、7、8、9、12和14天评估存活昆虫数。相对于第0天(测定开始时)来计算存活幼虫的百分比。乾标LD001(SEQIDNO163);乾标LD002(SEQIDNO168);耙标LD003(SEQIDNO173);乾标LD015(SEQIDNO215);乾标LD016(SEQIDNO220);gfpdsRNA(SEQIDNO235)。图3-LD:使用用dsRNA处理的马铃薯叶盘喂食的马铃薯叶曱幼虫的平均重量。使用以20jil局部应用的dsRNA(靶标LD002或gfp)溶液(10ng/nl)处理的叶盘喂食第二幼虫阶段的昆虫。2天后，每天将昆虫转移至未经处理的叶子上。图4-LD:使用以较短形式的乾标LD014dsRNA和多联体dsRNA处理的人工飼料喂食的马铃薯叶甲的存活。使用以50[il局部应用的dsRNA(gfp或乾标)溶液处理的飼料喂食第二幼虫阶段的昆虫。在第3、4、5、6和7天评估存活昆虫数。相对于第0天(测定开始时)来计算存活幼虫的百分比。图5-LD:使用以不同浓度的dsRNA(耙标LD002(a)、乾标LD007(b)、靶标LD010(c)、靶标LD011(d)、乾标LD014(e)、乾标LD015(f)、LD016(g)和乾标LD027(h))处理的人工饲料喂食的马铃薯叶甲幼虫的存活。使用以50pl局部应用的dsRNA溶液处理的飼料喂食第二幼虫阶段的昆虫。7W，将飼料替换为包含局部应用的dsRNA的新鲜飼料。以固定的时间间隔评估存活昆虫数。相对于第O天(测定开始时)来计算存活幼虫的百分比。图6-LD.表达dsRNA(靶标LD010)的大肠杆菌菌林对马铃薯叶曱幼虫存活的随时间的影响。在基于人工饲料的分别的生物测定中检测两林细菌菌林(a)AB301-105(DE3)，pGBNJ003和pGN29的数据点表示来自5个不同细菌克隆的平均死亡率值，(b)BL21(DE3)，pGBNJ003和pGN29的数据点分别表示来自5个不同的细菌克隆以及一个单独的细菌克隆的平均死亡率值。误差条线代表标准差。图7-LD.表达dsRNA(靶标LD010)的大肠杆菌菌林的不同克斷a)AB301-105(DE3)和(b)BL21(DE3)在侵害后12天对马铃薯叶曱幼虫存活的影响。数据点是pGN29和pGBNJ003的每个克隆的平均死亡率值。在该时间点，包含质粒pGBNJ003的AB301-105(DE3)克隆l显示出CPB100。/。死亡率。误差条线代表标准差。图8-LD.表达dsRNA(乾标LD010)的大肠杆菌菌林的不同克斷a)AB301-105(DE3)和(b)BL21(DE3)在侵害后7天对存活的马铃薯叶曱幼虫的生长和发育的影响。基于表IO的数据，数据点是每个克隆(一个pGN29克隆和5个pGBNJ003克隆)的幼虫平均重量值的百分数。只用饲料处理代表100%的正常幼虫重量。图9-LD.喂食马铃薯植物的马铃薯叶甲幼虫在侵害后7天的存活，所述马铃薯植物用产生双链RNA的细菌喷洒。计算存活幼虫数并表示为死亡率百分数。所使用的细菌宿主菌林是RNA聚合酶III缺陷型菌林AB301-105(DE3)。昆虫基因靼标是LDOIO。图10-LD.喂食马铃薯植物的存活的马铃薯叶甲幼虫在侵害后11天的生长/发育延迟，所述马铃薯植物用产生dsRNA的细菌喷洒。所使用的细菌宿主菌林是RNA聚合酶III缺陷型菌林AB301-105(DE3)。数据图表示正常幼虫重量的百分比，只用饲料的处理代表100%的正常幼虫重量。昆虫基因靶标是LDOIO。误差条线代表标准差。图ll-LD.在侵害后7天，产生双链RNA的细菌对马铃薯叶甲幼虫导致的马铃薯损伤的抗性。左图，用含有pGN29质粒的7个单位的细菌AB301-105(DE3)喷洒植物；右图，用含有pGBNJ003质粒的7个单位的细菌AB301-105(DE3)喷洒植物。一个单位定义为在600nmOD值为1的lml细菌悬液的等价物。昆虫基因靶标为LDOIO。图12-LD.使用以dsRNA处理的马铃薯叶盘喂食的马铃薯叶甲成虫的存活。开始两天使用以双链RNA处理的叶盘喂食年幼成虫，然后将其置于未经处理的马铃薯叶上。定期评估存活昆虫数；活的并且看起ifd逸动正常的昆虫记录为可动的昆虫；活的但似乎有病JU逸动緩慢的昆虫记录为濒死的昆虫——一旦将其背部朝下，这些昆虫不能翻身。靶标LD002(SEQIDNO168);耙标LD010(SEQIDNO188);乾标LD014(SEQIDNO198);乾标LD016(SEQIDNO220);gfpdsRNA(SEQIDNO235)。图13-LD.细菌产生的靶标双链RNA对马铃薯叶曱幼虫的影响。将OD为1的经热处理的表达dsRNA(SEQIDNO188)的50jul细菌AB301-105(DE3)悬液局部应用于48孔板每个孔中的固体人工飼料上。将L2阶段的CPB幼虫置于每个孔中。在第7天，对包含(a)含有表达靶标10双链RNA的细菌的飼料，(b)含有空载体pGN29的细菌的饲料，以及(c)只有饲料的平板中的CPB幼虫进行拍照。图14-LD.在昆虫侵害前，将不同量的含有质粒pGBNJ003的灭活大肠杆菌AB301-105(DE3)菌梯^局部应用于马铃薯叶对CPB幼虫存活和生长的影响。用经处理的马铃薯喂食10只LI幼虫7天。喷洒在植物上的细菌悬液的量为0.25U、0.08U、0.025U、0.008U的靶标10以及0.25U的pGN29(阴性对照；还包含Milli-Q水)。一个单位(U)定义为与在600nm吸光度值为1的1ml培养物中等量的细菌量。将1.6ml总体积喷洒至每^4i物上。昆虫基因耙标为LDOIO。图15-LD在侵害后7天，含有质粒pGBNJ003的灭活大肠杆菌AB301-105(DE3)菌林对CPB幼虫导致的马铃薯损伤的抗性。(a)水，(b)包含pGN29的0.25U大肠杆菌AB301-105(DE3)，(c洽有pGBNJ003的0.025U大肠杆菌AB301-105(DE3)，(d)含有pGBNJ003的0.008U大肠杆菌AB301-105(DE3)。一个单位(U)定义为与在600nm吸光度值为1的1ml培养物等量的细菌量。将1.6ml总体积喷洒至每,物上。昆虫基因乾标为LDOIO。图1-PC:喂食乾标dsRNA对辨^M泉叶曱幼虫的存活和生长的影响。使用以25pi局部应用的0.1吗/pldsRNA(乾标或gfp对照)溶液处理的油菜叶盘喂食新生幼虫。2天后，将所述昆虫移至新鲜的经dsRNA处理的叶盘上。在第4天，针对每种处理收集来自一次重复实验的幼虫，并置于含有未经处理的新鲜油菜叶的培养脏中。在第2、4、7、9和11天评估所述昆虫。(a)使用以dsRNA处理的油菜叶盘喂食的墨西哥豆瓢虫幼虫的存活。相对于第0天(测定开始时)来计算存活幼虫百分比，(b)使用以dsRNA处理的油菜叶盘喂食的辣才IM泉叶曱幼虫的平均重量。一起称重来自每次重复的昆虫并确定每只幼虫的平均重量。误差条线代表标准差。靶标l:SEQID473;乾标3:SEQIDN0478;靶标5:SEQIDN0483;靶标10:SEQIDNO488;靶标14:SEQID493;靶标16:SEQIDNO498;乾标27:SEQIDNO503;gfpdsRNA:SEQIDNO235。图2-PC:使用以不同浓度dsRNA(a)靼标PC010和(b)靶标PC027处理的油菜叶盘喂食l^根猿叶甲的存活。将初生幼虫置于用25nl局部应用的dsRNA溶液处理的油菜叶盘上。在第2天，将昆虫移至经处理的新鲜叶盘上。在第4天(针对靶标PC010)和第5天(针对靶标PC027)，将昆虫移至未经处理的叶子。在第2、4、7、8、9和11天(针对PC010)和第2、5、8、9和12天(针对PC027)评估昆虫的存活数。相对于第0天(测定开始时)来计算存活幼虫的百分比。图3-PC:表达dsRNA(靶标PC010)的;^杆菌AB301-105(DE3)菌^Mt辣根猿叶甲幼虫存活的随时间的影响。每种处理的数据点表示来自3次不同重复实验的平均死亡率值。误差条线表示标准差。靶标10:SEQIDNO488。图l-EV:使用以dsRNA处理的豆叶盘喂食的墨西哥豆瓢虫的存活。使用以25pi局部应用的1吗/^AldsRNA(靶标或gfp对照)溶液处理的豆叶盘喂食初生幼虫。2天后，将所述昆虫移至经dsRNA处理的新鲜叶盘上。在第4天，收集来自一种处理的幼虫，并置于含有未经处理的新鲜豆叶的塑料盒中。在第2、4、6、8和10天评估昆虫的死亡率。相对于第0天(测定开始时)来计算存活幼虫的百分比。靼标5:SEQIDNO576;靶标10:SEQIDNO586;乾标15:SEQIDNO591;乾标16:SEQIDNO596;gfpdsRNA:SEQIDNO235。图2-EV:喂食把标dsRNA对墨西哥豆瓢虫成虫的存活的影响，以及对食荚菜豆叶的昆虫侵害的抗性。(a)使用以dsRNA处理的豆叶盘喂食的墨西哥豆瓢虫成虫的存活。使用以75pl局部应用的0.1fig/|LildsRNA(靶标或gfp对照)溶液处理的豆叶盘喂食成虫。24小时后，将昆虫移至经dsRNA处理的新鲜叶盘上。再过24小时后，收集来自一种处理的成虫，并置于包含未经处理的新鲜的盆栽整林豆植物的塑料盒中。在第4、5、6、7、8和11天评估昆虫的死亡率。相对于第0天(测定开始时)来计算存活幼虫的百分比。把标10:SEQIDN0586;乾标15:SEQIDN0591;乾标16:SEQIDNO596;gfpdsRNA:SEQIDNO235。(b)dsRNA对墨西哥豆瓢虫成虫所造成豆叶损伤的抗性。在第9天，目测检查包含来自一种处理(参见U))的昆虫的整#^1物的叶损伤。(i)耙标10;(ii)靶标15;(iii)靶标16;(iv)gfpdsRNA;(v)未处理。图1-TC:使用以dsRNA(靶标14)处理的人工饲料喂食的赤拟谷盗的存活。基于含有lmgdsRNA(乾标14)的面粉/奶混合物喂食初生幼虫。飼料中的水(不含dsRNA)是对照。针对每种处理，进行4次重复实验，每次重复实验使用10只1龄幼虫。在第6、17、31、45和60天评估昆虫的存活的平均数百分比。相对于第0天(测定开始时)来计算存活幼虫的百分比。误差条线代表标准差。靶标TC014:SEQIDN0878。图l-MP:摄取dsRNA(靶标27)对桃辨若虫存活的影响。将l龄昆虫置于包含50nl液态饲料(含有2吗/pldsRNA(靶标27或gfpdsRNA对照))的"Wh室中。针对每种处理，建立5个M室，其中每个"W室包括10只龄虫。在生物测定开始后的第8天评估存活数。误差条线代表标准差。耙标MP027:SEQIDNO1061;gfpdsRNA:SEQIDN0235。图l-NL:使用以dsRNA处理的液体人工饲料喂食的褐飞虱的存活。在分别的生物测定中用补充有2mg/mldsRNA靶标的溶液的饲料喂食第一至第二幼虫阶段的若虫(a)NL002、NL003、NL005、NL010;(b)NL009、NL016;(c)NL014、NL018;(d)NL013、NL015、NL021。昆虫针对靶标的存活与喂食相同浓度的只有飼料和含有gfpdsRNA对照的饲料进行比较。每两天将饲料替换为含有dsRNA的新鲜饲料。每天评估存活昆虫数。图2-NL:使用以不同浓度的靶标dsRNA(NL002)处理的液体人工伺料喂食的褐飞虱的存活。用补充有1、0.2、0.08和0.04mg/ml(终浓度)NL002的饲料喂食第一至第二幼虫阶段的若虫。每两天将飼料替换为含有dsRNA的新鲜飼料。每天评估存活昆虫数。具体实施例方式实施例实施例l:在高通量筛选中沉默秀丽隐杆线虫中的靶基因在pGN9A载体(WO01/88121)中相同的两个T7启动子和终止子之间制备秀丽隐杆线虫基因组范围的文库，其在T7聚合酶表达的情况下通过IPTG诱导而驱动有义和反义方向的表达。以96孔板的形式，将此文库转化入AB301-105(DE3)细菌菌林。为了在基因组范围进行筛选，用这些细菌细胞喂食核酸酶缺陷型秀丽隐杆线虫遵循下述步骤，在96孔板中用所述AB301-105(DE3)细菌菌林中产生的dsRNA喂食秀丽隐杆线虫wmc-7"7392,将卵移至不同的板中，并使其在20'C同时孵化从而使L1代同步化。将包含IPTG的100nL液体生长培养基以及含有秀丽隐杆线虫dsRNA文库的OD6001的10AB301-105(DE3)细菌细胞培养物加至96孔板中，所述文库中每个载体包含用于表达所述dsRNA的秀丽隐杆线虫基因组片段。将4只同步化的Ll线虫加至每个孔中，在25'C孵育至少4至5天。这些实验一式四份进行。在所述筛选中使用了6种对照-pGN29=阴性对照，野生型-pGZl=騰-"=颤搐表型—pGZ18=几丁质合酶=胚胎致死—pGZ25=/ws-J=胚胎致死-pGZ59=6"-4D=急性致死-ACC=乙酰辅酶A羧化酶=急性致死5天后，将用产生dsRNA的细菌喂食的秀丽隐杆线虫ai"c-J与用空载体(pGN29)及其它对照喂食的线虫的表型进行比较。针对亲代(PO)的(急性的或幼虫的)致死性、子一代(F1)的(胚胎)致死性或者针对P0的生长阻滞对使用所述dsRNA喂食的线虫进行筛选，具体如下(i)P0的急性致死Ll不发育且死亡，该表型不产生后代，所述孔看上去相当空；(ii)P0的(幼虫)致死P0在比Ll更晚的阶段死亡，该表型也不产生后代。在孔中发现死亡的幼虫或死亡的成虫；(m)Fl致死Ll发育至成虫阶段并仍然存活。该表型不产生后代。这可能是由于不育、胚胎致死(孔底部有死亡的卵)、胚胎停滞或幼虫停滞(最终致死)；(hO生长停滞及生长阻滞/延迟与包含正常发育和正常后代数的孔进行比较。对于表1A中所示的靶序列来说，所得结论为在线虫(如秀丽隐杆线虫)中由dsRNA介导的秀丽隐杆线虫靶基因沉默对线虫的生长和存活具有重要影响。在上述dsRNA沉默实验之后，在24孔板中以高通量形式对秀丽隐杆线虫进行更细致的表型实验。按照如下步骤，用如上所述AB301-105(DE3)细菌菌林中得到的dsRNA文库喂食24孔板中的秀丽隐杆线虫/i"c-J(V/3"义具体如下将/i"o/卵移至不同的板中，并使其在20。C同时孵化从而使L1代同步化。然后，将100只同步化的Ll线虫浸泡于500S完全喂食培养基(含有5ng/mL胆固醇、4^L/mLPEG和lmMIPTG)和包含秀丽隐杆线虫dsRNA文库的00600为1的500AB301-105(DE3)细菌细胞培养物的混合物中，所述文库中每个载体包含用于表达所述dsRNA的秀丽隐杆线虫基因组片段.将被浸泡的Ll线虫在25'C滚动孵育2小时。在离心并除去950上清液后，将所剩5经重悬的沉淀(包含约10至15只线虫)移至24孔板每个孔的中部，加入一层琼脂LB液体培养基。将所接种的板在25'C孵育2天。在成虫阶段，挑出单只成虫并在25'C孵育2天用于检查其后代。在最初的24孔板上原位检查其它线虫成虫。一式四份地进行这些实验。用另一批线虫重复上述细致的表型筛选，唯一的区别在于第二批线虫在20。C孵育3天。对用秀丽隐杆线虫dsRNA喂食的线虫之表型以及用所述空载体艰食的秀丽隐軒线虫/iwc-JJ之表型进行比较。基于该实验，所得结论为如表1A中所示秀丽隐杆线虫靶基因的沉默对于线虫的生长和存活具有重要影响，所述靶基因对于线虫的存活是必需的。因此，这些基因是利用dsRNA介导的基因沉默来防治(杀死或阻止其生长)线虫的理想靶基因。因此，本发明包括上述秀丽隐杆线虫靶基因的线虫直向同源物用于防治线虫侵害(例如线虫对植物的侵害)的用途。实施例2:鉴定黑腹果蝇的直系同源物如实施例l中所述，鉴定了许多秀丽隐杆线虫的致死序列，并且所述致死序列可用于鉴定其它种属中的直向同源物。例如，所述秀丽隐杆线虫致死序列可用于鉴定黑腹果蝇的直向同源序列。也就是说，可使用每种秀丽隐杆线虫序列在公共数据库(例如GenBank)中检索黑腹果蝇的直向同源物。选择具有高度序列同源性的(E值优选小于或等于1E-30)可能的黑腹果蝇直向同源物，所述序列是相互blast的最佳命中结果，后者指来自不同生物(例如秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇)的序列相互为最佳blast命中结果。例如，使用BLAST将来自秀丽隐杆线虫的序列C与黑腹果蝇的序列D进行比对。如果黑腹果蝇序列D是序列C的最佳命中结果，并且与秀丽隐杆线虫的所有序列进行比对时序列C也是D的最佳命中结果，那么D和C是相互最佳命中结果。该标准常用于定义直系同源物，意指不同物种中具有相似功能的相似序列。所鉴定的黑腹果蝇序列示于表1A。实施例3:马铃薯叶曱(Coloradopotatobeetle,CPB)A.克隆来自马铃薯叶甲的部分基因序列按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr.15596-026/15596-018,Invitrogen，Rockville，Maryland,USA)从4个不同幼虫阶段的马铃薯叶甲(科罗拉多甲虫；来源JeroenvanSchaik，EntocareCVBiologischeGewasbescherming,Postbus162，6700ADWageningen，theNetherlands)分离高质量的完整RNA。按照制造商的说明，通过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理除去该RNA制备物中的基因组DNA。按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperscriptIII逆转录酶，Cat.Nr.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)得到cDNA。为了分离包含LD001、LD002、LD003、LD006、LD007、LDOIO、LDOll、LD014、LD015、LD016、LC018和LD027基因一部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用AmplitaqGold(Cat.Nr.N8080240,AppliedBiosystems)进行一系列PCR^jL表2-LD中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列，其显示了包括引物序列和所得cDNA序列的马铃薯叶甲靶基因。使用这些引物进行各自的PCR反应，其使用以下条件95'C10分钟，然后是40个循环的95。C30秒、55'C1分钟和72'Cl分钟，然后是72'C10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其克隆入pCR8/GW/topo载体(CatNr.K250020,Invitrogen)并测序。表2-LD+给出了用各自SEQIDNO表示的所得PCR产物的序列，并且其为部分序列。表3-LD中给出了用各自SEQIDNO表示的相应部分氨基酸序列，其中读码框的起点在括号中指明。B.产生马铃薯叶曱基因的dsRNA4吏用市售试剂盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个单独的PCR反应中得到最初两种独立的单个5，T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与T7启动子方向不同的靶序列。对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引物得到有义T7模板。表8-LD中给出了用于扩增每种靶序列有义模板的各引物的序列。所述PCR反应的条件如下95'C4分钟，然后是35个循环的95卩30秒、55'C30秒和72'C1分钟，然后是72'C10分钟。在使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引物得到反义T7模板。表8-LD中给出了用于扩增每种靶基因反义模板的各引物的序列。在琼脂糖凝胶上分析所得的PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaC104沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-LD中给出了每种靼基因所得dsRNA的有义链。表8-LD显示了用于制备马铃薯叶曱靶序列的dsRNA片段的序列和多联体序列，其包括引物序列。C.针对马铃薯叶甲的活性，使用人工饲料对dsRNA靶标进行筛选如下制备马铃薯叶甲的人工饲料(修改自GdmanWfl/.，2001，J.Ins.Sc.，vol.1，no.7，1-10):对水和琼脂进行高压灭菌，当温度降至55。C时加入其余的成分(如下文表A中所示)。在此温度下，均勻混合所述成分，然后将所述饲料以每孔lml的量等分至24孔板(Nunc),使所述人工铜料在室温下冷却而固化。饲料在4'C最多保存3周。表A:人工饲料的成分<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>将浓度为1mg/ml的50pidsRNA溶液局部应用至多孔板孔内的固体人工饲料上。所述饲料在层流柜(laminairflowcabin)中进行干燥。针对每种处理，测试24只马铃薯叶曱幼虫(第2阶段)，其中每孔两只昆虫。所述板在昆虫飼养室中保存，其条件为25土2。C，60%相对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。每l、2或3天评估所述曱虫的存活情况。7天后，对于乾标LD006、LD007、LDOIO、LD011和LD014，用包含相同浓度(1mg/ml)的局部应用dsRNA的新鲜饲料替换所述飼料；对于LDOOl、LD002、LD003、LD015和LD016,仅用新鲜饲料替换所述饲料。将所述dsRNA靶标与只有饲料或包含局部应用dsRNA的饲料(对应于GFP(greenfluorescentprotein,绿色荧光蛋白)编码序列(SEQIDNO235)片段)进行比较。如两个独立的生物测定中所显示的，用含有完整棵dsRNA的人工饲料喂食马铃薯叶曱幼虫导致幼虫死亡率显著增加(图1LD-2LD)。7至14天后，所有被测的dsRNA最终导致100%死亡率。在整个所述的生物测定中，含有或不含GFPdsRNA的饲料使所述昆虫几乎没有或没有死亡。通常，在所观察的所有测定中，用含有或不含dsRNA的饲料喂食的CPB第二阶段幼虫正常喂食2天并蜕皮成为第3阶段幼虫。在该新的幼虫阶段，观察到CPB的进食显著减少或完全停止，导致死亡率提高。D.针对马铃薯叶甲的活性，使用马铃薯叶盘对dsRNA靶标进行生物测定应用了使用马铃薯叶材料而非人工饲料作为CPB食物来源的可替代的生物测定法。使用合适尺寸的穿孔器从2至3周龄的马铃薯植物叶子切下直径约1.1cm(或0.95cm2)的叶盘。通过将10ng/pl的20pi耙标LD002dsRNA或对照gfpdsRNA溶液施加到近轴叶表面来制备经处理的叶盘。使叶盘干燥并分别单独置于24孔板(Nunc)的24个孔中。将单只第2幼虫阶段的CPB置于每个孔中，然后用棉纸和多孔板的塑料盖将其覆盖。将包含所述昆虫和叶盘的板置于昆虫室中，其条件为28。C以及16小时光照/8小时黑暗的光周期。使所述昆虫进食叶盘2天，之后将所述昆虫移至包含经处理的新鲜叶盘的新平板中。之后，每天将所述昆虫移至包含未处理叶盘的平板，直至第7天。记录昆虫死亡率和重量。用包含表面施加的完整棵dsRNA(靶标LD002)的马铃薯叶盘喂食马铃薯叶甲幼虫导致幼虫死亡率显著增加(即在笫7天所有昆虫死亡；100%死亡率)，而对照gfpdsRNA对CPB的存活没有影响。靶标LD002dsRNA在2至3天后严重影响幼虫的生长，而用相同浓度gfpdsRNA喂食的幼虫发育正常(图3-LD)。E.针对马铃薯叶曱的活性，使用人工飼料对较短形式的dsRNA进行筛选本实施例举例说明较短的(60或100bp)dsRNA片段本身或作为多联体构建体足以造成对马铃薯叶甲的毒性。选择LD014用于该实施例，已知其是在马铃薯叶甲中诱导致死性的靶标。该基因编码V-ATP酶亚基E(SEQIDNO15)。还选择了100个碱基对的片段LD014—Fl(在SEQIDNO15的195-294位，SEQIDNO159)和60个碱基xf的片段LD014_F2(在SEQIDNO15的235-294位，SEQIDNO160)。也参见表7-LD。设计了两个300碱基对的多联体，LD014_C1和LD014—C2(SEQIDNO161和SEQIDNO162)。LD014_C1包;上述100个碱基对片段(SEQIDNO159)的3个重复，LD014—C2包含上述60个碱基对片段(SEQIDNO160)的5个重复。也参见表7-LD。合成片段LD014_F1和LD014一F2作为有义和反义引物。在进行克隆之前，将这些引物ll火从而得到双链DNA分子。在所述引物的5，和3，端分别包含AT6fll和限制性位点，以l更进行克隆。所述多联体为300个碱基对的合成基因。在该合成DNA片段的5，和3，端分别包含AT6fll和XwflI限制性位点，以〗更进行克隆。用AT6fll和消化4种DNA分子，即两种单一单元(LD014_F1和LD014—F2)和两种多联体(LD014—C1和LD014—C2)，并将其分别亚克隆至被J^fll和ATwfll消化从而线性化的pBluescriptIISK+中，分别得到重组质粒pl、p2、p3和p4。双链RNA的产生使用市售试剂盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成dsRNA。在两个独立的PCR反应中得到最初两种独立的单个5，T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与T7启动子方向不同的靶序列。对于LD014一F1来说，使用特异性T7正向引物oGBM159和特异性反向引物oGBM164(本文分别用产生有义T7模板95°C4分钟，然后是35个循环的95'C30秒、55'C30秒和72°C1分钟，然后是72°C10分钟。使用特异性正向引物oGBM163和特异性T7反向引物oGBM160(本文分别用SEQIDNO206义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(QiaquickPCRPurificationKit，Cat.Nr.28106,Qiagen)以及NaC104沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向模板混合从而进行转录，将所得到的RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。所得dsRNA的有义链在本文中表示为SEQIDNO203。对于LD014_F2来说，使用特异性T7正向引物oGBM161和特异性反向引物oGBM166(本文分别用SEQIDNO209和SEQIDNO210表示)在PCR反应中使用下述条件产生有义T7模板95。C4分钟，然后是35个循环的95'C30秒、55'C30秒和72'C1分钟，然后是72'C10分钟。使用特异性正向引物oGBM165和特异性T7反向引物oGBM162(此处分别用SEQIDNO211和SEQIDNO212表示)在使用与上述相同条件的PCR反应中产生反义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106,Qiagen)以及NaC104沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向模板混合从而进行转录，将所得到的RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。所得dsRNA的有义链在本文中表示为SEQIDNO208。同样地，对于所述多联体来说，在两个独立的PCR反应中得到最初两种独立的单个5，T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与T7启动子方向不同的耙序列。用J^fll或AT挑flI对包含LD014一C1和LD014—C2的所述重组质粒p3和p4进行线性化，对每种构建体的两种线性片段进行纯化，并用作体外转录测定的模板，所述体外转录使用所述克隆位点侧翼的T7启动子。使用T7RiboMAXP1ExpressRNAiSystem(Promega)通过体外转录制备双链RNA。所得dsRNA(针对LD014—C1和LD014—C2)的有义链在本文中分别表示为SEQIDNO213和214。如图4-LD所示，靶标LD014的较短序列和多联体能够在马铃薯叶甲中诱导致死性。F.针对马铃薯叶曱的活性，使用人工飼料对不同浓度的dsRNA进行筛选将50MldsRNA溶液局部应用至24孔板(Nunc)孔内的固体人工饲料上，所述dsRNA溶液采用从1ng/nl(对于靶标LD027来说从0.1ng/^il)降至O.Olng/nl的一系列十倍浓度。所述饲料在层流柜中进行干燥。针对每种处理，测试24只马铃薯叶甲幼虫(第2阶段)，其中每孔两只昆虫。所述板在昆虫飼养室中保存，其条件为25士2。C,60%相对湿度，16:8小时的光照黑暗光周期。以固定的时间间隔(最多14天)来评估所述甲虫的存活情况。7天后，用包含相同浓度的局部应用dsRNA的新鲜饲料替换所述饲料。将所述dsRNA靶标与只有饲料时进行比较。如图5-LD所示，，用含有针对不同靶标的完整棵dsRNA(浓度低至0.1~10ngdsRNA/pl)的人工饲料喂食马铃薯叶甲幼虫导致高幼虫死亡率。G.将CPB基因片段克隆进载体中，所述栽体适于细菌产生在昆虫中具有活性的双链RNA尽管可使用任何有效的细菌启动子，然而将对应于CPB基因靶标的DNA片段克隆进用于在细菌宿主中表达双链RNA的载体中(参见WO00/01846)。表8-LD提供了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的模板是含有任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。使用所述引物进行PCR反应，其使用以下条件98"5分钟，然后是30个循环的98'C10秒、55°C30秒和72。C2分钟，然后是72。C10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其平端克隆进经线性化的pGNA49A载体中(参考WO00188121A1)并测序。表8-LD中给出了对应于各自序列的所得PCR产物的序列。包含该序列的重组栽体称作pGBNJ003。表8-LD中提供了用于扩增靶基因片段LD010的特异性引物的序列(正向引物SEQIDNO191和反向引物SEQIDNO190)。所使用的模板是含有LDOIO序列(SEQIDNO11)的pCR8/GW/topo载体。使用所述引物进行PCR反应，其采用以下条件98。C5分钟，然后是30个循环的98'C10秒、55'C30秒和72'C2分钟，然后是72'C10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,CatNr.28706,Qiagen)，将其平端克隆进经线性化的pGNA49A载体中(参考WO00188121A1)并测序。表8-LD中给出了对应于SEQIDNO188的所得PCR产物的序列。包含该序列的重组栽体称为pGBNJ003。H.在两个大肠杆菌菌林(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3)中表达和产生双链RNA靶标遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的靶标LD010的双链RNA，该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌林(AB301-105(DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3"进行比较。转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)将300ng质粒加至50pl水冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105(DE3)或BL21(DE3)菌林等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细胞20分钟，之后对其进行37'C热激处理5分钟，然后将所述细胞放回至冰上并再保持5分钟。将450pl室温的SOC培养基加至所述细胞，并将该悬液于37。C在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100^1细菌细胞悬液移至含有150mlLB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液体培养基补充有100吗/ml的羧节青霉素抗生素。所述培养物于37'C在Innova4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3)或BL21(DE3)细菌菌林中可以表达来自重组栽体pGBNJ003的双链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的侧翼是相反方向的T7启动子。使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度，并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移至50mlFalcon管中，然后在15'C以3000g离心所述培养物10分钟。除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100pg/ml羧节青霉素和1mMIPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5吗/ml胆固醇)进行重悬。在室温诱导细菌2至4小时。细菌的热处理通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工飼料被污染的风险减至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分钟，弃去上清液，并将沉淀在80'C水浴中保持20分钟。热处理后，将细菌沉淀重悬于1.5mlMilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20'C备用。I.针对马铃薯叶曱，对表达dsRNA靶标LD010的大肠杆菌进行实验室试验检测使用两种生物测定方法来检测针对马铃薯叶甲幼虫的大肠杆菌所产生的双链RNA:(1)基于人工饲料的生物测定，和(2)基于植物的生物测定。基于人工飼料的生物测定如前面实施例3C中所述制备马铃薯叶甲的人工祠料。将半亳升飼料分配至48孔多孔测试板(Nunc)的每个孔中。对于每种处理来说，将表达dsRNA的OD为1的50pl热处理细菌悬液(其等同于约5xl07个细菌细胞)局部应用至孔中的固体饲料上，并使该板在层流箱中干燥。针对每种处理，检测48只第2阶段的马铃薯叶甲幼虫，其中每个含有饲料和细菌的孔中包含一只马铃薯叶甲幼虫。板的每一行(即8个孔)作为一个重复。将所述板保存在昆虫飼养室中，其条件为25土2。C，60±5%相对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。每4天后，将所述甲虫移至包含局部应用细菌的新鲜飼料。昆虫侵害后每1或3天评估所述曱虫的存活情况。对于存活的昆虫，在侵害后第7天记录幼虫的重量从而记录其生长和发育。对于RNA酶III缺失的大肠杆菌JB3W-/05(^)￡3J菌林来i兌，在生物测定中测试含有质粒pGBNJ003及含有空质粒pGN29(参照WO00/188121A1)的细菌对CPB的毒性。包含pGBNJ003质粒的细菌显示昆虫死亡率随时间而明显增加，然而观察到pGN29和只有飼料的对照几乎没有或没有死亡(图6a-LD和7a-LD)。^喂食含表达dsRNA靶标LD010的细菌的人工飼料后第7天，存活的马铃薯叶甲幼虫的生长严重阻滞(表10-LD，图8a-LD，图13-LD)。对于大肠杆菌BL21(DE3)菌林来说，针对马铃薯叶曱幼虫检测包含质粒pGBNJ003的细菌和包含空载体pGN29的细菌。用含BL21(DE3)细菌的饲料喂食的幼虫中观察到与RNA酶III缺失菌林AB301-105(DE3)类似的有害影响(图6b-LD和7b-LD)。然而，对于5个克隆的存活数来说，BL21(DE3)要高于ABMUMOXE3>，在第12天，该菌林的平均死亡率值比RNA酶III缺失菌林约低25。/0。另外，用含有表达dsRNA(对应于靶标LDOIO)的BL21(DE3)的饲料喂食的存活昆虫的平均重量显著降低(表10-LD，图8b-LD)。用包含两细菌菌林(含有质粒pGBNJ003)之一的饲料喂食的CPB幼虫的生长和发育延迟直接与进食抑制有关，因为与包含空栽体pGN29的细菌或只有饲料的平板相比，从第4天起所更换平板的孔中无可见幼虫粪便。该观察类似于用局部应用至人工饲料的体外转录的双链RNA喂食CPB的情形(参见实施例3D);这里，从处理饲料第2天起发生停止进食。基于植物的生物测定用化学诱导的表达dsRNA的悬液喷洒整林马铃薯植物，然后用所述植物喂食CPB幼虫。"V系"品种的马铃薯植物(WageningenUniversity)在具有下述条件的植物培养室中从块茎生长至8-12片展开叶的阶段25±2。C，60%相对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。通过将500ml塑料瓶倒置于植物上从而軍住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结(condensation)并防止幼虫逃脱。将15只Ll阶段的马铃薯叶曱幼虫放置在罩中的每林经处理植物上。用包含pGBNJ003质粒(克隆1;图7a-LD)或pGN29质粒(克隆1;参见图7a-LD)的大肠杆菌AB301-105(DE3)的悬液处理植物。向植物应用不同量的细菌66、22和7个单位，其中一个单位定义为在600nm波长下吸光度值为1的lml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用喷雾器将总体积1.6ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用一林植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。用表达来自pGBNJ003的乾标dsRNA的大肠杆菌AB301-105(DE3)菌林悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显著增加。当细菌细胞悬液的量稀释9倍时，死亡率计数保持不变(图9-LD)。用包含pGBNJ003栽体的细菌喷洒的植物上第11天的存活幼虫平均重量比pGN29的约低10倍(图10-LD)。与用包含空载体pGN29的细菌喷洒的马铃薯植物相比，CPB幼虫对用包含pGBNJ003质粒的细菌喷洒的马铃薯植物造成的进食损害显著降低(图ll-LD)。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺失的细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫具有毒性，所述毒性表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实验还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA的细菌组成。J.针对马铃薯叶曱，测试表达dsRNA靶标LD010的大肠杆菌培养物的多种悬液密度细菌培养物的制备和处理描述于实施例3J中。将表达靶标LD010双链RNA的大肠杆菌RNA酶III缺失菌林AB301-105(DE3)培养物的三倍系列稀释物(从0.25个单位等价物开始)施加至8-12片展开叶阶段的马铃薯植物变种"Bintje"。将10只马铃薯叶甲Ll幼虫置于经处理的植物上，每种处理一林植物。在第7天(即昆虫侵害后7天)对昆虫的死亡率和生长阻滞打分。如图14-LD所示，在用经处理的马铃薯植物喂食昆虫l周后记录到高CPB幼虫死亡率(90~100%)，所述处理是通过细密喷洒浓度为0.25、0.08和0.025细菌单位的大肠杆菌热灭活培养物进行局部应用，所述大肠杆菌包含质粒pGBNJ003(用于表达乾标10dsRNA)。在0.008单位时，约三分之一的昆虫死亡，但是，存活昆虫显著小于对照组(包含空栽体pGN29的大肠杆菌以及只有水)。与用包含空载体pGN29的细菌喷洒的马铃薯植物相比，CPB幼虫对用包含pGBNJ003质粒的浓度为0.025或0.008单位的细菌喷洒的马铃薯植物造成的进食损害显著降低(图15-LD)。K.成虫对经口摄取的对应于靶基因的dsRNA极其敏感下文所提供的实施例突出显示了，昆虫成虫(不仅是幼虫阶段的昆虫)对经口摄取的对应于靶基因的dsRNA极其敏感。选择4种乾标用于该实验耙标2、10、14和16(分别为SEQIDNO168、188、198和220)。GFP片段dsRNA(SEQIDNO235)用作对照。从我们实验室饲养的培养物中随机挑选年幼成虫(2-3日龄)，对昆虫性别无偏好性。每种处理选择10只成虫。在处理开始前，所述成虫预先饥俄至少6小时。在处理的第一天，用4个马铃薯叶盘(直径1.5cm2)喂食每只成虫，每个所述马铃薯叶盘通过局部应用0.1pg/pl的25fil靶标dsRNA(如实施例3A所述进行合成；局部应用如实施例3E所述)进行预处理。将每只成虫限制在小的培养皿(直径3cm)中以确保所有昆虫摄食等量的食物，并因此接受等剂量的dsRNA。第二天，如上所述再次对每只成虫喂食4个经处理的叶盘。第三天，收集每种处理的所有10只昆虫，并一起放置于由塑料盒(尺寸30cmx20cmxl5cm)组成的軍中，所述塑料盒的盖子中带有细密尼龙网以提供良好通风。在所述塑料盒中，其底部放置了一些潮湿滤纸。所述滤纸上面放置了一些(未处理的)马铃薯叶，从而在实验过程中维持成虫。从第5天起，进行定期评估从而对死亡、存活(可动的)和濒死昆虫数目进行计数。对于濒死昆虫来说，将其背部朝下放置来检查它们能否在几分钟内自己翻身；只有不能翻身的昆虫被认为是濒死的。在该实验中表明，对应于不同耙标的双链RNA对马铃薯叶甲成虫明显的特异性毒性作用(图12-LD)。对应于gfp片段的双链RNA在最终评估日(第19天)显示出对CPB成虫没有毒性。该实验清楚地显示，当经口递送接触到dsRNA仅几天后CPB成虫的存活就显著降低。例如，对于靶标10来说，在第5天，IO只成虫中的5只瀕死(病态且移动緩慢)；在第6天，IO只成虫中的4只死亡，存活昆虫中3只濒死；在第9天，观察到所有成虫均死亡。作为该实验的结论，可将针对昆虫害虫的乾标双链RNA的应用扩展至包括可造成广泛的作物破坏之昆虫害虫的两个生活阶段(即幼虫和成虫)，所述昆虫害虫，如马铃薯叶甲的情形。实施例4:辣才艮猿叶甲(Mustardleafbeetle,MLB)A.通过家族PCR(familyPCR)克隆辣根猿叶甲PC001、PC003、PC005、PCOIO、PC014、PC016和PC027基因的部分序列。按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr.15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland,USA)从辣根猿叶甲(辣才艮猿叶甲；来源Dr.CarolineMuller,Julius-von-Sachs-InstituteforBiosciences,ChemicalEcologyGroup,UniversityofWuerzburg,Julius-von-Sachs國Platz3，D-97082Wuerzburg,Germany)第3阶段幼虫分离高质量的总RNA。按照制造商的说明，通过DNA斷Cat.Nr.1700:Promega)处理除去RNA制备物中存在的基因组DNA。按照制造商的说明，4吏用市售试剂盒(SuperscriptTMIIIReverseTranscriptase,Cat.Nr.18080044，Invitrogen,Rockville，Maryland,USA)得到cDNA。为了分离包含PCOOl、PC003、PC005、PC010、PC014、PC016和PC027基因一部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用AmplitaqGold(Cat.Nr.N8080240,AppliedBiosystems)进行一系列PCR反应。表2-PC中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引物进行各PCR反应，其使用以下条件95。CIO分钟，然后是40个循环的95'C30秒、55'C1分钟和72'C1分钟，然后是72'C10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其克隆入pCR4/TOPO载体(Cat.Nr.K4530-20,Invitrogen)并测序。表2-PC中给出了用各自SEQIDNO表示所得PCR产物的序列，并且其为部分序列。表3-PC中给出了用各自SEQIDNO表示的相应部分氨基酸序列。表3-PC提供了cDNA克隆的氨基酸序列，其中读码框的起点在括号中指明。B.产生辣根猿叶甲基因的dsRNA4吏用市售试剂盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个独立的PCR反应中得到最初两种独立的单个5，T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与T7启动子方向不同的靶序列。对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引物得到有义T7模板。表8-PC中给出了用于扩增每种靶序列有义模板的各引物的序列。表8-PC提供了制备辣根猿叶甲靶序列的dsRNA片段之细节，其包括引物序列。PCR反应的条件如下95'C1分钟，然后是20个循环的95'C30秒、60'C30秒和72'C1分钟，然后是15个循环的95"€30秒、50'C30秒和72卩1分钟，然后是72'C10分钟。在使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引物得到反义T7模板。表8-PC中给出了用于扩增每种靶基因反义模板的各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaC104沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-PC中给出每种乾基因所得dsRNA的有义链。C.对转基因拟南芥植物进行桃蚜侵害实验室试验得到转基因植物4吏用浸花法(CloughandBent(1998)iVfl"f/做nm/16735-743)转化拟南芥植物。将所述植物的地上部分在含有以下物质的溶液中孵育数秒，所述溶液含有5%蔗糖、来自过夜培养物的重悬根癌农杆菌(J^Y^""er/w附似挑e/flc/e/w)菌林C58C1Rif细胞以及0.03%的表面活性剂SilwetL-77。接种后，用透明塑料覆盖植物16小时以保持湿度。为了提高转化效率，一周后重复所述步骤。当种子成熟后停止浇水，收获干燥的种子并冷处理两天。灭菌后，将种子铺在含卡那霉素的生长培养基中用以选择转化植物。将所选植物移至泥土用以最佳地产生T2种子。生物测定通过使分离的T2种子在适当的选择培养基上萌发来选择转基因拟南芥植物。当这些转基因植物的根完全形成时，将它们移至新鲜的人工生长培养基或泥土，使它们在最佳条件下生长。针对桃蜂若虫来检测整林转基因植物，以显示(1)对摄食若虫造成的植物损害具有显著抗性，(2)若虫死亡率提高，和/或(3)存活若虫的重量减少(或任何其它的昆虫发育异常)。D.针对辣根猿叶甲幼虫的活性，使用油菜叶盘对dsRNA靶标进行实验室试验检测下文提供的实施例举例说明了辣根猿叶甲幼虫对经口摄入的对应于自身靶基因的dsRNA敏感。为了测试针对MLB幼虫的不同双链RNA样品，采用了使用油菜变种SWOban;来源NickBalaam,SwSeedLtd.,49NorthRoad,Abington，Cambridge,CB16AS，UK)叶材料作为食物来源的叶盘测定。在昆虫室中相同变种的油菜上维持所述昆虫培养物，其条件为25士2'C，60±5%相对湿度，16小时光照/8小时黑暗的光周期。使用合适尺寸的穿孔器从4至6周龄的油菜植物切下直径约1.1cm(或0.95cm2)的叶盘。用含有0.05%TritonX-100的Milli-Q水将双链RNA样品稀释到0.1ng/pl。通过将25pl的乾标PC001、PC003、PC005、PC010、PC014、PC016、PC027dsRNA和对照gfpdsRNA的稀释溶液或者0.05%TritonX-100施加到近轴叶表面来制备经处理的叶盘。将所述叶盘干燥并分别置于24孔板的每一个孔中，所述孔含有1ml凝胶化的2%琼脂，其有利于防止所述叶盘干枯。将两只新生MLB幼虫置于所述板的每个孔中，然后用多孔塑料盖将其盖上。将所述板(每种处理包含48只昆虫)分为4个重复，每个重复包含12只昆虫(每行)。将包含所述昆虫和叶盘的平板保存在昆虫室中，其条件为25士2。C,60±5%相对湿度，16小时光照/8小时黑暗的光周期。用叶盘喂食昆虫2天，之后将它们移至含有新近处理的叶盘的新平板。然后，在生物测定开始后4天，收集来自每个重复的昆虫并移至含未经处理新鲜油菜叶的培养皿。在第2、4、7、9和11天记录幼虫死亡率和平均重量。对于所有被测耙标，用经完整棵乾标dsRNA处理的油菜叶喂食辣根猿叶甲幼虫均导致幼虫死亡率显著增加，如图l(a)所示。针对靶标PC010的被测双链RNA在第9天导致100%幼虫死亡，而针对乾标PC027的被测双链RNA在第11天导致100%幼虫死亡。对于所有其它的靶标，与对照gfpdsRNA、只有0.05。/。TritionX-100或仅有未处理的叶相比在第11天达到高死亡率值(平均值百分数士a0.05的置信区间)PC001(94.4±8.2)，PC003(86.1±4.1),PC005(83.3±7.8)，PC014(63.9±20.6),PC016(75.0±16.8),gfpdsRNA(11.1±8.2)，0.05%TritonX-100(19.4±10.5)，尸、有叶(83±10.5)。基于它们的平均重量来评估存活的幼虫。对于所有被测靶标，在所述生物测定4天后，辣根猿叶甲幼虫的平均重量显著降低；喂食对照gfpdsRNA或仅有0.05%TritionX-100的昆虫发育正常，与仅摄食叶的幼虫一样(图1(b)-PC)。E.针对辣根猿叶甲幼虫的活性，使用油菜叶盘对不同浓度dsRNA进行实验室试验筛选如上文实施例4D所述，将25jil来自把标PC010或PC027的dsRNA溶液局部应用至油菜叶盘上，所述dsRNA溶液采用IO倍系列浓度(从0.1吗/nl降至0.1ng/nl)。作为阴性对照,将仅有0.05%TritonX-100施加到所述叶盘。针对每种处理，检测24只辣根猿叶曱新生幼虫，其中每孔两只昆虫。在昆虫饲养室中保存所述平板，其条件为25±2。C,60±5%相对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。在第2天，将所述幼虫移至含有新鲜的经dsRNA处理的叶盘的新平板上。在第4天(针对靶标PC010)和第5天(针对靶标PC027)，将来自每个重复实验的昆虫移至含充足的未处理叶材料的培养皿。在第2、4、7、8、9和11天(针对标PC010)以及在第2、5、8、9和12天(针对乾标PC027)评估所述甲虫的存活情况。如图2(a)和(b)中所示，用含有两种不同靶标(PC010和PC027)之完整棵dsRNA(以低至lngdsRNA/pl的溶液浓度)的油菜叶盘喂食辣根猿叶曱导致高死亡率。针对不同浓度dsRNA的平均死亡率值百分数土a0.05的置信区间对于乾标PC010来说第11天为，0ngl:8.3±9.4,0.1fig/fil:100，0.01ng/jil:79.2±20.6，0.001一l:58.3±9.4，0.0001Hg/fil:12.5±15.6;对于PC027来说在第12天为，0ng/jil:8.3±9.4，0.1Hg/Hl:95.8±8.2，0.01ng/fil:95.8±8.2，0.001fig/jil:83.3±13.3，0.00011:12.5±8.2。F.将MLB基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有活性的双链RNA以下是将对应于MLB基因靶标的DNA片段克隆进栽体中的实施例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考WO0001846)。表8-PC中提供了用于扩增靶基因片段PCOIO的特异性引物序列。所使用的模板是含有PC010序列(SEQIDNO253)的pCR8/GW/topo载体。所述引物用于使用以下条件的递减PCR(touch-downPCR)反应中95"1分钟，然后是20个循环的95'C30秒、60'C30秒(每个循环其温度降低0.5°C)和72'C1分钟，然后是15个循环的95°C30秒、50'C30秒和72'Cl分钟，然后是72'C10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其平端克隆进经线性化的pGNA49A载体中(参考WO00188121A1)并测序。表8-PC给出了对应于SEQIDNO488的所得PCR产物的序列。包含该序列的重组载体称为pGCDJOOl。G.在一个大肠杆菌菌林AB301-105(DE3)中表达和产生双链RNA乾标遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA，该双链RNA在昆虫中具有活性。在该实验中，使用RNA酶III缺失的菌林AB301國105(DE3)。转化AB301-105(DE3)将300ng质粒加至50nl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105(DE3)菌林等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细胞20分钟，之后对其进行37。C热激处理5分钟，然后将所述细胞放回至冰上并再保持5分钟。将450nl室温的SOC培养基加至所述细胞，并将该悬液于37°C在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100pl细菌细胞悬液移至含有150mlLB液体培A基的500ml锥形瓶中，所述LB液体培养基补充有100Hg/ml的羧千青霉素抗生素。所述培养物于37'C在Innova4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。在AB301-105(DE3)中化学资导双链RNA表达因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3)细菌菌林中可以表达来自重组载体pGXXXOXX的双链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7聚合物将以反义和正义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述把序列的侧翼是相反方向的T7启动子。使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度，并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移至50mlFalcon管中，然后在15'C以3000g离心所述培养物10分钟。除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100吗/ml羧节青霉素和1mMIPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5吗/ml胆固醇)进行重悬。在室温诱导细菌2至4小时。细菌的热处理通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分钟，弃去上清液，并将沉淀在80。C水浴中保持20分钟。热处理后，将细菌沉淀重悬于总体积为50ml的0.05%TritonX-100溶液中。所述管保存在纩C备用。H.针对辣根猿叶甲，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测叶盘生物测定针对辣根猿叶曱幼虫，应用叶盘生物测定法来检测大肠杆菌产生的靶标PC010双链RNA(来自质粒pGCDJOOl)。如实施例4所述，从油菜叶制备叶盘。将20nl细菌悬液(在600nm波长的吸光度值为1)加至每个叶盘上。将所述叶盘置于24孔板的孔中，所述孔含有1ml凝胶化的琼脂。将两只新生幼虫加至每个叶盘上。对于每种处理来说，准备3个重复实验，其中每个重复实验包含16只新生幼虫。所述平板保存在昆虫饲养室中，其条件为25士2。C，60±5%相对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。在第3天(即生物测定开始后3天)，将幼虫移至含新鲜的经处理(相同剂量)叶盘的新平板。从第5天起，每隔一天更换叶材料一次。该生物测定对死亡率和平均重量打分。阴性对照是用包含质粒pGN29(空载体)的细菌处理的叶盘以及只有叶子。在用含质粒pGCDJOOl的RNA酶III缺失大肠杆菌AB301-105(DE3)菌林处理的油菜叶喂食辣根猿叶甲幼虫后，所述昆虫的死亡率随时间显著增加，而在对照的包含质粒pGN29的细菌或只有叶子的情形中几乎没有或没有昆虫死亡(图3-PC)。基于植物的生物测定用热失活的化学诱导的表达dsRNA之细菌悬液喷洒整林植物，然后用所述植物喂食MLB。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置于植物上从而軍住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。将MLB置于革中的每林经处理的植物上。用包含pGCDJOOl或pGN29质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)菌林悬液处理植物。向植物施加不同量的细菌例如66、22和7个单位，其中一个单位定义为在600nm波长下吸光度值为1的lml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用喷雾器将总体积1~10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用一林植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。用表达来自pGCDJOOl的耙标dsRNA的大肠杆菌AB301-105(DE3)菌林悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺失的细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA的细菌组成。实施例5:墨西哥豆胍虫(Mexicanbeanbeetle,MBB)A.克隆墨西哥豆瓢虫的部分基因序列按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr.15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland,USA)从4个不同幼虫阶段的墨西哥豆胍虫(墨西哥豆胍虫；来源ThomasDorsey,SupervisingEntomologist,NewJerseyDepartmentofAgriculture,DivisionofPlantIndustry,BureauofBiologicalPestControl,PhillipAlampiBeneficialInsectLaboratory,POBox330,Trenton,NewJersey08625-0330，USA)中分离高质量的总RNA。按照制造商的i兌明，通过DNA酶(Cat.Nr.1700,Promega)处理除去该RNA制备物中的基因组DNA。按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperscriptIII逆转录酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen,Rockville，Maryland,USA)得到cDNA。为了分离包含EV005、EV009、EVOIO、EV015和EV016基因一部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用AmplitaqGold(Cat.Nr.N8080240,AppliedBiosystems)进行一系列PCR反应。表2-EV中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列，其显示了包括引物序列和所得cDNA序列的墨西哥豆瓢虫靶基因。使用这些引物进行各PCR反应，其使用以下条件对于EV005和EV009来说，95°C10分钟，然后是40个循环的95'C30秒、50'C1分钟和72'Cl分30秒，然后是72'C7分钟；对于EV014来说，95'C10分钟，然后是40个循环的95'C30秒、53'C1分钟和72°C1分钟，然后是72'C7分钟；对于EV010和EV016来说，95*€10分钟，然后是40个循环的95'C30秒、54'C1分钟和72°C1分40秒，然后是72'C7分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其克隆入pCR4/TOPO载体(Cat.Nr.K4530-20,Invitrogen)并测序。表2-EV+给出了用各自SEQIDNO表示的所得PCR产物的序列，并且其为部分序列。表3-EV中给出了用各自SEQIDNO表示的相应部分氨基酸序列，其中读码框的起点在括号中指明。B.产生墨西哥豆瓢虫基因的dsRNA《吏用市售试剂盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个单独的PCR反应中得到最初两种独立的单个5，T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与T7启动子方向不同的靼序列。对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引物得到有义T7模板。表8-EV中给出了用于扩增每种靶序列有义模板的各引物的序列。所述PCR反应的条件如下95'Cl分钟，然后是20个循环的95"30秒、60'C30秒和72。C1分钟，然后是15个循环的95°C30秒、50"30秒和72'Cl分钟，然后是72'C10分钟。在使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引物得到反义T7模板。表8-EV中给出了用于扩增每种靶基因反义模板的各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106,Qiagen)以及NaC104沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-EV中给出了每种靶基因所得dsRNA的有义链。C.针对墨西哥豆瓢虫幼虫的活性，使用豆叶盘对dsRNA靶标进行实验室试验检测下文提供的实施例举例说明墨西哥豆胍虫(Mexicanbeanbeetle,MBB)幼虫对经口摄入的对应于自身靶基因的dsRNA敏感。为了检测针对MBB幼虫的不同双链RNA样品，釆用了使用菜豆(/V^腳/wsvM/gfln、变种Montano;来源AveveNV,Belgium)叶材料作为食物来源的叶盘测定。在昆虫室中使用同样变种的菜豆以维持昆虫培养物，其条件为25士2。C，60±5%相对湿度，16小时光照/8小时黑暗的光周期。使用合适尺寸的穿孔器从1至2周龄的豆植物叶子切下直径约l.lcm(或0.95cm2)的叶盘。用含有0.05%TritonX-100的Milli國Q水将双链RNA样品稀释到1吗/[il。通过将25nl的乾标Ev005，EvOlO，Ev015，Ev016dsRNA和对照gfpdsRNA的稀释溶液或0.05%TritonX-100施加到近轴叶表面来制备经处理的叶盘。将所述叶盘干燥并分别置于24孔板的每一个孔中，所述孔含有lml凝胶化的2%琼脂，其有利于防止叶盘干枯。将一只新生MBB幼虫置于所述板的每个孔中，然后用多孔塑料盖将其盖上。将所述板分为3个重复，每个重复包含8只昆虫(每行)。将包含所述昆虫和叶盘的平板保存在昆虫室中，其条件为25±2'C，60±5%相对湿度，16小时光照/8小时黑暗的光周期。用叶盘喂食昆虫2天，之后将它们移至含有新鲜的经处理的叶盘的新平板。然后，在生物测定开始后4天，每天将所述昆虫移至含有未经处理新鲜豆叶的培养i，直至第10天。在第2天以及之后每隔一天记录幼虫死亡率和平均重量。用包含表面应用的完整棵靶标dsRNA的菜豆叶喂食的墨西哥豆胍虫幼虫均导致幼虫死亡率显著增加，如图1所示。8天后，耙标EV010、Ev015和Ev016的被测双链RNA导致100。/。死亡率，而乾标Ev005的dsRNA用10天杀死所有幼虫。用包含对照gfpdsRNA或仅有表面活性剂TritonX-100的叶盘喂食的大部分昆虫在整个生物测定中维持存活(图1-EV)。D.针对墨西哥豆胍虫成虫的活性，使用豆叶盘对dsRNA靶标进行实验室试验检测下文提供的实施例举例说明了墨西哥豆瓢虫成虫对经口摄入的对应于自身靶基因的dsRNA敏感。在与墨西哥豆胍虫幼虫类似的生物测定设置中，检测MBB成虫抗御局部应用至豆叶盘的双链RNA。用0.05%TritonX-100将来自每种靶标(Ev010、Ev015和Ev016)的测试dsRNA稀释至终浓度为0.1pig/nl。通过将30nl测试溶液局部施加到每个叶盘上对豆叶盘进行处理。使所述叶盘完全干燥，然后将其置于24孔板每个孔中的2%凝胶化琼脂薄片上。从培养罩中收集三日龄成虫，7-8小时不喂食，然后将一只成虫置于生物测定板的每个孔中(因此每种处理包括24只成虫)。所述板保存在昆虫飼养室中(在与MBB幼虫相同的条件下保存24小时)，之后将所述成虫移至包含新鲜的经dsRNA处理的叶盘的新板。再过24小时，收集来自每种处理的成虫，将其置于30cmxl5cmxl0cm的塑料盒中，所述塑料盒包含两盆未经处理的3周龄豆植物。从第4天到第11天评估昆虫死亡率。被墨西哥豆瓢虫成虫摄食的所有3种靶标dsRNA(Ev010、Ev015和Ev016)导致死亡率从第4天(生物测定开始后4天)开始显著增加，如图2(a)-EV所示。从第5天起，观察到在最初用乾标dsRNA处理的豆叶盘喂食的昆虫与用包含对照gfpdsRNA或表面活性剂TritonX-100的叶盘喂食的昆虫之间摄食模式的明显改变。与gfpdsRNA和只有表面活性剂的对照相比，对于所有3种靶标均明显可见MBB成虫对未处理豆植物的叶损伤降低(尽管水平不同)；用靶标15喂食的昆虫对豆叶损伤最小(图2(b)-EV)。E.将MBB基因片段克隆进栽体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有活性的双链RNA以下是将对应于MBB基因靶标的DNA片段克隆进栽体中的实例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启动子或在细菌中有效转录之其它任何的启动子的任何载体(参考WO0001846)。表8-EV中提供了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的模板是包含任意乾序列的pCR8/GW/topo栽体。使用所述引物进行PCR反应，其使用以下条件98'C5分钟，然后是30个循环的98'C10秒、55"30秒和72'C2分钟，然后是72'C10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706，Qiagen),将其平端克隆进经线性化的pGNA49A载体中(参考WO00188121A1)并测序。表8-EV中给出了对应于各自序列的所得PCR产物的序列。包含该序列的重组栽体称为pGXXXOXX。F.在两个大肠杆菌菌林(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3)中表达和产生双链RNA乾标遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA，该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺失的菌林(AB301-105(DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行比较。转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)将300ng质粒加至50nl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105(DE3)或BL21(DE3)菌林等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细胞20分钟，之后对其进行37'C热激处理5分钟，然后将所述细胞放回至水上并再保持5分钟。将450^室温的SOC培养基加至所述细胞，并将该悬液于37。C在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100pl细菌细胞悬液移至含有150mlLB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液体培养基补充有100吗/ml的羧千青霉素抗生素。所述培养物于37'C在Innova4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3)或BL21(DE3)细菌菌林中可以表达来自重组载体pGXXXOXX的双链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的侧翼是相反方向的T7启动子。使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度，并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移至50mlFalcon管中，然后在15。C以3000g离心所述培养物10分钟。除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100pg/ml羧千青霉素和1mMIPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5pg/ml胆固醇)进行重悬。在室温诱导细菌2至4小时。细菌的热处理通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减至最小，然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分钟，弃去上清液，并将沉淀在80'C水浴中保持20分钟。热处理后，将细菌沉淀重悬于1.5mlMilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20'C备用。G.针对墨西哥豆瓢虫，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测基于植物的生物测定用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整林植物，然后用所述植物喂食MBB。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置于植物上从而革住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。将MMB置于革中每林经处理过的植物上。用包含pGBNJOOl或pGN29质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量的细菌例如66、22和7单位，其中一个单位定义为在600nm波长下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用喷雾器将总体积1~10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用一林植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。用表达来自pGXXXOXX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105(DE3)菌林悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA的细菌组成。实施例6:墨西哥棉铃象(Cottonbollweevil,CBW)A.克隆墨西哥棉铃象的部分基因序列按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr.15596-026/15596-018，Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)从3龄墨西哥棉铃象(墨西哥棉铃象；来源Dr.GaryBenzon,BenzonResearchInc.,7KuhnDrive,Carlisle,Pennsylvania17013,USA)中分离高质量的完整RNA。按照制造商的说明，通过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理除去RNA制备物中的基因组DNA。按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperScriptTMIII逆转录酶，Cat.Nr.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)得到cDNA。为了分离包含AG001、AG005、AGOIO、AG014和AG016基因一部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用AmplitaqGold(Cat.Nr.N8080240,AppliedBiosystems)进行一系列PCR反应。表2-AG中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列，其显示了包括引物序列和所得cDNA序列的墨西哥棉铃象靶基因。使用这些引物进行各自的PCR反应，其使用以下条件对于AGOOl、AG005和AG016来说，95'C10分钟，然后是40个循环的95'C30秒、50'C1分钟和72°Cl分30秒，然后是72'C7分钟；对于AG010来说，95°C10分钟，然后是40个循环的95r30秒、54'C1分钟和72'C2分30秒，然后是72'C7分钟；对于AG014来说，95。C10分钟，然后是40个循环的95°C30秒、55'C1分钟和72'Cl分钟，然后是72'C7分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706，Qiagen),将其克隆入pCR8/GW/TOPO载体(Cat.Nr.K2500-20,Invitrogen)并测序。表2-AG中给出了用各自SEQIDNO表示的所得PCR产物的序列，并且称为部分序列。表3-AG中给出了用各自SEQIDNO表示的相应部分氨基酸序列。B.产生墨西哥棉铃象基因的dsRNA4吏用市售试剂盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个独立的PCR反应中得到最初两种独立的单个5，T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与T7启动子方向不同的靶序列。对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引物得到有义T7模板。表8-AG中给出了用于扩增每种靶序列有义模板的各引物的序列。如下进行递减PCR反应95。Cl分钟，然后是20个循环的95°C30秒、60'C30秒(每个循环降低0.5'C)和72'C1分钟，然后是15个循环的95'C30秒、50'C30秒和72'C1分钟，然后是72°C10分钟。在使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引物得到反义T7模板。表8-AG中给出了用于扩增每种靶基因反义模板的各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaC104沉淀进行纯化。将所得到的T7正向和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-AG中给出了每种把基因所得dsRNA的有义链。C.将CBW基因片段克隆进栽体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有活性的双链RNA以下是将对应于CBW基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启动子或在细菌中有效转录之其它任何的启动子的任何载体(参考WO0001846)。表8-AG中给出了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的模板是含有任意乾序列的pCR8/GW/topo载体。使用所述引物进行PCR反应，其使用以下条件98'C5分钟，然后是30个循环的98'CIO秒、55'C30秒和72匸2分钟，然后是72'C10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706,Qiagen)，将其平端克隆进经线性化的pGNA49A载体中(参考WO00188121A1)并测序。表8-AG中给出了对应于各自序列的所得PCR产物的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXXOXX。D.在两个大肠杆菌菌林(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3)中表达和产生双链RNA乾标遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA，该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺失的菌林(AB301-105(DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行比较。转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)将300ng质粒加至50Ml冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105(DE3)或BL21(DE3)菌林等份中并轻柔混合。在水上孵育所述细胞20分钟，之后对其进行37'C热激处理5分钟，然后将所述细胞放回至水上并再保持5分钟。将450jxl室温的SOC培养基加至所述细胞，并将该悬液于37。C在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100pl细菌细胞悬液移至含有150mlLB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液体培养基补充有100吗/ml的羧爷青霉素抗生素。所述培养物于37'C在Innova4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学谦导双链RNA表达因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3)或BL21(DE3)细菌菌林中可以表达来自重组栽体pGXXXOXX的双链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7聚合酶将以反义和有义方向驱动所述乾序列的转录，因为所述乾序列的侧翼是相反方向的T7启动子。使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度，并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移至50mlFalcon管中，然后在15。C以3000g离心所述培养物10分钟。除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100jig/ml羧千青霉素和1mMIPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5吗/ml胆固醇)进行重悬。在室温诱导细菌2至4小时。细菌的热处理通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分钟，弃去上清液，并将沉淀在80'C水浴中保持20分钟。热处理后，将细菌沉淀重悬于1.5mlMilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20'C备用。E.针对墨西哥棉铃象，对表达dsRNA乾标的大肠杆菌进行实验室试验检测基于植物的生物测定用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整林植物，然后用所述植物喂食CBW。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。将CBW置于革中每林经处理过的植物上。用包含pGXXXOXX或pGN29质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量的细菌例如66、22和7单位，其中一个单位定义为在600nm波长下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用喷雾器将总体积1~10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用一林植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。用表达来自pGXXXOXX的乾标dsRNA的大肠杆菌AB301-105(DE3)菌林悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA的细菌组成。实施例7:赤拟谷盗(Redflourbeetle,RFB)A.克隆赤拟谷盗的部分基因序列按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr.15596-026/15596-018,Invitrogen，Rockville，Maryland,USA)从所有不同阶段的赤拟谷盗(赤拟谷盗；来源Dr.LaraSenior,InsectInvestigationsLtd.,CapitalBusinessPark,Wentloog,Cardiff,CF32PX，Wales,UK)中分离高i量的完整RNA。按照制造商的说明，通过DNA酶(Cat.Nr.1700,Promega)处理除去RNA制备物中的基因组DNA。按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperscriptIII逆转录酶，Cat.Nr.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)得到cDNA。为了分离包含TC001、TC002、TCOIO、TC014和TC015基因一部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用AmplitaqGold(Cat.Nr.N8080240,AppliedBiosystems)进行一系列PCR>^应。表2-TC中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引物进行各PCR反应，其使用以下条件95'C10分钟，然后是40个循环的95。C30秒、50'C1分钟和72'Cl分30秒，然后是72。C7分钟(TC001、TC014、TC015);95。C10分钟，然后是40个循环的95'C30秒、54。C1分钟和72'C2分30秒，然后是72。C7分钟(TC010);95°C10分钟，然后是40个循环的95°C30秒、53t!1分钟和72'C1分钟，然后是72'C7分钟(TC002)。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其克隆入pCR8/GW/TOPO载体(Cat.Nr.K250020，Invitrogen)并测序。表2-TC中给出了用各自SEQIDNO表示的所得PCR产物的序列，并且称为部分序列。表3-TC中给出了用各自SEQIDNO表示的相应部分氨基酸序列。B.产生赤拟谷盗基因的dsRNA使用市售试剂盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成亳克级的dsRNA。在两个独立的PCR反应中得到最初两种独立的单个5，T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与T7启动子方向不同的靶序列。对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引物得到有义T7模板。表8-TC中给出了用于扩增每种靶序列有义模板的各引物的序列。所述PCR反应条件如下95'C1分钟，然后是20个循环的95'C30秒、60'C30秒(-0.5'C/循环)和72'C1分钟，然后是15个循环的95'C30秒、50'C30秒和72'C1分钟，然后是72'C10分钟。在使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引物得到反义T7模板。8-TC中给出了用于扩增每种靶基因反义模板的各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂叙QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106,Qiagen)以及NaC104沉淀进行纯化，按照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-TC中给出了每种乾基因所得dsRNA的有义链。C.针对赤拟谷盗幼虫，使用人工飼料对dsRNA靶标进行实验室试验检测下文提供的实施例举例说明了赤拟谷盗幼虫(RFB)对经口摄入的对应于自身乾基因的dsRNA敏感。赤拟谷盗维持于InsectInvestigationsLtd.(来源ImperialCollegeofScience,TechnologyandMedicine,SilwoodPark,Berkshire,UK)。根据公司的SOP/251/01来饲养昆虫。简言之，将所述甲虫置于塑,或箱中。这些罐或箱具有顶部开口用以通风。其顶部装有网并用弹性带固定从而防止逃脱。将幼虫饲^养基(面粉)放置于可飼养甲虫的容器中。在控温室中飼养絲的产品甲虫幹沐，其务fr为25土3。C,16:8小时的光照:黑暗循环。将来自靶标TC014的双链RNA(其序列对应于SEQIDNO799的)掺入到面粉和奶粉的混合物(全麦粉奶粉比值为4:1)中，使之过夜干燥。分别制备争个重复将10ng/pl的100pidsRNA溶液(1mgdsRNA)加入到0.1g面粉/奶混合物中。将干燥的混合物研磨成细粉。昆虫维持在培养亚(55mm直径)中，该培养亚中衬有双层滤纸。将经处理的饲料放置于两层滤纸之间。将10只l龄混合性别的幼虫放置于每个皿(重复)中。每种处理进行4次重复实验。对照是Milli-Q水。以常规标准进行评估(存活昆虫数)。在试验过程中，测试条件是25-33。C，20-25%相对湿度，12:12小时的光照:黑暗光周期。与只有对照的饲料相比，用经靶标TC014dsRNA处理的人工飼料喂食的赤拟谷盗幼虫之存活率随时间显著降低，如图l-TC所示。D.将RFB基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有活性的双链RNA以下是将对应于RFB基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考WO0001846)。表8-TC中提供了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的模板是含有任意耙序列的pCR8/GW/topo载体。使用所述引物进行PCR反应，其使用下述条件98°〇5分钟，然后是30个循环的98'C10秒、55*C30秒和72r2分钟，然后是72'CIO分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其平端克隆进经线性化的pGNA49A载体中(参考WO00188121A1)并测序。8-TC中给出了对应于各自序列的所得PCR产物的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXXOXX。E.在两个大肠杆菌菌林(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3)中表达和产生双链RNA靶标遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA，该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌林(AB301-105(DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行比较。转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)将300ng质粒加至50pl水冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105(DE3)或BL21(DE3)菌林等份中并轻柔混合。在冰上醉育所述细胞20分钟，之后对其进行37'C热激处理5分钟，然后将所述细胞放回至冰上并再保持5分钟。将450^室温的SOC培养基加至所述细胞，并将该悬液于37'C在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100pl细菌细胞悬液移至含有150mlLB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液体培养基补充有100吗/ml的羧节青霉素抗生素。所述培养物于37'C在Innova4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3)或BL21(DE3)细菌菌林中可以表达来自重组载体pGXXXOXX的双链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的侧翼是相反方向的T7启动子。使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度，并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1.将50ml该培养物移至50mlFalcon管中，然后在15'C以3000g离心所述培养物10分钟。除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100ng/ml羧节青霉素和1mMIPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5吗/ml胆固醇)进行重悬。在室温诱导细菌2至4小时。细菌的热处理通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分钟，弃去上清液，并将沉淀在80。C水浴中保持20分钟。热处理后，将细菌沉淀重悬于1.5mlMilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20'C备用。F.针对赤拟谷盗，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测基于植物的生物测定用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整株植物，然后用所述植物喂食RFB。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置于植物上从而軍住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。将RFB置于罩中每林经处理过的植物上。用包含pGXXX0XX或pGN29质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量的细菌例如66、22和7单位，其中一个单位定义为在600nm波长下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用喷雾器将总体积1~10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用一林植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。用表达来自pGXXXOXX的乾标dsRNA的大肠杆菌AB301-105(DE3)菌林悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA的细菌组成。实施例8:湘匕奸(Greenpeachaphid，GPA)A.克隆桃蜂的部分基序列按照制造商的i兌明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr.15596-026/15596-018,Invitrogen，Rockville，Maryland,USA)从桃对若虫(杉匕蜂；来源Dr.RachelDown,Insect&PathogenInteractions,CentralScienceLaboratory,SandHutton,York,Y041ILZ，UK)中分离高质量的完整RNA。按照制造商的说明，通过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理除去RNA制备物中的基因组DNA。按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperscriptIII逆转录酶，Cat.Nr.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)得到cDNA。为了分离包含MP001、MP002、MPOIO、MP016和MP027基因一部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用AmplitaqGold(Cat.Nr.N8080240,AppliedBiosystems)进行一系列PCR反应。表2-MP中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引物进行各自的PCR反应，其使用以下条件对于MP001、MP002和MP016来"^兌，95匸10分钟，然后是40个循环的95°C30秒、50°C1分钟和72'C1分30秒，然后是72。C7分钟；对于MP027来说，使用递减PCR程序95'C10分钟，然后是10个循环的95'C30秒、60°C40秒(每循环降低1°C)和72'C1分10秒，然后是30个循环的95'C30秒、50'C40秒和72'C1分10秒，然后是72'C7分钟；对于MP010来说，95'C10分钟，然后是40个循环的95'C30秒、54。C1分钟和72。C3分钟，然后是72t:7分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其克隆入pCR8/GW/TOPO载体(CatNr.K2500-20,Invitrogen)并测序。表2-MP中给出了用各自SEQIDNO表示的所得PCR产物的序列，并且称为部分序列。表3-MP中给出了用各自SEQIDNO表示的相应部分氨基酸序列。B.产生杉匕蜂基因的dsRNA使用市售试剂盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个独立的PCR反应中得到最初两种独立的单个5，T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与T7启动子方向不同的靶序列。对于每种乾基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引物得到有义T7模板。表8-MP中给出了用于扩增每种乾序列有义模板的各引物的序列。如下进行递减PCR反应95X:i分钟，然后是20个循环的95。C30秒、55*030秒(针对MPOOl、MP002、MP016、MP027和gfp)或50'C30秒(针对MPOlO)(每循环降低0.5卩)和72'C1分钟，然后是15个循环的95'C30秒、45'C30秒和72'Cl分钟，然后是72'C10分钟。在使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引物得到反义T7模板。表8-MP中给出了用于扩增每种靶基因反义模板的各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106,Qiagen)以及NaC104沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-MP中给出了每种乾基因所得dsRNA的有义链。C.桃奸对转基因拟南芥植物侵害的实验室试验得到转基因植物使用浸花法(CloughandBent(1998)i，/朋f/做iti"/16735-743)转化拟南芥植物。将所述植物的地上部分在含有以下物质的溶液中孵育数秒，所述溶液含有5%蔗糖、来自过夜培养物的重悬根癌农杆菌菌林C58ClRif细胞以及0.03。/。的表面活性剂SilwetL-77。接种后，用透明塑料覆盖植物16小时以保持湿度。为了提高转化效率，一周后重复所述步骤。当种子成熟后停止浇水，收获干燥的种子并冷处理两天。灭菌后，将种子铺在含卡那霉素的生长培养基中用以选择转化植物。将所选植物移至泥土用以最佳地产生T2种子。生物测定通过使分离的T2种子在适当的选择培养基上萌发来选择转基因拟南芥植物。当这些转基因植物的根完全形成时，将它们移至新鲜的人工生长培养基或泥土，使它们在最佳条件下生长。针对桃奸若虫来检测整林转基因植物，其显示(1)对摄食若虫造成的植物损害具有显著抗性，(2)若虫死亡率提高，和/或(3)存活若虫的重量减少(或任何其它的昆虫发育异常)。D.针对桃辨的活性，使用液体人工饲料对dsRNA靶标进行实验室试验检测基于适于豌豆对的饲料制备用于桃辨的液体人工飼料，如Febvayetal.(1988)[InfluenceoftheaminoacidbalanceontheimprovementofanartificialdietforabiotypeofJcyW/r0si》Aow/w'sw附(HomopteraAphididae).CVi"./.Z卯/.66:2449-2453所述，但进行了某些修改。如下制备所述飼料的氨基酸组分以mg/100ml计，丙氨酸178.71,p-丙氨酸6.22,精氨酸244.9，天冬酰胺298.55,天冬氨酸88.25,半胱氨酸29.59，谷氨酸149.36,谷氨酰胺445.61，甘氨酸166.56,组氨酸136.02，异亮氨酸164.75,亮氨酸231.56,盐酸赖氨酸351.09,蛋氨酸72.35，鸟氨酸(HC1)9.41，苯丙氨酸293,脯氨酸129.33，丝氨酸124.28，苏氨酸127.16，色氨酸42.75，酪氨酸38.63，L-缬氨酸190.85。除酪氨酸以外，将所述氨基酸溶于30mlMilli-Q水中，酪氨酸在加入到氨基酸混合物之前首先溶于数滴1M盐酸中。以如下5x浓缩原液的形式制备所述饲料的维生素混合物组分以mg/L计，氨基苯甲酸IOO、抗坏血酸1000、生物素1、泛酸钓50、氯化胆碱500、叶酸IO、肌醇420、烟酸IOO、盐酸吡喷醇25、核黄素5、盐酸硫胺25。将核黄素溶于lml50'C水中，然后加入到维生素混合物原液中。将所述维生素混合物等分为每等份20ml，保存于-20。C。将一等份维生素混合物加至所述氨基酸溶液。分别以下述量将蔗糖和MgS04.7H20加入到所述混合物中20g和242mg。如下制备微量金属原液以mg/100ml计，CuS045H204.7，FeCl3.6H2044.5,MnCl2.4H206.5，NaCl25.4,ZnCl28.3。将10ml微量金属溶液和250mgK丑2P04加至饲料，加入Milli-Q水至液体饲料终体积为100ml。用1MKOH溶液将所述饲料的pH调节为7。通过0.22滤器(Millipore)将所述液体饲料过滤灭菌。在受控环境室中具有70网孔的铝框笼中用4至6周龄油菜变种SWOban，来源NickBalaam,SwSeedLtd.,49NorthRoad,Abington，Cambridge,CB16AS，UK)饲养桃奸(初匕蜂；来源Dr.RachelDown,Insect&PathogenInteractions,CentralScienceLaboratory,SandHutton，York,Y041ILZ，UK)，所述室的条件如下23士2'C，60±5%相对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。生物测定开始的前一天，从饲养笼中收集成虫并将其置于培养皿中新近采摘的油菜叶上，并将其置于昆虫室中过夜。第二天，选取l龄若虫并移至飼养室。一个饲养室包括置于小培养亚(直径3cm)的10只l龄若虫，所述培养i覆盖有薄的单层拉伸封口膜(parafilmM)，向其上添加50nl飼料。用另一层封口膜密封所述饲养室，在与饲养成虫相同的条件下进行孵育。每隔一天更换包含dsRNA的饲料，在第8天(即生物测定开始后第8天)评估昆虫的存活率。针对每种处理，同时建立5个生物测定饲养室(重复)。将测试和对照(gfp)dsRNA溶液掺入饲料中至终浓度为2吗/pl。所述饲养室维持23±2。C，60±5%相对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。利用GraphPadPrism版本4测定Mann-Whitney检验，以确定乾标27(MP027)和gfpdsRNA之间中值是否有显著差异。在所述生物测定中，^使用飼养室将添加有靶标27(SEQIDNO1061)完整棵dsRNA的液体人工饲料喂食桃蚜若虫，其导致死亡率显著提高，如图l所示。用靶标27、gfpdsRNA和只有饲料处理的存活昆虫平均百分数分别为2、34和82。使用Mann-Whitney检验比较靶标027与gfpdsRNA组，得到0.004的单尾P值，这表明靶标027的中值与gfpdsRNA的预期较大中值有显著差异(P<0.05)。用掺有靶标27dsRNA的液体饲料喂食的桃圻明显小于用只有饲料或掺有gfpdsRNA对照的饲料喂食的桃对(数据未显示)。E.将GPA基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有活性的双链RNA以下是将对应于GPA基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何栽体(参考WO0001846)。表8-MP中给出了用于扩增乾基因的特异性引物序列。所使用的模板是含有任意乾序列的pCR8/GW/t叩o栽体。使用所述引物进行PCR反应，其使用以下条件98'C5分钟，然后是30个循环的98'C10秒、55*€30秒和72'C2分钟，然后是72。C10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其平端克隆进经线性化的pGNA49A栽体中(参考WO00188121Al)并测序。表8-MP给出了对应于各自序列的所得PCR产物的序列。包含该序列的重组栽体称为pGXXXOXX。F.在两个大肠杆菌(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3)菌林中表达和产生双链RNA靶标遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA，该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌林(AB301-105(DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行比较。转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)将300ng质粒加至50nl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105(DE3)或BL21(DE3)菌林等份中并轻柔混合。在水上孵育所述细胞20分钟，之后对其进行37'C热激处理5分钟，然后将所述细胞放回至水上并再保持5分钟。将450^il室温的SOC培养基加至所述细胞，并将该悬液于37'C在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100^1细菌细胞悬液移至含有150mlLB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液体培养基补充有100吗/ml的羧节青霉素抗生素。所述培养物于37'C在Innova4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3)或BL21(DE3)细菌菌林中可以表达来自重组载体pGXXXOXX的双链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的侧翼是相反方向的T7启动子。使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度，并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移至50mlFalcon管中，然后在15。C以3000g离心所述培养物10分钟。除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100pg/ml羧节青霉素和1mMIPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5吗/ml胆固醇)进行重悬。在室温诱导细菌2至4小时。细菌的热处理通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工飼料被污染的风险减至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分钟，弃去上清液，并将沉淀在80。C水浴中保持20分钟。热处理后，将细菌沉淀重悬于1.5mlMilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20'C备用。G.针对桃蜂，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测基于植物的生物测定用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整林植物，然后用所述植物喂食GPA。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。将GPA置于革中每林经处理过的植物上。用包含pGXXXOXX或pGN29质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量的细菌例如66、22和7单位，其中一个单位定义为在600nm波长下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用喷雾器将总体积1~10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用一林植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量.用表达来自pGXXXOXX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105(DE3)菌林悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因耙序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA的细菌组成。实施例9:褐飞虱(Brownplanthopper,BPH)A.克隆褐飞虱的部分序列按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperscriptIII逆转录酶，Cat.N°.18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland,USA)从褐飞虱(来源Dr.J.A.Gatehouse,Dept.BiologicalSciences,DurhamUniversity,UK)高质量的完整RNA得到cDNA。为了分离包含褐飞虱NLOOl、NL002、NL003、NL004、NL005、NL006、NL007、NL008、NL009、NLOIO、NLOll、NL012、NL013、NL014、NL015、NL016、NL018、NL019、NL021、NL022和NL027基因一部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用AmplitaqGold(Cat.N°.N8080240,AppliedBiosystems)进行一系列PCR反应。表2-NL中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引物进行各PCR反应，其4吏用以下条件对于NL001来说，95。C5分钟，然后是40个循环的95'C30秒、55'C1分钟和72'C1分钟，然后是72'C10分钟；对于NL002来说，95'C3分钟，然后是40个循环的95°C30秒、55。C1分钟和72'C1分钟，然后是72°C10分钟；对于NL003来说，95°C3分钟，然后是40个循环的95'C30秒、61'C1分钟和72°C1分钟，然后是72°C10分钟；对于NL004来说，95'C10分钟，然后是40个循环的95"30秒、51。C1分钟和72。C1分钟；对于NL005来说，95'C10分钟，然后是40个循环的95'C30秒、54'C1分钟和72°C1分钟，然后是72'C10分钟；对于NL006来说，95°C10分钟，然后是40个循环的95°C30秒、55"1分钟和72'C3分30秒，然后是72'C10分钟；对于NL007来说，95'C10分钟，然后是40个循环的95'C30秒、54'C1分钟和72'C1分15秒，然后是72'C10分钟；对于NL008和NL014来说，95°C10分钟，然后是40个循环的95'C30秒、53'C1分钟和72'C1分钟，然后是72'C10分钟；对于NL009、NLOll、NL012和NL019来说，95。C10分钟，然后是40个循环的95'C30秒、55匸1分钟和72'C1分钟，然后是72。C10分钟；对于NL010来说，95'C10分钟，然后是40个循环的95。C30秒、54*C1分钟和72°C2分30秒，然后是72'C10分钟；对于NL013来说，95'C10分钟，然后是40个循环的95'C30秒、54'C1分钟和72'C1分10秒，然后是72。C10分钟；对于NL015和NL016来说，95。C10分钟，然后是40个循环的95'C30秒、54'C1分钟和72"1分40秒，然后是72'C10分钟；对于NL018来说，95'C10分钟，然后是40个循环的95'C30秒、54匸1分钟和72汇1分35秒，然后是72。C10分钟；对于NL021、NL022和NL027来说，95'C10分钟，然后是40个循环的95'C30秒、54'C1分钟和72'C1分45秒，然后是72'CIO分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其克隆入pCR8/GW/t叩o载体(Cat.Nr.K250020，Invitrogen)并测序。表2-NL中给出用各自SEQIDNO表示的所得PCR产物的序列，并且称为部分序列。表3-NL中给出了用各自SEQIDNO表示的相应部分氨基酸序列'B.通过EST序列克隆褐飞虱NL023基因的部分序列按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperscriptIII逆转录酶，Cat.N°.18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland,USA)从褐飞虱(来源Dr.J.A.Gatehouse,Dept.BiologicalSciences,DurhamUniversity,UK)高质量的完整RNA得到cDNA。从褐飞虱cDNA扩增部分cDNA序列NL023,其对应于公共数据库GenBank中的褐飞虱EST序列，其序列号为CAH65679.2。为了分离包含NL023基因一部分的cDNA序列，按照制造商的说明使用基于EST的特异性引物来进行一系列PCR反应，其使用PerfectShotExTaq(CatN。.R画5A，TakaraBioInc.)。对于NL023来说，在两个独立的PCR反应中使用特异性引物oGBKW002和oGBKW003(在本文中分别用SEQIDNO1157和SEQIDN01158表示)，其条件如下95。C3分钟，然后是30个循环的95'C30秒、56'C30秒和72'C2分钟，然后是72'C10分钟。在琼脂糖^上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.N°.28706,Qiagen)，并将其克隆入pCR4-TOPO载体(CatN°K4575-40,Invitrogen)并测序。本文中用SEQIDNO1111表示对两种PCR产物测序所得的一財列，其指NL023基因的部分序列。本文中用SEQIDNO1112表示相应的部分^^酸序列。C.产生褐飞虱基因的dsRNA4吏用市售试剂盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个独立的PCR反应中得到最初两种独立的单个5，T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与T7启动子方向不同的靶序列。对于每种乾基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引物得到有义T7模板。表8-NL中给出了用于扩增每种乾序列有义模板的各引物的序列。所述PCR反应的条件如下对于NL001和NL002来i兌，94。C4分钟，然后是35个循环的94'C30秒、60°C30秒和72'C1分钟，然后是72'C10分钟；对于NL003来说，94。C4分钟，然后是35个循环的94'C30秒、66。C30秒和72'C1分钟，然后是72。C10分钟；对于NL004、NL006、NL008、NL009、NL010和NL019来说，95。C4分钟，然后是35个循环的95'C30秒、54'C30秒和72'C1分钟，然后是72'C10分钟；对于NL005和NL016来说，95'C4分钟，然后是35个循环的95'C30秒、57'C30秒和72°C1分钟，然后是72'C10分钟；对于NL007和NL014来说，95'C4分钟，然后是35个循环的95"30秒、51'C30秒和72'C1分钟，然后是72'C10分钟；对于NLOll、NL012和NL022来说，95'C4分钟，然后是35个循环的95'C30秒、53'C30秒和72'C1分钟，然后是72'C10分钟；对于NL013、NL015、NL018和NL021来i兌，95'C4分钟，然后是35个循环的95'C30秒、55'C30秒和72'C1分钟，然后是72t:10分钟；对于NL023和NL027来说，95'C4分钟，然后是35个循环的95'C30秒、5230秒和72。C1分钟，然后是72'C10分钟。在使用与上勤目同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引物得到反义T7模板。表8-NL中给出了用于扩增每种靼基因反义模板的各引物序列。在琼脂糖皿上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106,Qiagen)进行纯化。将所得到的T7正向和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。但ii行如下修改RNA沉淀在70%乙醇中洗两次。表8-NL中给出每种乾基因所得dsRNA的有义链。对于所i^色荧光蛋白(gfp)对照来说，使用T7引物进行PCR反应的模板DNA是pPD96.12质粒(theFireLab,http:〃genome-www.stanford.edu/group/fire/)，其^t^有被3个合成内含子隔开的野生型gfp编码序列。使用市售试剂盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.N°.P1700,Promega)合成双链RNA。在两个独立的PCR反应中得到最初两种独立的单个5，T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与T7启动子方向不同的把序列。对于gfp来说，使用特异性T7FW引物oGAU183和特异性RV引物oGAU182(本文中分别用SEQIDNO236和SEQIDNO237表示)在PCR反应中得到有义T7模板，其条件如下95°C4分钟，然后是35个循环的95°C30秒、55'C30秒和72'C1分钟，然后是72'C10分钟。使用特异性FW引物oGAU181和特异性T7RV引物oGAU184(本文中分别用SEQIDNO238和SEQIDNO239表示)在与上i^目同M的PCR反应中得到反义T7模板。在琼脂糖皿上分析所得PCR产物，并对其进行纯化(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.N°.28106，Qiagen)。按照制造商的说明，将所得到的T7FW和RV模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠和异丙醇进行纯化，但进行如下修改RNA沉淀在70%乙醇中洗两次。本文中所得dsRNA的有义链用SEQIDNO235表示。D.针对褐飞虱的活性，使用液体人工饲料对dsRNA靶标进行实验室试验筛选如Koyama(1988)[Artificialrearingandnutritionalphysiologyoftheplanthoppersandleafhoppers(Homoptera:DelphacidaeandDeltocephalidae)onaholidicdietX4及02220-27所述制备用于褐飞虱的液体人工饲料(MMD-1)，但改变了饲料蔗糖组分的终浓度使用14.4%(重量/体积)。将祠料组分制备为独立的浓缩物10x矿物质原液(保存于4t),2x氨基酸原液(保存于-20'C)以及10x维生素原液(保存于-20卩)。在生物测定临开始前混合所述原液组分至4/3x浓度，从而允许用测试dsRNA溶液(4x浓度)进行稀释，调节pH至6.5，过滤灭菌制成约500pl的等份。在受控环境室中，用2-3月龄水稻(台中在来一号水樹s""vflcvTaichungNative1))植物饲喂褐飞虱，所述室的条件为27土2"C，80%相对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。一个饲养室中包括10只l龄或2龄若虫，其被置于盖有拉薄的单层封口膜(parafilmM)的小培养i(直径3cm)中，所述封口膜上加有50pl飼料。用另一层封口膜密封所述室，在与饲养成虫相同的条件下进行孵育，但是不直接接触光。每隔一天更换包含dsRNA的飼料，每天评估昆虫的存活率。针对每种处理，同时建立5个生物测定饲养室(重复)。将测试和对照(gfp)dsRNA溶液掺入饲料中至终浓度为2mg/ml。所述飼养室维持27±2'C，80%相对湿度，16:8小时的光照黑暗光周期。使用Kaplan-Meier存活曲线模型对昆虫存活数据进行分析，使用时序检验(Prism版本4.0)比较组之间的存活。如四个独立的生物测定中所示，使用饲养室在体外用添加了完整棵dsRNA的液体人工饲料喂食褐飞虱，导致若虫死亡率显著增加(图1(a)-(d)-NL;表10-NL(a)-U))(DurhamUniversity)。这些结果表明，对应于不同的BPH必需基因的dsRNA显示出对褐飞虱的显著毒性。在这些生物测定中，gfpdsRNA对BPH存活的影响与只喂食饲料的存活昆虫没有显著差异。表10-NL(a)-(d)显示用添加有2mg/ml(终浓度)以下靶标的人工饲料喂食褐飞虱的存活情况总结；在表10-NL(a)中NL002、NL003、NL005、NL010;在表10-NL(b)中NL009、NL016;在表10-NL(c)中NL014、NL018;以及在表10-NL(d)中:NL013、NL015、NL021。在存活分析栏中，RNAi的作用如下标明+=与gfpdsRNA对照相比存活率显著下降(a<0.05);-=与gfpdsRNA对照相比无显著差异。使用时序检验比较存活曲线(在只有飼料和添加了测试dsRNA的飼料之间，在gfpdsRNA和测试dsRNA之间，以及在只有饲料和gfpdsRNA之间)。E.针对褐飞虱的活性，使用人工饲料对不同浓度dsRNA进行实验室试验筛选将50jil添加了不同浓度把标NL002dsRNA(即终浓度为1、0.2、0.08和0.04mg/ml)的液体人工饲料施加到褐飞虱饲养室。包含dsRNA的饲料每隔一天更换一次，每天评估昆虫的存活。针对每种处理，同时建立5个生物测定饲养室(重复)。所述饲养室维持27±2°C，80%相对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。使用Kaplan-Meier存活曲线模型对昆虫存活数据进行分析，使用时序检验(Prism版本4.0)比较组之间的存活。喂食添加有不同浓度完整棵乾标NL002dsRNA的液体人工饲料导致在低至0.04mgdsRNA/ml饲料的终浓度下BPH死亡率显著高于仅喂食饲料的存活率，如图2-NL和表ll-NL所示。表11-NL总结了用添加1、0.2、0.08和0.04mg/ml(终浓度)乾标NL002的人工饲料喂食褐飞虱试验中的存活情况。在存活分析栏中，RNAi的作用如下标明+=与gfpdsRNA对照相比存活率显著下降(aO.05);-=与gfpdsRNA对照相比无显著差异。使用时序检验比较存活曲线。F.将BPH基因片段克隆进到载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有活性的双链RNA以下是将对应于BPH基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考WO0001846)。表8-NL中提供了用于扩增把基因的特异性引物序列。所使用的模板是含有任意耙序列的pCR8/GW/topo载体。在PCR反应中使用所述引物，其使用下述条件98。C5分钟，然后是30个循环的98'C10秒、55°C30秒和72°C2分钟，然后是72'C10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit，Cat.Nr.28706，Qiagen),将其平端克隆进经线性化的pGNA49A载体中(参考WO00188121A1)并测序。表8-NL给出对应于各自序列的所得PCR产物的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXX0XX。G.在两个大肠杆菌菌林(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3)中表达和产生双链RNA靶标遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA，该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌林(AB301-105(DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行比较。转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)将300ng质粒加至50pl水冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105(DE3)或BL21(DE3)菌林等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细胞20分钟，之后对其进行37"热激处理5分钟，然后将所述细胞放回至水上并再保持5分钟。将450^il室温的SOC培养基加至所述细胞，并将该悬液于37。C在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100nl细菌细胞悬液移至含有150mlLB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液体培养基补充有100吗/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37'C在Innova4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3)或BL21(DE3)细菌菌林中可以表达来自重组载体pGXXXOXX的双链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的侧翼是相反方向的T7启动子。使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度，并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移至50mlFalcon管中，然后在15'C以3000g离心所述培养物10分钟。除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100pg/ml羧节青霉素和1mMIPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5吗/ml胆固醇)进行重悬。在室温诱导细菌2至4小时。细菌的热处理通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工飼料被污染的风险减至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分钟，弃去上清液，并将沉淀在80'C水浴中保持20分钟。热处理后，将细菌沉淀重悬于1.5mlMilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20'C备用。H.针对褐飞虱，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测基于植物的生物测定用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整林植物，然后用所述植物喂食BPH。它们在植物培养室中生长.通过将500ml塑料瓶倒置于植物上从而革住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。将BPH置于革中每林经处理过的植物上。用包含pGXXXOXX或pGN29质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量的细菌例如66、22和7单位，其中一个单位定义为在600nm波长下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用喷雾器将总体积110ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用一林植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105(DE3)菌林悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA的细菌组成。实施例10:二化螟(Ricestripedstemborer，SSB)A.通过家族PCR克隆二化螟基因的部分序列按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr.15596-026/15596-018,Invitrogen，Rockville，Maryland,USA)从4个不同幼虫阶段的二化螟分离高质量的完整RNA。按照制造商的说明，通过DNA酶(Cat.Nr.1700,Promega)处理除去RNA制备物中的基因组DNA。按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperScriptTMlII逆转录酶，Cat.Nr.18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)得到cDNA。为了分离包含CSOOl、CS002、CS003、CS006、CS007、CS009、CSOll、CS013、CS014、CS015、CS016和CS018基因一部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用AmplitaqGold(Cat.Nr.N8080240,AppliedBiosystems)进行一系列PCR^^应。表2-CS中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引物进行各PCR反应，其使用以下条件95'C10分钟，然后是40个循环的95°C30秒、55'C1分钟和72'C1分钟，然后是72'C10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其克隆入pCR4/TOPO载体(Cat.Nr.K250020，Invitrogen)并测序。表2-CS中给出用各自SEQIDNO表示的所得PCR产物的序列，并且称为部分序列。表3-CS给出了用各自SEQIDNO表示的相应部分氨基酸序列。B.产生二化螟基因的dsRNA4吏用市售试剂盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个单独的PCR反应中得到最初两种独立的单个5，T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与T7启动子方向不同的靶序列。对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引物得到有义T7模板。表8-CS给出了用于扩增每种耙序列有义模板的各引物的序列。所述PCR反应条件如下95'C4分钟，然后是35个循环的95°C30秒、55'C30秒和72°C1分钟，然后是72'C10分钟。在使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引物得到反义T7模板。表8-CS中给出了用于扩增每种耙基因反义模板的各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106,Qiagen)以及NaC104沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-CS给出了每种乾基因所得dsRNA的有义链。C.针对二化螟幼虫的活性，使用人工饲料对dsRNA靶标进行实验室试验检测二化螟(来源Syngenta,Stein，Switzerland)以基于Kamano和Sato，1985(HandbookofInsectRearingVolumesI&II.PSinghandRFMoore，eds"ElsevierSciencePublishers,AmsterdamandNewYork,1985,pp448)所述经修改的人工饲料为食。简言之，如下制备一升饲料的将20g琼脂加入到980mlMilli-Q水中并高压灭菌；使琼脂溶液冷却至约55。C，加入其余成分并彻底混合40g玉米粉(Polenta)、20g纤维素、30g蔗糖、30g酪蛋白、20g麦芽(烘烤的)、8gWesson盐混合物、12gVanderzant维生素混合物、1.8g抗坏血酸、1.6g尼泊金(对羟基苯曱酸甲酯)、0.3g金霉素、0.4g胆固醇和0.6gL-半胱氨酸。将饲料冷却至约45'C然后倒入飼养盘或杯中。将所述饲料置于水平层流柜中。从铜养有成虫蛾的軍中移出带有昆虫所产卵的稻叶片，将其固定至飼养杯或盘的固体饲料上。使卵孵化，新生幼虫用于生物测定以及昆虫培养物的维持。在试验和饲养中，条件是28士2。C，80±5%相对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。使用同样的人工饲料用于生物测定，但是在该情形中，将所述饲料平均倒入24孔板中，每个孔含有lml饲料。一旦飼料准备就绪，则以1ng/pl的50pi靶标dsRNA的比率将测试制剂施加到该饲料表面(2cm2)。使所述dsRNA溶液干燥，将2只1龄蛾幼虫置于每个孔中。7天后，将所述幼虫移至多孔板中新鲜的经处理的飼料。在第14天(即生物测定开始后14天)，记录存活和死亡昆虫的数目，并检查异常。对每种处理共检测24只幼虫。进行了一个可替代的生物测定，其中用经处理的稻叶喂食二化螟新生幼虫。将籼稻品种台中在来一号的小叶片浸于含1吗尔l靶标dsRNA的0.05%TritonX-100溶液中，使之干燥，并将每片置于含有凝胶化2%琼脂的24孔板的一个孔中。将两只新生幼虫从饲养盘转移到每片经dsRNA处理的叶子(每种处理包括24只幼虫)。在4和8天后，将所述幼虫转移到新鲜的经处理的稻叶片。在第4、8和12天评估存活和死亡昆虫的数目，并记录任何异常。D.将SSB基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有活性的双链RNA以下是将对应于SSB基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考WO0001846)。表8-CS中提供了用于扩增乾基因的特异性引物序列。所使用的模板是含有任意乾序列的pCR8/GW/t叩o载体。在PCR反应中使用所述引物，其使用下述条件98°C5分钟，然后是30个循环的98'C10秒、55'C30秒和72'C2分钟，然后是72'C10分钟。在琼脂糖^上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其平端克隆进经5>/1线性化的pGNA49A载体中(参考WO00188121A1)并测序。表8-CS给出了对应于各自序列的所得PCR产物的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXXOXX。E.在两个大肠杆菌菌林(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3)中表达和产生双链RNA靶标遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫耙标的双链RNA，该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌林(AB301-105(DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行比较。转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)将300ng质粒加至50pl水冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105(DE3)或BL21(DE3)菌林等份中并轻柔混合。在水上孵育所述细胞20分钟，之后对其进行37'C热激处理5分钟，然后将所述细胞放回至水上并再保持5分钟。将450pl室温的SOC培养基加至所述细胞，并将该悬液于37'C在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100nl细菌细胞悬液移至含有150mlLB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液体培养基补充有100吗/ml的羧节青霉素抗生素。所述培养物于37'C在Innova4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3)或BL21(DE3)细菌菌林中可以表达来自重组载体pGXXXOXX的双链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的侧翼是相反方向的T7启动子。使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度，并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移至50mlFalcon管中，然后在15。C以3000g离心所述培养物10分钟。除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100ng/ml羧节青霉素和1mMIPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5吗/ml胆固醇)进行重悬。在室温诱导细菌2至4小时。细菌的热处理通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分钟，弃去上清液，并将沉淀在80'C水浴中保持20分钟。热处理后，将细菌沉淀重悬于1.5mlMilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-2(TC备用。F.针对褐飞虱，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测基于植物的生物测定用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整林植物，然后用所述植物喂食SSB。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置于植物上从而軍住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。将SSB置于革中每林经处理过的植物上。用包含pGXXXOXX或pGN29质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量的细菌例如66、22和7单位，其中一个单位定义为在600nm波长下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用喷雾器将总体积1~10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用一林植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。用表达来自pGXXXOXX的乾标dsRNA的大肠杆菌AB301-105(DE3)菌林悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA的细菌组成。实施例11:菜蛾(Diamondbackmoth,DBM)A.克隆菜蛾的部分序列按照制造商的i兌明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr.15596-026/15596-018,Invitrogen，Rockville，Maryland,USA)从所有不同幼虫阶段的菜蛾(菜蛾；来源Dr.LaraSenior,InsectInvestigationsLtd,CapitalBusinessPark,Wentloog,Cardiff,CF32PX，Wales,UK)分离高质量的完整RNA。按照制造商的i兌明，通过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理除去RNA制备物中的基因组DNA。按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperscriptIII逆转录酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)得到cDNA。为了分离包含PX001、PX009、PXOIO、PX015、PX016基因一部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用AmplitaqGold(Cat.Nr.N8080240,AppliedBiosystems)进行一系列PCR反应。表2-PX中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引物分进行各PCR反应，其使用以下条件95'C10分钟，然后是40个循环的95'C30秒、50'C1分钟和72'C1分30秒，然后是72'C7分钟(针对PX001、PX009、PX015、PX016);95。C10分钟，然后是40个循环的95"30秒、54'C1分钟和72'C2分30秒，然后是72'C7分钟(针对PX010)。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706,Qiagen)，将其克隆入pCR8/GW/TOPO载体(Cat.Nr.K250020，Invitrogen)并测序。表2-PX中给出了用各自SEQIDNO表示所得PCR产物的序列，并且称为部分序列。表3-PX中给出用各自SEQIDNO表示的相应部分氨基酸序列。B.产生菜蛾基因的dsRNA4吏用市售试剂盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成亳克级的dsRNA。在两个独立的PCR反应中得到最初两种独立的单个5，T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与T7启动子方向不同的靶序列。对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引物得到有义T7模板。表8-PX中给出用于扩增每种乾序列有义模板的各引物的序列。所述PCR反应条件如下95'C1分钟，然后是20个循环的95。C30秒、60'C30秒(-0.5°。/循环)和72°C1分钟，然后是15个循环的95'C30秒、50°C30秒和72'C1分钟，然后是72。C10分钟。在使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引物得到反义T7模板。表8-PX中给出用于扩增每种乾基因反义模板的各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaC104沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-PX中给出每种乾基因所得dsRNA的有义链。C.针对菜蛾幼虫的活性，使用人工饲料对dsRNA靶标进行实验室试验检测菜蛾维持于InsectInvestigationsLtd.(来源NewcastleUniversity,Newcastle-upon-Tyne,UK)。用巻心菜叶艰食所述昆虫。选择1龄混合性别的幼虫(约1日龄)用于该试验。将昆虫置于Eppendorf管(容积1.5ml)中。将按照制造商说明制备的市售菜蛾饲料(Bio-Serv，NJ，USA)置于每个管的盖中(容积0.25ml，直径8mm)。在仍为液体时，将所述饲料找平以移去多余的部分并得到平的表面。一旦所述饲料准备就绪，则将测试制剂施加到饲料表面，为每个重复25nl未稀释制剂(l吗尔l靶标dsRNA)。使测试制剂千燥，将一只l龄幼虫置于每个管中。将所述幼虫放置于盖中饲料的表面，然后将管小心的闭合。将所述管倒置保存(在其盖上)，从而使每只幼虫保持在所述饲料的表面。一周两次将所述幼虫转移到包含新鲜饲料的新E卯endorf管。在试验的头两周向幼虫提供经处理的饲料，之后提供未处理的饲料。在总共38天中，一周两次进行评估，在第38天时所有幼虫均死亡。在每次评估时，评估所述昆虫的存活情况并检查异常。对于每种处理，进行40个单幼虫重复。在试验过程中，测试条件是2326'C，50~65%相对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。D.将DBM基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有活性的双链RNA以下是将对应于DBM基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考WO0001846)。表8-PX中给出了用于扩增乾基因的特异性引物序列。所使用的模板是含有任意乾序列的pCR8/GW/t叩o载体。在PCR反应中使用所述引物，其使用下述条件98'C5分钟，然后是30个循环的98'C10秒、558030秒和72'C2分钟，然后是72'CIO分钟。在琼脂糖^上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其平端克隆进经线性化的pGNA49A栽体中(参考WO00188121A1)并测序。表8-PX给出了对应于各自序列的所得PCR产物的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXXOXX。E.在两个大肠杆菌菌林(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3)中表达和产生双链RNA靶标遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA，该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌林(AB301-105(DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行比较。转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)将300ng质粒加至50pi冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105(DE3)或BL21(DE3)菌林等份中并轻柔混合。在水上孵育所述细胞20分钟，之后对其进行37。C热激处理5分钟，然后将所述细胞放回至水上并再保持5分钟。将450nl室温的SOC培养基加至所述细胞，并将该悬液于37。C在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100nl细菌细胞悬液移至含有150mlLB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液体培养基补充有100pg/ml的羧节青霉素抗生素。所述培养物于37'C在Innova4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)赙育。在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3)或BL21(DE3)细菌菌林中可以表达来自重组载体pGXXXOXX的双链RNA。在化学诱导物异丙基>5克代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7聚合酶将以反义和有义方向驱动所述乾序列的转录，因为所述靶序列的侧翼是相反方向的T7启动子。使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度，并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移至50mlFalcon管中，然后在15。C以3000g离心所述培养物10分钟。除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100吗/ml羧千青霉素和1mMIPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5ng/ml胆固醇)进行重悬。在室温诱导细菌2至4小时。细菌的热处理通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分钟，弃去上清液，并将沉淀在80'C水浴中保持20分钟。热处理后，将细菌沉淀重悬于1.5mlMilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次更新准备数个管并用于生物测定中，所述管保存在-20'C备用。F.针对菜蛾，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测基于植物的生物测定用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整林植物，然后用所述植物喂食DBM。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置于植物上从而革住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。将DBM置于革中每林经处理过的植物上。用包含pGXXXOXX或pGN29质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量的细菌例如66、22和7单位，其中一个单位定义为在600nm波长下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用喷雾器将总体积1~10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用一林植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105(DE3)菌林悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA的细菌组成。实施例12:居屋艾蟋(Housecricket,HC)A.克隆居屋艾蟋的部分序列按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr.15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland,USA)从所有不同昆虫阶段的居屋艾蟠(居屋艾蟠；来源Dr.LaraSenior,InsectInvestigationsLtd.，CapitalBusinessPark,Wentloog，Cardiff,CF32PX，Wales,UK)中分离高质量的完整RNA。按照制造商的i兌明，通过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理除去RNA制备物中的基因组DNA。按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperscriptIII逆转录酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen,Rockville，Maryland,USA)得到cDNA。为了分离包含ADOOl、AD002、AD009、AD015和AD016基因一部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用AmplitaqGold(Cat.Nr.N8080240,AppliedBiosystems)进行一系列PCR反应。表2-AD中给出用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引物进行各自的PCR反应，其使用以下条件95'C10分钟，然后是40个循环的95'C30秒、50'C1分钟和72'C1分30秒，然后是72°C7分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其克隆入pCR8/GW/topo载体(Cat.Nr.K250020,Invitrogen)并测序。表2誦AD中给出用各自SEQIDNO表示的所得PCR产物的序列，并且称为部分序列。表3-AD中给出用各自SEQIDNO表示的相应部分氨基酸序列。B.产生居屋艾蟋基因的dsRNA4吏用市售试剂盒T7RibomaxTMExpressRNAiSystem(Cat.Nr.P1700,Promega)合成亳克级的dsRNA。在两个单独的PCR反应中得到最初两种独立的单个5，T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与T7启动子方向不同的乾序列。对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引物得到有义T7模板。表8-AD中给出用于扩增每种乾序列有义模板的各引物的序列。所述PCR反应条件如下95'C1分钟，然后是20个循环的95。C30秒、60。C30秒(-0.5。。/循环)和72卩1分钟，然后是15个循环的95'C30秒、50'C30秒和72'C1分钟，然后是72'C10分钟。在使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引物得到反义T7模板。表8-AD中给出用于扩增每种靶基因反义模板的各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯4匕试剂盒(QiaquickPCRPurificationKit,Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaC104沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-AD中给出了每种靶基因所得dsRNA的有义链。C.针对居屋艾蟋幼虫的活性，使用人工飼料对dsRNA靶标进行实验室试验检测美洲蟠蟀维持于InsectInvestigationsLtd.(来源BladesBiologicalLtd.,Kent,UK)。所述昆虫以麦麸颗粒和巻心菜叶为食。选择相同尺寸的不超过5日龄的混合性别若虫用于该试验。将双链RNA与基于小麦的颗粒状啮齿类动物饲料(大鼠和小鼠标准饲料，B&KUniversalLtd.,Grimston,Aldbrough，Hull,UK)混合。所述饲料BK001P含有下述成分(以重量降序排列)小麦、大豆、麸皮、大麦、颗粒状粘合剂、啮齿动物5vitmin、混合脂、裤酸二钾、mouldcarb。细细研磨颗粒状啮齿动物飼料，在微波炉中进行热处理从而使任何酶组分失活，然后进行混合。所有啮齿动物飼料取自同一批次以确保一致性。将研磨过的饲料与dsRNA完全混合，形成等重的小颗粒，将其在室温过夜干燥。将靶标和gfp对照的双链RNA样品以10ng/pl的浓度应用，其比例为1g研磨过的饲料加1mldsRNA溶液，由此得到施加比例为10mgdsRNA/g颗粒。每周更换颗粒。在试验的头三周，向昆虫提供经处理的颗粒。之后提供未处理的颗粒。将昆虫置于带盖的塑料容器中(直径9cm，深4.5cm)，每个容器包含10只昆虫。每个容器中包含一个经处理的诱饰颗粒和一个水源(潮湿棉球)，将上述两者置于独立的小型称重船型皿(weighboat)中。在整个实验中，水被无限制地补充。以一周两次的间隔进行评估，两次评估之间不超过4天，直至所有对照昆虫死亡或蜕皮至成虫阶段(84天)。在每次评估中，对存活情况进行评估并且检查异常。从第46天起，一旦开始蜕皮至成虫，则评估所有昆虫(存活和死亡的)是若虫还是成虫。在试验第55天对存活的昆虫称重。每种处理进行4次重复实验。在试验过程中，测试条件是25~33'C，20~25%相对湿度，12:12小时的光照:黑暗光周期。D.将HC基因片段克隆进载体中，所述栽体适于细菌产生在昆虫中具有活性的双链RNA以下是将对应于HC基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考WO0001846)'表8-AD中给出了用于扩增乾基因的特异性引物序列。所使用的模板是含有任意乾序列的pCR8/GW/topo载体。在PCR反应中使用所述引物，其使用下述条件98'C5分钟，然后是30个循环的98。C10秒、55'C30秒和72'C2分钟，然后是72'C10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquickGelExtractionkit,Cat.Nr.28706,Qiagen)，将其平端克隆进经Sr/I线性化的pGNA49A载体中(参考WO00188121A1)并测序。表8-AD给出了对应于各自序列的所得PCR产物的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXX0XX。E.在两个大肠杆菌(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3)菌林中表达和产生双链RNA靶标遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靼标的双链RNA，该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌林(AB301-105(DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行比较。转化AB301誦105(DE3)和BL21(DE3)将300ng质粒加至50nl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105(DE3)或BL21(DE3)菌林等份中并轻柔混合。在水上孵育所述细胞20分钟，之后对其进行37'C热激处理5分钟，然后将所述细胞放回至水上并再保持5分钟。将450nl室温的SOC培养基加至所述细胞，并将该悬液于37。C在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100pl细菌细胞悬液移至含有150mlLB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液体培养基补充有100吗/inl的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37'C在Innova4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3)或BL21(DE3)细菌菌林中可以表达来自重组栽体pGXXXOXX的双链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的侧翼是相反方向的T7启动子。使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度，并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移至50mlFalcon管中，然后在15'C以3000g离心所述培养物10分钟。除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100pg/ml羧爷青霉素和1mMIPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5fig/ml胆固醇)进行重悬。在室温诱导细菌2至4小时。细菌的热处理通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工铜料被污染的风险减至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分钟，弃去上清液，并将沉淀在80'C水浴中保持20分钟。热处理后，将细菌沉淀重悬于1.5mlMilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20'C备用。F.针对居屋艾蟋，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测基于植物的生物测定用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整林植物，然后用所述植物喂食HC。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置于植物上从而革住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。将HC置于罩中每林经处理过的植物上。用包含pGXXXOXX或pGN29质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量的细菌例如66、22和7单位，其中一个单位定义为在600nm波长下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用喷雾器将总体积1~10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用一林植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。用表达来自pGXXXOXX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105(DE3)菌林悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因乾序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因耙标之双链RNA的细菌组成。表1A<table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage140</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage143</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table>表1-LD<table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table>表1-PC<table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage146</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table>表1-TC<table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table>表1-MP<table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table>表1.NL<table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage149</column></row><table>表1-PX<table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage151</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage153</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage154</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage155</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage157</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage158</column></row><table>表2-EV<table>tableseeoriginaldocumentpage158</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table>EV016SEQIDNO:531GTTCACCGGCGAYATYCTGCGSEQIDNO:532CGGCATAGTCAGMTSGGRATCTG表2-AG把标ID正向引物5'—3'反向引物5'—3'cDNA序列(有义链)5'—3'AG001SEQIDNO:611CATTTGAAGCGTTTWRMYGCYCCSEQIDNO:612CGCTTGTCCCGCTCCTCNGCRATSEQIDNO:601ACCATCCAACTGGAAATCGCCACCTCAAAGATCCTGGACTTTATCAAATTCGAATCCGGCAACTTGTGCATGATCACCGGAGGCAGGAATTTGGGTAGAGTGGGAACGGTAGTGAACAGGGAAAGGCAGAAACTGTCCATCGCTGSEQIDNO:521ACGAAATTGTACAGCTCAAGTTATCAGATGGAACAGTTAGGTCTGGACAAGTTTTGGAAGTCAGTGGACAGAAGGCGGTTGTCCAAGTTTTTGAAGGCACCTCCGGAATTGATGCTAAAAACATATGGGTGTCAATATGGAAACAGCCAGATTCTTCAAGCAAGATTTTGAAGAGAATGGCTCTATGGAAAATGTGTGCCTATTTTTGAACTTGGCCAATGATCCTACCATTGAAAGAATTATAACACCCCGTTTGACTTTAACAGCGGCTGAATTTATGGCATATCAATGTGAGAAGCATGTGTTAGTCATATTGACTGACATGTCATCTTATGCTGAGGCTTTGCGTGAGGTATCTGCTGCT200780002294.X转溢齿被144/3115Jj￡GGMAAATA9cwcccwGTTTc5GGAAcGGM丌GcctATSccGGtGGcGATTcGcGAGGTccGTc5cTA5GMcGTc9cAA.ic5ATGJTMATcAcGATcccGAcAG-Gc一<table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage162</column></row><table>表2-TC<table>tableseeoriginaldocumentpage162</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage163</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage164</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage165</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage166</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage167</column></row><table>CGGTGTCCATTCACAGYTCCGGCGATGCMGTAGGTGTCKGARTCYTCAACATCCATCTGAAGTACAACATGAATGCATTCCTCAAGCTGTACTTGGAATGGACATATTGTGTCAAGCGAAATCCGGTATGGGAAAAACTGCTGTATTTGTGTTGGCGACATTACAGCAAATTGMCCAACTGACMCCAAGTCAGTGTATTGGTCATGTGTCATACCAGAGAGCTTGCATTCCAAATCAGCAAAGAGTATGAACGATTTTCGAAATGTATGCCAAATATCAAGGTTGGAGTTTTCTTCGGCGGACTGCCGATTCAGAGGGATGAGGAGACGTTGAAATTGAACTGTCCTCACATCGTGGTTGGAACACCCGGACGAATTTTGGCGTTGGTACGCMCAAGAAGCTGGACCTCMGCATCTCMGCACTTTGTCCTTGACGAATGTGACAAAATGTTGGAACTGTTAGATATGCGAAGAGATGTGCAGGAAATATTCCGAAACACGCCGCACAGCAAACAAGTCATGATGTTCAGTGCAACTCTCAGCAAAGAAATTCGTCCAGTCTGCAAGAAATTCATGCAAGATCCGATGGAAGTGTACGTTGATGACGAGGCCAAGCTGACGCTTCACGGCCTGCAGCAGCACTATGTCAAACTCAAAGAAAACGAAAAGAACAAAAAGTTATTTGAATTACTTGACATACTTGAATTCAACCAGGTTGTTATATTTGTGAAGTCAGTGCAGCGCTGCATGGCCCTATCGCAACTCCTAACAGAGCAGAACTTCCCTGCAGTGGCTATTCACCGTGGCATGACACAAGAAGAACGATTGMGAAATATCAAGAGTTCAAAGAGTTCCTAAAGCGAATTTTGGTAGCAACGMTCTGTTTGGCAGAGGAATGGATATTGAGAGAGTCAACATTGTATTCAACTATGACATGCCTNL008SEQIDN0:1131GTGGTGGATCACTTYAAYCGKATGSEQIDNO:1132GCGCATTTGATCGTTBGTYTTCACSEQIDNO:1085GGAAGGATAGAAAACCAGAAACGAGTTGTTGGTGTTCTTTTGGGATGCTGGAGACCTGGAGGTGTATTAGATGTTTCMACAGTTTTGCAGTTCCATTTGATGAGGACGACAAAGAAAAGAATGTTTGGTTCTTAGACCATGATTACTTGGAAAACATGTTCGGGATGTTCAAGAAAGTTMTGCTAGAGAAAAGGTTGTGGGTTGGTACCATACTGGACCCAAACTCCACCAAAACGATGTTGCAATCAATGAGTTGATTCGTCGTTACTGTCCAAACTGTGTCTTAGTCATAATCGATGCCAAGCCTAAAGATTTGGGTCTACCTACAGAGGCATACAGAGTCGTTGMGAAATCCATGATGATGGATCGCCMCATCAAAAACATTTGAACATGTGATGAGTGAGATTGGGGCAGMGAGGCTGAGGAGATTGGCGTTGAACATCTGTTGAGAGACATCAAAGATACAACAGTCGGGTCACTGTCACAGCGCGTCACAAATCAGCTGATGGGCTTGAAGGGCTTGCATCTGCAATTACAGGATATGCGAGACTATTTGAATCAGGTTGTCGAAGGAAAGTTGCCAATGAACCATCAAATCGTTTACCAACTGCAAGACATCTTCAACCTTCTACCCGATATCGGCCACGGCAATTTTGTAGACTCGCTCTACNL009SEQIDNO:1133GGGCCGTGGTCAGAAYATYWAYAACSEQIDNO:1134CCGCCAAAGGACTSARRTADCCCTCSEQIDNO:1087TGCGACTATGATCGACCGCCGGGACGCGGTCAGGTGTGCGACGTCGACGTCAAGMCTGGTTTCCCTGCACCTCTGAGAACAATTTCAACTACCATCAATCGAGCCCTTGTGTTTTTCTCAAACTGAACAAGATAATTGGTTGGCAACCGGAGTACTACAATGAGACTGAAGGCTTTCCAGATMTATGCCAGGTGACCTCAAGCGACACATTGCCCAACAGAAGAGTATCAACAAGCTGTTTATGCAAACMTCTGGATAACTTGCGAAGGAGAGGGTCCTCTAGA<table>tableseeoriginaldocumentpage169</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage170</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage171</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage172</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage173</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage174</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage175</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage176</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage178</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage179</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage179</column></row><table>GTTCATTACGCAG<table>tableseeoriginaldocumentpage180</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage181</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage182</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage183</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage184</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage185</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage186</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage187</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage188</column></row><table>表3-MP<table>tableseeoriginaldocumentpage189</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage190</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage191</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage192</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage193</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage194</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage195</column></row><table>表3-AD<table>tableseeoriginaldocumentpage196</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage197</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage198</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage199</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage200</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage201</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage202</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage203</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage204</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage205</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage206</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage207</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage208</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage209</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage210</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage211</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage212</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage213</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage214</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage215</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage216</column></row><table>表4－MP<table>tableseeoriginaldocumentpage216</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage217</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage218</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage219</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage220</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage221</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage222</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage223</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage224</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage225</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage226</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage227</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage228</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage229</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage230</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage231</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage232</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage233</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage234</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage235</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage236</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage237</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage238</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage239</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage240</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage241</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage242</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage243</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage244</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage245</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage246</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage247</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage248</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage249</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage250</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage251</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage252</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage253</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage254</column></row><table>表5-PC<table>tableseeoriginaldocumentpage255</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage256</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage257</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage258</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage258</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage259</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage260</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage261</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage262</column></row><table>表6-MP<table>tableseeoriginaldocumentpage263</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage264</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage265</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage266</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage267</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage268</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage269</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage270</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage271</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage272</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage273</column></row><table>表8-LD<table>tableseeoriginaldocumentpage273</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage274</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage275</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage276</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage277</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage278</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage279</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage280</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage281</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage282</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage283</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage284</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage285</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage286</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage287</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage288</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage289</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage289</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage290</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage291</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage292</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage293</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage294</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage295</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage296</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage297</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage298</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage299</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage300</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage301</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage302</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage303</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage304</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage305</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage306</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage308</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage309</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage310</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage311</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage312</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage313</column></row><table>表9-PC<image>imageseeoriginaldocumentpage314</image><table>tableseeoriginaldocumentpage315</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage316</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage317</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage318</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage319</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage320</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage321</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage322</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage323</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage324</column></row><table>表10-NL(a><table>tableseeoriginaldocumentpage325</column></row><table>表10復(c)<table>tableseeoriginaldocumentpage326</column></row><table>表11-NL<table>tableseeoriginaldocumentpage327</column></row><table>权利要求1.分离的核苷酸序列，其包含选自以下的核酸序列(i)如下表示的任意序列SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908to1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486，或其互补序列，(ii)与如下表示的任意序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，78B，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486，或其互补序列，以及(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486，或其互补序列，或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的直系同源物SEQIDNO49至158、275至472、533至575、621至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、2120至2338、2384至2460，或其互补序列。2.权利要求1的多核苷酸序列表达产生的双链核糖核苷酸序列，其中植物昆虫害虫摄取所述核糖核苷酸序列抑制所述昆虫害虫的生长。3.权利要求2的核糖核苷酸序列，其中摄取所述序列抑制与所^列基本上互补的核苷酸序列的表达。4.包含根据权利要求2或3的核糖核苷酸序列的组合物，其还包含至少一种佐剂以及任选地至少一种表面活性剂。5.包含至少一种双链RNA的组合物，其中一条链包含与选自权利要求l中所限定序列的核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列，其还任选地包含至少一种适当的载体、赋形剂或稀释剂。6.用包含权利要求1中所限定核酸序列的多核苷酸转化的细胞，所述核酸序列任选地与调节序列有效连接。7.权利要求6的细胞，其中所述细胞是原核细胞，例如革兰氏阳性细胞或革兰氏阴性细菌细胞；或者其中所述细胞是真核细胞，例如酵母细胞或藻类细胞。8.权利要求7的细胞，其中所述细胞是细菌细胞。9.权利要求7的细胞，其中所述细胞是酵母细胞。10.包含至少一种细菌细胞或酵母细胞的组合物，所述细菌细胞或酵母细胞包含权利要求1中所限定的至少一种多核苷酸。11.权利要求10的组合物，其中所述细菌或酵母细胞被灭活或被杀死，例如通过热处理或机械处理。12.包含表达至少一种双链RNA的至少一种细菌或酵母细胞的组合物，其中所述双链RNA的一条链包含与选自权利要求1中所限定序列的核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列，该组合物中还任选地包含至少一种适当的载体、赋形剂或稀释剂。13.权利要求5或10至12中任一项的组合物，所述组合物还包含至少一种选自以下的杀虫剂化学杀虫剂、马铃薯糖蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白，所述杀虫剂具有对抗与权利要求2中所限定的同样的植物昆虫害虫的活性，或者其中所述杀虫剂具有对抗一种或多种其它植物昆虫害虫的活性。14.权利要求10至12中任一项的组合物，其中所述至少一种细菌或酵母细胞还包含或还表达至少一种选自以下的杀虫剂化学杀虫剂、马铃薯糖蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽a菌杀虫蛋白，所述杀虫剂具有对抗与权利要求2中所限定的同样的植物昆虫害虫的活性，或者其中所述杀虫剂具有对抗一种或多种其它植物昆虫害虫的活性。15.权利要求5或IO至12中任一项的组合物，其还包含至少一种其它细菌或酵母细胞，所述细胞包含或表达至少一种选自以下的杀虫剂化学杀虫剂、马铃薯糖蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽a菌杀虫蛋白，所述杀虫剂具有对抗与权利要求2中所限定的同样的植物昆虫害虫的活性，或者其中所述杀虫剂具有对抗一种或多种特定植物昆虫害虫的活性。16.权利要求13至15中任一项的组合物，其中所述苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白选自Cryl、Cry3、TIC851、CryET170、Cry22、二元杀虫蛋白CryET33和CryET34、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101以及二元杀虫蛋白PS149B1。17.权利要求13至16中任一项的组合物，其作为杀昆虫试剂。18.权利要求13至16中任一项的组合物，其用作预防或治疗人或动物机体免受昆虫侵害的药物。19.包含权利要求10至18中任一项的至少一种组合物的喷雾剂，其还任选地包含至少一种佐剂和至少一种表面活性剂。20.包含权利要求10至18中任一项所限定组合物的用于害虫的外軍、陷阱或诱辨。21.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20的外罩、陷阱或诱倂用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所述昆虫选自马铃薯叶甲属物种(丄印ri"W"r幼spp.)(例如，马铃薯叶甲(厶flfecew/iVieflto)、伪马铃薯叶甲(Z.或胡颓子叶茄叶曱(丄.fejcaw)),并且-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或-其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的核普酸序列(i)如下表示的任意序列SEQIDNO1，3，5,7,9,11，13,15.17,19,21,23,49至158,159，160至163.168,173,178.183,188,193,198,203，208,215,220,225,230'240至246,或2486,或其互补序列，(ii)与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、卯％,更优选至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO1,3，5,7,9,11,13,15,17，19,21,23，49至158,159，160至163,168,173,178,183，188,193,198,203,208,215,220,225,230，240至246,或2486,或其互补序列，以及(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列SEQIDNO1,3，5,7,9,11,13,15,17，19,21,23,49至158,159，160至163.168,173,178,183，188,193,198,203,208,215,220,225,230,240至246,或2486.或其互补序列，或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的直系同源物SEQIDN049至158，或其互补序列。22.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20的外罩、陷阱或诱辨用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途,所述昆虫选自猿叶甲属物种(iVi"e^wspp.)(例如，辣根猿叶甲(P.coc/r/e"n'fle))并且-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或—其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列(i)如下表示的4壬意序歹1SEQIDN0247'249'251■253'255'257'259'275至472,473,478,483,488,493,498,503，508至512,或其互补序列'(ii)与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、卯％，更优选至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO247'249,251,253,255,257，259,275至472,473,478,483'488,493,498,503,508至512,或其互补序列，以及(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列SEQIDNO247,249,251,253,255,257,259,275至472,473，478,483,488,493,498,503,508至512,或其互^卜序歹'J，或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的直系同源物SEQIDN0275至472，或其互补序列。23.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20的外罩、陷阱或诱饰用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所述昆虫选自食植胍虫属(五/w7"c/i"flspp.)(例如，墨西哥豆胍虫(五.v"riV幼's))，并且-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或-其中所^ia合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列(i)如下表示的任意序列SEQIDNO513,515，517,519,521,533至575，576，581，5明，591或596，或其互补序列'(ii)与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、90%,更优选至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO513,515，517.519,521,533至575，576，581，586,591或596，或其互补序列，以及(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列SEQIDNO513,515，517,519,521,533至575，576,581，586,591或596,或其互补序列，或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的直系同源物SEQIDNO533至575，或其互补序列。24.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20的外罩、陷阱或诱斜用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途,所述昆虫选自花象属物种(^i^柳wmisspp.)(例如，墨西哥棉铃象(Agnmd/s))，并且-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或-其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，所述多核普酸包含选自以下的核苷酸序列(i)如下表示的任意序列SEQIDNO601,603,605,607,609,621至767，768,773,778,783或788,或其互补序列，(ii)与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、90%,更优选至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO601,603,605,607,609,621至767，768,773,778,783或788,或其互补序列，以及(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列SEQIDNO601,603,605,607,609,621至767，768,773,778,783或788,或其互补序列，或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核普酸的基因的直系同源物SEQIDNO621至767,或其互补序列。25.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20的外革、陷阱或诱斜用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所述昆虫选自拟谷盗属物种(7>幼<//"/spp.)(例如，赤拟谷盗(7:CflS她eW挑))，并且-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或-其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列(i)如下表示的任意序列SEQIDNO793,795,797,7的，801,813至862,863,868，873,878或883,或其互补序列，(ii)与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、卯％，更优选至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO793,795，797,7的，801，813至862,863,868，873,878或883,或其互补序列，以及(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核普酸的序列SEQIDNO793,795,797,7的，801,813至862,863,868，873,878或883,或其互补序列，或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核香酸的基因的直系同源物SEQIDNO813至862，或其互补序列。26.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20的外罩、陷阱或诱斜用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所述昆虫选自瘤奸属物种(Afyz"sspp.)(例如，杉匕对(M;pws/c"e))，并且-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苦酸，或-其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的核普酸序列(i)如下表示的任意序歹'J:SECi,DN0888'890'&92'894'的8'908至1040'1041,1046、1051,1056'1061'或1066至1070，或其互^卜序歹寸，(ii)与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、卯％，更优选至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO888,柳，892,894,896,908至1040,1041,1046,1051,1056,1061,或1066至1070，或其互补序列，以及(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列SECi'DNO'BB8,890,&92,&94,896,908至1040,1041,1046,1051,1056、1061'或1066至1()70，或其互补序列，或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核普酸的基因的直系同源物SEQIDNO卯8至1040,或其互补序列。27.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20的外罩、陷阱或诱辨用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所述昆虫选自褐飞虱属物种(A7/fl/7flnYitospp.)(例如，褐飞虱(TV./wgrns))，并且-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或-其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，所述多核苷酸包M自以下的核苷酸序列(i)如下表示的任意序列SEQIDNO1071,1073,1075,1077,1079,1081,1083，1085.1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101.1103,1105,1107,1109,"11,"13,1161至1571,1572.1577,1582,1587,1592,1597,1602,雷,1612,1617,1622，1627,1632，1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667，1672或1677，或其互补序列，(ii)与如下表示的任意序列具有至少70%,优选至少75%、80%、85%、卯％，更优选至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO1071,1073，1075,1077，1079,■,1083,1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101'1103，1105,"07,1109,1111，1113,1161至1571,1572,1577,1582,1587,1592,1597,1602,1607，1612,1617，1622,1627,1632,1637,1642,1647,1652,1657,1662,1667,1672或1677,或其互补序列，以及(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列SEQIDNO1071,1073,1075,1077,1079,1081，1083，1085,1087,1089,1091,1093,1095,1097,1099,1101,1103,1105,1107'1109,1111,1113,1161至1571,1572.1577,1582'1587,1592,1597,1602,1607,1612,1617,1622,1627,1632，1637,1642,1647,1652,1657，1662,1667,1672或化77，或其互补序列，或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的基因的直系同源物SEQIDNO1161至1571，或其互补序列。28.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20的外罩、陷阱或诱饰用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所述昆虫选自禾草螟属物种(C7i/tospp.)(例如，二化螟(C.i/7/w^s"//s)、台湾稻螟(C."wwW/i"s)或稻多丽螟(Cl/w/j;c/^j似s))，并且-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或-其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，所述多核普酸包含选自以下的核普酸序列(i)如下表示的4壬意序列SEQIDNO1682.1684'1686,1688'1690'1692'1694,1696,1698,1700,1702,1704,1730至2039,2040,2045，2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090或2095，或其互补序列，(ii)与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、90%，更优选至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694'1696,1698,1700,1702，1704,1730至2039,2040，2045,2050,2055,2060,2065,2070,2075,2080,2085,2090或2095,或其互补序列，以及(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核香酸的序列SEQIDNO1682,1684,1686,1688,1690,1692,1694,1696,1698,1700,1702,1704，1730至2039,2040,2045,2050，2055,2060,2065，2070,2075,2080,2085,2090或2095,或其互补序列，或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核普酸的基因的直系同源物SEQIDNO1730至2039，或其互补序列。29.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20的外革、陷阱或诱饰用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所述昆虫选自户/"^//"属物种(例如，菜蛾)，并且-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或—其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的核香酸序列(i)如下表示的4壬意序列SEQIDNO2100,2102,2104,2106，2108,2120至233B,2339,23"，2349,2354或2359,或其互补序列，(ii)与如下表示的任意序列具有至少70%,优选至少75%、80o/q、85%、90%,更优选至少95%、96%、97%、98。/。或99°/。一致性的序列SEQIDNO2100，2102,2104,2106，2108,2120至2338,2339,2344.2349,2354或2359'或其互4卜序列，以及(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列SEQIDNO2100,2102,2104，2106,2108,2120至2338,2339，2344，2349，2354或2359,或其互补序列，或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核普酸的基因的直系同源物SEQIDNO2120至2338，或其互补序列。30.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20的外軍、陷阱或诱辨用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所述昆虫选自」c/^to属物种(例如，居屋艾蟠(A^wie幼'ow))，并且-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或-其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核香酸，所述多核普酸包含选自以下的核苷酸序列(i)以下任意序列SEQIDNO2364,2366,2368，2370,2372,2384至2460,2461,2466,2471,2476或2481,或其互补序列，(ii)与如下表示的任意序列具有至少70%，优选至少75%、80%、85%、90%，更优选至少95%、96%、97%、98%或99%—致性的序列SEQIDNO2364，2366,2368,2370,2372，2384至2460,2461,2466，2471,2476或2481,或其互补序列，以及(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列SEQIDNO2364,2366,2368，2370，2372,2384至2460,2461,2466,2471,2476或2481，或其互^卜序列，或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核普酸的基因的直系同源物SEQIDNO2384至2460，或其互补序列。31.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者权利要求20的外軍、陷阱或诱斜在药物或兽医应用中的用途。32.用于防止昆虫在植物上生长或者防止昆虫侵害植物的方法，其包括将权利要求10至18中任一项的组合物或者权利要求19的喷雾剂应用到所述植物。33.提高产量的方法，其包括将有效量的权利要求10至18中任一项的组合物或权利要求19的喷雾剂应用到植物。34.权利要求32或33的方法，其中所述植物选自苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、芦*、鳄梨、香蕉、大麦、豆、甜菜、黑莓、蓝莓、嫩茎花椰菜、抱子甘蓝、巻心菜、蓖麻、胡萝卜、木薯、花椰菜、谷类、芽菜、樱桃、柑桔、克莱门氏小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、茄子、菊苣、桉树、无花果、葡萄、葡萄柚、落花生、醋栗、猕猴桃、莴苣、韭、柠檬、莱姆酸橙、松树、玉米、芒果、甜瓜、小米、蘑菇、燕麦、菜秋葵、洋葱、橙、观赏性植物或花或树、番木瓜、欧芽、豌豆、桃、花生、豌豆、胡椒、柿子、菠萝、车前草、李子、石榴、马铃薯、南瓜、菊苣、萝卜、油菜、悬钩子、稻、黑麦、高粱、黄豆、大豆、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、红薯、橘子、茶树、烟草、番茄、藤4^t物、西瓜、小麦、山药以及西葫声。35.根据权利要求32至34中任一项的方法，其中所述昆虫选自马铃薯叶甲属(例如，马铃薯叶甲、伪马铃薯叶甲或胡颓子叶茄叶甲)、合爪负泥虫属物种(丄e附flspp.)(例如，三条负泥虫(丄，加7,Vie"to))、茄跳甲属物种(五/，^ix:spp.)(例如，美国马铃薯跳甲(￡草跳甲(五.AiW^e朋/s)或块茎跳曱(五.似6en:s))、豆芫胥属物种(五/;,'cflwtospp.)(例如，北美豆芫菁(五.v故"似))、食M虫属物种(例如，墨西哥豆瓢虫)、猿叶甲属物种(例如，辣根猿叶甲)、褐飞虱属物种(例如，褐飞虱)、灰飞虱属物种(spp.)(例如，灰飞虱(1.Wn'flte//ws))、黑尾叶蝉属物种(A^//iW^^:spp.)(例如，二点黑尾叶蝉(TV.viVrsce"s)，或黑尾叶蝉(Wd""/ce/w)，或二条黑尾叶蝉(TV.",》r印/""s))、白背飞虱属物种(Sogflte/tospp.)(例如，白背飞虱(51/wr";/^fl))、^cACfl属物种(例如，居屋艾錄)、杆长蝽属物种(fi//M"sspp.)(例如，美洲谷杆长蝽(丑./ewc丰mis/ewc丰mis))、黑棒属物种(5^ft7i印/^mspp.)(例如，稻黑蝽(5".veniMV/M/"te))、绿棒属物种(v4cr仍&r"wwspp.)(例如，拟绿蝽(A/ii7fl^))、稻弄蝶属物种(户"m"raspp.)(例如，直紋稻弄蝶(P.g"加似))、禾草螟属物种(例如，二化螟、台湾稻螟或稻多丽螟(C/w();c/^^"s))、禾草螟属物种(CA/to^Yieflspp.)(例如，稻杆螟(C/w(vcAo;柳))、经茎^^蛾属物种(5^"附/"spp.)(例如，稻蛀茎夜蛾(51Z"/eiwis))、蛀禾螟属物种(7>>;/wo^"spp.)(例如，白稻螟(r./""^flto)或三化螟(t:,Vi"w"/"s))、纵巻叶野螟属物种(Offl/^"/ocwdsspp.)(例如，稻纵巻叶野螟(C/M^/"fl/i:s))、潜錄属物种(j^ww^flspp.)(例如，日>^潜蝇(A"o^"e)或玉米斑潜錄(A/mn^w"/s))、杆草螟属物种(D,Wni^ispp.)(例如，小蔗螟(/>.saccAflm//s)或西南玉米杆草螟(D.gnmrf/仍函))、7V"i7iflga属物种(例如，绿稻毛虫(L"e"esce附))、黄夜蛾属物种(AT"w^oflfesspp.)(例如，犁紋黄^M(X&fl"svera"))、灰翅^l属物种(S/w^/;teraspp.)(例如，草地贪夜蛾(又/r"g,i^v/fl)、甜菜夜蛾(&d/g"fl)、海灰翅夜蛾(S./i'加nife)或西部黄条夜"(51.pm^c"))、秘夜蛾属物种(Afy汰/附/iflspp.)(例如，粘虫(Afy幼/w"fl(PseMdfl/"/flJ))、铃^L蛾属物种(/^//c瞎f77"spp.)(例如，谷实夜蛾(E卿))、CV/flsp/s属物种(CW"spi攀sspp.)(例如，i萄肖叶甲(Ci"朋e"))、稻水象属物种(丄/s，A丰nisspp.)(例如，稻水象甲(丄.wj鄉Ai7ws))、稻象属物种(五c/^Viocw附wsspp.)(例如，稻象(E^rni附仍))、稻铁甲属物种(D/cto必spflspp.)(例如，水稻铁甲(D.fliTM&mi))、^J^负泥虫属物种(0"/e附aspp.)(例如，水稻负泥虫(O.wjz"e))、米象属物种(S,'to/^i7wsspp.)(例如，米象(51.00^^))、户"c/^^/仍/s属物种(例如，稻瘿蚊(P.)、毛眼水錄属物^t(spp.)(例如，麦叶毛眼水錄(Egnko/fl)或日稻毛眼水錄(仗sfl湖A:/!'))、CMon/w属物种(例如，稻杆潜錄(C.wjz"e))、根萤叶甲属物种(Z)/fl&W/cflspp.)(例如，玉米根叶曱(D.v,V^^niv/wiy^ni)、北美玉米才艮叶甲(Z).6fl^m')、黄瓜十一星叶甲卡^根亚种(AM"^fed附/;w"""似/whywy//)、墨西哥玉米才艮叶甲(/)v/wy^razefle)、条紋黄瓜叶甲(D.6fl/teflto))、杆野螟属物种(仏加'"/"spp.)(例如，玉米螟(ft)、地虎属物种(JgrW/sspp.)(例如，小地老虎(A!》油w))、孤s腳/m/戸s属物种(例如，南美玉米苗斑螟(//g",/,"s))、梳爪叩头虫属(Me/"wWwsspp.)(线虫)、圆头犀金龟属(Q;c/oc印/^/"spp.)(例如，北部伪装金龟(C^re"fc)或南部伪装金龟(C./附wflc"/flto))、弧丽金龟属物种(iV/w7/Z"spp.)(例如，日本弧丽金龟(P.y"/ww/c"))、跳甲属物种((fletoc"e附flspp.)(例如，玉米铜色跳甲(C/w/f'cfln'"))、龙颈象属物种(5^/^m/^w"sspp.)(例如，玉米长咮象(51.wfl,Vfe))、缢管蚜属物种(及/^/7fl/os,》/i"附spp.)(例如，玉米蚜(及.附似7/&))、圆尾蜂属(J/iw，/^spp.)(例如,玉米根蜂d扁/flfiVWiWs))、黑埴属物种(她to/i印/"sspp.)(例如，红足黑埴(M/柳wm/6r謂))、特异黑蝗(Af.^Q^e""flfc)或迁飞黑嫂(A/:柳"gw/",y^s))、种錄属物种(场/e附y"spp.)(命J如，种錄(/;to似ni))、呆蓟马属物种(spp.)(例如，黄呆蓟马")、火蚊属物种(5Wew炉/sspp.)(例如，盗议(5".附,7esto))、叶螨属物种(r&m"j;c/^sspp.)(例如，二点叶螨(7:wW/cfle)、；^^、叶螨(r.c/"w"6fln'""s)、铃^LM属物种(例如，谷实夜蛾或棉铃虫(Efli7Mi;geni))、i^"/"印/^m属物种(例如，红铃麦蛾(P.^w砂/wW/fl))、金刚钻属物种(五"n'"sspp.)(例如，翠紋钻夜蛾v故C/"))、实^M属物种(/^//0幼/sspp.)(例如，烟芽夜械(Ev,Vescms))、花象属物种(^w幼wio附MSspp.)(例如，墨西哥棉铃象(Agnmrf/s))、/^^^1似附^"/&属物种(例如，棉伪斑腿盲棒(户.)、结翅粉虱属物种(rnWe"nwfesspp.)(例如，结翅粉虱(r.a6w&70weMS)、'温室粉虱(r.v"/wr"r/w"w))、'J、粉IL^物种(5e附&iVispp.)(例如，银叶粉虱(及a^e"ftyi///))、奸属物种(J//i/sspp.)(例如，棉蜂(Ag仍s，//))、草盲蝽属物种(Z膽"sspp.)(例如，美国牧草盲棒(Z.//"eo/fln's)或美洲牧草盲蝽(丄./^spmw))、美洲蝽属物种(五nscA/对"sspp.)(例如，斑点美洲蝽cww/^ra"s))、CM<wvcAnfl属物种(例如，赛氏蝽(Cl幼j;/))、绿蝽属物种(A^fl/Yispp.)(例如，稻绿蝽(7V;v,'nV/"/"))、蓟马属物种(2Tin》sspp.)(例如，烟蓟马(r.似6flc/))、花蓟马属物种(spp.)(例如，烟褐蓟马(F./wscfl)或西方花蓟马(F.ocdfifewto/i's))、绿小叶蝉属物种(五附/wflscflspp.)(例如，蚕豆小绿叶蝉(E/"^ie))、瘤奸属物种(M^"sspp.)(例如，桃蜂(M))、薯个木虱属物种(户flm加V^！spp.)(例如，马铃薯木虱(户.)、宽胸金针虫属物种(Omoflfenwspp.)(例如，南部马铃薯线虫(Cl/fl///)或烟草线虫(C.ves/;eW,Vii/s))、麦蛾属物种(w/附"e"Spp.)(例如，马铃薯麦蛾(户.O^^TMfe//"))、长管奸属物种(MflC7YWI》/^附spp.)(例如，大戟长管辨(3/.ewpAw6/"e))、77^flto属物种(例如，红肩棒象(r./7fl//!Vtov/mis))、麦蛾属物种(例如，马铃薯麦蛾)、铃夜蛾属物种(例如，谷实夜蛾)、A^^r,Vi属物种(例如，番茄囊蛾)、金针虫属物种(丄/附wi/"sspp.)(线虫)、Af"m/wc"属物种(例如，烟草天蛾(Ms^x,")或番痴天蛾(iWl《MfVi《"ein"c"/a^1))、斑潜錄属物种(丄/n'oiwj^flspp.)(例如，蔬菜斑潜錄(丄.s"ftV"e)、三叶草斑潜錄(L加:/b///)或南美斑潜錄(丄.))、果錄属物种(ZV卵o/Ai7/"spp.)(例如，黑腹果錄(/))、Z).拜A^"、拟暗果錄(D./w^too6scwra)或拟果蝇(/).s/附m/朋s))、步甲i物种(CVmi6"sspp.)(例如，粒步甲(C.)、摇蚊属物种(C7i/腦o麵sspp.)(例如，摇蚊(C.te"to/iws))、祁首蚤属物种(Cte/Mc印Afl/iV/esspp.)(例如，猫辨首蚤(C/efc))、非耳味象属物种(D/fl/;re/^spp.)(例如，根象鼻虫(D.fl66簡"似s))、齿小囊属物种(//isspp.)(例如，美木>齿小囊(///"/))、拟谷盗属物种(7>/^//"附spp.)(例如，赤拟谷盗(r.aiW"ifei/挑))、舌錄属物种(G/仍s/""spp.)(例如，刺舌蝇(G./Mora,Yfl附))、按^L^物种(v4wo/7/^/^spp.)(例如，甘比亚按蚊(Agfl附6/fle))、铃>^属物种(例如，棉铃虫(好.flrm/gem))、jotAosi>/^w属物种(例如，婉豆对(A/^"w))、蜜蜂属物种(J//sspp.)(例如，意大利蜜蜂(A附e/iy^r"))、Hwmi&flfcai属物种(例如，琉璃叶蝉(^acoagiitote))、伊蚊属物种(爿^fesspp.)(例如，埃及斑紋()、蚕蛾属物种(丑o附^aspp.)(众'J如，家蚕(丑.附w/))、飞埴属物种(Z^cnstospp.)(例如，飞埴(厶w/gmtonVi))、牛蜱属物种(5tfo;p/ii7wsspp.)(例如，微小牛蜱(丑.附iVtc^/"s))、Jam^osci/n*/"属物种(例如，红毛巧克力捕鸟蛛(Ago附esiVimi))、曱#^物种spp.)(例如,太平洋折翅蠊(A/wiw"flto))、袖^it^物种(H^Vwi/wsspp.)(例如，瓦氏袖蝶(^Kemto)或诗神袖蝶(we//wwee))、象虫属物种(C"itm//ospp.)(例如，欧洲栎象(C.g/"mjf,'"w))、iV"te/to属物种(例如，菜蛾(户.jcj^对e/to))、花蜱属物种(J附6/"iiMfi"spp.)(例如,彩饰花蜱(Avfln'egfl似w))、拃香属物种(Jwtem^ispp.)(例如，天香(」.拜mama/))和阿蚊属物种(v4r附/geirsspp.)(例如，發扰阿蚊(As"6fl/6fl似s))。36.用于防止昆虫在基层上生长的方法，其包括将权利要求10至18中任一项的组合物或权利要求19的喷雾剂应用到所U层。37.用于治疗和/或预防由耙生物导致的疾病或病症的方法，其包括将权利要求10至18中任一项的组合物或权利要求19的喷雾剂施用于有此治疗和/或预防需要的对象。全文摘要本发明涉及通过RNAi介导的基因沉默来防治害虫侵害的方法，其通过将完好的昆虫细胞与该昆虫细胞外部的双链RNA接触以及通过所述双链RNA被所述完好的昆虫细胞摄取来实现。在一个具体的实施方案中，本发明的方法用于减轻昆虫害虫对植物的侵害。作为替代地，所述方法用于向有此处理和/或防止需要的基层或对象进行处理和/或防止昆虫侵害。公开了适当的昆虫靶基因及其片段、dsRNA构建体、重组构建体和组合物。文档编号C12N15/113GK101370940SQ200780002294公开日2009年2月18日申请日期2007年1月12日优先权日2006年1月12日发明者劳伦特·库布勒,埃尔丝·万布勒,格特·普莱廷克,罗曼·雷马克斯申请人:德福根有限公司