高脂血症的治疗或预防剂的检验方法

专利名称：高脂血症的治疗或预防剂的检验方法
技术领域：
本发明涉及高脂血症的治疗或预防剂的新型检验方法，该方法中使用的核酸探针、引物和抗体。
背景技术：
最近，随着饮食结构的改变，脂肪和胆固醇的过量摄取导致的高脂血症患者明显增多。高脂血症是血清脂质，即胆固醇、中性脂肪(甘油三酯，TG)、磷脂、游离脂肪酸等的血清浓度增高的疾病，并且是导致动脉硬化症的重要危险因子。进而招致高血压、心绞痛和心肌梗塞之类的冠状动脉硬化症，脑梗塞等并发症的可能性增高。
迄今为止，已报道了多个具有抗高脂血症作用的化合物，但其中的大部分是通过化学方法合成的物质，因此在其性质上不可能避免连续使用时产生的种种负作用。
另一方面，目前市售的普伐他汀钠(pravastatin Sodium)是一种来自微生物代谢产物的强有力的高脂血症治疗剂，其作用是胆固醇生物合成体系中的限速酶HMG-CoA还原酶的抑制剂。类似于此，如果可以鉴定出存在于生物体内的高脂血症相关蛋白质或其编码基因，则可开发出通过直接抑制其功能或通过对其表达进行调控等消除了负作用(或减少了负作用)，且更有效的高脂血症治疗剂，但对于这种与高脂血症发作密切相关的基因还无从了解。
另一方面，本发明方法中使用的核酸探针的相同序列已作为编码“血管生成因子相关蛋白质3”的核苷酸序列公开在Genbank数据库中，并且在国际专利申请公开WO99/55869号公报中同一核苷酸序列又作为编码“zalpha5”的基因公开，但对于具有这些核苷酸序列的基因与高脂血症的关系还完全不知晓。因此，对于编码“血管生成因子相关蛋白质3”乃至“zalpha5”的核苷酸序列的一部分可用于高脂血症的治疗或预防剂检验也不知晓。
即，本发明的目的在于，提供可用于高脂血症的治疗或预防剂检验的新型方法，以及该方法中使用的核酸探针、引物或抗体。
发明的公开本发明人等以寻找高脂血症的治疗或预防剂的靶基因为目的，通过将先天性低脂血症小鼠的基因与高脂血症小鼠的基因进行比较，对高脂血症的病原基因在染色体上的位置进行了悉心研究，结果在鉴定高脂血症小鼠中高效表达的基因方面取得了成功。同源性检索的结果表明，该基因的cDNA已作为编码“血管生成因子相关蛋白质3”的核苷酸序列公开在Genbank数据库中，但本发明人等发现将具有该核苷酸序列的基因在低脂血症小鼠中强制表达时，血液中的中性脂肪浓度上升，进而明确了该基因具有以往未见报道的新型功能。由此，成功地创立了利用将该核苷酸序列或其一部分作为探针或引物的基因表达检测体系的、高脂血症的治疗或预防剂的新型检验方法。并且，通过制备该核苷酸序列编码多肽的特异性抗体，创立了利用将该抗体用于检测该多肽产量的实验体系的、高脂血症的治疗或预防剂的新型检验方法。进而，通过制作将该核苷酸序列导入到实验动物中的模型动物，成功地创立了利用该模型动物的高脂血症治疗或预防剂的新型检验方法，从而完成了本发明。
第一，本发明涉及包括下述步骤的、检验物质作为高脂血症的治疗或预防剂的效果的方法。1)将培养细胞在待测物质存在下或非存在下进行培养；2)检测由上述1)得到的培养细胞中，具有下述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列(其中，序列中的t改为读作u)的mRNA的表达量；a)序列表序列号1的核苷酸序号47至1411所示的核苷酸序列；b)序列表序列号3的核苷酸序号78至1457所示的核苷酸序列；c)插入到转化大肠杆菌E.coli pBK/m55-1 SANK 72199(FERM BP-6490)携有的噬菌体粒子中的DNA所具有的核苷酸序列；d)插入到转化大肠杆菌E.coli pTrip/h55-1 SANK 72299(FERM BP-6491)携有的噬菌体粒子中的DNA所具有的核苷酸序列；e)在严格条件下与由上述a)乃至d)任一项所述核苷酸序列的反义序列构成的多核苷酸杂交，并编码具有可使血中的中性脂肪浓度上升的活性的多肽的核苷酸序列；以及3)比较上述步骤2)的结果，即，比较在待测物质非存在下培养的细胞和待测物质存在下培养的细胞之间检测出的mRNA表达量。
优选上述培养细胞来自于肝脏(初代培养肝细胞等)，并优选来自于灵长类或啮齿类动物。更优选来自于人、小鼠、大鼠或仓鼠的细胞，但本发明不限于此。
上述方法中，作为检测mRNA表达量的方法，优选Northern blot、斑点印迹(dot blot)或狭线印迹(slot blot)、RT-PCR、核糖核酸酶保护分析、连缀转录分析(run on assay)、DNA芯片分析、DNA微阵列分析、或定量PCR方法等，但本发明不限于此。
第二，本发明涉及具有与可用于上述方法中的核酸探针，即，与含有上述a)乃至d)任一项所述核苷酸序列(其中，序列中的t改为读作u)的mRNA在严格条件下杂交的核苷酸序列的多核苷酸(其中，含有下述a)乃至d)所述核苷酸序列的除外)。并且，序列表序列号1的核苷酸序号47至1411所示核苷酸序列的一侧或两侧末端缺失了1个核苷酸或2个核苷酸以上且至少由15个核苷酸组成的DNA，或序列表序列号3的核苷酸序号78至1457所示核苷酸序列的一侧或两侧末端缺失了1个核苷酸或2个核苷酸以上且至少由15个核苷酸组成的DNA也都可以优选用作上述方法中的核酸探针。
第三，本发明涉及包括下述步骤的、检验物质作为高脂血症的治疗或预防剂的效果的方法，以及可用于下述步骤2)中的抗体。1)将培养细胞在待测物质存在下或非存在下进行培养；2)利用可特异识别下述多肽的抗体检测上述1)得到的培养细胞上清中，由上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列编码的氨基酸序列或其一部分构成的多肽的产量；以及3)比较上述步骤2)的结果，即，比较在待测物质非存在下培养的细胞和待测物质存在下培养的细胞之间检测出的多肽量。
此方法中，可特异识别由上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列编码的氨基酸序列或其一部分构成的多肽的抗体，优选可特异识别由序列表序列号2的氨基酸序号17-455所示氨基酸序列构成的多肽或其一部分、由序列表序列号2的氨基酸序号19-455所示氨基酸序列构成的多肽或其一部分、或由序列表序列号4的氨基酸序号17-460所示氨基酸序列构成的多肽或其一部分的抗体，更优选可特异识别序列表序列号9的氨基酸序号1-13所示的氨基酸序列或序列表序列号10的氨基酸序号1-14所示的氨基酸序列的抗体。
此外，上述步骤2)中作为用抗体进行检测的方法，优选Westernblot、斑点印迹或狭线印迹、固相酶免疫定量法(ELISA法)或放射性同位素免疫定量法(RIA法)，但本发明并不局限于此。
第四，本发明涉及包括上述抗体的、检验高脂血症的治疗或预防剂的试剂盒。
第五，本发明涉及包括下述步骤的、检验物质作为高脂血症的治疗或预防剂的效果的方法。1)将待测物质投给通过基因操作得到的、将含有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的外源基因以可高效表达该基因的方式导入的非人动物；以及2)测定1)的动物血中的中性脂肪浓度。
此方法中，上述步骤1)的非人动物优选为小鼠，但本发明并不局限于此。并且，作为将外源基因导入步骤1)所述的非人动物中的方法，优选将含有整合了该基因的腺病毒载体的腺病毒感染该动物的方法，但本发明并不局限于此。
第六，本发明涉及由序列表序列号3的核苷酸序号78-1457所示核苷酸序列中连续的15个乃至30个核苷酸构成的核苷酸序列的反义DNA或RNA序列，以及含有该DNA或RNA作为有效成分的高脂血症治疗剂。
即，本发明提供将具有序列表序列号1或序列号3中所示核苷酸序列、并参与哺乳动物血液中中性脂肪浓度调节的基因的表达作为指标检验待测物质作为高脂血症的治疗或预防剂的效果的方法，该方法中使用的核酸探针、引物及抗体，以及具有序列表序列号3中所示核苷酸序列的DNA的反义核酸分子。
本发明中，“在严格条件下杂交”是指在市售的杂交溶液ExpressHyb Hybridization Solution(Clontech公司制)中68℃进行杂交，或在与上述条件同等的条件下进行杂交。
具体来说，本发明的方法例如是将具有序列表序列号1中核苷酸序号47至1411所示核苷酸序列或序列表序列号3中核苷酸序号78至1457所示核苷酸序列的基因、或编码与上述基因编码的多肽具有相同活性的多肽的基因的表达，通过该核酸(mRNA)或该多肽的特异性检测进行测定，进而筛选可降低该基因表达量的待测物质作为高脂血症的治疗或预防剂的候选物质的方法。以下，通过核酸的检测方式以及多肽的检测方式两部分内容对本发明进行说明。(A)核酸的检测1)探针进行核酸的检测时，核酸杂交方法中使用的探针是DNA或RNA，其核苷酸序列可以是与具有下述a)乃至e)中任一序列(其中，序列中的t改为读作u)的多核苷酸在严格条件下杂交的核苷酸序列。a)序列表序列号1中核苷酸序号47至1411所示的核苷酸序列；b)序列表序列号3中核苷酸序号78至1457所示的核苷酸序列；c)插入到转化大肠杆菌E.coli pBK/m55-1 SANK 72199(FERM BP-6490)携有的噬菌体粒子中的DNA所具有的核苷酸序列；d)插入到转化大肠杆菌E.coli pTrip/h55-1 SANK 72299(FERM BP-6491)携有的噬菌体粒子中的DNA所具有的核苷酸序列；e)在严格条件下与具有上述a)乃至d)任一项所述核苷酸序列的反义序列的多核苷酸杂交，并编码具有可使血中的中性脂肪浓度上升的活性的多肽的核苷酸序列。
例如，具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的反义序列的多核苷酸，具有该反义序列中连续的且至少由15个核苷酸构成的部分序列的多核苷酸，或该反义序列的改变体等，以及通过与具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交，进而可特异检测该多核苷酸的核苷酸序列均可在本发明的方法中使用。这些核苷酸序列中，具有上述a)所述核苷酸序列的反义序列的多核苷酸，例如可以将序列表序列号1所示的核苷酸序列信息为基础，从小鼠肝脏cDNA文库中通过已知的方法，例如噬菌斑杂交法、菌落杂交法或PCR法等克隆出cDNA克隆，并用已知的方法直接标记，或将该cDNA作为模板并在应用聚合酶反应的复制或转录反应中进行标记，进而以标记探针的形式得到。并且，具有上述b)所述核苷酸序列的反义序列的多核苷酸，例如可以将序列表序列号3所示的核苷酸序列信息为基础，从人肝脏cDNA文库中通过同样的操作克隆出cDNA克隆，进而得到标记探针。另一方面，具有上述c)或d)所述核苷酸序列的反义序列的多核苷酸，例如可以从保藏在日本国茨城县筑波市东1丁目1-3号工业技术院生命工学工业技术研究所，国际保藏日期为1999年11月19日，保藏编号为FERM BP-6940或FERM BP-6941的转化大肠杆菌E.colipBK/m55-1 SANk 72199株或E.coli pTrip/h55-1 SANK 72299株携有的噬菌体粒子中获得。
此外，具有上述e)所述核苷酸序列的反义序列的多核苷酸，例如可以将通过上述步骤得到的具有上述a)乃至d)所述核苷酸序列的反义序列的多核苷酸作为探针，通过噬菌斑杂交法或菌落杂交法从任一哺乳动物的cDNA文库(优选肝脏cDNA文库)中进行克隆，进而从分离的cDNA克隆获得。
再者，具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的反义序列中连续的且至少由15个核苷酸构成的部分序列的多核苷酸，如果是数十个核苷酸程度的序列，就可以通过化学合成来得到。或者，也可以将通过上述步骤得到的具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的cDNA克隆中的任一部分序列通过PCR等亚克隆后，利用与上述同样的方法调制成具有反义序列的探针。
例如，即使是在序列表序列号1所述核苷酸序列的反义序列中连续的且由数十个核苷酸构成的部分序列中附加、缺失和/或附加数个核苷酸的核苷酸序列构成的多核苷酸，只要与上述a)乃至e)任一项所述多核糖核苷酸在严格条件下杂交，就可在本发明的方法中使用。上述多核苷酸可以通过利用化学合成法或聚合酶链反应(以下，称作“PCR”)等的本发明所属技术领域中已知的诱变法进行制备。
本发明方法中使用的探针可以由单一的核苷酸序列构成，对此没有特殊的限制。即，本发明的方法中，可以用满足上述要素的多种核苷酸序列的混合物作为探针，也可以分别单独利用上述多种核苷酸序列进行多重检测。2)RT-PCR用引物本发明中进行核酸的检测的另外一种方式为，首先进行以mRNA为模板的逆转录酶反应后，进行PCR并特异扩增DNA片段，即，进行RT-PCR的方法。此方法中，为了特异扩增目的核苷酸序列，使用与mRNA中特定的部分序列互补的反义引物，以及与由该反义引物并通过逆转录酶反应生成的cDNA序列中特定的部分序列互补的有义引物。
可用于逆转录酶及PCR两者的反义引物，实质上由上述a)乃至e)所述核苷酸序列的反义序列中连续的且至少为18个核苷酸，优选至少为23个核苷酸的核苷酸序列构成。
另一方面，PCR中使用的有义引物的序列，由上述a)乃至e)所述核苷酸序列中、相当于上述反义引物的互补链的序列中存在于比最靠近5’末端侧还要靠近5’末端侧区域的序列中的连续且至少为18个核苷酸，优选至少为21个核苷酸的任一部分序列构成。但是，有义引物与反义引物间存在相互互补的序列时，由于引物彼此间的配对，将扩增出非特异性的序列并有可能干扰特异基因的检测，所以优选设计出避免产生类似于上述组合的引物。
这些反义引物及有义引物均可以在上述规定的那些核苷酸序列的5’末端附加与上述a)乃至e)所述核苷酸序列无关的核苷酸序列作为接头。但是，为了不干扰特异基因的检测，上述接头优选为在反应中不与反应液内核酸产生非特异配对的核苷酸序列。3)检测基因表达的细胞或动物可用于本发明方法中的培养细胞，只要是表达具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的基因的哺乳动物细胞即可。优选来自哺乳动物肝脏的培养细胞(优选初代培养肝细胞)，但也可以使用例如将具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的基因与其启动子区域一起导入的细胞等人工进行转化的细胞(例如，CHO细胞)。作为哺乳动物种，优选人、小鼠、大鼠或仓鼠，更优选人或小鼠，进而作为优选的细胞，例如高脂血症小鼠KK小鼠(可由日本Kurea公司购得)的初代培养肝细胞，但不仅限于此。另外，可判断为比使用培养细胞更适合的情况下，也可采用将待测物质投给哺乳动物个体，然后检测从该动物个体摘出的其脏器或组织细胞中具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的基因的表达的方法。此时，作为基因表达检测对象的脏器或组织可以是表达具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的基因的脏器或组织，但优选肝脏。此实施方式中优选的哺乳动物种为人、小鼠、大鼠或仓鼠，更优选人或小鼠。例如作为小鼠可以优选使用上述KK小鼠，但本发明并不局限于此。
可用于本发明方法中的培养细胞，只要是可表达具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的基因的条件(未添加待测物质)，即可在任一条件下进行培养。例如，针对该培养细胞确立的培养条件为已知，且在该条件下该细胞表达具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的基因时，即可在该条件下进行培养。4)待测物质的添加上述细胞的培养过程中，将待测物质添加到培养基中并培养一定期间。作为待测物质，例如化合物、微生物的代谢产物、植物或动物组织的提取物、它们的衍生物或它们的混合物等。待测物质的给药量或浓度可以适宜进行设定，或例如也可以作成稀释系列等后设定多种给药量。存在待测物质时的培养期间也可以适宜进行设定，但优选30分钟乃至24小时。将待测物质投给哺乳动物个体时，根据待测物质的物性，分为口服给药、静脉注射、腹腔内注射、透皮给药、皮下注射等给药形式进行使用。5)样品的制备从通过上述步骤培养的细胞提取RNA时，在培养结束后优选立即用RNA提取用溶剂(例如，含有苯酚等具有灭活核糖核酸酶作用的成分的溶剂)将细胞直接溶解。或者，在不破坏细胞的前提下，通过用细胞刮刀小心刮或用胰蛋白酶等蛋白酶平稳地从培养基材中分离等方法回收细胞后，迅速转至RNA提取步骤。
作为RNA的提取方法，例如可采用硫氰酸胍-氯化铯超离心法、硫氰酸胍-热酚法、盐酸胍法、酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿法(Chomczvnski，P.and Sacchi，N.，(1987)Anal.Biochem.，162，156-159)等，优选酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿法。
由得到的RNA进一步纯化mRNA的方法如下所述。即，已知存在于真核细胞细胞质中的mRNA大多数在其3’末端具有poly(A)序列，所以利用这一特征，例如将mRNA吸附在生物素化的寡聚(dT)探针上，然后再利用生物素/链霉抗生物素蛋白之间的结合将mRNA捕获在固定化了链霉抗生物素蛋白的顺磁性粒子上，并经过洗涤操作后，通过洗脱mRNA来纯化mRNA。另外，也可以采用将mRNA吸附于寡聚(dT)纤维素柱，然后将之洗脱进行纯化的方法。还可通过蔗糖密度梯度离心等进一步将mRNA分级分离。但本发明的方法中，这些mRNA的纯化步骤不是必须的，只要可检测出具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的基因，也可以将总RNA用于随后的步骤。6)样品的固定通过核酸杂交进行检测时，为了特异性检测通过上述步骤得到的RNA样品中的基因，或者将该RNA样品经琼脂糖凝胶电泳后转印至(Northern blot法)杂交实验用薄膜(以下，略作“薄膜”)，或者直接将样品印迹到薄膜上，即，通过斑点印迹法或狭线印迹法等固载于薄膜上。作为这种薄膜，例如可以采用硝酸纤维素薄膜(例如AmershamPharmacia制的High bond-C pure等)、正电性尼龙膜(例如AmershamPharmacia制的High bond-N+等)或亲水性尼龙膜(例如AmershamPharmacia制的High bond-N/NX等)等。
作为Northern blot用琼脂糖凝胶电泳方法，例如琼脂糖甲酰胺凝胶电泳法，以及用乙二醛和二甲亚砜处理样品并使样品变性后，用磷酸缓冲液制备的琼脂糖凝胶进行电泳的方法，以及琼脂糖凝胶甲基汞电泳法(以上可参照Maniatis，T.等(1982)《分子克隆实验指南》，冷泉港实验室，NY)等，但并不仅限于此。
从电泳后的凝胶中将RNA转移至薄膜上，即，作为印迹方法，例如毛细管转移法(Maniatis，T.等(1982)《分子克隆实验指南》，冷泉港实验室，NY)、真空法、电泳法(Maniatis，T.等(1982)《分子克隆实验指南》，冷泉港实验室，NY)等，用于斑点印迹法或狭线印迹法的器材也已有市售品(例如Bio-Rad制的Biodot等)。
印迹结束后，进行将转移至薄膜上的RNA固定在薄膜上的操作(该操作根据薄膜的材质而有所不同，并且根据制品不同有时并不需要固定操作)。7)探针的标记对于通过核酸杂交进行检测时，检测通过上述步骤固定的RNA样品中的特定的mRNA所用的探针的标记方法和检测方法如下所述。i)放射性同位素标记将DNA片段或将携有该片段的载体作为材料乃至模板，例如用缺口平移法(例如用Amersham Pharmacia制的缺口平移试剂盒等)、随机引物法(例如用Amersham Pharmacia制的multi prime DNA标记系统等)、末端标记法(例如用宝酒造(株)社制的Mega label，AmershamPharmacia公司制的3’-末端标记试剂盒等)制备标记DNA探针，或通过利用亚克隆模板DNA的载体中的SP6启动子或T7启动子的体外转录法制备标记RNA。这些探针的检测可通过利用X光片或显影板的放射自显影来进行，并且，采用X光片时可以用光密度分析法(例如使用Bio-Rad公司制的GS-700影像光密度分析仪)进行定量，采用显影板时可以用BAS2000II(富士胶卷制)系统进行定量。ii)酶标记DNA或RNA片段直接用酶进行标记。标记时所用的酶，例如碱性磷酸酶(使用Amersham Pharmacia制的Alkphos Direct system forchemiluminescence等)、辣根过氧化物酶(使用Amersham Pharmacia制的ECL direct nucleic acid labeling and detection system等)。探针的检测，可通过将薄膜浸渍在含有可由标记的酶的催化反应检测出的底物，例如含有通过上述催化反应可生成生色底物或发光底物的缓冲液中来进行。采用生色底物时可通过目视进行检测，采用发光底物时与放射性同位素标记时相同，可通过利用X光片或影像显影板的放射自显影或利用快拍相机的拍照进行检测。并且，采用发光底物时，也可以进行利用光密度测定仪或BAS2000II系统的定量。iii)用其它分子进行标记荧光素标记将DNA片段用缺口平移法、随机引物法、或3’末端标记法(使用由Amersham Pharmacia公司购入的ECL 3’-oligo labelingsystem等)进行标记。或通过利用SP6、T7启动子的体外转录标记RNA。
生物素标记标记DNA的5’末端(使用由Amersham Pharmacia公司购入的寡核苷酸-生物素标记试剂盒等)，或将DNA片段用缺口平移法、随机引物法等进行标记。
地高辛修饰dUTP标记将DNA片段用缺口平移法、随机引物法等进行标记。
这些标记分子的检测过程均包括将可特异结合已标记分子的分子用放射性同位素或酶标记后，再结合在探针上的步骤。作为可特异结合的分子，例如采用荧光素或地高辛时为抗荧光素抗体或抗地高辛抗体，采用生物素时为抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。结合在这些探针上后，可通过用该标记的放射性同位素或酶并按照上述i)或ii)所述的同样方法进行检测。8)杂交杂交可采用本发明所属技术领域中公知的方法进行。关于本发明中杂交溶液或洗涤液的组成，杂交温度或洗涤温度，例如可按照文献(《生物实验图解说明4》，p148，秀润社刊)所述进行，但优选条件如下所述。
杂交溶液ExpressHyb Hybridization Solution(ClonTech公司制)；探针的终浓度(采用放射性标记探针时)1乃至2×106cpm/ml(优选2×106cpm/ml)；杂交温度及时间68℃，1乃至24小时；膜的洗涤条件i)将在0.1乃至5×SSC(最优选2×SSC)、0.05乃至0.1％SDS(最优选0.05％)十二烷基硫酸钠(以下，略作“SDS”)中，于室温乃至42℃(最优选室温)振荡20乃至60分钟(最优选20分钟)的操作，交换洗涤液反复2乃至6次(最优选3次)；ii)上述i)后，在0.1×SSC、0.1％SDS中，于50乃至65℃振荡20乃至60分钟的操作，交换洗涤液反复2乃至6次。或在0.2乃至0.5×SSC、0.1％SDS中，于62乃至65℃振荡20乃至60分钟的操作，交换洗涤液反复2乃至6次。最优选在0.1×SSC、0.1％SDS中，于50℃振荡20分钟的操作，交换洗涤液反复3次。
洗涤结束后，如上述7)所述，结合探针的标记法进行检测及定量。另外，将已知在每单位细胞中表达量稳定的基因(例如，用于检测23kDa高碱性蛋白质、α-微管蛋白、甘油醛-3-脱氢酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、磷脂酶2、核糖体蛋白质S9、泛醌等基因表达的探针已有市售)在各样品中的表达量，出于对由各样品间RNA量的差别导致的不均衡进行补正的目的而同时进行测定，然后以该稳定性表达基因的表达量为标准，将待测对象基因表达量的相对值，通过在施用待测物质的细胞组和未施用的细胞组之间进行比较，可进行更为精确的评价。
其结果，可使具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的基因的表达量降低的待测物质可作为高脂血症的治疗或预防剂。9)RT-PCR反应通过RT-PCR检测核酸的方式中，各反应的条件如下所述。另外，用于RT-PCR检测的样品，通常没有必要纯化至poly(A)+RNA。i)逆转录酶反应反应液组成的例子(总量20μl)总RNA适量；氯化镁2.5乃至5mM(优选5mM)；1×RNA PCR缓冲液(10mM Tris-盐酸(25℃时的pH为8.3乃至9.0，优选8.3)、50mM氯化钾)；dNTPs 0.5乃至1mM(优选1mM)；反义引物1μM(作为反义引物的代用品，可以添加市售的随机引物或寡聚(dT)引物(12-20个核苷酸)2.5μM)；逆转录酶0.25乃至1单位/μl(优选0.25单位/μl)；用灭菌水调至20μl反应温度条件30℃保温10分钟(只限于使用随机引物时)后，于42乃至60℃(优选42℃)保温15乃至30分钟(优选30分钟)，再于99℃加热5分钟使酶失活，然后于4乃至5℃(优选5℃)冷却5分钟。ii)PCR反应液组成的例子氯化镁2乃至2.5mM(优选2.5mM)；1×PCR缓冲液(10mM Tris-盐酸(25℃时的pH为8.3乃至9.0，优选8.3)、50mM氯化钾)；dNTPs 0.2乃至0.25mM(优选0.25mM)；反义引物及有义引物0.2乃至0.5μM(优选0.2μM)；Taq聚合酶1乃至2.5单位(优选2.5单位)用灭菌水将总量调节至80μl，将该总量加到结束逆转录反应的反应液总量中，然后开始PCR。
反应温度条件首先于90℃加热2分钟后，90乃至95℃(优选94℃)加热30秒，然后将40乃至60℃(优选在根据引物特性算出的解链温度(Tm)至比其低20℃的温度范围内)30秒、70乃至75℃(优选72℃)1.5分钟的温度循环反复28乃至50个循环(优选28个循环)，最后于4℃进行冷却。
PCR反应结束后，反应液进行电泳，检测是否扩增出目的大小的条带。进行定量检测时，将预先进行系列稀释的cDNA克隆作为标准的模板DNA，在相同条件下进行PCR，并确定可进行定量检测的温度循环次数，或者，例如每5个循环取一部分反应液样品分别进行电泳。另外，例如也可通过在进行PCR反应时使用放射性标记dCTP，以条带持有的放射能的量作为指标进行定量。
比较来自在待测物质存在下培养的细胞的样品和来自在待测物质非存在下培养的细胞的样品之间的检测结果，可知降低了具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的基因的表达量的待测物质可作为高脂血症的治疗或预防剂。10)其他方法作为测定具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的基因的表达量的方法，例如可以举出以下所述的方法。i)核糖核酸酶保护分析(RNase protection assay)只将RNA样品中具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的mRNA(其中，序列中的t改为读作u)与标记探针进行杂交，形成双链多核苷酸后，在样品中添加核糖核酸酶并孵育，此时，与探针杂交的mRNA由于形成双链而免于核糖核酸酶的降解，其余RNA由于被降解掉，所以只残留该双链多核苷酸(如果探针比检测出的mRNA短，将残留与探针链长相当的双链多核苷酸)。通过定量该双链多核苷酸，测定目的基因的表达量。具体的例如可参照以下所述方法。
为了将未形成双链残留的标记探针与双链多核苷酸完全进行分离并为了使定量易于进行，残留的标记探针优选用核糖核酸酶进行降解，此时，核糖核酸酶如果使用也可以降解单链DNA的酶，则标记探针可以是DNA或RNA。标记探针的制备方法可以参照上述1)乃至7)所述的方法，但此方法中所用的探针的长度优选为50乃至500个核苷酸左右。另外，将双链DNA直接标记后只进行热变性的探针等混有互补链的探针在本方法中并不适用。
RNA探针例如可以采用下述方法进行制备。首先，将模板DNA插入到具有噬菌体启动子(T7、SP6、T3启动子等)的质粒载体(例如，Promega公司制的pGEM-T等)中。然后，将此重组质粒用限制酶在插入片段的紧下游一个位点切断降解。以得到的直链DNA作为模板，在放射能标记的核糖核苷酸存在下进行体外转录反应。适应于载体中的启动子，该反应中可以使用T7、SP6或T3聚合酶等酶。以上操作，例如可以采用核糖探针系统-T7、同一系统的SP6或同一系统的T3(均为Promega公司制)进行。
到制备RNA样品的步骤如上述3)乃至5)所述。取相当于制备的总RNA样品10乃至20μg的RNA样品以及相当于5×105cpm的过量的标记探针进行核糖核酸酶保护分析。这一操作可以采用市售的试剂盒(HybSpeed RPA Kit，Anbion公司制)进行。核糖核酸酶降解后得到的样品在含有8M脲的4乃至12％聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳后，使胶干燥，用X光片进行放射自显影。通过以上操作，可检测出免于核糖核酸酶降解的双链多核苷酸条带，而该条带的定量可以按照上述7)中i)所述的方法进行。进而，与进行Northern blot分析时同样，出于对由各样品RRNA量的差别导致的不均衡进行补正的目的，同时对β-肌动蛋白基因的表达量进行测定的话，可以进行更为精确的评价。
如上所述，比较来自在待测物质存在下培养的细胞的样品和来自在待测物质非存在下培养的细胞的样品之间的检测结果，可知降低了具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的基因的表达量的待测物质可作为高脂血症的治疗或预防剂。ii)连缀转录分析(Run-on assay，参照Greenberg，M.E.and Ziff，E.B.(1984)Nature 311，433-438，以及Groudine，M.et al(1981)Mol.CellBiol.1，281-288)本方法是从细胞中分离核后测定目的基因的转录活性的方法，而非如上所述的检测细胞内mRNA的方法，但在本发明中包括在“检测基因表达量的方法”中。用分离的细胞核在试管内进行转录反应时，分离核之前已经开始转录并只进行生成的mRNA链继续延伸的反应。在该反应进行时添加放射性标记的核糖核苷酸标记正在延伸的mRNA，进而通过检测其中含有的与非标记探针杂交的mRNA，可以测定分离核时的目的基因的转录活性。为了确定待测物质的影响最为显著的时间数据，可采取对于将待测物质添加在培养细胞中起至分离核为止的时间，例如从添加30分钟后、1小时后、2小时后、4小时后、8小时后及24小时后的细胞中分离核，然后分别进行试验的方法等。具体的操作过程除了按照上述1)所述的方法制备非标记探针之外，其余均按上述参照文献所述的方法进行。通过以上步骤，比较来自在待测物质存在下培养的细胞的样品和来自在待测物质非存在下培养的细胞的样品之间的检测结果，可知降低了具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的基因的表达量的待测物质可作为高脂血症的治疗或预防剂。iii)DNA芯片分析、DNA微阵列分析[1]获取探针用样品的制备首先，提取纯化来自在待测物质存在下培养的细胞的样品、以及来自在待测物质非存在下培养的细胞的样品的mRNA。到制备RNA样品的步骤如上述3)乃至5)所述。[2]探针的标记作为用于制备DNA芯片分析或DNA微阵列分析用探针的起始材料，例如可以使用未纯化的总RNA，但优选通过上述5)所述的方法纯化的poly(A)+RNA。
利用核酸杂交进行检测时，探针的标记方法和检测方法如下所述。
用Affymetrix公司制DNA芯片进行分析时所用的探针按照Affymetrix公司制DNA芯片中附带的方案，利用生物素标记的cRNA探针。
用DNA微阵列进行分析时所用的探针通过逆转录酶反应由poly(A)+RNA制备cDNA时，通过加入荧光色素(例如Cy3、Cy5等)标记的d-UTP等荧光标记cDNA。此时，分别用不同的色素标记来自在待测物质存在下培养的细胞的样品、以及来自在待测物质非存在下培养的细胞的样品的话，则以后进行杂交时可混合使用两者。
用滤膜进行分析时所用的探针通过逆转录酶反应由poly(A)+RNA制备cDNA时，通过加入放射性同位素(例如32P、33P)标记的d-CTP等标记探针。[3]固定样品作为用于与上述步骤[2]得到的标记探针杂交的固定样品，例如以下列出的样品。
固定以数据库的EST(expressed sequence tag)序列或mRNA序列为基础合成的反义寡核苷酸的基因芯片(Affymetrix公司制)(Lipshutz，R.J.et al(1999)Nature genet.21，suppliment，20-24)上述EST序列或mRNA序列优选与用于探针制备的细胞为同种动物来源，但不限定于此，例如也可以使用近缘种动物来源的序列。但是，使用的是将具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的基因、在Genbank数据库上作为编码“血管生成因子相关蛋白质3”的核苷酸序列已知的基因、或含有它们中任一个的部分序列的序列进行固定的样品。
固定由与用于探针制备的细胞为同种乃至近缘动物的脏器组织(优选肝脏)、或由从该脏器组织分离或株化的细胞得到的mRNA制备的cDNA乃至RT-PCR产物的DNA微阵列或滤膜这些cDNA或RT-PCR产物，例如能够以作为mRNA材料的动物的EST数据库等的序列信息为基础合成引物后，通过实施逆转录酶反应或PCR来进行克隆化。作为制备样品的材料，使用的是表达具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的基因、在Genbank数据库上作为编码“血管生成因子相关蛋白质3”的核苷酸序列已知的基因的细胞(优选来源于肝脏细胞)。作为该cDNA或RT-PCR产物，也包括预先将表达量有差异的mRNA通过削减法(subtraction method，Diatchenko，L.et al.(1996)Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A 93，6025-6030)、差异显示法(Kato，K.(1995)Nucleic Acids Res.23，3685-3690)等进行筛选而制备的产物。另外，DNA微阵列或滤膜也可以使用含有作为检测对象的基因，即在Genbank数据库上作为编码“血管生成因子相关蛋白质3”的核苷酸序列已知的基因的市售品，也可以制备用定位器(spotter)将具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的基因进行固定的DNA微阵列或滤膜(例如，宝酒造(株)社制的GMS417阵列等)。
在该固定材料上，用上述[2]中制备的探针，在相同条件下分别、或混合后同时进行杂交(Brown，P.O.et al(1999)Natrue genet.21，suppliment，33-37)。[4]分析采用Affymetrix公司制DNA芯片进行分析时按照Affymetrix公司制DNA芯片中附带的方案，进行杂交及分析。
采用DNA微阵列进行分析时例如采用宝酒造(株)社的市售DNA微阵列时，按照宝酒造(株)社的方案进行杂交及洗涤，用荧光信号检测仪(例如宝酒造(株)社制的GMS418阵列扫描仪等)检测荧光信号后，进行分析。
采用滤膜时杂交可以按照本发明所属技术领域中众所周知的方法进行。例如，进行杂交及洗涤后，用分析装置(例如ClonTech公司制Altlasimage等)进行分析。
上述所有情况均是将同一批固定样品分别与来自从在待测物质存在下培养的细胞得到的样品的探针、以及来自从在待测物质非存在下培养的细胞得到的样品的探针杂交。此时，除使用的探针以外，其余杂交条件相同。如上述[2]中所述，用不同的荧光色素标记各个探针时，也可以将两种探针的混合物与一个固定样品进行杂交(Brown，P.O.etal.(1999)Natrue genet.21，supplement，33-37)。
分析的结果，测定来自从在待测物质存在下培养的细胞得到的样品的探针、以及来自从在待测物质非存在下培养的细胞得到的样品的探针两者之间与固定样品的靶基因，即具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的基因、或具有编码“血管生成因子相关蛋白质3”的核苷酸序列的基因杂交的探针量。其结果，比较与靶基因杂交的探针量后，在来自从在待测物质存在下培养的细胞得到的样品的探针一方少于来自从在待测物质非存在下培养的细胞得到的样品的探针时，待测物质为抑制具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的基因表达的物质，所以可作为高脂血症的治疗或预防剂。iv)其它除上述以外，作为用来自在待测物质存在下培养的细胞的样品特异性检测与来自在待测物质非存在下培养的细胞的样品相比可降低具有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的基因表达量的待测物质的方法，例如以下的方法。
即，可利用在单一的反应中将PCR与杂交探测(HybridzationProbing，以下略作“探测”)组合的已知称作“Taqman”的技术(Holland，P.M.et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，7276-7280)，以及在单一反应中将PCR与探测组合的方法(Higuchi et al Biotechnology，10，413-417(1992))。在后一个方法中，将受到紫外线激发后会发出荧光的核酸检测试剂溴化乙锭添加到PCR反应液中。存在双链DNA时由于可增加溴化乙锭的荧光，照射激发光时可检测出的荧光的增加可与双链PCR产物的蓄积相关。
作为将PCR扩增与探测相组合的其它方法，也可以利用欧洲专利申请公开第0601899号公报记载的方法。再者，也可以用Light cycler系统(Roche diagnostics公司制，参照日本专利公开2000-312600号公报)定量mRNA量。(B)多肽的检测以下，作为本发明方法的另一种实施方式，例如检测在上述检测基因表达的实施方式中作为检测对象的基因所编码的多肽的方法。在此实施方式中，将样品中的多肽固定于96孔板的孔内底面或膜等后，用特异性识别靶多肽的抗体进行检测。其中，采用96板的方法是通常称为固相酶免疫定量法(ELISA法)或放射性同位素免疫定量法(RIA法)的方法。另一方面，作为固定在膜上的方法，例如样品经聚丙烯酰胺电泳后将多肽印迹在膜上的方法(Western blot法)，或直接将样品或其稀释液浸染在膜上的方法，即，所谓的斑点印迹法或狭线印迹法。1)样品的制备与在上述检测多肽的实施方式中使用的培养细胞种类相关的条件，与上述检测基因表达的实施方式时相同。并且，也可采用将待测物质投给哺乳动物个体，然后将从该动物个体提取的血清作为样品的方法。此时，优选的哺乳动物种为人、小鼠、大鼠或仓鼠，更优选人或小鼠。例如，作为小鼠可优选使用高脂血症小鼠KK小鼠，但本发明不受此限制。对于培养细胞的培养条件、待测物质的给药方法，也与检测基因表达的实施方式时相同。另外，作为需要研究作为高脂血症的治疗或预防剂的活性的待测物质，例如化合物、微生物的代谢产物、植物或动物组织的提取物、它们的衍生物或其它们的混合物等。
作为用于制备本实施方式中样品的材料，可以使用在待测物质存在下或非存在下培养的细胞培养的培养上清或细胞质组分，但优选培养上清。培养上清是在培养结束后回收，根据需要经膜过滤灭菌后提供给ELISA/RIA用样品或Western blot用样品的制备步骤。
作为ELISA/RIA用样品，例如直接使用回收的培养上清，或使用用缓冲液进行适度稀释的稀释物。
Western blot用(电泳用)样品的制备方法如下所述。首先，例如将培养上清用三氯乙酸处理以使蛋白质沉淀，然后通过离心分离得到沉淀。将该沉淀用冰冷的丙酮洗涤并风干后，溶解在SDS-聚丙烯酰胺电泳用且含2-巯基乙醇的样品缓冲液中(Bio-Rad公司制等)。
进行斑点/狭线印迹时，例如将回收的培养上清直接或用缓冲液适度稀释后，通过使用印迹装置等直接吸附在膜上。2)样品的固定为了特异性检测由上述步骤得到的样品中的多肽，将该样品进行固定。作为Western blot法、斑点印迹法或狭线印迹法中使用的膜，例如硝酸纤维素膜(例如，Bio-Rad公司制等)、尼龙膜(例如，AmershamPharmacia公司制High bond-ECL等)、棉膜(例如，Bio-Rad公司制Blot absorbent filter等)或聚偏二氟乙烯(PDVF)膜(例如，Bio-Rad公司制等)等。
作为将多肽从电泳后凝胶转移至膜上的所谓印迹方法，例如湿式印迹法(CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY volume2 ed byJ.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W.Strober)、半干式印迹法(参照上述CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY volume2)等。用于斑点印迹法或狭线印迹法的器材也已有市售品(例如，Bio-Rad的Biodot等)。
另一方面，为了用ELISA法/RIA法进行检测及定量，在专用的96孔板(例如，Nunc公司制Immunoplate maxi soap等)中装入样品或其稀释液(例如用含有0.05％叠氮钠的磷酸缓冲生理盐水(以下略作“PBS”)稀释的稀释物)后，通过在4℃乃至室温放置过夜或在37℃放置1乃至3小时，使多肽吸附在孔内底面进行固定。3)抗体本实施方式中使用的抗体，例如特异识别上述A)中含有a)至e)所述核苷酸序列的基因在动物细胞中表达产生的多肽，优选由序列表序列号2的氨基酸序号17-455(更优选氨基酸序号19-455)所示氨基酸序列构成的多肽或其一部分，或由序列号4的氨基酸序号17-460所示氨基酸序列构成的多肽或其一部分的抗体。作为这种抗体的优选例子，例如与由序列表序列号2中氨基酸序号17-455(更优选氨基酸序号19-455)所示氨基酸序列构成的多肽及由序列号4中氨基酸序号17-460所示氨基酸序列构成的多肽中任意一方结合，但不与其它任何小鼠或人蛋白质结合的抗体。
本实施方式中的抗体，可通过常规方法将用作抗原的蛋白质或选自其氨基酸序列的任意多肽免疫动物，并通过提取纯化体内产生的抗体来得到。另外，按照公知的方法(例如Kohler and Milstein，Natrue 256，495-497，1975；Kennet，R.ed.，Monoclonal Antibody p.365-367，1980，Prenum Press，N.Y.)，通过融合产生针对本发明蛋白质的抗体的抗体生成细胞与骨髓瘤细胞构建杂交瘤，也可以得到单克隆抗体。
作为用于制备本实施方式中使用的抗体的抗原，例如由序列表序列号2中氨基酸序号17-455(优选氨基酸序号19-455)所示氨基酸序列构成的多肽或由其至少6个连续的部分氨基酸序列构成的多肽，或由序列号4中氨基酸序号17-460所示氨基酸序列构成的多肽或由其至少6个连续的部分氨基酸序列构成的多肽，或在这些多肽上附加任意氨基酸序列或载体形式的衍生物，但优选在由序列表序列号9中氨基酸序号1-14构成的多肽的C末端或在由序列号10中氨基酸序号1-14所示氨基酸序列构成的多肽的N末上，将钥孔血蓝蛋白作为载体进行结合的抗原。
由序列表序列号2中氨基酸序号17-455(优选氨基酸序号19-455)所示氨基酸序列构成的多肽或由序列号4中氨基酸序号17-460所示氨基酸序列构成的多肽，例如可以将序列表序列号1中核苷酸序号47-1411所示核苷酸序列或序列表序列号3中核苷酸序号78-1457所示核苷酸序列编码的多肽通过基因操作在宿主细胞中进行生产来得到。具体来说，通过将具有上述核苷酸序列的DNA整合到适当的载体DNA中，转化其它原核生物或真核生物的宿主细胞。进而，通过在这些载体中导入适当的启动子以及与性状表达有关的序列，使基因在各种宿主中的表达成为可能。
作为原核细胞的宿主，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或枯草杆菌(Bacillus subtilis)等。用目的基因转化这些宿主细胞时，用含有来自与宿主相适应的物种的复制子，即，用含有复制起点和调控序列的载体转化宿主细胞。作为载体，优选具有可赋予转化细胞以表现性状(表现型)的选择性的序列的载体。
例如，作为大肠杆菌通常使用K12株等，作为载体通常使用pBR322或pUC系列的质粒，但不局限于此，可以使用所有公知的各种菌株及载体。
作为启动子，在大肠杆菌中，例如色氨酸(trp)启动子、乳糖(lac)启动子、色氨酸·乳糖(tac)启动子，脂蛋白(lpp)启动子、多肽链延伸因子Tu(TufB)启动子等，这些启动子中的任一种均可用于目的多肽的生产。
作为枯草杆菌例如优选207-25株，作为载体可使用pTUB228(Ohmura，K.et al.(1984)J.Biochem.95，87-93)等，但并不局限于此。也可以连接上编码枯草杆菌α-淀粉酶的信号肽序列的DNA序列，进行菌体外的分泌表达。
真核细胞的宿主细胞包括脊椎动物、昆虫、酵母等的细胞，作为脊椎细胞，例如通常使用猿猴细胞COS细胞(Gluzman，Y.(1981)Cell23，175-182；ATCC CRL-1650)或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞，ATCCCCL-61)的二氢叶酸还原酶缺失株(Urlaub，G.and Chasin，L.A.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77，4126-4220)等，但并不局限于此。
作为脊椎动物细胞的表达载体，通常可以使用具有位于待表达基因上游的启动子、RNA剪接位点、多腺苷化位点、以及转录终止序列等的载体，进而其中根据需要还可以具有复制起点。作为该表达载体的例子，例如具有SV40早期启动子的pSV2dhfr(Subramani，S.et al(1981)Mol.Cell.Biol.1854-1864)等，但并不局限于此。
作为宿主细胞使用COS细胞时，作为表达载体可以使用具有SV40复制起点，可在COS细胞中自主复制，且还具有转录启动子、转录终止信号、以及RNA剪接位点的载体。该表达载体可通过二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖法(Luthman，H.and Magnusson，G.(1983)NucleicAcids Res，11，1295-1308)、磷酸钙-DNA共沉淀法(Graham，F.L.andvan der Eb，A.J.(1973)Virology 52，456-457)、以及电脉冲穿孔法(Neuman，E.et al.(1982)EMBO J.1，841-845)等导入COS细胞中，进而可以得到目的转化细胞。另外，作为宿主细胞使用COS细胞时，除表达载体之外，还可同时共转染可表达发挥抗生素G418抗性筛选标记作用的neo基因的载体，例如共转染pRSVneo(Sambrook，J.等(1989)《分子克隆实验指南》，冷泉港实验室，NY)或pSV20-neo(Southern，P.J.and Berg，P.(1982)J.Mol.Appl.Genet.1，327-341)等，并通过筛选G418抗性的克隆，可以得到稳定产生目的多肽的转化细胞。
将昆虫细胞作为宿主细胞使用时，鳞翅类夜蛾科的草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞的株化细胞(Sf9或Sf-21)或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)卵巢细胞的High Five细胞(Wickham，T.J.et al，(1992) Biotechnol Pro.I391-396)等通常可作为宿主细胞使用，作为杆状病毒转移载体，通常可使用利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的多角体蛋白质启动子的pVL1392/1393(Kidd，I.M.andV. C. Emery(1993)The use of baculoviruses as expression vectors.Applied Biochemistry and Biotechnology 42，137-159)。其余的也可以使用利用杆状病毒P10或杆状病毒碱性蛋白质的启动子的载体。再者，也可以将AcNPV被膜表面蛋白质GP67的分泌信号序列连接在目的蛋白质的N末端侧，形成重组蛋白质并以分泌蛋白质的形式进行表达(Zhe-mei wang，et al.(1998)Biol.Chem.，379，167-174)。
作为以真核微生物为宿主细胞的表达体系，通常熟知的是酵母，其中优选酵母菌属酵母，例如面包酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或石油酵母毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)。作为该酵母等真菌微生物的表达载体，例如可优选利用乙醇脱氢酶基因的启动子(Bennetzen，J.L.and Hall，B.D.(1982)J.Biol.Chem.257，3018-3025)或酸性磷酸酶基因的启动子等。另外，以分泌型蛋白质的形式进行表达时，也能够以具有分泌信号序列和在N末端侧具有宿主细胞内源性蛋白酶或已知蛋白酶的切割位点的重组体形式进行表达。例如，已知在石油酵母中表达胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶的人肥大细胞胰蛋白酶的体系中，通过在N末端侧连接酵母α因子的分泌信号序列和石油酵母的KEX2蛋白酶的切割位点后进行表达，可将活性型胰蛋白酶分泌在培养基中(Andrew，L.Niles，et al.(1998)Biotechnol.Appl.Biochem.28，125-131)。
由上述方法得到的转化体可按照常规方法进行培养，通过该培养，可在细胞内或细胞外生成目的多肽。作该培养中使用的培养基，可以根据采用的宿主细胞适宜选择惯用的各种培养基，例如，培养上述COS细胞时，可在RPMI1640培养基或Dulbecco改进Eagle培养基(以下略作“DEME”)等培养基中，根据需要添加胎牛血清等血清成分后进行使用。
通过上述培养，在转化体的细胞内或细胞外生成的重组蛋白质，可通过利用该蛋白质的物理性质或化学性质等的各种公知的分离操作方法进行分离纯化。作为该方法，具体的例子可举出用通常的蛋白沉淀剂进行处理、超滤、分子筛色谱(凝胶过滤)、吸附色谱、离子交换色谱、亲和色谱、高速液相色谱(HPLC)等各种液相色谱、透析法、以及这些方法的组合等。另外，通过在进行表达的重组蛋白质上连接6个组氨酸残基，可用镍亲和柱有效地进行纯化。通过组合上述方法，可以更为轻松地制备高收率、高纯度的本发明多肽。
由上述方法得到的抗体可以应用在RIA法、ELISA法、荧光抗体法、受体血细胞凝集反应法等的各种免疫学测定方法或免疫组织染色法等中。4)检测由上述3)所述方法得到的抗体可直接标记后用于检测，或以该抗体为一抗，与特异性识别该抗体(识别来自制备抗体的动物的抗体)的标记二抗协同用于检测。
作为标记的种类，优选酶(碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)或生物素(增加在二抗的生物素上再结合酶标记链霉抗生物素蛋白的操作)，但并不局限于此。对于使用标记二抗(或标记链霉抗生物素蛋白)的方法，预先标记过的抗体(或链霉抗生物素蛋白)已有种种市售品。采用RIA法时，使用标记I125等放射性同位素的抗体，测定采用液闪计数器等进行。
通过检测这些标记的酶的活性，可以测定抗原多肽的量。使用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶时，通过这些酶的催化而生色的底物或发光的底物已有市售。
采用生色底物时，在Western blot法或斑点/狭线印迹法中能够以目测的方式进行测定。在ELISA法中，优选利用市售的微量板读数器测定各孔的吸光度(测定波长因底物不同而有所差异)，进而进行定量。并且，优选将上述3)中制备抗体时使用的抗体调制为稀释系列，将该稀释系列作为标准抗原样品并与其它样品同时进行检测操作，通过制作将标准抗原浓度与测定值线性化的标准曲线，可以定量其它样品中的抗原浓度。
另一方面，使用发光底物时，在Western blot法或斑点/狭线印迹法中可通过利用X光片或显影板的放射自显影或利用快拍相机的拍摄来进行检测，也可以利用光密度分析仪或BAS2000II系统进行定量。另外，在ELISA法中使用发光底物时，利用发光微量板读数器(例如，Bio-Rad公司制等)测定酶活性。5)测定操作i)采用Western blot法、斑点印迹法或狭线印迹法时首先，为了防止抗体的非特异性吸附，预先进行在含有可防止发生上述非特异性吸附的物质的缓冲液中将膜浸渍一定时间的操作(封闭)。可以使用封闭液的组成中例如含有5％脱脂乳、0.05乃至0.1％Tween20的磷酸缓冲生理盐水(PBS)或Tris盐酸生理盐水(TBS)。替代脱脂乳，也可以使用1乃至10％牛血清白蛋白、0.5乃至3％明胶或1％聚乙烯吡咯烷酮等。封闭时间为4℃下16乃至24小时，或室温下1乃至3小时。
随后，将膜用含0.05乃至0.1％Tween20的PBS或TBS(以下称作“洗涤液”)洗涤，除去残余的封闭液后，用上述3)所述方法制备的抗体在用洗涤液适度稀释的溶液中浸渍一定时间，使抗体结合在膜上的抗原上。此时的抗体稀释倍数，例如可以将上述3)所述重组抗原的阶段稀释物作为样品进行预Western blot实验来确定。该抗体反应操作，优选在室温进行1小时。抗体反应操作结束后，用洗涤液洗涤膜。这里，使用的抗体为已标记抗体时，可以直接进行检测操作。使用未标记抗体时，随即进行二抗反应。标记二抗例如使用市售品时，用洗涤液稀释2000倍乃至20000倍后使用(附带的指导书中描述了适宜的稀释倍数时，按该描述进行稀释)。将洗涤除去一抗后的膜在二抗溶液中室温浸渍1乃至3小时，用洗涤液洗涤后，根据标记方法进行检测操作。洗涤操作例如首先在洗涤液中将膜振荡15分钟后，将洗涤液更换为新的并振荡5分钟，然后再度更换洗涤液并振荡5分钟。根据需要还可更换洗涤液进行洗涤。ii)ELISA/RIA首先，为了防止抗体非特异性吸附在用上述2)所述方法固定样品的板的孔内底面，与Western blot时相同，预先进行封闭。封闭条件与Western blot项所述的相同。
其次，将孔内部用含0.05乃至0.1％Tween20的PBS或TBS(以下称作“洗涤液”)洗涤，除去残余的封闭液后，分注入用洗涤液适度稀释由上述3)所述方法制备的抗体的溶液，并温育一定时间，使抗体结合在抗原上。此时的抗体稀释倍数，例如可以将上述3)所述重组抗原的阶段稀释物作为样品进行预ELISA实验来确定。该抗体反应操作，优选在室温进行1小时。抗体反应操作结束后，用洗涤液洗涤孔内部。这里，使用的抗体为已标记抗体时，可以直接进行检测操作。使用未标记抗体时，随即进行二抗反应。标记二抗例如使用市售品时，用洗涤液稀释2000倍乃至20000倍后使用(附带的指导书中描述了适宜的稀释倍数时，按该描述进行稀释)。将二抗溶液分注入洗涤除去一抗后的孔中，于室温温育1乃至3小时，用洗涤液洗涤后，根据标记方法进行检测操作。洗涤操作例如首先将洗涤液分注到孔中振荡5分钟后，将洗涤液更换为新的并振荡5分钟，然后再度更换洗涤液并振荡5分钟。根据需要还可更换洗涤液进行洗涤。
在本发明中，所谓夹心ELISA法例如可以通过以下所述方法实施。首先，从序列表序列号2中氨基酸序号17-455(优选氨基酸序号19-455)所示氨基酸序列及序列号4中氨基酸序号17-460所示氨基酸序列的任一个中选出2个亲水性区域，合成由各区域中6个氨基酸残基构成的部分肽，取得以该部分肽作为抗原的2种抗体。将其中一个抗体按上述4)所述的方法进行标记。未标记的抗体按上述2)所述的方法固定在96孔ELISA用板的孔内底面。封闭后，将样品液加到孔内部并于常温温育1小时。将孔内部洗涤后，分注入标记一方的抗体稀释液进行温育。再次洗涤孔内部后，根据标记方法进行检测操作。6)评价用以上所述的方法，比较来自在待测物质存在下培养的细胞的样品和在待测物质非存在下培养的细胞的样品之间的检测结果，由结果可知，降低了用上述3)所述方法制备的抗体特异结合的多肽的产量的待测物质可用作高脂血症的治疗或预防剂。另外，通过组合用上述3)所述方法制备的抗体和其它上述一系列反应中使用的试剂，可提供用于检验高脂血症的治疗或预防剂的试剂盒。
本发明方法中作为检测对象的多肽，可按照获取上述抗体制备用抗原的方法所述得到之外，也可利用整合具有序列表序列号1中核苷酸序号47-1411所示核苷酸序列或序列表序列号3中核苷酸序号78-1457所示核苷酸序列的DNA的腺病毒载体在动物细胞中产生。作为构建上述重组腺病毒载体的方法，例如利用市售的试剂盒(例如，宝酒造(株)社制的腺病毒表达载体试剂盒)的方法。在本发明方法中作为检测对象的基因与哺乳动物血中中性脂肪浓度密切相关，例如将具有由上述方法得到的重组腺病毒载体的重组腺病毒感染哺乳动物、例如感染小鼠后，表达该重组腺病毒载体携有的基因，并通过观察血中中性脂肪浓度的上升来加以证明，以及通过先天性低脂血症小鼠中具有序列表序列号1中核苷酸序号47-1411所示核苷酸序列的基因的表达量少于高脂血症小鼠来加以证明。
另外，利用通过基因操作的得到的、以高效表达的方式导入含有上述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的外源基因的非人动物检验高脂血症的治疗或预防剂的方法也包括在本发明中。该方法中使用的动物，例如感染上述重组腺病毒的KK/San小鼠、或将具有序列表序列号1中核苷酸序号47-1411所示核苷酸序列或序列表序列号3中核苷酸序号78-1457所示核苷酸序列的DNA导入小鼠的转基因小鼠等，但并不局限于此。
转基因动物可以从动物体取得受精卵，并向其中导入基因后，移植到拟妊娠动物体内并通过使其发生来得到，关于这一过程的顺序，可以参照已确立的方法[参照《发生工程学实验手册》，野村达次监修，胜木原也编著，1987年刊；《小鼠胚胎操作手册》，B.Hogan，F.Costantini and E.Lacy编著，山内一也、丰田裕、岩仓洋一郎翻译，1989年刊；特公平5-48093号公报等]。具体过程为，例如以小鼠为实验对象时，首先将排卵诱导剂投给雌性小鼠(优选血中中性脂肪浓度低于正常水平的小鼠，例如优选KK/San小鼠，但不局限于此)后，与同系雄鼠交配，第二天从雌性小鼠输卵管中提取前核受精卵。然后，用微小玻璃管将欲导入的DNA片段溶液注入到受精卵的前核中。此外，作为促使导入基因在动物细胞内表达的启动子或增强子等调控基因，只要可在导入的动物细胞内发挥作用，就对此没有限制。注入DNA的受精卵移植到拟妊娠养母雌性小鼠(SlcICR等)的输卵管中，约20天后通过自然分娩或切开子宫生出。作为确认由此得到的动物是否保持有导入的基因的方法，例如从该动物的尾巴等部位提取DNA，以该DNA为模板并利用导入基因特异性的有义和反义引物进行PCR的方法，以及用数种限制酶消化该DNA后进行电泳，将凝胶中的DNA印迹到硝酸纤维素膜或尼龙膜上后，以将导入基因的全部或一部分进行标记的DNA作为探针进行Southern blot的方法等。另外，对于导入基因在体内是否确实进行表达，可通过测定外周血中的中性脂肪浓度加以确认。导入基因在动物体内确实进行表达时，与未导入基因的动物相比血中的中性脂肪浓度变高。
将待测物质投给由上述步骤得到的基因导入动物，筛选可降低血中中性脂肪浓度的物质(优选也将待测物质投给未导入基因的动物后，对结果进行比较，并筛选可显著降低基因导入动物中的血中中性脂肪浓度的物质)。根据该方法，除抑制或阻碍导入基因的表达的物质之外，可发现有助于该基因编码的多肽本身的功能表达、或与该多肽相互作用进而有助于该多肽功能表达的因子(例如受体)等，阻碍与通过该多肽的作用使血中中性脂肪浓度的上升有关的任意生物体反应的物质。这种物质也可作为高脂血症的治疗或预防剂。
本发明还涉及特异结合在本发明方法中作为检测对象的多肽(以下，略作“检测对象多肽”)的、抗体以外的多肽，即检测对象多肽的受体。该受体为存在于细胞膜上的蛋白质时，例如可通过以下所述的方法克隆该受体。首先，构建可在哺乳动物细胞中表达由序列表序列号1中核苷酸序号47-1411所示核苷酸序列或序列表序列号3中核苷酸序号78-1457所示核苷酸序列构成的DNA的重组载体，导入COS-1细胞后回收培养上清，纯化检测对象多肽的重组多肽。将得到的重组多肽用荧光素异硫氰酸酯(下，略作“FITC”)进行标记。然后，将标记重组多肽添加到来自种种哺乳动物组织的培养细胞中，鉴定标记重组多肽特异结合在细胞膜上的细胞，即表达受体的细胞。将来自已鉴定细胞的cDNA文库整合到可在哺乳动物细胞中进行表达的载体中，在不表达受体的细胞(优选COS-1或CHO，更优选CHO细胞)中进行表达。在表达该cDNA文库的细胞中添加上述FITC标记的重组多肽，培养一定时间后回收细胞，用细胞分类器筛选结合FITC标记重组多肽的细胞。从得到的细胞中用PCR等克隆导入的cDNA。根据需要重复以上操作，最终克隆出编码特异结合FITC标记重组多肽的受体的cDNA。另外，受体本身可从由上述步骤克隆化的细胞中回收。
由此，如果可得到编码检测对象多肽的受体的cDNA，则可利用作为该cDNA文库材料的细胞筛选阻碍检测对象多肽与该受体之间相互作用的物质、通过结合在该受体上发挥与检测对象多肽同样的功能的物质、或阻碍由检测对象多肽和该受体之间相互作用起始的信号传递的物质。具体来说，例如通过限制酶消化等将小鼠基因组DNA适宜片段化，将在它们的一端连接编码绿色荧光蛋白质(green fluorescentprotein，作为报告试验用载体，Clon Tech公司制的pEGFP-1已有市售)的DNA的载体，导入作为上述cDNA文库材料的细胞中。在该细胞的培养过程中，添加检测对象多肽的重组多肽(未进行标记)，并用细胞分类器筛选生成绿色荧光蛋白质的细胞。筛选出的细胞在该重组多肽存在下生成绿色荧光蛋白质。在96孔培养板中培养该细胞并使每孔细胞数大致相等，然后或只添加待测物质，或同时添加该重组多肽和待测物质后培养一定时间，用荧光微量板读数计测定绿色荧光蛋白质的生成量。只添加待测物质进行培养时，若可生成绿色荧光蛋白质的话，则可认为该待测物质是检测对象多肽的促效剂。另一方面，同时添加该重组多肽和待测物质的孔中的绿色荧光蛋白质的生成量少于单独添加该重组多肽的孔时，该物质为检测对象多肽的拮抗剂或为该多肽的信号传递抑制剂，并可认为可用作于高脂血症的治疗或预防剂。
由上述步骤得到的拮抗剂为蛋白质或多肽时，具有编码该蛋白质或多肽的核苷酸序列的多核苷酸可用于高脂血症的基因治疗。这种多肽例如可通过分析已鉴定的拮抗剂蛋白质或多肽的氨基酸序列，并合成由编码该氨基酸序列的核苷酸序列组成的寡核苷酸后，通过筛选种种cDNA文库或基因组文库来得到。另外，具有拮抗活性的多肽来自随机合成的人工多肽库时，化学合成由编码该多肽的氨基酸序列的核苷酸序列组成的DNA。基因治疗过程中，例如将编码由上述方法得到的拮抗剂的多核苷酸整合到病毒载体中，用具有该重组病毒载体的病毒(经灭毒化处理)感染患者。由此，患者体内生成拮抗剂，并抑制由序列表序列号4所示氨基酸序列构成的多肽的功能，进而可降低血中的中性脂肪浓度。
作为将基因治疗剂导入细胞内的方法，利用病毒载体的基因导入方法、或非病毒性的基因导入方法(《日经科学》，1994年4月号，20-45页；《实验医学增刊》，12(15)(1994)；《实验医学别册 基因治疗的基础技术》，羊土社(1996))两种方法均可适用。
作为利用病毒载体的基因导入方法，例如在反转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、Sindbis病毒等DNA病毒或RNA病毒中整合编码TR4或变异TR4的DNA的方法。其中，特别优选利用反转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、牛痘病毒的方法。作为非病毒性的基因导入方法，例如将表达质粒直接注入到肌肉内的方法(DNA疫苗法)、脂质体法、脂转染法、微注射法、磷酸钙法、电穿孔法等，特别优选DNA疫苗法、脂质体法。
另外，将基因治疗剂作为医药实际使用时，例如将DNA直接导入到体内的体内(in vivo)法，以及从人体中取出某种细胞后，在体外将DNA导入该细胞，并将该细胞重新移植到体内的体外(ex vivo)法(《日经科学》，1994年4月号，20-45页；《月刊药事》，36(1)，23-48(1994)；《实验医学增刊》，12(15)(1994))。
例如，该基因治疗剂以体内法形式施用时，根据疾病和症状等，可通过静脉、动脉、皮下、皮内、肌肉内等适当的给药途径施用。另外，以体内法形式施用时，通常可以将该基因治疗剂制成注射剂的形式，但根据需要也可加入常规载体。再者，以脂质体或膜融合脂质体(仙台病毒脂质体等)形式施用时，可以制成悬浮剂、冻干剂、离心分离浓缩冻干剂等脂质体制剂形式。
与序列表序列号3中核苷酸序号78-1457所示核苷酸序列的部分序列互补的核苷酸序列可用于所谓的反义治疗中。反义分子能够以与序列表序列号3中核苷酸序号78-1457所示核苷酸序列的部分序列互补并通常由15乃至30mer构成的DNA形式，或其硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或吗啉衍生物等稳定的DNA形式，2’-O-烷基RNA等稳定的RNA形式使用。这种反义分子可以通过微量注入、脂质体胶囊化、或利用具有反义序列的载体进行表达等本发明技术领域中众所周知的方法导入到细胞中。这种反义疗法对于可通过降低序列表序列号3中核苷酸序号78-1457所示核苷酸序列编码的蛋白质活性来治疗的疾病，特别是对于高脂血症的治疗有效。
可用作含有上述反义寡核苷酸的医药的组合物，可通过混合可药用载体等公知的方法制造。作为这种载体及制造方法，例如记载于Remington的《药物科学》中。此外，在含有序列表序列号3中核苷酸序号78-1457所示核苷酸序列的基因的表达或其基因产物的活性异常的高脂血症的治疗过程中，对于患者个体使用足够量的药物。该有效量可以根据个体的状态、体重、性别、以及年龄等各种因素，或根据皮下、局部、口服及肌肉内等给药方法进行变化。例如，进行静脉注射时，以0.02乃至0.2mg/Kg/小时使用2小时，进行皮下给药时，给药量则变为1乃至200mg/m2/天。
附图的简单说明

图1是来自KK小鼠脏器的样品的Northern blot分析结果。图右侧的数字(28S及18S)表示标准RNA的沉降系数。
图2是将基因导入COS-1细胞培养上清作为样品时的Western blot分析结果。图左侧的数字表示分子量标准的分子量(单位为KDa)。
图3是将基因导入HeLa细胞培养上清作为样品时的Western blot分析结果。图左侧的数字表示分子量标准的分子量(单位为KDa)。
图4是感染重组腺病毒的KK/San小鼠外周血中中性脂肪浓度的测定结果。
图5是来自KK小鼠及感染重组腺病毒的KK/San小鼠肝脏的样品的Northern blot分析结果。图左侧的数字表示标准RNA的沉降系数。
实施发明的最佳方式以下，结合实施例对本发明进行更为详细的说明，但本发明并不局限于此。另外，在下述实施例中，如果不对有关基因操作的各操作过程加以特别说明时，则根据《分子克隆》(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.及Maniatis，T.编著，冷泉港实验室出版，1989年发刊)中所述的方法进行，或采用市售的试剂盒时，则按照市售品的指导书进行使用。参考例1.cDNA的克隆以小鼠肝脏作为材料，按照下述方法得到具有序列表序列号1中所示核苷酸序列的cDNA。a)从小鼠肝脏提取mRNA解剖2只9周龄的KK小鼠(雄性，获自滨松医科大学附属动物实验设施)，摘出肝脏后，迅速置于液氮中急速冷冻。测定其重量，取3.1g在液氮存在下于研钵中进行粉碎。加入5.5M硫氰酸胍(以下，略作GT)缓冲液(5.5M硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠(pH7.0)，0.5％十二烷基肌氨酸钠，0.2Mβ-巯基乙醇)30ml，用研磨棒破碎组织，加入新的GT缓冲液10ml，用研磨棒破碎后，回收溶解液。用GT缓冲液20ml洗涤研钵后，该溶液也进行回收。将36ml回收液3000rpm、10℃离心10分钟后，将上清转移至新试管中，各用18号注射针反复抽打20次。然后用三氟乙酸铯(CsTFA)进行密度梯度离心，分离总RNA。将19mlCsTFA原液用18.924ml无核糖核酸酶重蒸水稀释，取6.18ml该稀释液分别装到6支13PA(Beckmann制)管中，并将先前回收的样品(每管5.2ml)置于稀释液的上层。将该管用备有旋转转子(日立工机(株)社制P40ST)的超离心机(日立SCP70H型)于30000rpm(约125000g)、20℃离心20.5小时后，将除去上清得到的沉淀悬浮于mRNA纯化试剂盒(Amersham Pharmacia公司制的Quickprep mRNA纯化试剂盒)附带的提取缓冲液3.3ml中。mRNA的纯化按照该纯化试剂盒附带的方案进行。将由此得到的5μg mRNA作为模板，按照cDNA文库制备试剂盒(Stratagene公司制的ZAP expresscDNA Giga pack III gold cloning Kit)附带的方案使用试剂盒，制备λ噬菌体cDNA文库。b)cDNA文库的第一次筛选将感染由上述a)所述方法得到的λ噬菌体cDNA文库的大肠杆菌涂布在直径9cm的琼脂培养皿(NZY培养基0.5％氯化钠，0.2％硫酸镁7水合物，0.5％酵母提取物，1％酪蛋白水解物，1.5％琼脂)上，并使每个平皿形成1.8×105个噬菌斑，37℃培养8小时。在该形成噬菌斑的琼脂培养基的14个位置上，用250μl大口径移液枪枪头(RAININ公司制)的尖头部分，连带噬菌斑挑取琼脂培养基，将这些琼脂培养基片置于分别装有100μl SM缓冲液(0.1M氯化钠，8mM硫酸镁，50mMTris-盐酸(pH7.5)，0.01％明胶)的塑料离心管中，用振荡混合器激烈混悬并在4℃放置1-2小时后，12000×g离心5分钟，回收上清作为噬菌体悬浮液。
另一方面，作为PCR中使用的引物，将具有下述核苷酸序列的寡核苷酸，用DNA自动合成仪(型号394，(株)Perkin-Elmer日本应用生物技术系统事业部制)，按照亚磷酰胺法(Matteucci，M.D.，andCaruthers，M.H.(1981)J.Am.Chem.Soc.103，3185-3191)合成。引物15’-gactgatcaa atatgttgag ctt-3’(序列表序列号5)以及引物25’-tgcatccaga gtggatccag a-3’(序列表序列号6)将由上述方法得到的噬菌体悬浮液5μl与2.5μl的10×PCR用缓冲液(宝酒造(株)社制的Taq聚合酶附带)、4μl的dNTP混合液(各2.5mM，宝酒造(株)社制的Taq聚合酶附带)、各1μl分别调节至7.5μM的上述引物1及2、0.25μl的Taq聚合酶(宝酒造(株)社制)、11.25的灭菌水混合，首先在94℃加热5分钟后，接着将94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒作为一个温度循环，进行30个循环，最后在72℃保温7分钟后，于4℃保存。反应物在4％琼脂糖凝胶(用FMCBioProducts公司制的NuSieve3∶1琼脂糖调制)进行电泳，分析特异扩增的片段。由此对14个噬菌体悬浮液进行筛选的结果，得到了2个特异扩增目的cDNA片段的阳性样品。2)第二次筛选以小鼠基因组DNA(ClonTech公司制)100ng为模板，按上述b)所述条件进行PCR，进行琼脂糖凝胶电泳回收扩增的DNA片段。以该DNA片段为模板，进行生成用multi-prime DNA标记系统(AmershamPharmacia公司制)标记32P的DNA片段的反应后，将反应液注入到镍柱(Amersham Pharmacia公司制)中。将该柱用400μl的TE(10mMTris-盐酸(pH7.5)，1mM EDTA)洗涤一次，再用400μl的TE洗涤并回收洗脱液。将该洗脱组分的全部作为以下第二次筛选的标记探针。
另一方面，将在上述b)中判断为阳性的噬菌体悬浮液用SM缓冲液稀释100倍，用其中2μl噬菌体悬浮液感染大肠杆菌后，涂布于直径9cm琼脂培养皿上，37℃培养8小时。在该形成噬菌斑的琼脂培养基上，覆盖上合乎平皿内经的圆形尼龙膜(Amersham Pharmacia公司制的High bond N+)，4℃放置5分钟转移噬菌斑。用18G注射针在膜的三个位置上穿透至琼脂培养基做上三个位置契合用标记后，剥离膜后依次浸渍在碱溶液(1.5M氯化钠，0.5M氢氧化钠)2分钟，中和溶液(1.5M氯化钠，0.5M Tris-盐酸(pH8.0))5分钟，含2×SSC、0.2MTris-盐酸(pH7.5)的溶液中30秒钟后，在室温完全风干。
将该膜在20ml杂交溶液(Clon Tech公司制的ExpressHyb杂交液)中68℃保温1小时后，换成含标记探针的8ml杂交溶液于68℃保温6小时。然后，将该膜于含2×SSC、0.05％SDS的溶液中反复进行3次室温缓缓振荡15分钟的洗涤操作，再用含0.1×SSC、0.1％SDS的溶液反复进行3次50℃、30分钟的洗涤操作。
洗涤后的膜进行放射自显影，将确认为阳性的位置上的原噬菌斑从琼脂培养基中回收，将该噬菌体悬浮液用上述b)所述条件进行PCR，结果表明10个阳性噬菌斑样品中有6个可以特异扩增DNA片段。
将其中扩增结果最理想的样品的噬菌体悬浮液，用ZAP expresscDNA Giga pack III gold克隆试剂盒(Stratagene公司制)中附带的辅助噬菌体及宿主菌，并按照该试剂盒中附带的方案进行体内剪切(invivo excision)，在琼脂培养基上形成含噬菌体粒子的大肠杆菌菌落。分离这些菌落并分别提取噬菌体粒子，用上述b)所述方法进行PCR的结果，筛选特异扩增DNA片段的菌落并进行培养，分离携有具有1.6kbp cDNA插入片段的噬菌体粒子#55-1的转化大肠杆菌E.colipBK/m55-1 SANK 72199。
得到的噬菌体粒子#55-1中插入的cDNA全长核苷酸序列用(株)Perkin Elmer日本应用生物技术系统事业部制的ABI prism 337DNA测序仪或3700DNA测序仪进行分析的结果，可知为序列表序列号1中所示序列(其中，序列表序列号1中核苷酸序号1-8为来自载体的衔接序列)。该序列与在Gen Bank数据库中注册为小鼠血管生成因子相关蛋白质3的序列(注册号AF162224)相同。另外，携有该噬菌体粒子#55-1的转化大肠杆菌E.coli pBK/m55-1 SANK 72199于1999年(平成11年)11月19日委托日本国茨城县筑波市东1丁目1-3号的工业技术院生命工学工业技术研究所进行国际保藏，保藏编号为FERM BP-6940。实施例 1.Northern blot分析a)从小鼠脏器提取总RNA为了研究表达参考例1中得到的cDNA的组织，进行Northern blot分析。首先，从KK小鼠(高脂血症小鼠)及KK/San小鼠(低脂血症变异小鼠，白木等，第7届糖尿病动物研究会(1993年))的睾丸(testis)、脾脏(spleen)、肾脏(kidney)、小肠(small intestine)、肝脏(liver)及脑(brain)中提取总RNA。解剖18周龄的KK小鼠及KK/San小鼠，分别摘出各脏器后，迅速置于液氮中急速冷冻后，于-80℃保存。对于脏器0.5g加入约15ml的TRIzol试剂(Gibco BRL公司制)，用超速匀浆器Polytoron(Ckinematica公司制)在冰中进行匀浆(6级2分种)。将此在室温静置5分钟后，加入3ml氯仿并用手激烈颠倒混合15秒。再于室温静置3分钟后，于12000×g、4℃离心15分钟。离心后回收上清，加入0.8体积不含核糖核酸酶的异丙醇进行混合。将此在室温静置10分钟，于12000×g、4℃离心10分钟后，去除上清并加入不含核糖核酸酶的70％乙醇。将此于12000×g、4℃离心10分钟后，去除上清并干燥沉淀后，于-80℃保存。b)总RNA的电泳及印迹用不含核糖核酸酶的重蒸水将回收的各脏器总RNA调节至4μg/μl后，将该RNA液5μl与RNA样品缓冲液(1.15×MOPS缓冲液1×MOPS缓冲液含有20mM MOPS，5mM乙酸钠，1mM乙二胺四乙酸(以下，略作“EDTA”))，2.4M甲醛，57％甲酰胺，7％甘油，18μg/ml溴酚蓝，18μg/ml二甲苯胺，0.18mM EDTA)16μl混合，65℃保温10分钟后，在冰上放置5分钟。将该溶液全部注入到含1.17％福尔马林的电泳用琼脂糖凝胶(1×MOPS缓冲液，1.17％琼脂(Bio-Rad公司制的高强度分析用琼脂)，0.66M甲醛)的1个上样孔中进行电泳。电泳过程为，在放入含500ng/ml溴化乙锭的1×MOPS缓冲液的submarine电泳槽中，于50V通电约1小时后，再于100V通电约1.5小时。电泳结束后，将琼脂糖凝胶中的RNA按毛细管转移法(Maniatis，T.等(1982)《分子克隆实验指南》，冷泉港实验室，NY)转移过夜(转移用溶液使用20×SSC)至尼龙膜(Amersham Pharmacia公司制的High bond N+)上。将该膜用2×SSC洗涤5分钟后，风干，用交联用紫外线照射装置(Tomi-精工(株)社制的Spectrolinker XL-1000)进行紫外线照射(1200J/cm2)以固定RNA。c)探针的制备用参考例1的b)中合成的引物，使用Thermal cycler((株)PerkinElmer日本应用生物技术系统事业部制的Gene amplifier PCR系统9600)并在以下的条件进行PCR。首先，在引物(终浓度分别为0.5μM)和Tween20(Sigma公司制，终浓度0.1％)中加入灭菌水调节总量至7.5μl后，添加2×PCR solution premix Taq(宝酒造(株)社制，含0.05单位/μl Taq聚合酶，0.4mM dNTPs，20mM Tris-盐酸(pH8.3)，100mM氯化钾，3mM氯化镁)7.5μl再加入小鼠基因组DNA(ClonTech公司制)1μl(相当于100ng)，调制反应液。将该反应液先在94℃加热3分钟后，进行35个94℃30秒、55℃1分钟、72℃45秒的温度循环，然后于4℃保存。
取该PCR后的反应液1μl，按TA克隆试剂盒(Invitrogen公司制的Dual promoter version A)附带的方案使用该试剂盒，将扩增的DNA片段克隆到质粒载体中。用该重组质粒载体转化感受态大肠杆菌，在含50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上进行培养。其结果，筛选出显示氨苄青霉素抗性并生长的大肠杆菌菌落，用4ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基37℃培养过夜。从其中3.5ml的培养液中用质粒自动提取装置(Kurabo公司制的PI-50)回收质粒DNA。对得到的质粒DNA进行核苷酸序列分析，将插入目的PCR产物的质粒用于以下的操作。
将筛选的质粒DNA 8μg用限制酶EcoRI消化后，进行酚/氯仿萃取、乙醇沉淀，得到的沉淀溶解于灭菌水10μl中。该溶液中加入着色液(0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯胺，15％Ficoll(型号400))2μl，将全部进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(胶浓度8％，100V，室温3小时)。电泳后的凝胶用溴化乙锭染色后，在紫外线照射下用刀片将相当于目的DNA的条带(约200bp，序列表序列号11)部分的凝胶片切出，转移到微量离心管中进行粉碎。向其中加入300μl抽提缓冲液(0.5M醋酸铵，10mM EDTA(pH8.0)，0.1％SDS)，37℃保温过夜后，进行酚/氯仿萃取2次，乙醇沉淀1次，将沉淀用灭菌水20μl溶解。
对于得到的DNA溶液5μl，按照参考例1的c)中所述方法制备32P标记的探针(400μl)。d)杂交将上述b)中制成的膜放入20ml杂交溶液(Clon Tech公司制的ExpressHyb杂交液)中，68℃孵育1小时(预杂交)后，在含32P标记探针的20ml杂交溶液中68℃孵育过夜。然后，将膜在含2×SSC、0.05％SDS的溶液中室温20分钟洗涤3次。再于含0.1×SSC、0.1％SDS的溶液中50℃20分钟洗涤3次后，进行放射自显影。
其结果，只在肝脏中发现有检测基因的表达，并且其表达量在KK/San小鼠(低脂血症小鼠)中明显要比在KK小鼠(高脂血症小鼠)中低(图1)。
上述实验体系中，例如由在待测物质存在下或非存在下培养的KK小鼠初代培养肝细胞制备RNA样品，通过进行以后步骤同样的操作，可研究待测物质作为高脂血症的治疗或预防剂的效果。该实验中降低检测基因的表达量的待测物质可作为高脂血症的治疗或预防剂。同时处理多个检测样品时，也可以省去电泳步骤而进行斑点印迹或狭线印迹。参考例2.人cDNA的克隆1)探针的制备为了获得对应于序列表序列号1所示小鼠cDNA的人cDNA，合成了具有下述核苷酸序列的寡核苷酸。5’-tcctctagtt atttcctcca g-3’(序列表序列号7)，以及5’-tggtttgcca gcgatagatc-3’(序列表序列号8)然后，混合人基因组DNA(Boeheringer公司制，200mg/ml)1μl、Taq聚合酶(宝酒造(株)社制的rTaq，5单位/μl)1μl、10×PCR用缓冲液(宝酒造(株)社制)10μl、dNTP混合液(各2.5mM)16μl、2μM引物各2μl、以及灭菌水68μl。将此反应液于94℃加热5分钟后，接着反复30次94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒的温度循环，最后于72℃保温10分钟后，于4℃保存。将该反应液用2％琼脂糖凝胶进行电泳后，切出扩增DNA条带部分的凝胶片并进行纯化。将由此得到的DNA用DNA标记试剂盒(宝酒造(株)社制的BcaBest标记试剂盒)标记上32P后，作为下述2)中的探针。2)cDNA文库的第一次筛选将市售的人肝脏cDNA文库(Clon Tech公司制的Human Liver5’-STRETCH cDNA文库)中1×106个噬菌斑的DNA固定在尼龙膜上。即，将感染cDNA文库的大肠杆菌涂布在20个直径9cm的琼脂培养皿上，每个平皿形成5×104个噬菌斑，37℃培养8小时。在该形成噬菌斑的琼脂培养基上，覆盖上合乎平皿内经的圆形尼龙膜(AmershamPharmacia公司制的High bond N+)，4℃放置5分钟转移噬菌斑。用18G注射针在膜的三个位置上穿透至琼脂培养基做上三个位置契合用标记后，剥离膜后依次浸渍在碱溶液(1.5M氯化钠，0.5M氢氧化钠)2分钟，中和溶液(1.5M氯化钠，0.5M Tris-盐酸(pH8.0))5分钟，含2×SSC、0.2M Tris-盐酸(pH7.5)的溶液中30秒钟后，在室温完全风干。然后，用交联用紫外线照射装置(Tomi-精工(株)社制的Spectrolinker XL-1000)照射紫外线(1200J/cm2)以固定DNA。
将由此制成的膜在含上述1)中得到的标记探针的杂交溶液(Clon Tech公司制的ExpressHyb杂交液)中65℃孵育过夜。然后，将膜用含2×SSC、0.05％SDS的溶液于室温洗涤3次，每次15分钟，然后再于含0.1×SSC、0.1％SDS的溶液50℃洗涤3次，每次30分钟，然后进行放射自显影。
其结果，将与确定为阳性信号的位置契合的噬菌斑，连带培养基从上述琼脂培养基中抠出，分别放入100μl的SM缓冲液(0.1M氯化钠，8mM硫酸镁，50mM Tris-盐酸(pH7.5)，0.01％明胶)中充分悬浮后，于4℃放置2小时，然后12000×g离心5分钟并回收上清。
用由此得到的1次阳性噬菌体液再次感染大肠杆菌后，在直径9cm的琼脂培养皿上进行培养，使每个平皿形成500个噬菌斑。通过重复上述操作进行第二次筛选。用得到的2次阳性克隆噬菌体感染大肠杆菌BM 25.8(ClonTech公司制)后，于37℃在琼脂培养基上进行培养，形成含噬菌体粒子的大肠杆菌菌落。分离菌落，用液体培养基进行小量培养后提取噬菌体粒子，用限制酶酶切进行插入片段的分析，结果分离出携有含1.6kbp插入片段的克隆#h5-1的大肠杆菌E.colipTrip/h55-1 SANK 72299。分析该克隆中插入片段的核苷酸序列的结果，与在GenBank数据库中注册为人血管生成因子相关蛋白质3的cDNA序列(注册号AF152562)一致(序列表序列号3，其中，序列表序列号3中核苷酸序号1-14为来自载体的衔接序列)。另外，携有该噬菌体粒子#h55-1的转化大肠杆菌E.coli pTrip/h55-1 SANK 72299于1999年(平成11年)11月19日委托日本国茨城县筑波市东1丁目1-3号的工业技术院生命工学工业技术研究所进行国际保藏，保藏编号为FERM BP-6941。实施例2.多克隆抗体的制备为了制备识别序列表序列号1及序列号3所示核苷酸序列编码的氨基酸序列、即具有序列表序列号2及序列表序列号4所示氨基酸序列的多肽的抗体，作为抗原，用化学合成法合成了具有选自这些小鼠及人多肽之间保守性区域的2种氨基酸序列的多肽(使用仪器PerkinElmer公司制的型号433)。Glu-Pro-Lys-Ser-Arg-Phe-Ala-Met-Leu-Asp-Asp-Val-Lys-Cys (55-1-N1，序列表序列号9)，以及Cys-Gly-Glu-Asn-Asn-Leu-Asn-Gly-Lys-Tyr-Asn-Lys-Pro-Arg (55-1-C1，序列表序列号10)其中，55-1-N1的氨基酸序列由于在随后要结合钥孔血蓝蛋白(以下，略作“KLH”)作为载体，所以在原有氨基酸序列的C末端附加上半胱氨酸残基。另一方面，55-1-C1中结合KLH的N末端的半胱氨酸为原有氨基酸序列自身携带的。
其次，将合成肽55-1-N1 11.1mg及KLH 21.5mg，或55-1-C1 10.2mg及KLH 21.2mg分别用N-(6-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺(EMCS，同仁化学研究所(株)社制)试剂进行缩合(作为缩合反应溶剂使用含8M脲、0.9％氯化钠的0.02M磷酸缓冲液(pH7.5)，于室温保温15小时)。将该反应液加到8M脲溶液中后，对流动水进行透析，再对纯水进行透析后进行冻干，得到结合KLH的肽抗原。向这些肽抗原约10mg中加入1ml生理盐水，用超声波振荡器(sonicator)、振荡混合器、玻璃棒等制成细致均匀的悬浮液。然后，用生理盐水将总量调节至7.5ml，再取1ml分装到小瓶中冷冻保存。
进行免疫时，将1份上述小瓶的抗原溶液进行融解并与等量的佐剂混合后，分别在两只兔子的背上进行皮下或皮内注射。佐剂使用弗氏完全佐剂，第2次以后的免疫过程中则改为使用弗氏不完全佐剂。免疫是每隔2周进行4次，第2次免疫后进行试验采血，血清中的抗体效价用固相法的酶联免疫测定法(ELISA)进行测定。将各抗原肽涂在96孔ELISA用微量板中，使用辣根过氧化物酶标记抗兔IgG抗体作为二抗。第4次免疫起13天后进行完全采血。
采血后，用亲和柱纯化抗体。即，在使N-(6-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺(EMCS，同仁化学研究所(株)社制)和氨基烷基琼脂糖(Bio-Rad公司制的Affigel 102)反应后活化的载体EMC-琼脂糖(约5ml)上结合多肽(55-1-N1为7.82mg，55-1-C1为8.07mg)。未反应的EMC基用0.1M盐酸巯基乙胺(含5mM EDTA)进行处理使之惰化。用PBS(含0.02M磷酸缓冲液(pH7.0)，0.9％氯化钠)将抗血清8ml稀释2倍，用硫酸铵沉淀(终浓度40％)法得到沉淀物，将该沉淀物溶解于PBS中，脱盐后用PBS进行透析，将该透析液作为粗IgG组分。分3批用亲和柱进行色谱操作。即，将1/3的粗IgG组分上样到亲和柱中，反复3次将直接通过的组分再次上样到柱中的操作。合并直接通过部分和洗脱液得到的40ml作为非吸附组分进行收集。为了除去非特异结合在柱上的物质，用含1M氯化钠的PBS充分洗涤后，用4M氯化镁溶液、3.5M硫氰酸钾溶液及0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.3)依次洗涤柱子，将与结合在柱载体上的多肽特异结合的抗体作为亲和纯化抗体进行洗脱。目的抗体由于含在4M氯化镁溶液及3.5M硫氰酸钾溶液的洗脱液中，因此将各洗脱液用PBS进行透析后，用作以下操作中的抗体。实施例3.COS-1细胞中的表达及Western blot分析将参考例2中得到的#h5-1噬菌体粒子DNA用限制酶EcoRI和XbaI消化，进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用实施例1的c)中所述的方法分离纯化含cDNA的约1.6kb片段。另一方面，将高效表达载体pME18S(Hara，T.et al.(1992)EMBO.J.11，1875-；《生物技术手册第3辑基因克隆实验方法》，横田崇、新井贤一编著，羊土社，p18-20)同样用EcoRI和XbaI消化，末端脱磷酸化后，用DNA连接试剂盒(宝酒造(株)社制的version2)与上述cDNA片段连接。用该DNA转化大肠杆菌，对得到转化株携有的质粒DNA进行限制酶分析，筛选携有1.6kb DNA片段的菌株命名为pMEh55-1。
然后，将携有pMEh55-1的转化大肠杆菌在含50μgml氨苄青霉素的100ml液体LB培养基中37℃培养过夜。从该培养液中，用质粒纯化试剂盒(Promega公司制的Wizard purefection质粒DNA纯化系统)回收pMEh55-1 DNA，用氯化铯法进行纯化。
用由此得到的质粒pMEh55-1转染COS-1细胞。转染COS-1细胞时，通过使用(株)岛津制作所的基因导入装置GTE-1的电穿孔法进行。即，首先从将COS-1细胞增殖至半汇合状态的烧瓶中，通过胰蛋白酶-EDTA处理回收细胞，用PBS(-)缓冲液(宝酒造(株)社制)洗涤。然后将该细胞用PBS(-)缓冲液悬浮至6×107个细胞/ml。将通过上述方法回收的质粒DNA(pMEh55-1)用PBS(-)缓冲液调节至200μg/ml。将细胞悬浮液和DNA溶液各20μl混合，将此装入电极间距2mm的小室中，将600-30μsec的脉冲以1秒钟的间隔施加2次。将该小室于4℃冷却5分钟后，将其中的细胞-DNA混合液加到含10％胎牛血清的DMEM 10ml中，转移到平皿中后于37℃、5％CO2培养过夜。然后去除培养上清，用无血清培养基(DMEM)洗涤细胞，加入DMEM10ml培养3天。
从由此得到的细胞培养物中回收培养上清。将不含cDNA的阴性对照质粒pME18S或用pMEh55-1转染得到的COS-1细胞的无血清培养上清0.3ml分别用三氯乙酸(以下，略作“TCA”)处理以沉淀蛋白质，通过离心得到沉淀。将该沉淀用冰冷丙酮洗涤并风干后，溶解于含SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)用2-巯基乙醇的样品缓冲液(Bio-Rad公司制)中，用4-20％聚丙烯酰胺密度梯度凝胶(第一化学药品(株)制的multi-gel 4/20)在还原条件下进行SDS-PAGE。
电泳后，将聚丙烯酰胺凝胶中的条带在转移缓冲液(192mM甘氨酸，20％甲醇，25mM Tris)中，用凝胶-膜转移装置(Marisol公司制的NP7513)于4℃、90分钟、200mA的条件转移至硝酸纤维素膜(Bio-Rad公司制)上。
对于转移后的硝酸纤维素膜，用实施例中得到的抗体(以下，略作“55-1-N1抗体”或“55-1-C1抗体”)进行Western blot分析。即，首先将硝酸纤维素膜用含0.05％Tween 20的PBS(以下，略作“0.05％Tween 20-PBS”)洗涤(室温15分钟1次，然后5分钟2次)后，装入塑料袋(商品名为Hybribag，Cosmobio公司制)中，加入含5％脱脂乳(雪印乳业(株)社制)的0.05％Tween 20-PBS 20ml，室温振荡1小时。1小时后取出膜，在0.05％Tween 20-PBS中进行15分钟1次、然后5分钟2次的洗涤操作。洗涤后，将膜转移至新的塑料袋中，添加含55-1-N1抗体或55-1-C1抗体(100倍稀释)、1％牛血清白蛋白(以下略作“BSA”，Sigma公司制)的0.05％Tween 20-PBS 20ml，室温振荡1小时。1小时后取出膜，用0.05％Tween 20-PBS溶液进行15分钟1次、5分钟2次的洗涤操作。然后，将膜转移至新的塑料袋中，加入用含1％BSA的0.05％Tween 20-PBS稀释2000倍的辣根过氧化物酶标记抗兔IgG抗体(Amersham Pharmacia公司制)稀释液20ml，室温振荡1小时。1小时后取出膜，用0.05％Tween 20-PBS进行15分钟1次、然后5分钟4次的洗涤操作。洗涤后，将膜置于包裹膜上，用ECL Western blotting检测溶液(Amersham Pharmacia公司制)检测55-1-N1抗体或55-1-C1抗体结合的条带(将膜置于包裹膜上，在ECLWestern blotting检测溶液中浸渍1分钟后，室温放置1小时以减低背景，用X光片进行感光(3秒钟))。其结果，通过两种抗体，在导入pMEh55-1质粒DNA得到的COS-1培养上清中检测出特异的条带(图2)。
对于表达参考例1中得到的小鼠cDNA的COS-1细胞培养上清也进行同样的实验。即，将参考例1中得到的噬菌体粒子#55-1 DNA用限制酶EcoRI和XbaI消化，将得到的约1.6kb插入DNA片段整合到pME18S中构建克隆(pME55-1)，并用上述同样的方法导入COS-1细胞中，回收培养上清。对于从此培养上清制备的样品，用55-1-N1抗体或55-1-C1抗体进行Western blot分析，用任一抗体进行检测时，均可在导入pME55-1质粒DNA得到的COS-1培养上清中检测出特异的条带。
在上述实验体系中，例如由待测物质存在下或非存在下培养的KK小鼠初代培养肝细胞的培养上清制备样品，通过进行以下步骤相同的操作，可以研究待测物质作为高脂血症的治疗或预防剂的效果。在该实验中，降低了检测抗原量的待测物质可以作为高脂血症的治疗或预防剂。同时处理多个检测样品时，也可以省去电泳步骤而进行斑点印迹或狭线印迹。实施例4.重组腺病毒的制备及在培养细胞中的表达用市售的试剂盒(宝酒造(株)制的腺病毒表达载体试剂盒)制备强制表达参考例1中得到的小鼠cDNA的重组腺病毒。即，用限制酶EcoRI及XbaI消化参考例1中得到的噬菌体粒子克隆#55-1，将得到的约1.7kb DNA片段平末端化后，作为插入DNA片段用于以下的操作。
另外，构建在由细胞肥大病毒增强子和家禽β-肌动蛋白启动子驱动表达的粘粒载体pAxCAwt(腺病毒表达载体试剂盒中附带)的限制酶SwaI识别位点插入DNA插入片段的粘粒pAxCA/mAP5。用磷酸钙转染系统(LifeTech公司制)将pAxCA/mAP5 DNA及末端蛋白质结合病毒DNA(DNA-TPC，腺病毒表达载体试剂盒中附带)共转染至293细胞(ATCC CRL1573)，分离重组腺病毒Ad/mAP-5，再在293细胞中扩增。另外，同样构建具有整合从对照粘粒pAxCAiLacZ中切出的LacZ基因的重组腺病毒载体的腺病毒Ad/LacZ，并在293细胞中进行扩增。从293细胞中回收扩增的病毒时，首先对病毒感染293细胞进行30秒×4次的超声波处理(使用Branson公司制的B-1200)，然后反复2次通过氯化铯密度梯度离心进行纯化的步骤。将得到的病毒液用添加10％甘油的PBS于4℃进行透析后，-70℃冷冻保存直至使用。
将由此得到的重组腺病毒以约5m.o.i.(多重感染度，multiplicity ofinfection)感染HeLa细胞(ATCC CCL2)，在无血清培养基(Dulbecco改进Eagle培养基(DMEM))中培养3-4天后，回收培养上清。将该上清1ml装入1.5ml体积Eppendorf管中，添加100μl三氯乙酸并在室温放置3分钟后，用台式离心机15000rpm离心5分钟。除去上清，加入冰冷的丙酮0.5ml充分搅拌后，再次用台式离心机15000rpm离心2分钟。除去上清，再加入冰冷的丙酮0.5ml充分搅拌后，用台式离心机15000rpm离心2分钟，除去上清，真空干燥沉淀物。将该沉淀溶解在10μl的蒸馏水中，与含2-巯基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液(Bio-Rad公司制)混合后，99℃加热5分钟，制备电泳用样品。将样品在4-20％聚丙烯酰胺密度梯度凝胶中进行电泳(电泳用缓冲液为25mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％SDS)后，在转移缓冲液中于4℃、1小时、200mA的条件转移至硝酸纤维素膜上。转移的膜在添加0.5％脱脂乳的PBS液中于4℃封闭过夜，用洗涤液(0.05％Tween 20-PBS)洗涤3次。然后，将膜装入用含5％胎牛血清的0.05％Tween 20-PBS将55-1-N1抗体纯化前的抗血清和55-1-C1抗体纯化前的抗血清的混合物稀释10000倍的反应液中，室温孵育1小时后，用洗涤液洗涤3次。接着，将膜在用含5％胎牛血清的0.05％Tween 20-PBS将辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(Bio-Rad公司制的H+L)稀释10000倍的反应液中室温孵育1小时后，用洗涤液洗涤5次。将该膜置于包裹膜上，在ECL Westernblotting检测溶液中浸渍1分钟后，室温放置1小时以减低背景，然后用X光片感光(3秒钟)。其结果，在感染重组腺病毒Ad/mAP-5的HeLa细胞培养上清样品带中检测出特异的条带(图3)。
另一方面，将噬菌体粒子克隆#h5-1携有的cDNA整合到腺病毒载体中，进而构建重组腺病毒(Ad/hAP5)，并进行同样的实验。对在HeLa细胞中进行表达的培养上清进行Western blot分析的结果，同样可检测出特异的条带(图3)。实施例5.利用重组腺病毒进行体内表达将通过上述方法纯化的重组腺病毒Ad/mAP-5或Ad/LacZ，用含10％甘油的PBS稀释至2×1010pfu(噬菌斑形成单位，plaque formingunit)/ml，然后分别在3只(Ad/mAP-5)或2只(Ad/LacZ)13-14周龄雄性KK/San小鼠身上，各100μl(2×109pfu)通过尾静脉注射进行接种。接种1天后，从各只小鼠的眼底用采血管采血，用台式离心机5200rpm离心15分钟分离血浆，用中性脂肪测定试剂盒(和光制药(株)社制的triglyceride E-test Wako)测定中性脂肪浓度。相对于Ad/LacZ接种小鼠组的血中中性脂肪浓度没有明显的差异，在Ad/mAP-5接种小鼠组和其它2组之间血中中性脂肪浓度具有明显的差异(图4)。
另一方面，将噬菌体粒子克隆#h5-1携有的cDNA整合到腺病毒载体中，进而构建重组腺病毒(Ad/hAP5)，并进行同样的实验。在雄性KK/San小鼠中进行表达的结果，血中中性脂肪浓度明显增高，可确认人源分子也可在小鼠体内发挥作用(图4)。
另外，从这些血中中性脂肪浓度明显具有差异并感染腺病毒的小鼠组肝脏中回收总RNA，按照实施例1所述的方法进行Northern blot分析时，可确认导入基因确实进行了高效表达(图5)。从腺病毒感染KK/San小鼠组中检测出的条带比在未进行基因操作的KK小鼠中检测出的条带要大，这是由于重组腺病毒载体中有效的转录起始位点或poly(A)附加信号与原来基因上的具有差异的缘故。不管怎样，在整合到重组腺病毒载体中的cDNA中，由于在最初的翻译起始密码的紧5’末端侧存在与该翻译起始密码在同一阅读框架内的终止密码，因此该mRNA大小上的差异不会影响翻译的氨基酸序列。实施例6.重组蛋白质的纯化及N末端氨基酸序列的测定按照以下所述的方法，用实施例3中制备的、插入具有序列表序列号3中所示核苷酸序列的人cDNA的表达载体pMEh55-1转化动物细胞，纯化分泌在该转化细胞培养上清中的重组蛋白质，并测定其N末端氨基酸序列。(1)转化体的获得及培养上清的制备在含10％FCS(Gibco BRL公司制)、10单位/ml青霉素及10μl/ml链霉素(Gibco BRL公司制)的αMEM(Gibco BRL公司制)培养基中增殖二氢叶酸还原酶缺失CHO细胞(ATCC CRL-9096)后，使用转染试剂(Roche Diagnostics公司制的FuGENE6)，将pMEh55-1质粒以1μg/106细胞的比例进行转染。具体来说，细胞用200个细胞培养皿(150mm，Coning公司制)培养至1.5×107细胞/平皿，转染时每个平皿使用15μg的pMEh55-1质粒。转染操作后的细胞在上述含FCS的培养基中培养24小时后，将培养基更换为无血清αMEM培养基(30ml/平皿)，再培养3天，回收无血清培养上清6L。(2)重组蛋白质的纯化1)在柱(Amersham Pharmacia Biotech公司制的stream line C-100)中填充1.6L胶体积的Sephadex G25(Amersham Pharmacia Biotech公司制)，注入600ml上述(1)中得到的培养上清(流速为20ml/分钟)。然后，将洗脱缓冲液(20mM Tris-盐酸(pH7.5)，0.01％叠氮钠(Sigma公司制)，0.05％蛋白酶抑制剂混合液(Sigma公司制)，0.05％Tween20(Sigma公司制)；以下略作“A液”)以流速50ml/分钟流过柱子，回收开始时的1500ml体积的洗脱液。该操作实施10次，进行上述(1)中得到的6L培养上清的脱盐及低分子物质去除操作。2)然后，上述1)中的得到的洗脱液用FPLC装置(Amersham PharmaciaBiotech公司制的Biopilot system)，按照以下所述的条件，通过离子交换色谱进行分级。
柱子 将Q Sepharose fastflow(Amersham Pharmacia Biotech公司制)100ml填充在XK50/100柱(Amersham Pharmacia Biotech公司制)中。
A液参照上述B液20mM Tris-盐酸，1M氯化钠(pH7.5)，0.01％叠氮钠，0.05％蛋白酶抑制剂混合液，0.05％Tween 20流速10ml/分钟收集组分各10ml/管温度4℃洗脱条件100％A液至100％B液的直线浓度梯度(60分钟)，回收氯化钠浓度0.3～0.4M的洗脱组分。3)然后，对于上述2)中通过离子交换色谱回收的组分，用FPLC并按照以下所述的条件组，进行特异性的亲和色谱。
柱子将Affigel blue(Bio-Rad公司制)10ml填充在XK16/40柱(Amersham Pharmacia Biotech公司制)中。
缓冲液组成
C液20mM Tris-盐酸，0.5M氯化钠(pH7.5)，0.01％叠氮钠，0.05％蛋白酶抑制剂混合液，0.05％Tween 20D液20mM Tris-盐酸，1M氯化钠(pH7.5)，0.01％叠氮钠，0.05％蛋白酶抑制剂混合液，0.05％Tween 20流速1.5ml/分钟温度4℃上述2)中回收的组分流经柱子后，流入60ml C液进行洗涤，然后流入100ml D液，回收由D液洗脱出的组分。4)上述3)中得到的洗脱液中加入等量(100ml)的A液，对于该混合液，用FPLC并按照以下所述的条件组，进行特异性的亲和色谱。
柱子将lentil lectin Sepharoses 4B(Amersham Pharmacia Biotech公司制)10ml填充在XK16/40柱中。
缓冲液组成C液参照上述F液20mM Tris-盐酸，0.5M氯化钠，0.3M甲基吡喃甘露糖苷(pH7.5)，0.01％叠氮钠，0.05％蛋白酶抑制剂混合液，0.05％Tween20流速1ml/分钟温度4℃样品通过柱子后，流入50ml C液进行洗涤，然后流入50ml F液，回收由F液洗脱出的组分。
将该洗脱液转移到透析管(排除分子量界限10KDa，Gibco BRL公司制)中，用含0.01％叠氮钠及0.1％蛋白酶抑制剂混合液的DulbeccoPBS(-)(日本制药(株)社制)2L，于4℃透析过夜。然后，回收透析管中的溶液，向其中4ml中加入1/10体积的含4mg/ml脱氧胆酸钠的TCA(0.4ml)，回收得到的沉淀，接着加入丙酮并回收得到的沉淀，溶解于50μl的灭菌超纯水中。(3)N末端氨基酸序列的测定上述(2)中纯化的样品中加入PNGaseF(New England Biolab公司制)，切断N结合型糖链。具体来说，首先在50μl的样品中添加6μl的10×变性缓冲液(PNGaseF试剂中附带)进行搅拌，在沸水浴中加热10分钟。将此冷却至室温后，依次加入6μl的10％Nonidet P-40及6μl的10×G7缓冲液(以上均为PNGaseF试剂中附带)进行搅拌。向其中加入3μl的PNGaseF，边搅拌边在37℃的水浴中保温2小时。
对于该N结合型糖链切断反应后的反应液，在使用4～20％浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶(第一化学药品(株)社制的Multi gel 4/20)及微型板电泳装置(日本eido(株)社制)的还原条件下进行SDS-PAGE。电泳后，用凝胶-膜转移装置(Marisol公司制)，将胶中分离的蛋白质转移至0.2μm孔径的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad公司制)上(2mA/cm2，4℃2小时)。转移后的膜用100％甲醇(和光纯药(株)社制)浸润10秒钟后，用超纯水洗涤2分钟，然后用考马斯染色液(Bio-Rad公司制)染色5分钟，再将膜浸在甲醇中脱色2分钟的结果，看到了相当于约50KDa的条带。切出该条带部分的膜，用蛋白测序仪(岛津制作所(株)社制的PPSQ-10)进行N末端序列的分析。
其结果，上述约50KDa的条带的N末端氨基酸序列为Ser-Arg-Ile-Asp-Gln-Asp-Asn-Ser-Ser-Phe-Asp(序列表序列号4中氨基酸序号17至27)。由此，可知序列表序列号3中核苷酸序号78至1457所示核苷酸序列编码的蛋白质在哺乳动物细胞中N末端16个肽(序列表序列号4中氨基酸序号1至16)被切断，并以将紧随其后的丝氨酸残基(序列表序列号4中氨基酸序号17)作为N末端的成熟体形式进行分泌。
产业上的实用性如上所述，根据本发明，由序列表序列号1中核苷酸序号47至1411所示核苷酸序列或序列表序列号3中核苷酸序号78至1457所示核苷酸序列构成的基因是使血中的中性脂肪浓度上升的基因因子之一，进而，可确定抑制该基因表达量的物质可作为高脂血症的治疗或预防剂。即，在本发明的方法、以及在该方法的进行核酸检测的方式中作为探针或引物使用的多核苷酸，以及在该方法的进行多肽检测的方式中使用的抗体，均可用于高脂血症的治疗或预防剂的探索研究中。
序列表<110>三共株式会社(Sankyo Company，Limited)<120>高脂血症的治疗或预防剂的检验方法<130>FP-200054<140><141><150>JP H11-349976<151>1999-12-09<160>11<170>Patent In version 2.0<210>1<211>1604<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<220><221>CDS<222>(47)..(1411)<223><400>1ggcacgaggt tccaaattgc ttaaaattga ataattgaga caaaaa atg cac aca 55Met His Thr1att aaa tta ttc ctt ttt gtt gtt cct tta gta att gca tcc aga gtg 103Ile Lys Leu Phe Leu Phe Val Val Pro Leu Val Ile Ala Ser Arg Val5 10 15gat cca gac ctt tca tca ttt gat tct gca cct tca gag cca aaa tca 151Asp Pro Asp Leu Ser Ser Phe Asp Ser Ala Pro Ser Glu Pro Lys Ser20 25 30 35aga ttt gct atg ttg gat gat gtc aaa att tta gcg aat ggc ctc ctg 199Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn Gly Leu Leu40 45 50cag ctg ggt cat gga ctt aaa gat ttt gtc cat aag act aag gga caa 247Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr Lys Gly Gln55 60 65att aac gac ata ttt cag aag ctc aac ata ttt gat cag tct ttt tat 295Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln Ser Phe Tyr70 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权利要求
1.检验物质作为高脂血症的治疗或预防剂的效果的方法，该方法包括以下步骤；1)将培养细胞在待测物质存在下或非存在下进行培养；2)检测由上述1)得到的培养细胞中，具有下述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列(其中，序列中的t改为读作u)的mRNA的表达量；a)序列表序列号1的核苷酸序号47至1411所示的核苷酸序列；b)序列表序列号3的核苷酸序号78至1457所示的核苷酸序列；c)插入到转化大肠杆菌E.colipBK/m55-1 SANK 72199(FERMBP-6490)携有的噬菌体粒子中的DNA所具有的核苷酸序列；d)插入到转化大肠杆菌E.colipTrip/h55-1 SANK 72299(FERMBP-6491)携有的噬菌体粒子中的DNA所具有的核苷酸序列；e)在严格条件下与由上述a)乃至d)任一项所述核苷酸序列的反义序列构成的多核苷酸杂交，并编码具有可使血中的中性脂肪浓度上升的活性的多肽的核苷酸序列；以及3)比较上述步骤2)的结果，即，比较在待测物质非存在下培养的细胞和待测物质存在下培养的细胞之间检测出的mRNA表达量。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，培养细胞来自肝脏。
3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于，培养细胞来自灵长类或啮齿类动物。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于，培养细胞来自人或小鼠。
5.权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，mRNA表达量的检测方法为Northern blot、斑点印迹或狭线印迹。
6.权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，mRNA表达量的检测方法为RT-PCR。
7.权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，mRNA表达量的检测方法为核糖核酸酶保护分析法。
8.权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，mRNA表达量的检测方法为连缀转录分析法。
9.具有与含有下述a)乃至d)任一项所述核苷酸序列(其中，序列中的t改为读作u)的mRNA在严格条件下杂交的核苷酸序列的多核苷酸(其中，含有下述a)乃至d)所述核苷酸序列的除外)；a)序列表序列号1的核苷酸序号47至1411所示的核苷酸序列；b)序列表序列号3的核苷酸序号78至1457所示的核苷酸序列；c)插入到转化大肠杆菌E.coli pBK/m55-1 SANK 72199(FERMBP-6490)携有的噬菌体粒子中的DNA所具有的核苷酸序列；d)插入到转化大肠杆菌E.colipTrip/h55-1 SANK 72299(FERMBP-6491)携有的噬菌体粒子中的DNA所具有的核苷酸序列。
10.序列表序列号1的核苷酸序号47至1411所示核苷酸序列的一侧或两侧末端缺失了1个核苷酸或2个核苷酸以上，且至少由15个核苷酸组成的DNA。
11.序列表序列号3的核苷酸序号78至1457所示核苷酸序列的一侧或两侧末端缺失了1个核苷酸或2个核苷酸以上，且至少由15个核苷酸组成的DNA。
12.检验物质作为高脂血症的治疗或预防剂的效果的方法，该方法包括以下步骤；1)将培养细胞在待测物质存在下或非存在下进行培养；2)利用可特异识别该多肽的抗体检测上述1)得到的培养细胞上清中，由下述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列编码的氨基酸序列或其一部分构成的多肽的产量；a)序列表序列号1的核苷酸序号47至1411所示的核苷酸序列；b)序列表序列号3的核苷酸序号78至1457所示的核苷酸序列；c)插入到转化大肠杆菌E.coli pBK/m55-1 SANK 72199(FERMBP-6490)携有的噬菌体粒子中的DNA所具有的核苷酸序列；d)插入到转化大肠杆菌E.coli pTrip/h55-1 SANK 72299(FERMBP-6491)携有的噬菌体粒子中的DNA所具有的核苷酸序列；e)在严格条件下与由上述a)乃至d)任一项所述核苷酸序列的反义序列构成的多核苷酸杂交，并编码具有可使血中的中性脂肪浓度上升的活性的多肽的核苷酸序列；3)比较上述步骤2)的结果，即，比较在待测物质非存在下培养的细胞和待测物质存在下培养的细胞之间检测出的多肽量。
13.权利要求12所述的方法，其特征在于，可特异识别由a)乃至e)任一项所述核苷酸序列编码的氨基酸序列或其一部分构成的多肽的抗体为，可特异识别由序列表序列号2的氨基酸序号17-455所示氨基酸序列构成的多肽或其一部分、由序列表序列号2的氨基酸序号19-455所示氨基酸序列构成的多肽或其一部分、或由序列表序列号4的氨基酸序号17-460所示氨基酸序列构成的多肽或其一部分的抗体。
14.权利要求12或13所述的方法，其特征在于，可特异识别由a)乃至e)任一项所述核苷酸序列编码的氨基酸序列或其一部分构成的多肽的抗体为，可特异识别序列表序列号9的氨基酸序号1-13所示的氨基酸序列或序列号10的氨基酸序号1-14所示的氨基酸序列的抗体。
15.权利要求12至14任一项所述的方法，其特征在于，将由a)乃至e)任一项所述核苷酸序列编码的氨基酸序列或其一部分构成的多肽产量用可特异识别该多肽的抗体进行检测的操作为Western blot、斑点印迹或狭线印迹。
16.权利要求12至14任一项所述的方法，其特征在于，将由a)乃至e)任一项所述核苷酸序列编码的氨基酸序列或其一部分构成的多肽产量用可特异识别该多肽的抗体进行检测的操作为固相酶免疫定量法(ELISA法)或放射性同位素免疫定量法(RIA法)。
17.特异识别由下述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列编码的氨基酸序列或其一部分构成的多肽的抗体；a)序列表序列号1的核苷酸序号47至1411所示的核苷酸序列；b)序列表序列号3的核苷酸序号78至1457所示的核苷酸序列；c)插入到转化大肠杆菌E.coli pBK/m55-1 SANK 72199(FERMBP-6490)携有的噬菌体粒子中的DNA所具有的核苷酸序列；d)插入到转化大肠杆菌E.coli pTrip/h55-1 SANK 72299(FERMBP-6491)携有的噬菌体粒子中的DNA所具有的核苷酸序列；e)在严格条件下与由上述a)乃至d)任一项所述核苷酸序列的反义序列构成的多核苷酸杂交，并编码具有可使血中的中性脂肪浓度上升的活性的多肽的核苷酸序列。
18.权利要求17所述的抗体，其特征在于，该抗体可特异识别序列表序列号9的氨基酸序号1至13所示的氨基酸序列或序列号10的氨基酸序号1至14所示的氨基酸序列。
19.用于检验高脂血症的治疗或预防剂的试剂盒，该试剂盒中含有权利要求17或18所述的抗体。
20.检验物质作为高脂血症的治疗或预防剂的效果的方法，该方法包括下述步骤；1)将待测物质投给通过基因操作得到的、将含有下述a)乃至e)任一项所述核苷酸序列的外源基因以可高效表达该基因的方式导入的非人动物；a)序列表序列号1的核苷酸序号47至1411所示的核苷酸序列；b)序列表序列号3的核苷酸序号78至1457所示的核苷酸序列；c)插入到转化大肠杆菌E.coli pBK/m55-1 SANK 72199(FERMBP-6490)携有的噬菌体粒子中的DNA所具有的核苷酸序列；d)插入到转化大肠杆菌E.coli pTrip/h55-1 SANK 72299(FERMBP-6491)携有的噬菌体粒子中的DNA所具有的核苷酸序列；e)在严格条件下与由上述a)乃至d)任一项所述核苷酸序列的反义序列构成的多核苷酸杂交，并编码具有可使血中的中性脂肪浓度上升的活性的多肽的核苷酸序列；2)测定1)的动物血中的中性脂肪浓度。
21.权利要求20所述的方法，其特征在于，1)的非人动物为小鼠。
22.权利要求20所述的方法，其特征在于，外源基因导入1)所述的非人动物的步骤通过用含有整合该基因的腺病毒载体的腺病毒感染该动物来实现。
23.具有与含有下述a)乃至d)任一项所述核苷酸序列(其中，序列中的t改为读作u)的mRNA在严格条件下杂交的核苷酸序列的多核苷酸在制备用于检验高脂血症的治疗或预防剂的探针中的应用；a)序列表序列号1的核苷酸序号47至1411所示的核苷酸序列；b)序列表序列号3的核苷酸序号78至1457所示的核苷酸序列；c)插入到转化大肠杆菌E.coli pBK/m55-1 SANK 72199(FERMBP-6490)携有的噬菌体粒子中的DNA所具有的核苷酸序列；d)插入到转化大肠杆菌E.coli pTrip/h55-1 SANK 72299(FERMBP-6491)携有的噬菌体粒子中的DNA所具有的核苷酸序列。
24.由序列表序列号2的氨基酸序号17-455所示氨基酸序列构成的多肽或其一部分、由序列表序列号2的氨基酸序号19-455所示氨基酸序列构成的多肽或其一部分、或由序列表序列号4的氨基酸序号17-460所示氨基酸序列构成的多肽或其一部分在制备用于检验高脂血症的治疗或预防剂的抗体中的应用。
25.由序列表序列号2的氨基酸序号17-455所示氨基酸序列构成的多肽或其一部分、由序列表序列号2的氨基酸序号19-455所示氨基酸序列构成的多肽或其一部分、或由序列表序列号4的氨基酸序号17-460所示氨基酸序列构成的多肽或其一部分在制作高脂血症的治疗或预防剂的检验试剂盒中的应用。
26.由序列表序列号3的核苷酸序号78至1457所示核苷酸序列中连续的15至30个核苷酸构成的核苷酸序列的反义序列构成DNA或RNA。
27.含有权利要求26所述的DNA或RNA作为有效成分的高脂血症治疗剂。
全文摘要
本发明提供用于检验高脂血症的治疗或预防剂的新型方法，以及该方法中所用的核酸探针、引物及抗体。具体来说，本发明提供以序列表序列号1或序列号2所示的、参与调节哺乳动物血液中中性脂肪浓度的基因的表达为指标，检验待测物质作为高脂血症的治疗或预防剂的效果的方法，该方法中所用的核酸探针、引物及抗体。使用本发明的方法，可以探寻高脂血症的治疗或预防剂的候选物质。
文档编号C07K16/22GK1433482SQ00818875
公开日2003年7月30日 申请日期2000年12月8日 优先权日1999年12月9日
发明者小石龙太, 小野满, 古川秀比古, 掘越大能, 藤原俊彦, 安藤洋介 申请人:三共株式会社