专利名称：烟草为原料制备辅酶q的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域尤其是辅酶Q10的制备辅酶Q10(CoenzymeQ10，CoQ10)又称泛醌10，是2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-二苯醌的衍生物，其侧链含有10个异戊烯基。它广泛存在于动物、植物和微生物中，是呼吸链中电子/氢的载体。它可以以NADH脱氢酶，磷酸甘油脱氢酶、脂酰CoA脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、铁硫蛋白等中接受电子/氢，并将电子传递给Cyt。因此，在呼吸链中占据承上启下的重要位置和作用。辅酶Q10是重要的药源，在医药上广泛用于治疗心、脑、肝、肾疾病，细菌和病毒传染病，癌症病人的综合治疗，以及改善机体免疫功能等。
辅酶Q10在国外用化学合成法或微生物发酵法生成，但产率低、产物专一性差，成本高，价格贵，难于满足制药工业需要。目前国内尚无生产，至今我国制药所需辅酶Q10完全依赖进口。因此，辅酶Q10在国内外都存在广阔的市场。以烟草为原料生产辅酶Q10目前国内外都未见报道。
本发明的目的在于采用现代生物技术方法，利用植物细胞工程和酶工程的原理和技术，从发酵高产生长快的烟草细胞中制备高纯度的结晶辅酶Q10，经济、简便的生产辅酶Q10，以适应经济建设和国内外市场的需要。
我们从1994年起对烟草细胞发酵条件、工艺及其生产辅酶Q10技术、辅酶Q10的分离纯化、结晶纯度控制等技术进行了长期深入研究，从而发明了烟草为原料，以烟草细胞悬浮培养生产辅酶Q10的技术。
本发明是这样实现的
(一)愈伤组织诱导取烟草植体，洗净，70％乙醇溶液浸泡，再用0.1％氯化汞消毒，无菌水冲洗。在无菌条件下切碎，接种于诱导培养基上培养，置16-32℃培养箱中黑暗培养至形成愈伤组织，较理想的培养温度为28±1℃。诱导培养基以MS为基本培养基，加入BA 0.05mg/L,2,4-D 1.0mg/L,NAA 1.0mg/L，蔗糖浓度3％，琼脂0.7％，pH5.8，高压灭菌。
(二)继代培养上述愈伤组织转入继代培养基中进行继代培养，继代培养基以LS为基本培养基，另加入BA 0.05mg/L,2,4-D 1.0mg/L,NAA 1.0mg/L，蔗糖浓度3％，琼脂0.7％，pH5.8，高压灭菌，产生疏松愈伤组织；(三)悬浮培养出种子细胞将上述疏松愈伤组织，转入悬浮培养基中进行悬浮培养出种子细胞。
1．悬浮培养基的组成组 成 含量最佳含量无机营养 LS LSKT,mg/L 0.02-4 0.022,4-D,mg/L 0.05-4 2.00肌醇mg/L80-800 100盐酸硫胺素mg/L 0.05-8.0 4.00酵母膏％0.05-0.5 0.15蔗糖％ 1045 30甲硫酸胺mg/L5-20 20.02．培养条件☆摇床转速，100-150r/min，最佳转速为100r/min，振幅2cm
☆培养基pH,pH4.0-8.0，最佳pH5.8☆培养温度，16-32℃，最佳培养温度为28±1℃☆培养时间，8天☆黑暗中培养(四)辅酶Q10的制备1．辅酶Q10的提取用丙酮作为抽提溶剂，将烟草悬浮培养细胞与丙酮按12(质量/体积比)混合，研磨，过滤，残渣重复2次以上，合并滤液，用0.5倍滤液体积的石油谜(30-65)℃作萃取剂进行萃取，所得石油醚萃取液为辅酶Q10的石油醚提取液。
2．辅酶Q10分离纯化将石油醚提取液用蒸发法浓缩至原体积的1/15，上硅胶柱层析纯化，硅胶(60-325孔/cm)烘至恒重，加60克/L水活化，装柱(2.0×20.0cm2)，用体积分数为4％的乙醚-石油醚浓度线性梯度洗脱，流速1ml/分钟、5ml/管，收集黄色部分洗脱液，为辅酶Q10纯化液。
3．结晶将纯化辅酶Q10溶液于60℃水浴上蒸发除去有机溶剂后，干物质入乙醇溶解，密封于4-8℃冰箱中结晶，结晶完全后离心(10500转/分钟，4℃,15分钟)，收集结晶为辅酶Q10。
4．干燥用冷冻干燥法干燥，密封避光保存。
5．辅酶Q10含量每克干重细胞产辅酶Q10500-510ug，回收率达59.2％，纯度98％。辅酶Q10的特征特性辅酶Q10正品为黄色长菱形结晶，无毒，无味，易溶于有机溶液。水分＜5％，
辅酶Q10正品为黄色长菱形结晶，无毒，无味，易溶于有机溶液。水分＜5％，灰份＜3％，辅酶Q9及其他杂质＜0.2％。
其化学结构式 辅酶Q10含量检测将辅酶Q10溶于10ml无水乙醇，取3ml在275 nm波长下测定其氧化型吸光值(A1)；然后，加入0.1ml0.7％硼氢化钠水溶液，又在275nm波长下测定其还原型吸光值(A2)。对照为无水乙醇。按下式计算辅酶Q10含量CoQ10ug/g.dw细胞=(A1-A2)×n×106142×s式中n为稀释倍数，s为细胞干重(g)，142为辅酶Q10的1％无水乙醇溶液在275波长下氧化型和还原型吸光值之差。
每g干重细胞达500-510ug辅酶Q10质量标准检验采用高效液相色谱法(HPLC)检测辅酶Q10的纯度。色谱条件色谱柱Zorbaxods7u；流动相为60％的乙醇/甲醇溶液；流速为1ml/min，波长283nm，进样量为30ul，标样和样品辅酶Q10的浓度4.9umol/L。纯度)98％，辅酶Q9及其他杂质＜0.2％。
水分、灰份检测按常规法。
细胞干重按常规恒重法。
本发明的优点1．本发明为辅酶Q10药源生产开辟了新途径，为辅酶Q10药源国产化奠定了基础。以适应市场和经济发展的需要。
2．本发明用烟草细胞为材料，细胞生长快，辅酶Q10含量高。从发酵细胞中易于提取辅酶Q10。
3．本发明工艺生产设备简单，可以国产化，而且投资少，工艺简便。辅酶Q10成本低。
4．发明辅酶Q10回收率高，纯度高。达到药用要求，可以用于制药。
实例取盆栽砂培烟草黄花大金元具3-4片真叶幼苗的叶片，用自来水洗净。在无菌条件下70％乙醇溶液浸泡5-8秒，再用0.1％氯化汞消毒8-10分钟，无菌水冲洗3次，切成0.5cm-0.5cm小块，接种于诱导培养基上培养，置28±1℃培养箱中黑暗培养25天形成愈伤组织。将愈伤组织转入继代培养基中进行继代培养，产生疏松愈伤组织。将疏松愈伤组织转入装有50ml悬浮培养基的250ml锥形瓶中，接种4g。摇瓶；转速为100-120r/分钟，振幅2cm,28±1℃黑暗中培养8天。用吸管吸取培养基中上部细胞并过滤，可作为悬浮培养的种子细胞。
取100g悬浮培养细胞，加入200ml丙酮，研磨，过滤，残渣重复2次以上，合并滤液，用300ml石油谜(30-60)℃作萃取剂进行萃取，所得萃取液为辅酶Q10的石油醚提取液。将石油醚提取液置于60℃水浴浓缩至20ml，上硅胶柱(2.0×20.0cm)，用体积分数为4％的乙醚-石油醚浓度线性梯度洗脱，流速1ml/分钟，5ml/管，收集黄色部分洗脱液250ml,60℃水浴上蒸发除去有机溶剂后，干物质加入10ml乙醇溶解，密封避光，置于4-8℃冰箱中结晶，2天后结晶完全，离心(10500转/分钟，4℃,15分钟)，收集结晶，冷冻干燥，即为辅酶Q10成品。产率为500-510ug/干细胞，回收率达59.2％，纯度98％以上。
权利要求
1．烟草为原料制造辅酶Q10的方法，其特征在于(1)愈伤组织诱导取烟草植体，洗净，70％乙醇溶液浸泡，再用0.1％氯化汞溶液消毒，无菌水冲洗除去浸泡液和消毒液，在无菌条件下，切成小块，接种于诱导培养基上，置16-32℃培养箱中黑暗培养至形成愈伤组织；(2)继代培养将上述愈伤组织转入继代培养基中进行继代培养，产生疏松愈伤组织；(3)悬浮培养出种子细胞将上述疏松愈伤组织，转入悬浮培养基中培养出种子细胞；(4)辅酶Q10提取用丙酮作为抽提溶剂，将烟草悬浮培养细胞与丙酮按1∶2(质量/体积比)混合，研磨，过滤，残渣重复2次以上，合并滤液，用0.5倍滤液体积的石油谜(30-65)℃作萃取剂进行萃取，所得石油醚萃取液为辅酶Q10的石油醚提取液；(5)辅酶Q10分离纯化将石油醚提取液用蒸发法浓缩至原体积的1/15，上硅胶柱用体积分数为4％的乙醚-石油醚浓度混合液线性梯度洗脱，收集黄色部分洗脱液，为辅酶Q10纯化液；(6)结晶将纯化辅酶Q10溶液于60℃水浴上蒸发除去有机溶剂后，加入无机乙醇溶解，密封于4-8℃冰库中结晶，结晶完全后离心，收集结晶，即为辅酶Q10产品。
2．根据权利要求1所说的烟草为原料制备辅酶Q10方法，其特征在于愈伤组织培养基以MS为基本培养基，加入BA 1.Smg/L,NAA 1.4mg/L，蔗糖浓度3％，琼脂0.7％，pH6.0，较理想的培养温度为28±1℃。
3．根据权利要求1所说的烟草为原料制造辅酶Q10方法，其特征在于继代培养基以LS为基本培养基，加入BA 0.05mg/L,2，4-D 1.0mg/L,NAA 1.0mg/L，蔗糖浓度3％，琼脂0.7％，pH5.8。
4．根据权利要求1所说的烟草为原料制备辅酶Q10方法，其特征在于悬浮培养基中各营养成分为无机营养LS,KT0.02-4mg/L,2,4-D0.05-4mg/L，肌醇80-800mg/L，盐酸硫胺素0.05-8.0mg/L，酵母膏0.05-0.5％，蔗糖1045％，甲硫酸胺5-20mg/L；各营养成分较佳含量为LS(无机)，KT0.02mg/L,2,4-D2.00mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素4.00mg/L，酵母膏0.15％，蔗糖30％，甲硫氨酸10mg/L。
5．根据权利要求1和4所说的烟草为原料制备辅酶Q10方法，其特征在于烟草细胞在悬浮培养基的培养条件为摇床转速100-150转/分钟，最佳转速为100转/分钟，培养基的pH4.0-8.0，最佳的pH5.8，培养温度16-32℃，最佳培养温度为28±1℃，培养时间8天。
全文摘要
本发明是以烟草为材料,经过诱导、继代和悬浮培养,产生生长快、辅酶Q
文档编号C07C50/28GK1298942SQ0013081
公开日2001年6月13日 申请日期2000年11月28日 优先权日2000年11月28日
发明者徐凤彩, 穆虹, 高向阳, 康起亮, 叶国洪 申请人:华南农业大学