专利名称：2,4－二氨基－3－羟基羧酸衍生物作为蛋白酶体抑制剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及式I的2，4-二氨基-3-羟基羧酸以游离形式、药学上可接受的盐或配合物(complex)的形式用于制备治疗增殖性疾病如实体瘤的新用途，式I中的符号和取代基的含义由下文给出，下文将该化合物组统称为本发明化合物；涉及一种温血动物包括人的治疗方法，其中将有效抗增殖剂量的本发明化合物给予患有增殖性疾病的患者；涉及新的2，4-二氨基-3-羟基羧酸及其药学上可接受的盐；涉及含有本发明化合物和药用载体的药物组合物；还涉及用在治疗人或动物体的方法中的本发明化合物。
由多催化蛋白酶体复合物靶向降解的蛋白质本身具有细胞周期控制(如细胞周期蛋白p21，p27)和编程性细胞死亡(如p53)的功能(Rolfe，M.，Chiu，I.M.和Pagano，M.，泛素介导的蛋白水解途径作为治疗区域(The ubiquitin-mediated proteolytic pathway astherapeutic area.)J.Mol.Med.75，1997，5-17)。因此蛋白酶体抑制剂适于治疗对蛋白酶体活性的抑制应答的增殖性疾病。这里可提及的增殖性疾病如牛皮癣特别是实体瘤如结肠瘤，乳房瘤，肺瘤和前列腺瘤。
本发明涉及式I的2，4-二氨基-3-羟基羧酸的新用途， 其中
A和B独立地代表键或者未取代或取代的氨基酰基部分；R1代表氢、氨基保护基或式R5Y-的基团，其中R5代表氢或者未取代或取代的烷基、链烯基、炔基、芳香基、芳烷基、杂芳香基、杂芳烷基、杂环基或杂环烷基，而Y代表-CO-、-NH-CO-、-NH-CS-、-SO2-、-O-CO-或-O-CS-；R2代表天然氨基酸的侧链、烷基、芳烷基、杂芳烷基或环烷基烷基或三甲基甲硅烷基甲基、2-噻吩基甲基或苯乙烯基甲基；R3代表卤素、烷基、烷氧基或羟基烷氧基；和R4代表2(R)-羟基2，3-二氢化茚-1(S)-基、(S)-2-羟基-1-苯乙基或者未被取代或在4位被甲氧基取代的2-羟基苄基；其中该2，4-二氨基-3-羟基羧酸为游离的形式，药学可接受的盐或药物组合物形式。
未取代或取代的烷基优选1-5个碳原子、优选1-4个碳原子的烷基，如甲基、乙基、异丙基或叔丁基；尤其是具有1或4个碳原子。取代基如苯氧基、羟基或未保护或保护的氨基。
未取代或取代的芳烷基如总共7-10个碳原子的苯基烷基，如苄基或2-苯乙基。它是未被取代的或在芳香基或烷基部分被如羟基取代，如苄基-CH(OH)-或苯基-CH(CH2OH)-，或者被烷基、氨基或烷基氨基取代；或者它为在亚烷基部分具有1-4个碳原子的萘基烷基，特别是萘基甲基。
氨基保护基优选苄氧基羰基、环烷基烷氧基羰基，特别是环己基甲氧基羰基或叔丁氧基羰基。未取代或取代的杂芳烷基优选吡啶基烷基，特别是2-吡啶基甲基和4-吡啶基甲基。
芳香基，杂芳香基，和芳烷基和杂芳烷基的芳香基部分可以是单-或多环，如吡啶基、萘基、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)或苯并咪唑基。芳烷基或杂芳烷基的亚烷基部分可以被羟基取代。
杂环基，和杂环基烷基的杂环基部分为具有-或多个选自氮、氧和硫的杂原子的饱和杂环基。它优选具有5或6环构成原子，优选至多3个杂原子。
环烷基烷基优选环己基烷基，它优选在亚烷基部分具有1-4个碳原子。
卤素为氟、氯、溴或碘，优选氯或溴。
烷基和烷氧基优选含1-4个碳原子，特别是1或2个碳原子，更优选甲基或甲氧基。
羟基烷氧基优选2-4个碳原子的ω-羟基烷氧基，特别是2-羟基乙氧基。
盐如酸加成盐，例如盐酸盐。
式I的化合物具有多个手性中心，因此可以多种立体异构体存在。除非另外特别指出，本发明提供了所有的立体异构体和外消旋混合物。可以用常规技术如色谱法将这些异构体解析或分离。从式I可以看出，在2位的碳原子的构型为R，而在3和4的构型为S。
R1优选氢、吡啶基烷氧基羰基、萘基烷氧基羰基、萘基烷基羰基、苄基-CH(OH)-羰基、苯氧基甲基羰基、苯基烷基羰基或氨基保护基如叔丁氧基羰基、环烷基烷氧基羰基，特别是环己基甲氧基羰基、或者未被取代或被烷基或氨基取代的苄氧基羰基；尤其萘基甲氧基羰基、萘基甲基羰基、吡啶基甲氧基羰基、苯基丙酰基、氨基苯基丙酰基、叔丁氧基羰基、氨基苄氧基羰基、烷基苄氧基羰基、二烷基苄氧基羰基或苄氧基羰基，更优选苄氧基羰基。
当A为未取代或取代的氨基酰基部分时，它优选未取代或取代的α-氨基酰基部分如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天门冬酰胺、缬氨酸、叔丁基甘氨酸、叔亮氨酸或组氨酸。优选天然α-氨基酸，更优选作为蛋白质正常组分的氨基酸的保护或未保护部分或叔亮氨酸。它优选L构型。A特别是甘氨酸、L-缬氨酸、L-叔亮氨酸或键，更优选L-叔亮氨酸(L-tert-leucine).
R2优选天然氨基酸，更优选α-氨基酸，进一步优选作为蛋白质正常组分的氨基酸的侧链。例如它是异丙基、氨基羰基甲基、甲基、1-甲基丙基、苄基、4-羟基苄基或异丁基，优选苄基。
当B为未取代或取代的氨基酰基部分时，它优选未取代或取代的α-氨基酰基部分，如苯基丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸或天门冬酰胺。它优选天然α-氨基酸，更优选作为蛋白质正常组分的氨基酸的取代或未被取代部分。优选用C1-C3-醇，特别是用甲醇将具有第二羧基的α-氨基酸如谷氨酸酯化。它优选L构型。B特别是L-缬氨酸、L-谷氨酸甲基酯或键，更优选L-缬氨酸。
R3优选卤素、甲基或甲氧基，特别是甲氧基。
R4优选如上述的未取代或取代的2(R)-羟基2，3-二氢化茚-1(S)-基或2-羟基苄基，特别是2-羟基-4-甲氧基-苄基。
Y优选-CO-或-O-CO-，特别是-O-CO-。
R5优选未取代或取代的烷基、芳烷基或杂芳烷基，特别是烷基；当它是未取代或取代的杂芳烷基时，它优选吡啶基烷基，特别是2-吡啶基甲基；当它是未取代或取代的芳烷基时，它优选苄基-CH(OH)-；当它是取代的烷基时，优选苯氧基甲基。
在专利申请EP 94810150.6和JP 041047/94，专利AU 672867、EC 961021、TW NI-74341和US 5,538,997中描述了本发明化合物由于能抑制HIV蛋白酶因而具有抗AIDS活性。
根据本发明，已发现本发明化合物令人惊讶地具有对增殖性疾病的有益效果，如对牛皮癣，特别是对实体瘤如结肠瘤、乳房瘤、肺瘤和前列腺瘤。
根据本发明的特别发现，本发明还提供了一种温血动物包括人的治疗方法，其中将治疗学上，特别是抗过度增殖的有效剂量的本发明化合物给予患有增殖性疾病的温血动物。
本发明化合物可以根据上述专利和专利申请所述制备。特别是表1的化合物可以通过以下所述的方法制备(参照US 5,538,997)。
缩写Bn 苄基BOC 叔丁氧基羰基
ES-MS 电喷雾质谱Glu谷氨酸Gly甘氨酸HPLC 高压液相色谱Me 甲基TFA三氟乙酸tLeu 叔-亮氨酸Val缬氨酸Z 苄氧基羰基表1(R2＝Bn，R3＝OMe，R4＝2-OH，4-MeO-Bn)
实施例1-15的制备按照US 5,538,997所述的用于将式III的化合物转化为式VII的化合物一般反应方案。在上述的美国专利的实施例1-4，第6-8栏，和’进一步的中间产物(Further Intermediates)’，第9-11栏中描述了不同构件的合成。
通过在Nucleosil C18-柱(250×4mm，5mm，100A)上的反相分析HPLC来检验化合物的纯度体系A线性梯度7分钟内MeCN/0.09％TFA与H2O/0.1％TFA为1∶49-1∶0，3分钟内为1∶0；流速2.0mL/分，在215nm处检测；体系B线性梯度10分钟内MeCN/0.09％TFA和H2O/0.1％TFA为1∶49-1∶0；流速2.0mL/分，在215nm处检测。体系C在Nucleosil C18AB-柱(125×3mm，3m，120A)上的反相分析HPLC；线性梯度7分钟内MeCN/0.09％TFA和H2O/0.1％TFA为1∶49-1∶0，3分钟内为1∶0；流速1.15mL/分，在215nm处检测。
实施例1N-{4(S)-[N-苄氧基羰基-叔亮氨酰基]氨基}-3-(S)-羟基-2(R)-(4-甲氧基苄基氨基)-5-苯基}戊酰基-L-缬氨酸-N-[(2-羟基-4-甲氧基)苄基]酰胺实施例1的化合物对应于US 5,538,997实施例4的化合物。
实施例24-[4-(2-苄氧基羰基氨基-3-甲基-丁酰氨基)-3-羟基-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-5-苯基-戊酰氨基]-4-(2-羟基-4-甲氧基-苄基-氨基甲酰基)-丁酸甲基酯该标题化合物的制备类似于US 5,538,997的实施例4。根据’进一步的中间产物(Further Intermediates)’，在步骤C.c)中使用BOC-L-谷氨酸γ-甲基酯α-对硝基苯基酯代替BOC-L-缬氨酸对-硝基苯基酯，而在步骤B)中使用BOC-L-缬氨酸代替BOC-L-叔亮氨酸来制备其构件。ES-MS 856[M+H+]。
实施例3{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸叔丁基酯实施例3的化合物对应于US 5,538,997实施例11的化合物。
实施例4{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基-氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸萘-1-基甲基酯该标题化合物的制备类似于US 5,538,997的实施例4，使用碳酸萘-1-基甲基酯4-硝基-苯基酯代替N-(苄氧基-羰基氧)-琥珀酰亚胺。从1-萘甲醇(Aldrich，Buchs，瑞士)开始，根据现有技术已知的方法(P.Furet et al.，J.Med.Chem.1997，40，3551-3556)合成碳酸萘-1-基甲基酯4-硝基-苯基酯。ES-MS(标题化合物)877.3[M+H+]，899.4[M+Na+]；HPLC(体系A)在tR＝7.30分钟处产生单峰。
实施例5{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2.2-二甲基-丙基}-氨基甲酸萘-2-基甲基酯该标题化合物的制备类似于US 5,538,997的实施例4，使用碳酸萘-2-基甲基4-硝基-苯基酯代替N-(苄氧基-羰基氧)-琥珀酰亚胺。从2-萘甲醇(Aldrich，Buchs，瑞士)开始，根据现有技术已知的方法(P.Furet et al.，J.Med.Chem.1997，40，3551-3556)合成碳酸萘-2-基甲基酯4-硝基-苯基酯。ES-MS(标题化合物)877.3[M+H+]，899.4[M+Na+]；HPLC(体系A)在tR＝7.38分钟处产生单峰。
实施例6{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸吡啶-4-基甲基酯该标题化合物的制备类似于US 5,538,997的实施例4，使用碳酸4-硝基-苯基酯吡啶-4-基甲基酯代替N-(苄氧基-羰基氧)-琥珀酰亚胺。从4-(羟基甲基)吡啶(Fluka，Buchs，瑞士)开始，根据现有技术已知的方法(P.Furet et al.，J.Med.Chem.1997，40，3551-3556)合成碳酸4-硝基-苯基酯吡啶-4-基甲基酯。ES-MS(标题化合物)828.3[M+H+]，849.2[M+Na+]；HPLC(体系B)在tR＝6.80分钟处产生单峰。
实施例7{]1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-甲基}-氨基甲酸苄基酯该标题化合物的制备类似于US 5,538,997的实施例4。根据’进一步的中间产物(Further Intermediates)’，在步骤B)中使用Z-L-甘氨酸代替BOC-L-叔亮氨酸来制备一个构件。ES-MS771.0[M+H+]；HPLC(体系B)在tR＝9.45分钟处产生单峰。
实施例8{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙基}-氨基甲酸苄基酯实施例8的化合物对应于US 5,538,997的实施例22化合物。ES-MS813.0[M+H+]；HPLC(体系A)，在tR＝7.53分钟处的单峰。
实施例9{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2，2-二甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基]丙基}-氨基甲酸苄基酯该标题化合物的制备类似于US 5,538,997的实施例4。根据’进一步的中间产物(Further Intermediates)’，在步骤C.c)中使用BOC-L-叔亮氨酸对硝基苯基酯代替BOC-L-缬氨酸对-硝基苯基酯来制备一个构件。ES-MS(标题化合物)841.0[M+H+]；HPLC(体系A)在tR＝7.22分钟处产生单峰。
实施例104-[3，3-二甲基-2-(2-萘-1-基-乙酰氨基)-丁酰氨基]-3-羟基-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-5-苯基-戊酸[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基-氨基甲酰基)-2-甲基-丙基]-酰胺该标题化合物的制备与US 5,538,997的实施例4类似，但使用1-萘基乙酸(Fluka，Buchs，瑞士)以结合最终的N-末端基团。首先在二异丙基乙基胺(2.2当量)的存在下并使用N，N-二甲基乙酰胺作为溶剂将R1.1-萘基乙酸(1.1当量)与2-(2-吡啶酮-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓-四氟硼酸盐(1.1当量；Fluka)偶合。ES-MS(标题化合物)861.0[M+H+]，883.1[M+Na+]；HPLC(体系A)在tR＝7.17分钟处产生单峰。
实施例11{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸3-甲基苄基酯该标题化合物的制备与US 5,538,997的实施例4类似，通过使用碳酸3-甲基-苄基酯4-硝基-苯基酯代替N-(苄氧基羰基-氧)-琥珀酰亚胺。从3-甲基苄基醇(Aldrich，Buchs，瑞士)开始，根据现有技术已知的方法(P.Furet et al.，J.Med.Chem.1997，40，3551-3556)合成碳酸3-甲基-苄基酯4-硝基-苯基酯。ES-MS(标题化合物)841.0[M+H+]，843.0[M+Na+]；HPLC(体系A)在tR＝7.17分钟处产生单峰。
实施例124-{2-[3-(3-氨基-苯基)-丙酰氨基]-3，3-二甲基-丁酰氨基}-3-羟基-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-5-苯基-戊酸[1-(2-羟基-4-甲氧基苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基]-酰胺该标题化合物的制备与US 5,538,997的实施例4类似，但使用3-(3-叔丁氧基羰基氨基-苯基)-丙酸(Fluka，Buchs，瑞士)以结合最终的N-末端基团。从3-(3-氨基苯基)丙酸(Trans World Chemicals，Inc.，Roekville，U.S.A.)开始，根据现有技术中已知的方法(P.Furet et al.，J.Med.Chem.1997，40，3551-3556)合成R1.3-(3-叔丁氧基羰基氨基-苯基)-丙酸，并采用与实施例10类似的方案将其结合到N-末端。通过三氟乙酸的处理除去叔丁氧基羰基。ES-MS(标题化合物)840.0[M+H+]，862.1[M+Na+]；HPLC(体系A)在tR＝5.74分钟处产生单峰。
实施例13{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}氨基甲酸3-氨基-苄基酯该标题化合物的制备与US 5,538,997的实施例4类似，通过使用碳酸3-叔丁氧基羰基氨基-苄基酯4-硝基-苯基酯代替N(苄氧基羰基氧)-琥珀酰亚胺。从3-氨基苄基醇(Aldrich)开始，根据现有技术中的已知的方法(P.Furet et al.，J.Med.Chem.1997，40，3551-3556)合成碳酸3-叔丁氧基羰基氨基-苄基酯4-硝基-苯基酯。通过三氟乙酸的处理除去叔丁氧基羰基ES-MS(标题化合物)842.0[M+H+]，864.0[M+Na+]，tR＝5.85分钟(HPLC，体系A)。
实施例14{1-[1-苄基-2-羟基-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基-氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}氨基甲酸3，5-二甲基-苄基酯该标题化合物的制备与US 5,538,997的实施例4类似，通过使用碳酸3，5-二甲基-苄基酯4-硝基-苯基酯代替N-(苄氧基-羰基氧)-琥珀酰亚胺。从3，5-二甲基苄基醇(Aldrich，瑞士)开始，根据现有技术中已知的方法(P.Furet et al.，J.Med.Chem.1997，40，3551-3556)合成碳酸3，5-二甲基-苄基酯4-硝基-苯基酯。ES-MS(标题化合物)855.0[M+H+]，877.0[M+Na+]，tR＝7.32min(HPLC，体系A)。
实施例15{(S)-1-[(1S，2S，3R)-1-苄基-2-羟基-3-[(S)-1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸环己基甲基酯该标题化合物的制备与US 5,538,997的实施例4类似，通过使用碳酸3，5-二甲基-苄基酯4-硝基-苯基酯代替N-(苄氧基-羰基氧)-琥珀酰亚胺。从环己基-甲醇(Fluka，Buchs，瑞士)开始，根据现有技术中已知的方法(P.Furet et al.，J.Med.Chem.1997，40，3551-3556)合成碳酸环己基甲基酯4-硝基-苯基酯(1.1当量)。ES-MS(标题化合物)833.0，tR＝7.55分钟(体系C)。
实施例16口服组合物如下制备20.0g口服溶液(％指重量成分/总重量溶液)Cremophor RH 40 9.6g(48％)，玉米油-单-双-三-甘油酯、5.8g(29％)，丙二醇 3.8g(19％)，式I的化合物 0.8g(4％)将溶液室温下保存至使用。
在下文所描述的试验方法中可证明本发明化合物在治疗以上例举的增殖性疾病中的应用。
抑制20S蛋白酶体本发明化合物抑制20S蛋白酶体.
多催化蛋白酶体复合物负责大部分细胞内蛋白的ATP依赖性蛋白水解。虽然20S蛋白酶体含有蛋白水解核，但它在体内不能降解蛋白质，除非其与本身含有多ATP酶活性的19S帽结构的任-末端复合。已知该更大的结构为26S蛋白酶体，它将快速地降解已通过加入许多分子8.5kDa的多肽遍在蛋白而靶向降解的蛋白质。靶向蛋白酶体降解的蛋白具有细胞周期控制(如细胞周期蛋白，p21，p27)和编程性细胞死亡(如p53)的功能(Rolfe，M.，Chiu，I.M.和Pagano，M.，see above)。因此本发明化合物非常适于治疗对20S蛋白酶体的活性抑制应答的疾病，即上述增殖性疾病的情况。
20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性抑制可以通过以下实验证明。它是以萤光肽Suc-LLVY-AMC(琥珀酰-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-酪氨酸-7-氨基-4-甲基-香豆素)的水解为基础的，采用20S蛋白酶体仅在Y-AMC键处将该萤光肽断裂。这种肽的水解伴随着荧光密度(355nm，Rem 460nm)的增大，因为内部猝灭的2-氨基苯甲酰基荧光伴随着水解产物Suc-LLVY的扩散分离而释放。
将2μl在DMSO(二甲基亚砜，20 RM每孔最终浓度)中的1mM受试化合物溶液在室温下在黑色的96孔微滴平皿中与1μl的纯化的人体胎盘20S蛋白酶体(Diabetes Forschungsinstitut，Dusseldorf，Germany；大约100ng蛋白酶体，取决于蛋白酶体的制备)和47μl缓冲剂-Ca(5 mM CaCl2，20 mM Tris/HCl(Tris(羟基甲基)-氨基-甲烷盐酸盐)pH 8.0)的混合物一起预温育60分钟。混合并加入3μl在DMSO(8011M每孔中的最终浓度)中的2.67 mM SucLLVY-AMC(Bachem，瑞士)溶液和47μl缓冲剂-Ca。将所得混合物在37℃下温育3-24小时。如果需要，可以通过加入50μl终止溶液(100mM单氯乙酸，130mMNaOH，100mM乙酸，pH＝4.3)而终止反应物的水解。用FLUOROSKANASCENTTM微滴平皿阅读器监测荧光。
每一测定系列必须进行两组对照实验1.)0％值使用2μl DMSO代替2μl在DMSO中的1mM受试化合物溶液，48μl缓冲剂-Ca代替47μl缓冲剂-Ca和1μl纯化蛋白酶体的混合物进行上述的测定。
2.)100％值在上述的测定中，使用2μl DMSO代替2μl在DMSO中的1mM受试化合物溶液。计算
IC50值定义为保留活性是50％的化合物浓度。在下表(表2)中给出了在该测试中测得的本发明化合物的例举性的IC50。
表2(R2＝Bn，R3＝OMe，R4＝2-OH，4-MeO-Bn)。
还可以在体内证明本发明化合物的抗肿瘤作用。
采用人肿瘤异种移植体内评价裸鼠上的抗肿瘤作用将皮下移植人肿瘤的雄性或雌性BALB/c nu/nu(Novartis动物农场，Sisseln，瑞士或Bomholtgaard，Copenhagen，丹麦)小鼠用于评价本发明化合物对来自以下四种肿瘤类型的细胞系的抗肿瘤作用乳房瘤MCF-7；肺瘤NCI H596结肠瘤HCT 116；和前列腺瘤PC3。
材料从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，USA)得到人结肠癌HCT 116(ATCC CCL 247)、人鳞状细胞肺癌NCI H596(ATCC HTB178)、雌激素依赖性乳房癌MCF-7(A TCC HTB 22)和人前列腺癌PC 3细胞系。37℃下在5％v/v CO2和80％相对湿度气氛下在以下介质中在培养这些细胞NCl H 596RPM11640，20％v/vFBS(胎牛血清)，1％w/v谷酰胺，HCT-116McCoy’s 5A，10％v/vFBS，1％w/v谷酰胺；PC 3RPM11640，20％v/vFBS，1％w/v谷酰胺；MCF-7，RPM11640，20％v/v FBS，1％w/v谷酰胺。所有这些细胞系是粘着的并可以通过Hank’s平衡盐的洗涤和0.25％w/v的胰蛋白酶的处理而释放。制备所有这些细胞作为主细胞储备物(在培养基中加至含有20％v/v FBS和7％v/v DMSO)，并在-125℃下贮存(液体氮蒸气)。通过以下方法由主储备物制备工作细胞储备物融化并扩散细胞三个传代以上，然后将其分配到小瓶中并冷冻。所有细胞系在冷冻前的生存力(采用0.5％w/v台盼蓝的台盼蓝排出试验)＞90％。
在裸鼠上产生实体瘤将小鼠在受控条件(最佳卫生条件，[OHC])下保持游离获取无菌食物和水。在皮下注射细胞(最少为在100μlPBS(磷酸盐缓冲盐水)或培养基中的2×106细胞)后在载体小鼠(4-8只小鼠每个细胞系)上产生肿瘤。在小鼠的头尾之间的中路的左胁腹的半月瓣闭合处注射。所得的肿瘤在开始治疗前可连续地传代至少三次连续的移植。当肿瘤达到800-1000mm3的体积时移植肿瘤。
在裸鼠上移植实体瘤将供体小鼠麻醉(ForeneNE，Abbott，瑞士)并通过宫颈脱位处死。将皮肤消毒并通过解剖移出肿瘤。用解剖刀除去肿瘤团的外缘并将所得的肿瘤团调整到约3-4mm重量的碎片。切除3-4mm2的部分并将其置于无菌0.9％w/v NaCl中。不使用坏死的肿瘤部分。
将肿瘤碎片植入到受体小鼠的左胁腹内的半月瓣闭合处。将受体小鼠麻醉(Forene，Abbott，瑞士)并消毒小鼠的整个背部和侧面的皮肤。在尾巴上出现0.5-1cm的皮肤并作单一的1-1.5cm的切口。将肿瘤切片推至13-标准度量的套管针内。将套管针推至皮肤的开口，并在皮肤下推进至头尾之间的中路点。通过推进套管针而将肿瘤碎片沉积。采用一或两个金属夹将伤口缝合。
在雌激素依赖性乳房瘤的情况下，将雌激素小丸(17b-雌二醇，5mg/小丸提供60天的连续释放，得自Innovative Research ofAmerica，Sarasota，USA)置于另一胁腹的皮下。
让肿瘤增长直至在开始治疗前其大小为100-150mm3。然后测定该肿瘤并将其分组(通常n＝6-8)，这些组根据肿瘤体积的平均大小和范围来平衡。
制备和应用该受试化合物将40mg/ml的化合物储备液溶于100％DMSO并在室温下搅拌直至得到澄清的溶液。在每次给药前，往储备液加入10％Tween 80(FLUKA，Buchs，瑞士)，然后用无菌0.9％w/v NaCl或水稀释1∶20(v/v)。每天在用药前制备溶液和稀释液。一周用药7天(p.o.，i.p.，s.c.或i.v.)。用药的体积为p.o.，25 ml/kg，i.p.，25ml/kg，s.c.10ml/kg，i.v.，10ml/kg。
测定肿瘤体积每周和在最后一次治疗的24小时后通过测定垂直直径而测定肿瘤生长，次数为一次、两次或三次(取决于肿瘤系的生长速率)。使用能测定mm距离的测径器。根据式L×D2×π/6计算肿瘤的体积。抗肿瘤活性表示为T/C％(治疗动物的平均肿瘤体积增大除以对照组动物的平均肿瘤体积增大并乘以100)。肿瘤消退(％)代表与起始治疗时的平均肿瘤体积相比的最小平均肿瘤体积。Delta()肿瘤体积比较实验期间肿瘤体积的变化(最后治疗日的-最初治疗日的体积)。将任何肿瘤大小达到大于约1500-2000mm3的动物处死。
其它测定还收集体重和存活数据。计算Delta()体重作为对治疗耐受性的指示(最后治疗日的体重-最初治疗日的体重)。认为统计学上显著的体重损失或死亡率表明对治疗的耐受性差。此外，还每日一次或两次监测小鼠的常规健康状态。
统计学分析基本的统计学分析方法采用多重比较试验以判定治疗组之间的差异以及在治疗诱发稳定的疾病或肿瘤的消退的情况下确定的组内差异的统计学显著性。由于皮下肿瘤体积总是不能正常分布，因此治疗组间的皮下肿瘤体积的差异的测定采用对分级数据的非参数Kruskal-Wallis单向方差分析试验，而治疗组与对照组相比的统计学显著性差异的测定采用Dunnett试验。采用Student Newman-Keuls(SNK)方法进行所有组之间的成对比较。如果只比较两组，则使用Ranksum试验。
动物的体重正常分布，通过成对t检验分析组内的体重变化，并用单向方差分析和采用Tukey试验的的成对比较分析组间的差异。所有的试验的显著性水平设定在p＜0.05。
另一种测定本发明化合物的抗肿瘤活性的体内试验为以下的中空纤维测定中空纤维测定评价在裸鼠上的抗肿瘤活性在该测定中，将封装在中空纤维中的四种不同人肿瘤细胞皮下和/或腹膜内植入到裸鼠上(无胸腺雌性远系繁殖小鼠(Ncr nu/nu))。然后用在适宜的赋形剂中制成的受试化合物治疗，同时单独用赋形剂治疗对照组动物。在实验结束时回收纤维，并采用新陈代谢分析(MTT，3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)来测定存活细胞的数量。通过比较实验动物(T)中的细胞生长和单独用赋形剂处理的对照动物(C)的细胞生长而测定受试化合物的活性，并表示为％T/C。
材料人结肠癌SW620和LS 174T，以及乳腺癌MDA-MB435S得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockyille，USA)。最初从Dana FarberCancer Institute，Boston，USA的患者建立表达高水平pgp-1的结肠癌MIP 101。根据标准组织培养技术所有细胞系在含有以下添加物的RPMI 1640中生长5％FBS(胎牛血清)、5mg/ml胰岛素、5mg/ml转铁蛋白、5ng/ml亚硒酸、1 nM P-雌二醇、1nM睾酮。
测定设计将四种人实体瘤细胞系封装在1mm内径的PVDF(聚偏二氟乙烯)中空纤维(Biopore，Spectrum Medical，CA，USA)中。在封装之后和植入到动物之前，通过在组织培养基中培养24小时使细胞附着在该纤维的内表面。然后将四种中空纤维植入到某一动物的腹膜内或皮下。在实验计划中每组采用4-6只动物，且该实验由最少三组组成1.″时间0″组2.对照(安慰剂)组3.″治疗″(受试化合物)组。
在植入纤维的24小时以后开始治疗。在第1、3、5天每天治疗动物一次。同时在开始治疗时，将″时间0″组的动物处死，回收纤维，并测定实验开始时存活细胞的数量(T0)。在植入7天后将所有动物处死，回收纤维并测定对照组(Cv)和″治疗″组(Tv)存活细胞的数量。然后根据下式计算％T/C
％T/C＝(Tv-T0)/(Cv-T0)×100％将肿瘤细胞封装到中空纤维中将纤维切割成所需长度并在70％乙醇中浸泡至少72小时。然后消毒纤维和用于封装的器具。使在组织培养物中生长的人实体瘤细胞系受胰蛋白酶作用，将其悬浮在少量的培养基中并采用注射器将其转移到纤维。加热密封纤维并于37℃下在含有5％的CO2气氛中温育24小时。然后将该纤维植入到裸鼠的皮下和/或腹膜内。
测定中空纤维中的存活细胞将1gMTT加到200ml PBS(磷酸盐缓冲的盐水)，搅拌20分钟并过滤(0.22微米过滤器)。将10ml的该溶液与40ml的含添加剂的RPMI 1640混合得到MTT工作溶液。37℃下在5％CO2的稳定下在5mlRPMI 1640中温育该纤维。将0.5ml的MTT工作溶液加到试样平皿的每一个孔中。37℃下将该平皿在5％CO2下温育4小时。从试样平皿的每一孔中抽出MTT。将2ml 2.5％的含水鱼精蛋白硫酸盐溶液加到试样平皿的每个孔中。将该平皿在4℃下温育24小时。从试样平皿的每一孔中抽出鱼精蛋白硫酸盐。将2ml的鱼精蛋白硫酸盐加到每一孔中并将该平皿在4℃下进一步温育2-4小时。将每一纤维转移到24孔平皿的孔中。切断纤维以使其存在于该孔的底部并干燥过夜。将250μl的DMSO加到每一孔中。将该平皿放置在配有保护MTT免受光照的盖子的轨道震动器上4小时。将150μl的每一试样转移到96孔平皿的适宜的孔中。在540nm处采用DMSO作为空白孔对该平皿读数。
根据文献已知，基于肽的药物特征性表现为不良的口服生物利用率。这是在研制这种肽结构类的有效药物的一个主要障碍。令人惊奇的是，本发明化合物在口服后表现出优异的生物利用率。这可以如以下的试验所示为进行口服给药，要在适宜的溶剂如Cremophor RH40R/MaisineR/丙二醇/乙醇(38/32/15/15)中制备试验物质的溶液(25mg/ml)。将雌性Balb/c小鼠在试验开始前禁食24小时，并在实验过程中任意给予水。在给药后的各时间，在麻醉下通过切断颈静脉，然后通过宫颈脱位处死动物而获得血样。将试样收集到肝素化管(一般0.4-0.6ml)。为进行试样分析，使用固相提取和HPLC。通过最小平方线性回归分析峰形血液标准对浓度的峰面积率(抑制剂/内部标准)来计算试样中的药物浓度。根据浓度对时间的数据，采用梯形规则计算″曲线下的面积″(AUC)值。
在该试验中，在US 5,538,997中公开的化合物在125mg/kg的剂量时表现出从约25μM.h到约160μM.h的AUC-值。
该试验表明本发明化合物可以用作药物。
本发明特别涉及本发明化合物的用途，其中A和B独立地代表键或氨基酰基部分，它未被取代或被烷基或烷氧基羰基烷基取代；R1代表氢、氨基保护基、或式R5Y-的基团，其中R5代表氢或者未取代或取代的烷基、链烯基、炔基、芳香基、芳烷基、杂芳香基、杂芳烷基、杂环基或杂环基烷基；Y代表-CO-、-NH-CO-、-NH-CS-、-SO2-、-O-CO-、或-O-CS-；R2代表天然氨基酸的侧链、烷基、芳烷基、杂芳烷基或环烷基烷基、或者三甲基甲硅烷基甲基、2-噻吩基甲基或苯乙烯基甲基；R3代表卤素、烷基、烷氧基或羟基烷氧基；R4代表2(R)-羟基2，3-二氢化茚-1(S)-基、(S)-2-羟基-1-苯乙基、或者未被取代或在4位被甲氧基取代的2-羟基-苄基。
本发明特别优选涉及本发明化合物的应用，其中A和B独立地代表键或氨基酰基部分，它未被取代或者被烷基或烷氧基羰基烷基取代；R1代表氢、氨基保护基、或式R5Y-的基团，其中R5代表氢或者未取代或取代的烷基、链烯基、炔基、芳香基、芳烷基、杂芳香基、杂芳烷基、杂环基或杂环烷基，和Y代表-CO-、-NH-CO-、-NH-CS-、-SO2-、-O-CO-、或-O-CS-；
R2代表芳烷基；R3代表卤素、烷基、烷氧基或羟基烷氧基；R4代表未被取代或在4位被甲氧基取代的2-羟基苄基。
而且，本发明优选涉及本发明化合物用途，其中A和B独立地代表未被取代或者被C1-C4烷基或C1-C4烷氧基羰基C1-C4烷基取代的氨基酰基部分；R1代表氢或式R5Y-的基团，其中R5代表氢；未被取代或被苯氧基、羟基或氨基取代的C1-C4烷基；C2-C4链烯基、C2-C4炔基、C6-C10芳香基、未被取代或被羟基、C1-C4烷基、氨基或C1-C4烷基氨基取代的C7-C12芳烷基、；吡啶基C1-C4烷基，而Y代表-O-CO-或-CO-；R2代表C7-C12芳烷基；R3代表卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或羟基C1-C4烷氧基；R4代表未被取代或在4位被甲氧基取代的2-羟基苄基。
更优选，本发明涉及本发明化合物的用途，其中A和B独立地代表未被取代或者被C1-C4烷基或C1-C4烷氧基羰基C1-C4烷基取代的氨基酰基部分；R1代表氢或式R5Y-的基团，其中R5代表氢；未被取代或被苯氧基、羟基或氨基取代的C1-C4烷基；C2-C4链烯基、C2-C4炔基、C6-C10芳香基；未被取代或被羟基、C1-C4烷基、氨基或C1-C4烷基氨基取代的C7-C12芳烷基；吡啶基C1-C4烷基；Y代表-O-CO-或-CO-；R2代表C7-C12芳烷基；R3代表C1-C4烷氧基；R4代表在4位被甲氧基取代的2-羟基苄基。
在本发明的优选实施方案中，该温血动物为人。
在本发明的进一步优选的实施方案中，该治疗学有效剂量抑制肿瘤的细胞增殖。
优选的本发明化合物的亚组为上述的式I的化合物，其中R4为2-羟基苄基或优选2-羟基4-甲氧基苄基。
本发明特别涉及式I*的本发明化合物， 其中A和B独立地代表未取代或取代的氨基酰基部分；R2代表芳香基烷基；R3代表卤素、烷基、烷氧基或羟基烷氧基；R4代表未被取代或者在4位被甲氧基取代的2-羟基-苄基；R5代表芳烷基而Y代表-CO-；或R5代表被环烷基、萘基、吡啶基或苯基取代的烷基，其中苯基被烷基或氨基取代，而Y代表-O-CO-。
式I*的本发明化合物优选如下的化合物，其中A和B独立地代表L-叔-亮氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸甲基酯或甘氨酸；R2代表芳基烷基；R3代表烷氧基；R4代表2-羟基-4-甲氧基苄基；R5代表芳烷基而Y代表-CO-；或R5代表被环烷基、萘基、吡啶基或苯基取代的烷基，其中苯基被烷基或氨基取代，而Y代表-O-CO-。
式I*的本发明化合物最优选如下的化合物，其中
A和B独立地代表L-叔-亮氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸甲基酯或甘氨酸；R2代表C7-C12芳基烷基；R3代表C1-C4烷氧基；R4代表2-羟基-4-甲氧基苄基；R5代表C7-C12芳基烷基而Y代表-CO-；或R5代表被C5-C7环烷基、萘基、吡啶基或苯基取代的C1-C4烷基，其中苯基被C1-C4烷基或氨基取代，而Y代表-O-CO-。
本发明的另一优选的实施方案涉及以下化合物之一或这些化合物之一的药学上可接受的盐的用途{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2-甲基-丙基}-氨基甲酸苄基酯；N-{4(S)-[N-苄氧基羰基-叔亮氨酰基]氨基}-3-(S)-羟基-2(R)-(4-甲氧基苄基-氨基)-5-苯基}戊酰基-L-缬氨酸-N-[(2-羟基-4-甲氧基)苄基]酰胺；或{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸叔丁基酯。
进一步地，本发明涉及选自以下的化合物4-[4-(2-苄氧基羰基氨基-3-甲基-丁酰氨基)-3-羟基-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-5-苯基-戊酰氨基]-4-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-丁酸甲基酯；{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基-氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸萘-1-基甲基酯；{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸萘-2-基甲基酯；
{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸吡啶-4-基甲基酯；{[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-甲基}-氨基甲酸苄基酯；或{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2，2-二甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸苄基酯；4-[3，3-二甲基-2-(2-萘-1-基-乙酰氨基)-丁酰氨基]-3-羟基-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-5-苯基-戊酸[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基-氨基甲酰基)-2-甲基-丙基]-酰胺；{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸3-甲基苄基酯；4-{2-[3-(3-氨基-苯基)-丙酰氨基]-3，3-二甲基-丁酰氨基}-3-羟基-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-5-苯基-戊酸[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基]-酰胺；{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸3-氨基-苄基酯；{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基-氨基甲酰基)-2-甲基丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}氨基甲酸3，5-二甲基-苄基酯；或这些化合物的药学上可接受的盐。
在本发明的更为优选的实施方案中，本发明涉及4-[4-(2-苄氧基羰基氨基-3-甲基-丁酰氨基)-3-羟基-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-5-苯基-戊酰氨基]-4-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-丁酸甲基酯或该化合物的药学上可接受的盐。
进一步地，本发明特别涉及用在人或动物体的治疗方法中的选自以下的化合物或这些化合物的药学可接受的盐4-[4-(2-苄氧基羰基氨基-3-甲基-丁酰氨基)-3-羟基-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-5-苯基-戊酰氨基]-4-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-丁酸甲基酯；{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基-氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸萘-1-基甲基酯；{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸萘-2-基甲基酯；{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸吡啶-4-基甲基酯；{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-甲基}-氨基甲酸苄基酯；{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2，2-二甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸苄基酯；和{1-[(1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸环己基甲基酯；本发明特别涉及一种治疗患有增殖性疾病，特别是肿瘤疾病，尤其是对多催化蛋白酶体复合物的抑制应答的疾病的温血动物，特别是人的方法，该方法包括给予需要这种治疗的温血动物一定数量的有效抑制肿瘤的本发明化合物；或者本发明涉及本发明化合物用于这种治疗的用途。进一步地，本发明涉及本发明化合物治疗增殖性疾病的用途。本发明还涉及本发明化合物在抑制温血动物，尤其是人身上的多催化蛋白酶体复合物的用途。
本发明化合物可与常规的化学治疗上可接受的稀释剂和载体混合，并通过肠道外或静脉内给药，优选以溶液、片剂或胶囊的形式口服。活性物质的浓度当然取决于所用的本发明化合物、期望的治疗和剂型的性质。
这些组合物构成本发明的一部分。因此本发明还涉及包括式I*的本发明化合物和药用载体的组合物，特别用于治疗增殖性疾病，更特别是用于人或动物体的治疗。
可以通过配制本发明的药剂与包括亲水相、亲脂相和表面活性剂的载体而获得提供高吸收率和药物装载量的口服用稳定组合物。该组合物的优选剂型为″微乳剂预浓缩物″或″乳剂预浓缩物″，特别是提供o/w(水包油)型的微乳剂或乳剂。但是，该组合物可以是额外含有含水相，优选水的微乳剂或乳剂的剂型。″微乳剂预浓缩物″是一种自发地在含水介质中例如在水中或在口服后的胃液中形成微乳剂的制剂。″微乳剂″是一种当其组分发生接触时自发或基本上自发地形成的不透明的或基本上不透明的胶体分散体。微乳剂是热力学稳定的。
″乳剂预浓缩物″是一种在含水介质中如在水中或在口服后的胃液中自发形成乳剂的制剂。所形成的乳剂为透明的和热力学稳定的。其亲脂相约占载体介质重量的10-85％；其表面活性剂约占载体介质重量的5-80％o；亲水相约占载体介质重量的10-50％。
本发明化合物优选存在量约为该组合物重量的1-15％，更优选约为2-8％。
亲水相可以选自如Transcutol(C2H5-[O-(CH2)2]2-OH)、Glycofurol(还已知作为四氢喃甲基醇聚乙二醇醚)和1，2-丙二醇，或它们的混合物，并且它优选1，2-丙二醇。它可以进一步包括亲水性共有组分如C1-C5阿卡诺尔。
优选的亲脂相组分为中等链脂肪酸甘油三酯、混合的单、双、三甘油酯和酯交换的乙氧基化植物油。适宜的中等链脂肪酸甘油三酯是已知的且可以根据商品名Miglyol、Captex、Captex、Neobee和Mazol而商购得到；最优选Miglyol 812。混合的单、双、三甘油酯优选含有C12-20脂肪酸单、双和三甘油酯的混合物。该混合的单、双和三甘油酯可以含有饱和与不饱和脂肪酸残基。酯交换的乙氧基化植物油包括如杏仁油、棕榈油或优选的玉米油、向日葵油或红花油和最优选的玉米油与甘油的酯交换产物。除单、双和三甘油酯组分以外，该酯交换产物一般还包括较少量的游离甘油。优选首先除去其中一些甘油以在要制备软胶囊时得到“基本上不含甘油的批料”。
玉米油和甘油的酯交换产物特别提供了适宜混合的单、双和三甘油酯。适宜混合的甘油酯产物的实例为根据商品名Maisine[购自Etablissements Gattefoss é，69804 Saint-Priest，Cedex(法国)]而商购得到。Maisine的脂肪酸含量一般为约11％棕榈酸、约2.5％硬脂酸、约29％油酸、约56％亚油酸和1.5％的其它酸。
如果本发明药剂的给药形式为微乳剂或乳剂，则优选混合的单、双和三甘油酯为澄清的并且在20℃-25℃的温度下储藏时保持至少20天的澄清。而且，单、双，和三甘油酯的试样在约2℃-8℃的冷藏库中保存24小时，随后在室温下保存1小时后应该是澄清的。而且单、双、三甘油酯优选具有低饱和脂肪酸含量。可以采用现有技术中已知的分离技术除去饱和脂肪酸组分并提高不饱和脂肪酸组分含量而由商购的产物获得符合这些要求的混合的单、双、三甘油酯。一般总饱和脂肪酸组分的重量小于亲脂相总重的15％。适宜的方案如在WO 93/09211中所述。
该亲脂相可选择含有适宜的酯交换的乙氧基化植物油如通过各种天然植物油与分子量为200-800的聚乙二醇在适宜的催化剂下反应而得到的物质。该方法是已知的，它的一个实例如在US Patent 3 288 824中所述。特别优选酯交换的乙氧基化玉米油。优选的酯交换的乙氧基化植物油为Labrafil M 2125 CS。
适宜的表面活性剂的实例为i)天然或氢化的海狸油和氧化乙烯的反应产物。根据商品名Cremophor而购得的油特别合适。特别适宜的为Cremophor RH 40和Cremophor RH60。还适宜为聚乙二醇海狸油如根据商品名Cremophor EL而获得。可使用的类似或相同的产物可以根据商品名Nikkol、Mapeg、Incrocas和Tagat获得。
ii)聚氧乙烯-脱水山梨糖醇-脂肪酸酯，如已知类型的和根据商品名名Tween而获得的酯。
iii)聚氧乙烯脂肪酸酯，如已知类型的和根据商品名Myrj而获得的聚氧乙烯硬脂酸。
iv)聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和嵌段共聚物，如已知类型的和根据商品名Pluronic，Emkalyx和Poloxamer，特别优选PluronicF68和Poloxamer 188而商购得到的该共聚物。
v)二辛基磺基琥珀酸酯或二-[2-乙基己基]-琥珀酸酯。
vi)磷脂，特别是卵磷脂。
vii)丙二醇单和双脂肪酸酯。
优选的表面活性剂的HLB(亲水/亲脂平衡)至少为10。
可以从以下文献中获知这里以商路引用的产品的完整的物理特征如H.P.Fiedler，″Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie，Kosmetik und Angrenzende Gebiete″，Editio Cantor，D-7960Aulendorf，Germany，第三次修订和扩展编辑(1989)。优选的亲水相组分、亲脂相和表面活性剂的相对比例处于标准三路图案(three wayplot)的“微乳剂”区的范围内。如此得到的组合物为高稳定性的微乳剂预浓缩物。
可以其它方式选择这些组分以提供乳剂预浓缩物。乳剂预浓缩物组合物还表现出良好的稳定特征。
该药物组合还可以进一步包括添加剂或成分，例如抗氧剂。它们在口服给药时表现出特殊的优良性能，例如在稠度和在标准生物利用率试验中获得的高水平生物利用率方面。药代动力学参数如吸收度和血液浓度还可以变得令人惊奇地更为可预测性并且可以消除或减少具有不稳定吸收给药中的问题。此外，该药物组合物对表面活性剂(tenside)材料如存在于胃肠道中的胆汁盐有效。
口用药物组合物优选以单元剂型复合，如将它们填充到可口服的胶囊壳中。该胶囊壳可以是软或硬的凝胶胶整壳。但是，如果需要，该药物组合物可以是饮用溶液的形式，并可以包括水或任何其它含水体系以提供适于饮用的乳剂或微乳剂体系。
本发明化合物良好地耐受在本发明的用途和方法中所需的剂量。根据种族、年龄、个体条件、给药方式和特定的临床图象、有效剂量，将日剂量约0.05-10g，优选约0.1-5g如0.15g-1.5g的本发明化合物给予约70kg体重的温血动物。
本发明特别涉及本发明化合物，尤其是式I*的本发明化合物在制备治疗增殖性疾病如实体瘤的药物组合物中的用途以及它们用于治疗这种增殖性疾病的用途。
权利要求
1.式I的2，4-二氨基-3-羟基羧酸以其游离的形式或者以药学上可接受的盐或配合物的形式用于制备治疗增殖性疾病的药物组合物的用途 其中A和B独立地代表键或者未取代或取代的氨基酰基部分；R1代表氢、氨基保护基或式R5Y-的基团，其中R5代表氢或者未取代或取代的烷基、链烯基、炔基、芳香基、芳烷基、杂芳香基、杂芳烷基、杂环基或杂环基烷基，而Y代表-CO-、-NH-CO-、-NH-CS-、-SO2-、-O-CO-或-O-CS-；R2代表天然氨基酸的侧链、烷基、芳烷基、杂芳烷基或环烷基烷基或三甲基甲硅烷基甲基、2-噻吩基甲基或苯乙烯基甲基；R3代表卤素、烷基、烷氧基或羟基烷氧基；和R4代表2(R)-羟基2，3-二氢化茚-1(S)-基、(S)-2-羟基-1-苯乙基或者未被取代或在4位被甲氧基取代的2-羟基苄基。
2.根据权利要求1的式I的2，4-二氨基-3-羟基羧酸的用途，其中A和B独立地代表键或氨基酰基部分，它未被取代或者被烷基或烷氧基羰基烷基取代；R1代表氢、氨基保护基或式R5Y-的基团，其中R5代表氢或者未取代或取代的烷基、链烯基、炔基、芳香基、芳烷基、杂芳香基、杂芳烷基，杂环基或杂环基烷基；Y代表-CO-、-NH-CO-、-NH-CS-、-SO2-、-O-CO-或-O-CS-；R2代表天然氨基酸的侧链、烷基、芳烷基、杂芳烷基或环烷基烷基、或者三甲基甲硅烷基甲基、2-噻吩基甲基或苯乙烯基甲基；R3代表卤素，烷基，烷氧基或羟基烷氧基；R4代表2(R)-羟基2，3-二氢化茚-1(S)-基、(S)-2-羟基-1-苯乙基或者未被取代或在4位被甲氧基取代的2-羟基苄基。
3.根据权利要求1的式I的2，4-二氨基-3-羟基羧酸的用途，其中A和B独立地代表键或氨基酰基部分，它未被取代或者被烷基或烷氧基羰基烷基取代；R1代表氢、氨基保护基或式R5Y-的基团，其中R5代表氢或者未取代或取代的烷基、链烯基、炔基、芳香基、芳烷基、杂芳香基、杂芳烷基，杂环基或杂环基烷基；Y代表-CO-、-NH-CO-、-NH-CS-、-SO2-、-O-CO-或-O-CS-；R2代表芳烷基；R3代表卤素、烷基、烷氧基或羟基烷氧基；和R4代表未被取代或在4位被甲氧基取代的2-羟基苄基。
4.根据权利要求1的式I的2，4-二氨基-3-羟基羧酸的用途，其中A和B独立地代表未被取代或者被C1-C4烷基或C1-C4烷氧基羰基C1-C4烷基取代的氨基酰基部分；R1代表氢或式R5Y-的基团，其中R5代表氢、未被取代或者被苯氧基、羟基或氨基取代的C1-C4烷基；C2-C4链烯基、C2-C4炔基、C6-C10芳香基、未被取代或者被羟基、C1-C4烷基、氨基或C1-C4烷基氨基取代的C7-C12芳烷基；吡啶基C1-C4烷基；和Y代表-O-CO-或-CO-；R2代表C7-C12芳烷基；R3代表卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或羟基C1-C4烷氧基；R4代表未被取代或在4位被甲氧基取代的2-羟基苄基。
5.根据权利要求1的式I的2，4-二氨基-3-羟基羧酸的用途，其中A和B独立地代表未被取代或者被C1-C4烷基或C1-C4烷氧基羰基C1-C4烷基取代的氨基酰基部分；R1代表氢或式R5Y-的基团，其中R5代表氢；未被取代或被苯氧基、羟基或氨基取代的C1-C4烷基；C2-C4链烯基、C2-C4炔基、C6-C10芳香基、未被取代或者被羟基、C1-C4烷基、氨基或C1-C4烷基氨基取代的C7-C12芳烷基；吡啶基C1-C4烷基；而Y代表-O-CO-或-CO-；R2代表C7-C12芳烷基；R3代表C1-C4烷氧基；R4代表在4位被甲氧基取代的2-羟基苄基。
6.一种治疗温血动物，包括人的方法，其中给予患有增殖性疾病的温血动物治疗有效剂量的式I的2，4-二氨基-3-羟基羧酸，式I中的符号和取代基的含义由权利要求1给出，药物的形式为游离形式或药学上接受的盐或配合物的形式。
7.权利要求6的方法，其中该治疗有效剂量抑制了肿瘤内的细胞增殖。
8.式1*的化合物， 其中A和B独立地代表未取代或取代的氨基酰基部分；R2代表芳烷基；R3代表卤素、烷基、烷氧基或羟基烷氧基；R4代表未被取代或者在4位被甲氧基取代的2-羟基-苄基；R5代表芳烷基；Y代表-CO-；或R5代表被环烷基、萘基、吡啶基或苯基取代的烷基，其中苯基被烷基或氨基取代；Y代表-O-CO-；或其药学上可接受的盐。
9.根据权利要求8的式I*的化合物，其中A和B独立地代表L-叔-亮氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸甲基酯或甘氨酸；R2代表芳基烷基；R3代表烷氧基；R4代表2-羟基-4-甲氧基苄基；R5代表芳基烷基；Y代表-CO-；或R5代表被环烷基、萘基、吡啶基或苯基取代的烷基，其中苯基被烷基或氨基取代；Y代表-O-CO-；或其药学上可接受的盐。
10.根据权利要求8的式I*的化合物，其中A和B独立地代表L-叔-亮氨酸，L-缬氨酸，L-谷氨酸甲基酯或甘氨酸；R2代表C7-C12芳基烷基；R3代表C1-C4烷氧基；R4代表2-羟基-4-甲氧基苄基；R5代表C7-C12芳基烷基；Y代表-CO-；或R5代表被C5-C7环烷基、萘基、吡啶基或苯基取代的C1-C4烷基，其中苯基被C1-C4烷基或氨基取代；Y代表-O-CO-；或其药学上可接受的盐。
11.根据权利要求8的式I*的化合物，选自以下化合物4-[4-(2-苄氧基羰基氨基-3-甲基-丁酰氨基)-3-羟基-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-5-苯基-戊酰氨基]-4-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-丁酸甲基酯；{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基-氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸萘-1-基甲基酯；{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸萘-2-基甲基酯；{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸吡啶-4-基甲基酯；{[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-甲基}-氨基甲酸苄基酯；{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2，2-二甲基-丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸苄基酯；和这些化合物的药学上可接受的盐。
12.根据权利要求8的式I*的化合物，它是4-[4-(2-苄氧基羰基氨基-3-甲基-丁酰氨基)-3-羟基-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-5-苯基-戊酰基氨基]-4-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-丁酸甲基酯或该化合物的药学上可接受的盐。
13.根据权利要求8的式I*的化合物，选自以下化合物4-[3，3-二甲基-2-(2-萘-1-基-乙酰氨基)-丁酰氨基]-3-羟基-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-5-苯基-戊酸[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基-氨基甲酰基)-2-甲基-丙基]-酰胺；{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸3-甲基苄基酯；4-{2-[3-(3-氨基-苯基)-丙酰氨基]-3，3-二甲基-丁酰氨基}-3-羟基-2-(4-甲氧基-苄基氨基)-5-苯基-戊酸[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基]-酰胺；{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸3-氨基-苄基酯；{1-[1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基-氨基甲酰基)-2-甲基丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基}-氨基甲酸3，5-二甲基-苄基酯；{1-[(1-苄基-2-羟基-3-[1-(2-羟基-4-甲氧基-苄基氨基甲酰基)-2-甲基丙基氨基甲酰基]-3-(4-甲氧基-苄基氨基)-丙基氨基甲酰基]-2，2-二甲基-丙基]-氨基甲酸环己基甲基酯；和这些化合物的药学上可接受的盐。
14.根据权利要求8的式I*的化合物或该化合物的药学上可接受的盐，用于治疗人或动物体。
15.一种含有权利要求8的式I*的化合物或该化合物的药学上可接受的盐以及药用载体的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及式(I)的2,4－二氨基－3－羟基羧酸在制备治疗增殖性疾病如实体瘤的药物组合物中的新用途,其中A和B独立地代表键或者未取代或取代的氨基酰基部分;R
文档编号C07C271/22GK1351587SQ00807741
公开日2002年5月29日 申请日期2000年4月25日 优先权日1999年4月27日
发明者D·弗朗斯, P·弗斯特, J·齐默尔曼, C·加西亚－埃克福里亚, D·肖尔茨, P·福里特, P·伊姆巴克 申请人:诺瓦提斯公司