白介素－1受体拮抗剂样分子及其应用的制作方法

专利名称：白介素－1受体拮抗剂样分子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的白介素-1受体拮抗剂样(IL-1ra-L)多肽以及编码这些多肽的核酸分子。本发明还涉及用于产生IL-1ra-L多肽的选择性结合剂、载体、宿主细胞和方法。此外，本发明还涉及用于诊断、治疗、改善和/或预防与IL-1ra-L多肽有关的疾病、病症和病情的药用组合物及方法。
背景技术：
核酸分子鉴定、克隆、表达和操作领域的技术进步以及人类基因组的解译使新治疗剂的发现速度大大加快。如今，可利用快速核酸测序技术以前所未有的速度来获取序列信息，而将该技术与计算机分析方法结合可以把重叠序列装配成部分的或完整的基因组，并可以对多肽编码区进行鉴别。将一种推测氨基酸序列与已知氨基酸序列的汇总数据库进行比较，可以确定该序列与已鉴定序列和/或结构标识的同源程度。通过克隆和表达核酸分子的多肽编码区可以获得多肽产物，从而用于结构与功能分析。对核酸分子及编码的多肽进行操作可以使产物具有优良的性质，从而有利于作为治疗剂使用。
尽管基因组研究领域在过去10年中取得了明显的技术进步，但依据人类基因组开发新治疗剂的潜在能力在很大程度上仍未变成现实。还有许多可能编码有益的多肽治疗剂或编码的多肽可作为治疗剂分子的“靶”的基因未被鉴定出来。
因此，本发明的一个目的是鉴定具有诊断或治疗用途的新型多肽和编码这些多肽的核酸分子。
白介素-1(IL-1)是目前已发现的最有效的炎性细胞因子之一。IL-1被认为与多种疾病和医学病症有关。它由巨噬/单核系细胞产生(但不排除其他来源)，并且是以两种形式产生IL-1alpha(IL-1α)和IL-1beta(IL-1β)。白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)是一种人类蛋白，它可作为白介素-1的天然抑制剂。
发明概述本发明涉及新IL-1ra-L核酸分子及编码的多肽。
本发明提供一种分离的核酸分子，该核酸分子含有一种核苷酸序列，该序列选自(a)序列编号1的核苷酸序列；(b)ATCC保藏号PTA-1215中DNA插入序列的核苷酸序列；(c)可编码序列编号2所示多肽的一种核苷酸序列；(d)能够在中度或高度严格条件下与(a)-(c)之一的互补序列杂交的一种核苷酸序列；以及(e)与(a)-(c)之一的序列互补的一种核苷酸序列。
本发明还提供一种分离的核酸分子，该核酸分子含有一种核苷酸序列，该序列选自(a)可编码与序列编号2所示多肽至少具有约70％同一性的一种多肽的一种核苷酸序列，其编码的这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(b)可编码序列编号1所示核苷酸序列、ATCC保藏号PTA-1215中DNA插入序列的核苷酸序列或(a)的一种等位变异体或剪接变异体的一种核苷酸序列；(c)可编码一种至少含有约25个氨基酸残基的多肽片段的序列编号1所示核苷酸序列的一段区域、ATCC保藏号PTA-1215中DNA插入序列的一段区域、(a)的一段区域，或(b)的一段区域，其中，该多肽片段具有序列编号2所示编码多肽的一种活性或具有抗原性；(d)含有一种至少约16个核苷酸的片段的序列编号1所示核苷酸序列的一段区域、ATCC保藏号PTA-1215中DNA插入序列的一段区域，或(a)-(c)之一的一段区域；(e)能够在中度或高度严格条件下与(a)-(d)之一的互补序列杂交的一种核苷酸序列；以及(f)与(a)-(d)之一的序列互补的一种核苷酸序列。
本发明还提供一种分离的核酸分子，该核酸分子含有一种核苷酸序列，该序列选自(a)可编码如序列编号2所示并且至少有一个保守氨基酸取代的一种多肽的一种核苷酸序列，其编码的这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(b)可编码如序列编号2所示并且至少有一个氨基酸插入的一种多肽的一种核苷酸序列，其编码的这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(c)可编码如序列编号2所示并且至少有一个氨基酸缺失的一种多肽的一种核苷酸序列，其编码的这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(d)可编码如序列编号2所示并且C端和/或N端被截断的一种多肽的一种核苷酸序列，其编码的这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(e)可编码如序列编号2所示并且至少有一种选自氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失、C端截断和N端截断的修饰的一种多肽的一种核苷酸序列，其编码的这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(f)含有一种至少约16个核苷酸的片段的(a)-(e)之一的一种核苷酸序列；(g)能够在中度或高度严格条件下与(a)-(f)之一的互补序列杂交的一种核苷酸序列；以及(h)与(a)-(e)之一的序列互补的一种核苷酸序列。
本发明提供一种分离的多肽，这种多肽含有一种氨基酸序列，该序列选自(a)序列编号2所示氨基酸序列；以及(b)由ATCC保藏号PTA-1215中的DNA插入序列编码的氨基酸序列。
本发明还提供一种分离的多肽，这种多肽含有一种氨基酸序列，该序列选自(a)序列编号2的一种直向同源物的一种氨基酸序列；(b)与序列编号2的氨基酸序列至少有约70％同一性的一种氨基酸序列，其中，这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(c)序列编号2所示氨基酸序列的至少含有约25个氨基酸残基的一种片段，其中，该片段具有序列编号2所示多肽的一种活性或具有抗原性；以及
(d)序列编号2所示氨基酸序列、由ATCC保藏号PTA-1215中的DNA插入序列编码的氨基酸序列、(a)或(b)的一种等位变异体或剪接变异体的一种氨基酸序列。
本发明还提供一种分离的多肽，这种多肽含有一种氨基酸序列，该序列选自(a)至少有一个保守氨基酸取代的序列编号2所示氨基酸序列，其中，这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(b)至少有一个氨基酸插入的序列编号2所示氨基酸序列，其中，这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(c)至少有一个氨基酸缺失的序列编号2所示氨基酸序列，其中，这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(d)C端和/或N端被截断的序列编号2所示氨基酸序列，其中，这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；以及(e)至少有一种选自氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失、C端截断和N端截断的修饰的序列编号2所示氨基酸序列，其中，这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性。
此外还提供含有IL-1ra-L氨基酸序列的融合多肽。
本发明还提供一种含有文中描述的分离的核酸分子的表达载体、含有文中描述的重组核酸分子的重组宿主细胞，以及产生IL-1ra-L多肽的一种方法，该方法包括培养该宿主细胞，并且还选择性地包括分离其产生的多肽。
本发明还包括一种非人类的转基因动物，该动物含有一种可编码IL-1ra-L多肽的核酸分子。可以将这种核酸分子以能够表达IL-1ra-L多肽并提高其水平的方式引入该动物，其中包括提高循环水平。作为选择，也可以将这种核酸分子以阻碍内源性IL-1ra-L多肽表达的方式引入该动物(即产生一种IL-1ra-L多肽基因被敲除的转基因动物)。优选的是这种非人类转基因动物为哺乳动物，更优选的为啮齿动物，如大鼠或小鼠。
本发明还提供IL-1ra-L多肽的衍生物。
此外，本发明还提供选择性结合剂，如能够与本发明的IL-1ra-L多肽特异性结合的抗体和肽。这些抗体和肽可以是促效性的(agonistic)，也可以是拮抗性的(antagonistic)。
本发明还包括一些含有本发明的核苷酸、多肽或选择性结合剂以及一种或多种药学容许的配制剂的药用组合物。这些药用组合物可用来提供治疗有效剂量的本发明所述核苷酸或多肽。本发明还包括这些多肽、核酸分子和选择性结合剂的使用方法。
本发明的IL-1ra-L多肽及核酸分子可用于疾病和病症的治疗、预防、改善和/或检测，其中包括文中描述的疾病和病症。
本发明还提供一种检定测试分子的方法，以确定测试分子是否与IL-1ra-L多肽结合。该方法包括，使IL-1ra-L多肽与测试分子相接触，以确定该测试分子与这种多肽的结合程度。该方法还包括，确定这些测试分子是否可作为IL-1ra-L多肽的显效剂或拮抗剂。本发明还提供一种方法，用于检测分子对IL-1ra-L多肽的表达或IL-1ra-L多肽的活性的影响。
本发明还包括调节IL-1ra-L多肽表达以及调整(即提高或降低)IL-1ra-L多肽水平的方法。一种方法是将编码IL-1ra-L多肽的核酸分子向动物给药。另一种方法是将含有调节或调整IL-1ra-L多肽表达的元件的核酸分子给药。这些方法的实例包括基因疗法、细胞疗法和反义疗法，这些方法将在下文做进一步的描述。
另一方面，本发明的IL-1ra-L多肽可用于其受体(“IL-1ra-L多肽受体”)的鉴定。目前有多种形式的“表达克隆”被广泛地用来克隆蛋白配体的受体。可参考，例如，Simonsen and Lodish，1994，Trends Pharmacol.Sci.15437-41和Tartaglia et al.，1995，Cell 831263-71。IL-1ra-L多肽受体的分离有利于鉴定或产生IL-1ra-L多肽信号通路的显效剂和拮抗剂。这些显效剂和拮抗剂包括可溶性IL-1ra-L多肽受体、抗IL-1ra-L多肽受体的选择性结合剂(例如抗体及其衍生物)、小分子和反义寡核苷酸，它们均可用于一种或多种疾病或病症的治疗，其中包括文中公开的疾病或病症。
附图简述

图1A-1B显示人IL-1ra-L基因的核苷酸序列(序列编号1)和人IL-1ra-L多肽的推导氨基酸序列(序列编号2)。
图2显示人IL-1δ(IL-1_delta；序列编号3)、人IL-1ra-L多肽(IL-1ra-L；序列编号2)、人IL-1ε(IL-1_epsilon；序列编号4)、人IL-1受体拮抗剂、分泌型多肽(IL-1ra_sec；序列编号9)、人IL-1β(IL-1_beta；序列编号6)的氨基酸序列对比以及具有一定相似性的氨基酸位置(共有序列)。
发明详述文中使用的小节标题只是为了使结构清晰，而不是要限制其描述的主题。该申请书中引用的所有参考文献均在此引入作为参考。
定义术语“IL-1ra-L基因”或“IL-1ra-L核酸分子”或“IL-1ra-L多核苷酸”是指含有或包括序列编号1所示核苷酸序列、可编码序列编号2所示多肽的核苷酸序列、ATCC保藏号PTA-1215中DNA插入序列的核苷酸序列的一种核酸分子，以及文中定义的核酸分子。
术语“IL-1ra-L多肽的等位变异体”是指，在一种生物或生物群体的染色体上占据特定基因座的一种基因的几种可能的天然替换形式中的一种。
术语“IL-1ra-L多肽的剪接变异体”是指，通过对序列编号2所示IL-1ra-L多肽氨基酸序列的一种RNA转录体中的内含子序列的选择性加工而产生的一种核酸分子，通常为RNA。
术语“分离的核酸分子”是指(1)由源细胞分离的总核酸中普遍存在的蛋白、脂类、糖类或其他物质的至少约50％已被分离的、(2)与自然条件下和这种“分离的核酸分子”相联接的所有或部分多核苷酸不再联接的、(3)与自然条件下不联接的一种多核苷酸有效连接的，或(4)自然条件下不出现在一种较大的多核苷酸序列中的本发明的一种核酸分子。优选的是，本发明的分离的核酸分子基本不含其他任何污染性核酸分子或在自然环境中存在但是会妨碍其应用于多肽产生或治疗、诊断、预防或研究领域的其他污染物。
术语“核酸序列”或“核酸分子”是指一种DNA序列或一种RNA序列。该术语包括由DNA和RNA的任何已知的碱基类似物形成的分子，如4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)-尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基-甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、次黄苷、N6-异-戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄苷、2，2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5’-甲氧羰基-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤，但不局限于此。
术语“载体”是指用于将编码信息传送至宿主细胞的任何分子(如核酸、质粒或病毒)。
术语“表达载体”是指一种适用于宿主细胞转化的载体，这种载体含有指导和/或调控异源插入核酸序列表达的核酸序列。表达包括，但不局限于，诸如转录和翻译的过程，如果存在内含子，则还包括RNA剪接过程。
术语“有效连接”是指侧翼序列的一种排列，其中，所述侧翼序列的配置和组装方式能够使其发挥正常的功能。因此，与一种编码序列有效连接的侧翼序列能够影响该编码序列的复制、转录和/或翻译。举例来说，当一种启动子能够指导一种编码序列的转录时，则称该编码序列与该启动子有效连接。只要能正常发挥功能，侧翼序列无需与编码序列相邻。此时，举例来说，在启动子序列和编码序列之间可存在能够转录但不翻译的插入序列，并且该启动子序列仍被认为与该编码序列“有效连接”。
术语“宿主细胞”是指已被转化或能够被一种核酸分子转化，从而表达特定目的基因的一种细胞。该术语还包括亲代细胞的子细胞，条件是该子细胞中含有这种特定基因，而不管其形态或遗传结构是否与亲代细胞相同。
术语“IL-1ra-L多肽”是指含有序列编号2所示氨基酸序列的一种多肽以及相关多肽。相关多肽包括至少具有序列编号2所示多肽的一种活性的IL-1ra-L多肽片段、IL-1ra-L多肽直向同源物、IL-1ra-L多肽变异体和IL-1ra-L多肽衍生物。IL-1ra-L多肽可以是如文中定义的成熟多肽，也可以根据制备方法的不同而具有或不具有氨基末端甲硫氨酸残基。
术语“IL-1ra-L多肽片段”是指含有序列编号2所示多肽的截断形式的氨基末端(包括或不包括前导序列)和/或截断形式的羧基末端的一种多肽。术语“IL-1ra-L多肽片段”还包括IL-1ra-L多肽直向同源物、IL-1ra-L多肽衍生物或IL-1ra-L多肽变异体的截断形式的氨基末端和/或羧基末端，或由IL-1ra-L多肽等位变异体或IL-1ra-L多肽剪接变异体编码的多肽的截断形式的氨基末端和/或羧基末端。产生IL-1ra-L多肽片段的原因可以是RNA选择性剪接或体内蛋白酶活性。本发明还包括膜结合形式的IL-1ra-L多肽。在优选实施方案中，截断形式和/或缺失形式可含有约10个氨基酸，或约20个氨基酸，或约50个氨基酸，或约75个氨基酸，或约100个氨基酸，或约100个以上的氨基酸。由此产生的这些多肽片段可含有约25个连续氨基酸，或约50个氨基酸，或约75个氨基酸，或约100个氨基酸，或约125个氨基酸。这些IL-1ra-L多肽片段可以选择性地含有一个氨基末端甲硫氨酸残基。应该了解的是，这些片段可用于，例如，产生抗IL-1ra-L多肽的抗体。
术语“IL-1ra-L多肽直向同源物”是指来自另一物种的与序列编号2所示IL-1ra-L多肽氨基酸序列相对应的一种多肽。例如，小鼠和人的IL-1ra-L多肽被认为是彼此的直向同源物。
术语“IL-1ra-L多肽变异体”是指与序列编号2所示IL-1ra-L多肽氨基酸序列(包括或不包括前导序列)相比，所含氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸序列取代、缺失(如内部缺失形式和/或IL-1ra-L多肽片段)和/或添加(如内部添加形式和/或IL-1ra-L融合多肽)的IL-1ra-L多肽。变异体可以是天然的(如IL-1ra-L多肽等位变异体、IL-1ra-L多肽直向同源物和IL-1ra-L多肽剪接变异体)，也可以是人工构建的。这些IL-1ra-L多肽变异体可以由相应的核酸分子制备而成，因而这些核酸分子含有与序列编号1所示DNA序列不同的DNA序列。在优选实施方案中，这些变异体可具有1-3、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-50、1-75、1-100或100个以上的氨基酸取代、插入、添加和/或缺失，其中的取代可以是保守取代或非保守取代，或其任意的组合。
术语“IL-1ra-L多肽衍生物”是指如上所述并且已经过化学修饰的序列编号2所示多肽、IL-1ra-L多肽片段、IL-1ra-L多肽直向同源物或IL-1ra-L多肽变异体。术语“IL-1ra-L多肽衍生物”还包括如上所述由IL-1ra-L多肽等位变异体或IL-1ra-L多肽剪接变异体编码并且已经过化学修饰的多肽。
术语“成熟IL-1ra-L多肽”是指不含前导序列的一种IL-1ra-L多肽。成熟IL-1ra-L多肽还可含有其他修饰，如氨基末端(包括或不包括前导序列)和/或羧基末端的蛋白水解加工、由较大的前体剪切成较小的多肽、N联糖基化和/或O联糖基化，等等。
术语“IL-1ra-L融合多肽”是指在如上所述的序列编号2所示多肽、IL-1ra-L多肽片段、IL-1ra-L多肽直向同源物、IL-1ra-L多肽变异体或IL-1ra-L衍生物的氨基或羧基末端融合的一个或多个氨基酸融合体(如异源蛋白或肽)。术语“IL-1ra-L融合多肽”还包括在如上所述由IL-1ra-L多肽等位变异体或IL-1ra-L多肽剪接变异体编码的多肽的氨基或羧基末端融合的一个或多个氨基酸融合体。
术语“具有生物活性的IL-1ra-L多肽”是指具有包含序列编号2所示氨基酸序列的多肽的至少一种特有活性的IL-1ra-L多肽。此外，还可以是一种具有免疫原活性的IL-1ra-L多肽；也就是说，这种IL-1ra-L多肽至少含有一种可诱发抗体的表位。
术语“分离的多肽”是指(1)由源细胞分离时普遍存在的多核苷酸、脂类、糖类或其他物质的至少约50％已被分离的、(2)与自然条件下和这种“分离的多肽”相联接的所有或部分多肽不再(通过共价或非共价相互作用)联接的、(3)与自然条件下不联接的一种多多肽(通过共价或非共价相互作用)有效连接的，或(4)自然条件下不存在的本发明的一种多肽。优选的是，这种分离的多肽基本不含其他任何污染性多肽或在自然环境中存在但是会妨碍其应用于治疗、诊断、预防或研究领域的其他污染物。
该领域所了解的术语“同一性”是指通过序列比较确定的两种或多种多肽分子或两种或多种核酸分子之间的一种关系。在该领域中，“同一性”还表示根据具体情况由两种或多种核苷酸序列或两种或多种氨基酸序列的线形配比而确定的核酸分子或多肽之间的序列相关程度。还可利用由特定算数模型或计算机程序(即算法)确定的间隔对排(如果有的话)，以“同一性”来衡量两种或多种序列中较短序列之间的完全匹配百分率。
术语“相似性”是与“同一性”相关但不完全相同的一个概念，“相似性”是相关性的一种衡量方法，它既包括完全匹配，也包括保守取代匹配。举例来说，如果两种多肽序列具有10/20的完全相同的氨基酸，并且剩余的氨基酸均为非保守取代，则同一性百分率和相似性百分率均为50％。如果该例的剩余氨基酸中再有5个位置是保守取代，则同一性百分率仍为50％，而相似性百分率却是75％(15/20)。因此，在具有保守取代的情况下，两种多肽之间的相似性百分率将大于其同一性百分率。
与核酸分子、多肽、宿主细胞等生物物质结合使用的术语“天然存在的”或“天然的”是指自然条件下存在并且未经人工处理的物质。同样，文中使用的“非天然存在的”或“非天然的”是指自然条件下不存在的或其结构已经过人为改变的或人工合成的一种物质。
术语“有效剂量”和“治疗有效剂量”均表示用于使文中所述IL-1ra-L多肽的一种或多种生物活性维持在一种可观测水平的IL-1ra-L多肽或IL-1ra-L核酸分子的量。
文中使用的术语“药学容许的载剂”或“生理上容许的载剂”是指一种或多种适用于将IL-1ra-L多肽、IL-1ra-L核酸分子或IL-1ra-L选择性结合剂作为药用组合物进行递送或促进其递送的配制剂。
术语“抗原”是指一种分子，该分子或该分子的一部分能够被抗体等选择性结合剂结合，此外还可用于在动物体内产生能够与该抗原的一种表位结合的抗体。一种抗原可具有一种或多种表位。
术语“选择性结合剂”是指对IL-1ra-L多肽具有特异性的一种或多种分子。其中的术语“特异的”或“特异性”是指该选择性结合剂可结合人类的IL-1ra-L多肽但不结合人类的非IL-1ra-L多肽的能力。但应该了解，这种选择性结合剂或许还可结合序列编号2所示多肽的直向同源物，也就是其种间形式，如小鼠和大鼠的IL-1ra-L多肽。
术语“转导”是指基因由一种细菌转移至另一种细菌，通常是利用噬菌体来实现。“转导”还包括利用逆转录病毒来获得和转移真核细胞的序列。
术语“转染”是指细胞摄取外来或外源DNA，当外源DNA被引入到细胞膜内时，则认为该细胞已被“转染”。有多种转染技术已为该领域所熟知，并且文中将公开一些转染技术。可参考，例如，Graham et al.，1973，Virology 52456；Sambrook et al.，分子克隆实验手册(Cold SpringHarbor Laboratories，1989)；Davis et al.，分子生物学基本方法(Elsevier，1986)；和Chu et al.，1981，Gene 13197。这些技术可用于将一种或多种部分外源的DNA引入适当的宿主细胞。
术语“转化”是指细胞遗传特性的一种变化，当一种细胞经过改造而含有一种新DNA时，则认为该细胞已被转化。例如，对细胞的转化可以从其天然状态进行遗传改造。在完成转染或转导后，转化DNA可以通过物理整合到细胞的染色体中而与该细胞的DNA进行重组，也可作为不进行复制的游离因子而被暂时维持，也可作为质粒自主复制。当该DNA能够随细胞分裂而被复制时，即认为该细胞已被稳定地转化。
核酸分子和/或多肽的相关物应该了解的是，相关核酸分子包括序列编号1所示核酸分子的等位变异体或剪接变异体，还包括上述核苷酸序列之一的互补序列。相关核酸分子还包括，与序列编号2所示多肽相比而含有或基本包含一个或多个氨基酸残基取代、修饰、添加和/或缺失的一种多肽的编码核苷酸序列。这些相关IL-1ra-L多肽可含有一个或多个N联或O联糖基化位点的添加和/或缺失，也可含有一个或多个半胱氨酸残基的添加和/或缺失。
相关核酸分子还包括IL-1ra-L核酸分子的片段，该片段可编码一种至少含有序列编号2所示IL-1ra-L多肽的约25个连续氨基酸，或约50个氨基酸，或约75个氨基酸，或约100个氨基酸，或约125个氨基酸，或125个以上氨基酸的多肽。
此外，IL-1ra-L相关核酸分子还包括，所含核苷酸序列能够在文中定义的中度或高度严格条件下与序列编号1所示IL-1ra-L核酸分子的全互补序列、或含有序列编号2所示氨基酸序列的一种多肽的编码分子的全互补序列、或文中定义的一种核酸片段的全互补序列、或编码文中定义的多肽的一种核酸片段的全互补序列杂交的分子。为了从cDNA库、基因组库或合成DNA库中筛选相关序列，可以用文中提供的IL-1ra-L序列制备杂交探针。利用文中描述的序列对比算法可以方便地确定出IL-1ra-L多肽的DNA序列和/或氨基酸序列中与已知序列具有明显同一性的区域，这些区域即可用来设计筛选探针。
术语“高度严格条件”是指能够使序列高度互补的DNA链杂交而不能使明显错配的DNAs杂交的条件。杂交的严格程度主要由温度、离子强度和甲酰胺等变性剂的浓度决定。用于杂交和清洗的“高度严格条件”的实例为65-68℃下0.015M氯化钠和0.0015M柠檬酸钠，或42℃下0.015M氯化钠、0.0015柠檬酸钠和50％甲酰胺。可参考Sambrook，Fritsch&Maniatis，分子克隆实验手册(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)；Anderson et al.，核酸杂交实用方法，第四章(IRL Press Limited)。
也可使用更严格的条件(如更高的温度、更低的离子强度、浓度更高的甲酰胺或其他变性剂)——但是会影响杂交的速度。为了降低非特异性杂交和/或本底杂交，可以在杂交缓冲液和清洗缓冲液中添加其他制剂。例如0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％焦磷酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠(NaDodSO4，SDS)、菲可、Denhardt’s溶液、超声处理的鲑鱼精DNA(或其他非互补DNA)以及硫酸葡聚糖，但也可使用其他适当的制剂。可以在基本不影响杂交条件的严格程度的情况下改变这些添加剂的浓度和类型。杂交实验通常是在pH6.8-7.4的条件下进行；但是在典型的离子强度条件下，杂交的速度几乎不受pH影响。可参考Anderson et al.，核酸杂交实用方法，第四章(IRL Press Limited)。
影响DNA双螺旋稳定性的因素包括碱基组成、长度和碱基对错配程度。为了适应这些变量，该领域的技术人员可以对杂交条件进行调整，使不同相关序列的DNAs能够形成杂交体。完全匹配的DNA双螺旋的溶链温度可由以下等式来进行估算Tm(℃)＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(％G+C)-600/N-0.72(％甲酰胺)其中，N为形成的双螺旋的长度，[Na+]为杂交缓冲液或清洗缓冲液中的钠离子摩尔浓度，％G+C为杂交体中的(鸟嘌呤+胞嘧啶)百分率。对不完全匹配的杂交体而言，每1％的错配约使溶链温度下降1℃。
术语“中度严格条件”是指，与“高度严格条件”相比能够形成碱基对错配程度更高的DNA双螺旋的条件。典型的“中度严格条件”的实例为50-65℃下0.015M氯化钠和0.0015M柠檬酸钠，或37-50℃下0.015M氯化钠、0.0015柠檬酸钠和20％甲酰胺。例如，50℃下0.015M钠离子的“中度严格条件”将允许约21％的错配存在。
该领域的技术人员都了解，“高度严格条件”和“中度严格条件”之间并不存在绝对的差别。例如，在0.015M钠离子(无甲酰胺)的条件下，完全匹配的长DNA的溶链温度约为71℃。在65℃(相同离子强度)的条件下清洗，将会允许约6％的错配存在。为了捕获关系更远的相关序列，该领域的技术人员只需简单地降低温度或提高离子强度。
约含有多达20nt的寡核苷酸探针在1M NaCl*中的溶链温度的有效估算方法是
Tm＝2℃每A-T碱基对+4℃每G-C碱基对*6×氯化钠柠檬酸钠(SSC)中的钠离子浓度为1M。可参考Suggs etal.，使用纯化基因的发育生物学，683(Brown and Fox，eds.，1981)。
寡核苷酸的高度严格清洗条件通常是比其Tm低0-5℃的温度和6×SSC、0.1％SDS。
在另一项实施方案中，相关核酸分子包括或含有一种与序列编号1所示核苷酸序列具有至少约70％同一性的核苷酸序列，或包括或基本含有一种可编码与序列编号2所示多肽具有至少约70％同一性的一种多肽的核苷酸序列。在优选实施方案中，这些核苷酸序列与序列编号1的核苷酸序列具有约75％，或约80％，或约85％，或约90％，或约95、96、97、98或99％的同一性，或这些核苷酸序列可编码一种与序列编号2所示多肽具有约75％，或约80％，或约85％，或约90％，或约95、96、97、98或99％的同一性的多肽。相关核酸分子所编码的多肽至少具有序列编号2所示多肽的一种活性。
核酸序列的差异可导致其编码的氨基酸序列与序列编号2所示氨基酸序列相比存在保守改变和/或非保守改变。
序列编号2所示氨基酸序列的保守改变(及其编码核苷酸的相应改变)将产生一种具有与IL-1ra-L多肽类似的功能及化学特性的多肽。相比之下，使IL-1ra-L多肽的功能特性和/或化学特性发生实质性改变的方法是在序列编号2的氨基酸序列中选择一些在维持(a)取代区域的分子骨架结构，如折叠构象或螺旋构象，(b)该分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链体积方面的作用明显与众不同的取代。
例如，“保守的氨基酸取代”包括用一种非天然氨基酸残基取代一种天然氨基酸残基，同时不影响或极少影响该位置氨基酸残基的极性或电荷。此外，还可按照前人描述的“丙氨酸扫描诱变”方法将多肽中的任一天然残基取代成丙氨酸。
保守的氨基酸取代还包括非天然存在的氨基酸残基，这些残基的掺入一般采用肽的化学合成方法，而不是在生物系统内合成的方法。这些非天然存在的残基包括肽模拟物和其他反向形式或倒置形式的氨基酸部分。
根据共有侧链的性质，可以将天然残基分为几类1)疏水性残基正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
2)中性亲水性残基Cys、Ser、Thr；3)酸性残基Asp、Glu；4)碱性残基Asn、Gln、His、Lys、Arg；5)影响侧链取向的残基Gly、Pro；以及6)芳香族残基Trp、Tyr、Phe。
例如，非保守取代包括将这些种类之一的一种残基替换成另一种类的一种残基。可以在人IL-1ra-L多肽与非人类IL-1ra-L多肽同源的区域中引入取代残基，也可以在该分子的非同源区域中引入取代残基。
在进行改变时，可以参考氨基酸的亲水指数。根据疏水性和电荷性质，每种氨基酸都具有特定的亲水指数。其亲水指数为异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
该领域的技术人员普遍了解这种氨基酸亲水指数在使蛋白质具有交互性生物学功能方面的重要性(Kyte et al.，1982，J.Mol.Biol.157105-31)。已知某些氨基酸可以被亲水指数或分值近似的其他氨基酸取代，同时仍保持类似的生物活性。当根据亲水指数进行改变时，优选的是在亲水指数处于±2范围内的氨基酸之间进行取代，特别优选的是在±1范围内的氨基酸之间进行取代，更加特别优选的是在±0.5范围内的氨基酸之间进行取代。
该领域的技术人员还认为，在亲水性的基础上也可以有效地进行类似氨基酸的取代，特别是本文的这种要将由此产生的生物学功能相同的蛋白或肽用于免疫实施方案的情况。一种蛋白的局部平均亲水性的最大值由其相邻氨基酸的亲水性决定，该值与这种蛋白的免疫原性和抗原性相关，也就是与其生物学特性相关。
这些氨基酸残基的特定亲水性值如下精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。当根据类似的亲水性值进行改变时，优选的是在亲水性值处于±2范围内的氨基酸之间进行取代，特别优选的是在±1范围内的氨基酸之间进行取代，更加特别优选的是在±0.5范围内的氨基酸之间进行取代。还可以根据亲水性从初级氨基酸序列中确定表位。这些区域也被称为“表位核心区域”。
当需要某些种类的氨基酸取代时，该领域的技术人员可以对这些取代(是保守的还是非保守的)进行鉴定。例如，可通过氨基酸取代来确定IL-1ra-L多肽的重要残基，或提高或降低文中所述IL-1ra-L多肽的亲和力。表I列举了典型的氨基酸取代。
表I氨基酸取代
熟练的技术人员都能够用众所周知的技术来确定序列编号2所示多肽的适当变异体。为了确定该分子中能够被改变并且不破坏其生物活性的适当区域，技术人员可以将不认为对活性具有重要作用的区域作为对象。例如，当已知有来自相同物种或其他物种的具有类似活性的类似多肽时，该领域的技术人员可以比较IL-1ra-L多肽与这些类似多肽的氨基酸序列。通过这种比较，可以确定该分子在类似多肽中保守的残基和部分。应该了解的是，IL-1ra-L分子中相对于类似多肽的非保守区域的变化对其生物活性和/或结构产生不利影响的可能性较低。该领域的技术人员还知道，甚至在相对保守的区域，也可以将天然存在的残基取代成化学性质上类似的氨基酸(保守的氨基酸残基取代)，同时使活性得以维持。因此，即使是对生物活性或结构具有重要作用的区域，也可以进行保守氨基酸取代而不破坏多肽的生物活性或不对其结构产生负面影响。
此外，该领域的技术人员可以回顾有关鉴定类似多肽中对活性或结构具有重要作用的残基的结构-功能研究。通过这种比较，技术人员可以预测与类似多肽中对活性或结构具有重要作用的氨基酸残基相对应的IL-1ra-L多肽中的氨基酸残基的重要性。该领域的技术人员可以选择将IL-1ra-L多肽的这些可能具有重要作用的氨基酸残基取代成化学性质类似的氨基酸残基。
该领域的技术人员还可以分析类似多肽中的三维结构以及与该结构有关的氨基酸序列。根据这些信息，技术人员可以预测IL-1ra-L多肽中与其三维结构有关的氨基酸残基的排列。对于可能处在蛋白表面的氨基酸残基，该领域的技术人员可以选择不进行根本的改变，因为这些残基可能涉及与其他分子的重要相互作用。此外，该领域的技术人员还可制备对每个氨基酸残基进行单个氨基酸取代的测试变异体。并用该领域已知的活性测试方法对这些变异体进行筛选。由这些变异体可以收集关于适当变异体的信息。例如，若发现特定氨基酸残基的改变会导致活性丧失，或导致不必要的活性降低，或导致不适当的活性时，则可以排除含有这种改变的变异体。也就是说，根据这些常规实验收集的信息，该领域的技术人员可以很容易地确定应避免再进行单独取代或结合其他突变进行取代的氨基酸残基。
有许多科技出版物专门研究二级结构的预测。参考Moult，1996，Curr.Opin.Biotechnol.7422-27；Chou et al.，1974，Biochemistry 13222-45；Chou et al.，1974，Biochemistry 113211-22；Chou et al.，1978，Adv.Enzymol.relat.Areas Mol.Biol.4745-48；Chou et al.，1978，Ann.Rev.Biochem.47251-276；和Chou et al.，1979，Biophys.J.26367-84。如今还可以用计算机程序来辅助进行二级结构预测。预测二级结构的一种方法是以同源性建模为基础。例如，序列同一性大于30％或相似性大于40％的两种多肽或蛋白通常具有类似的拓扑结构。蛋白质结构数据库(PDB)的近期发展加强了预测二级结构的能力，其中包括多肽或蛋白结构中可能的折叠数量。可参考Holm et al.，1999，Nucleic Acids Res.27244-47。研究表明，特定多肽或蛋白中的折叠数量十分有限，一旦确定了结构的临界值，结构预测的准确性将会急剧提高(Brenner et al.，1997，Curr.Opin.Struct.Biol.7369-76)。
二级结构预测的其他方法还包括“穿线法”(Jones，1997，Curr.Opin.Struct.Biol.7377-87；Sippl et al.，1996，Structure 415-19)、“轮廓分析法”(Bowie et al.，1991，Science，253164-170；Gribskov et al.，1990，Methods Enzymol.183146-59；Gribskov et al.，1987，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.844355-58)和“进化连锁法”(参考Holm et al.，见上文，和Brenneret al.，见上文)。
优选的IL-1ra-L多肽变异体包括糖基化变异体，其糖基化位点的数量和/或类型与序列编号2所示氨基酸序列相比有所改变。在一项实施方案中，IL-1ra-L多肽变异体与序列编号2所示氨基酸序列相比含有更多的或较少的N联糖基化位点。N联糖基化位点的特征是具有Asn-X-Ser序列或Asn-X-Thr序列，其中，标为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸残基。可形成这种序列的氨基酸残基取代将产生新的添加N联糖链的潜在位点。反之，破坏这种序列的取代将去除已有的N联糖链。也可以去除一个或多个N联糖基化位点(通常是天然存在的糖基化位点)，同时创建一个或多个新的N联位点，从而导致N联糖链的重排。优选的IL-1ra-L变异体还包括半胱氨酸变异体，与序列编号2的氨基酸序列相比，这种变异体中的一个或多个半胱氨酸残基缺失或被取代成另一种氨基酸(如丝氨酸)。在IL-1ra-L多肽必需重新折叠成生物活性构象的情况下，例如在分离不溶性包涵体之后必需重新折叠的情况下，半胱氨酸变异体的作用十分明显。与天然蛋白相比，半胱氨酸变异体通常含有较少的半胱氨酸残基，并且数量一般为偶数，这样可以使未配对半胱氨酸之间的相互作用减至最小。
在其他实施方案中，相关核酸分子包括或含有可编码如序列编号2所示并且至少有一个氨基酸插入的一种多肽的一种核苷酸序列，其编码的这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性，或包括或含有可编码如序列编号2所示并且至少有一个氨基酸缺失的一种多肽的一种核苷酸序列，其编码的这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性。相关核酸分子还包括或含有可编码如序列编号2所示并且羧基末端和/或氨基末端被截断的一种多肽的一种核苷酸序列，其编码的这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性。相关核酸分子还包括或含有可编码如序列编号2所示并且至少有一种选自氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失、羧基末端截断和氨基末端截断的修饰的一种多肽的一种核苷酸序列，其编码的这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性。
此外，还可以将含有序列编号2所示氨基酸序列的多肽或其他IL-1ra-L多肽与一种同源多肽融合以形成一种同二聚体，或与一种异源多肽融合以形成一种异二聚体。异源的肽和多肽包括，但不局限于可用来检测和/或分离一种IL-1ra-L融合多肽的表位；跨膜受体蛋白或其部分，如细胞外区域或跨膜及细胞内区域；能够与跨膜受体蛋白结合的配体或其部分；具有催化活性的酶或其部分；可促进寡聚化的多肽或肽，如亮氨酸拉链结构域；可提高稳定性的多肽或肽，如免疫球蛋白恒定区；以及具有与包含序列编号2所示氨基酸序列的多肽或其他IL-1ra-L多肽不同的治疗活性的多肽。
可以在含有序列编号2所示氨基酸序列的多肽或其他IL-1ra-L多肽的氨基末端进行融合，也可以在羧基末端进行融合。可以不用接头或连接物而直接进行融合，也可以通过一种接头或连接分子进行融合。接头或连接分子可以是一个或多个氨基酸残基，典型的则约为20-50个氨基酸残基。还可以将接头或连接分子设计成含有一种DNA限制性内切核酸酶剪切位点或一种蛋白酶切位点，用于融合部分的分离。应该了解的是，可以用文中描述的方法对构建好的融合多肽进行衍化。
在本发明的另一项实施方案中，是将含有序列编号2所示氨基酸序列的多肽或其他IL-1ra-L多肽与人IgG Fc区域的一种或多种结构域相融合。抗体含有功能独立的两个部分，称为“Fab”的可变区能够与抗原结合，称为“Fc”的恒定区则与效应子功能有关，如补体活化以及被吞噬细胞攻击。Fc的血清半衰期较长，而Fab的较短。Capon et al.，1989，Nature 337525-31。若将Fc结构域与一种治疗性蛋白构建在一起，则该结构域可赋予其较长的半衰期和某些功能，如Fc受体结合功能、蛋白A结合功能、补体固定功能，甚至胎盘转运功能。同上文。表II概括了该领域已知的某些Fc融合体的应用。
表IIFc与治疗性蛋白的融合体
在一项实施例中，是利用技术人员已知的方法将人IgG的铰链区、CH2区和CH区融合在IL-1ra-L多肽的氨基末端或羧基末端。在另一实施例中，是将人IgG的铰链区、CH2区和CH区融合在IL-1ra-L多肽的一种片段(如IL-1ra-L多肽的预测的细胞外部分)的氨基末端或羧基末端。
所得IL-1ra-L融合多肽可以用蛋白A亲和柱进行纯化。研究发现，与Fc区融合的肽和蛋白在体内的半衰期明显高于未融合的对应物。此外，与Fc区融合可以使融合多肽形成二聚体(多聚体)。使用的Fc区可以是天然存在的Fc区，也可以对其进行改造以加强某些特性，如治疗特性、循环时间或聚集较少。
相关核酸分子及相关多肽的同一性和相似性可利用已知方法来方便地计算。这些方法包括，但不局限于，计算分子生物学(A.M.Lesk，ed.，Oxford University Press 1988)；生物计算信息学与基因组计划(D.W.Smith，ed.，Academic Press 1993)；序列数据的计算机分析(第1部分，A.M.Griffin and H.G.Griffin，eds.，Humana Press 1994)；G.von Heinle，分子生物学中的序列分析(Academic Press 1987)；序列分析引物(M.Gribskov and J.Devereux，eds.，M.Stockton Press 1991)以及Carillo et al.，1988，SIAM J.Applied Math.，481073中描述的方法。
确定同一性和/或相似性的优选方法需能够给出测试序列间最大程度的匹配。确定同一性和相似性的方法在公用计算机程序中均有所描述。确定两种序列间的同一性和相似性的优选计算机程序包括，但不局限于，GCG程序包，其中包括GAP(Devereux et al.，1984，Nucleic AcidsRes.12387；Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)，BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.215403-10)。BLASTX程序可由国家生物技术信息中心(NCBI)和其他来源公开获得(Altschul et al.，BLAST Manual(NCB NLM NIH，Bethesda，MD)；Altschul et al.，1990，如上)。也可利用著名的Smith Waterman算法来计算同一性。
用于比较两种氨基酸序列的一些对比方案只能给出这两种序列的很短的匹配区域，这段对比的小区域甚至在全长序列之间没有明显相关性的情况下也可以具有非常高的同一性。因此，在一项优选实施方案中，选择的对比方法(GAP程序)可以产生跨度至少为本发明所述多肽的50个连续氨基酸的对比结果。
例如，可以用GAP计算机算法(Genetics Computer Group，Universityof Wisconsin，Madison，WI)对需要测定序列同一性百分率的两种多肽进行排比，以获得相应氨基酸的最佳匹配结果(由算法确定的“匹配跨度”)。在该算法中还采用了间隔缺口损失(按平均对角线值的3倍计算；“平均对角线值”是所用比较矩阵的对角线的平均值；“对角线值”是由特定的比较矩阵为每个完全匹配的氨基酸指定的评分或数值)、间隔延伸损失(通常为间隔缺口损失的0.1倍)，以及PAM250或BLOSUM62等比较矩阵。此外，该算法还采用了标准的比较矩阵(参考Dayhoff et al.，5 Atlas of Protein Sequence and Structure(Supp.3 1978)(PAM250比较矩阵)；Henikoff et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-19(BLOSUM62比较矩阵))。
多肽序列比较的优选参数包括算法Needleman and Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48443-53；比较矩阵BLOSUM62(Henikoff et al.，见上文)；间隔损失12间隔长度损失4相似性阈值0GAP程序可以有效地使用以上参数。上述参数是用GAP算法进行多肽比较的默认值(并且末端间隔不计算损失)。
核酸分子序列比较的优选参数包括算法Needleman and Wunsch，见上文；比较矩阵匹配＝+10，错配＝0；间隔损失50间隔长度损失3GAP程序可以有效地使用以上参数。上述参数是进行核酸分子比较的默认值。
其他典型的算法、间隔缺口损失、间隔延伸损失、比较矩阵和相似性阈值也可以使用，其中包括Program Manual，Wisconsin Package，Version 9，September，1997所述。该领域的技术人员都了解该如何做出具体的选择，这将取决于特定的比较，如DNA与DNA比较、蛋白与蛋白比较，蛋白与DNA比较；此外，还取决于是在给定的序列对之间比较(此时优选的一般是GAP和BestFit)，还是在序列与大型序列库之间比较(此时优选的是FASTA或BLASTA)。
核酸分子编码含有IL-1ra-L多肽氨基酸序列的多肽的核酸分子可以由多种方法来方便地获得，其中包括，但不局限于，化学合成法、cDNA库或基因组库筛选法、表达库筛选法和/或PCR扩增cDNA法。
文中使用的重组DNA方法一般是按照Sambrook et al.，分子克隆实验手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)和/或Current Protocolsin Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.，Green Publishers Inc.and Wileyand Sons 1994)中的描述来进行。本发明提供文中所述的核酸分子以及获得这些分子的方法。
当从某一物种中鉴定出一种编码IL-1ra-L多肽氨基酸序列的基因时，可以将该基因的全部或一部分作为探针，在相同的物种中鉴别直向同源基因或相关基因。也可以用这些探针或引物对来源于可能表达IL-1ra-L多肽的不同组织的cDNA库进行筛选。此外，还可以用包含序列编号1所示序列的核酸分子的全部或一部分来筛选基因组库，以鉴别和分离能够编码IL-1ra-L多肽氨基酸序列的基因。筛选的条件通常为中度或高度严格条件，以使筛选获得的假阳性结果减至最少。
还可以用表达克隆的方法来鉴别可编码IL-1ra-L多肽氨基酸序列的核酸分子，该方法是基于所表达蛋白的特性来检测阳性克隆。一般是利用抗体或其他结合配偶体(如受体或配体)与表达并展示在宿主细胞表面的克隆化蛋白的结合来筛选核酸库。可以用一种可检测标记对该抗体或结合物进行修饰，以鉴别那些表达所需克隆的细胞。
下述重组表达技术可用来产生这些多核苷酸，并可用来表达其编码的多肽。例如，该领域的技术人员可以将编码IL-1ra-L多肽氨基酸序列的核酸分子插入到适当的载体中，这样可以很容易地产生大量的所需核苷酸序列。然后可利用这些序列来产生检测探针和扩增引物。作为选择，还可以将编码IL-1ra-L多肽氨基酸序列的多核苷酸插入到表达载体中。将这种表达载体引入到适当的宿主中，这样就可以大量地产生所编码的IL-1ra-L多肽。
获得适当核酸序列的另一种方法是聚合酶链反应(PCR)法。该方法首先是利用逆转录酶由poly(A)+RNA或总RNA制备出cDNA。然后在cDNA中添加两种引物，这两种引物通常是与编码IL-1ra-L多肽氨基酸序列的cDNA的不同区域互补，同时还要添加一种聚合酶，如Taq聚合酶，最后由该聚合酶扩增出两种引物之间的cDNA区域。
编码IL-1ra-L多肽氨基酸序列的核酸分子的另一种制备方法是利用该领域技术人员熟知的方法进行化学合成，如Engels et al.，1989，Angew.Chem.Intl.Ed.28716-34中描述的方法。这些方法尤其包括核酸的磷酸三酯合成法、亚磷酰胺合成法和H-磷酸酯合成法。优选的化学合成方法是用标准的亚磷酰胺化学剂在聚合物支持物上进行合成。编码IL-1ra-L多肽氨基酸序列的DNA的长度一般为数百个核苷酸。长度大于约100个核苷酸的核酸可以分为几个片段来合成。然后将这些片段连接在一起，以形成IL-1ra-L基因的全长核苷酸序列。多肽氨基末端的编码DNA片段通常含有一个编码甲硫氨酸残基的ATG。在成熟形式的IL-1ra-L多肽中可以包含这个甲硫氨酸，也可以不含这个甲硫氨酸，这取决于是否将宿主细胞内产生的这种多肽设计成能够被分泌到细胞外。此外，还可以使用该领域技术人员已知的其他方法。
一些实施方案中的核酸变异体含有被改变的密码子，目的是在特定宿主细胞内获得最佳的IL-1ra-L多肽表达。具体的密码子改变取决于IL-1ra-L多肽和选定的表达宿主细胞。这种“密码子优化”可由多种方法来实现，例如，选择那些在特定宿主细胞内高度表达的基因中优先使用的密码子。可以采用University of Wisconsin Package Version 9.0(GeneticsComputer Group，Madison，WI)提供的计算机算法，该算法带有密码子频率表，例如“Eco_high.Cod”是高表达细菌基因的优先密码子。可以使用的其他密码子频率表包括“Celegans_igh.cod”、“Celegans_low.cod”、“Drosophila_high.cod”、“Human_high.cod”、“Maize_high.eod”和“Yeast_high.cod”。
有时需要制备IL-1ra-L多肽变异体的编码核酸分子。编码变异体的核酸分子的制备方法包括定点诱变、PCR扩增或其他适当的方法，其中的引物带有所需的点突变(参考上文Sambrook et al.和上文Ausubel et al.中有关诱变技术的描述)。也可利用上文Engels et al.中描述的化学合成方法来制备这些变异体。此外，还可以用该领域技术人员已知的其他方法。
载体和宿主细胞利用标准的连接技术可以将编码IL-1ra-L多肽氨基酸序列的核酸分子插入到适当的表达载体中。选择的载体通常能在使用的特定宿主细胞内发挥功能(也就是说，载体与宿主细胞兼容，从而能实现基因的扩增和/或基因的表达)。编码IL-1ra-L多肽氨基酸序列的核酸分子的扩增(表达)可以在原核宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞(杆状病毒系统)和/或真核宿主细胞中进行。宿主细胞的选择在某种程度上取决于是否要对IL-1ra-L多肽进行翻译后修饰(如糖基化和/或磷酸化)。如果需要，则优选的是酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞或哺乳动物宿主细胞。有关表达载体的综述，可参考Meth.Enz.，Vol.185(D.V.Goeddel，ed.，Academic Press 1990)。
一般而言，所有宿主细胞的表达载体都含有用于维持质粒的序列和用于克隆及表达外源核苷酸序列的序列。在一些实施方案中，这些序列被统称为“侧翼序列”，这些序列通常含有一种或多种以下核苷酸序列一个启动子、一个或多个增强子序列、一个复制起始点、一个转录终止序列、含有一个剪接供体和一个剪接受体的完整内含子序列、用于多肽分泌的前导序列的编码序列、一个核糖体结合位点、一个多腺苷酸化位点、用于插入待表达序列的编码核酸的多接头，和一种选择标记元件。下文将对这些序列分别进行论述。
本发明的载体可以选择性地含有一种“标记”编码序列，也就是位于IL-1ra-L多肽编码序列5’或3’端的一种寡核苷酸分子；这种寡核苷酸序列可以编码多聚组氨酸(如六聚组氨酸)或其他“标记”，如FLAG、HA(血凝素流感病毒)或myc，其抗体均已实现商品化。当多肽表达时，该标记通常与多肽融合，并且可作为从宿主细胞中亲和纯化IL-1ra-L多肽的一种手段。亲和纯化的实现方法可以是，例如，用该标记的抗体作为亲和介质进行柱层析。此后，作为选择，还可以用不同的方法将该标记从纯化的IL-1ra-L多肽中去除，例如用某些肽酶进行酶切。
侧翼序列可以是同源的(即来自与宿主细胞相同的物种和/或品系)、异源的(即来自与宿主细胞的物种或品系不同的物种)、杂合的(即一种以上来源的侧翼序列的组合)，或合成的，还可以是在正常情况下能够调节IL-1ra-L多肽表达的天然序列。因此，侧翼序列可以来源于任何原核或真核生物，或任何脊椎动物或无脊椎动物，或任何植物，条件是该侧翼序列能够在宿主细胞中行使功能，并且可被激活。
能在本发明所述载体中有效使用的侧翼序列的获得方法可以是该领域熟知的几种方法中的任何一种。以前的有效侧翼序列——不包括IL-1ra-L基因侧翼序列——的鉴定方法一般是作图和/或限制性内切核酸酶消化，然后用适当的限制性内切核酸酶从适当的源组织中分离。侧翼序列的全长核苷酸序列有时是已知的。此时可以用文中描述的核酸合成或克隆的方法进行合成。
在了解整个侧翼序列或只了解部分侧翼序列的情况下，可利用来自相同物种或另一物种的适当寡核苷酸和/或侧翼序列片段进行PCR和/或筛选基因组库的方法获得该侧翼序列。在不了解侧翼序列的情况下，可以从较大DNA片段中分离出含有侧翼序列的DNA片段，这种较大的DNA片段可以含有，例如，编码序列甚至另外一种或多种基因。实现分离的方法可以是限制性内切核酸酶消化，以产生适当的DNA片段，然后用琼脂糖凝胶纯化法、Qiagen柱层析法(Chatsworth，CA)或技术人员已知的其他方法进行分离。该领域的普通技术人员都能很容易地选择适当的酶来实现这一目的。
商品化的原核表达载体一般都含有复制起始点元件，该元件可协助载体在宿主细胞内扩增。在某些情况下，载体扩增至某一拷贝数是实现IL-1ra-L多肽最佳表达的重要因素。若选择的载体不含复制起始位点，则可根据已知的序列进行化学合成，然后连接到载体中。例如，pBR322质粒(New England Biolabs，Beverly，MA)的复制起始点适用于大多数革兰氏阴性菌，有多种复制起始点(如SV40、多瘤、腺病毒、水泡性口炎病毒，或乳头状瘤病毒，如HPV或BPV)可有效用于哺乳动物细胞的克隆载体。哺乳动物表达载体一般不需要复制起始点元件(例如，经常使用SV40起始点只是因为它含有早期启动子)。
转录终止序列通常位于多肽编码区末端的3’端，其作用是终止转录。原核细胞内的转录终止序列一般是富含G-C的片段，后接一段poly-T序列。从库中可以很容易地克隆出该序列，甚至可将其作为商品化载体的一部分来购买，而利用文中描述的核酸合成方法也可以很容易地合成该序列。
选择标记基因元件可编码一种蛋白，该蛋白是宿主细胞在选择培养基中存活和生长所必需的。选择标记基因可以编码(a)能赋予原核宿主细胞抗生素抗性或其他毒素抗性的蛋白，如赋予氨苄青霉素抗性、四环素抗性或卡那霉素抗性的蛋白；(b)能够补充细胞的营养缺陷型缺陷的蛋白；或(c)能够提供复合培养基中不包含的必需营养的蛋白。优选的选择标记为卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。也可以将新霉素抗性基因用于原核及真核宿主细胞的筛选。
其他选择基因则可用于待表达基因的扩增。扩增是指用于产生对生长至关重要的蛋白的需求量较大的一些基因在重组细胞连续世代的染色体中串联重复的过程。适用于哺乳动物细胞的选择标记的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸腺嘧啶激酶。将转化的哺乳动物细胞置于唯有依靠载体中的选择基因才能够生存的选择压力之下。施加选择压力的方法是，在培养基中的选择剂浓度持续变化的条件下培养转化细胞，由此导致选择基因和IL-1ra-L多肽的编码DNA同时扩增。这样就可以由扩增的DNA合成更大量的IL-1ra-L多肽。
mRNA起始翻译通常都需要一个核糖体结合位点，核糖体结合位点以Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)为特征。该元件一般位于启动子的3’端和待表达IL-1ra-L多肽编码序列的5’端。Shine-Dalgarno序列有多种不同的变化，但通常都是一种多聚嘌呤(即A-G含量高)。目前已鉴定出多种Shine-Dalgarno序列，利用文中列举的方法可以很容易地合成这些序列，每种序列都可用于原核载体。
前导序列，也被称为信号序列，可用于将IL-1ra-L多肽引导至宿主细胞外。信号序列的核苷酸编码序列通常位于IL-1ra-L核酸分子的编码区内，或直接位于IL-1ra-L多肽编码区的5’端。目前已鉴定出多种信号序列，能够在特定宿主细胞内行使功能的任一种信号序列都可以与IL-1ra-L核酸分子连同使用。因此，信号序列可以与IL-1ra-L核酸分子同源(天然的)，也可以与IL-1ra-L核酸分子异源。此外，还可以用文中描述的化学方法合成信号序列。宿主细胞可以通过信号肽实现IL-1ra-L多肽的分泌，而分泌的IL-1ra-L多肽一般都去除了该信号肽。可以将该信号序列作为载体的组件，也可作为被插入载体的IL-1ra-L核酸分子的一部分。
本发明提供与IL-1ra-L多肽编码区相连接的IL-1ra-L多肽天然信号序列或异源信号序列的编码核苷酸序列的应用。选择的异源信号序列应能够被宿主细胞识别和加工，即能够被宿主细胞的信号肽酶剪切。对不能识别和加工IL-1ra-L多肽天然信号序列的原核宿主细胞而言，可以将信号序列替换成原核信号序列，这些原核信号序列可以选自，例如，碱性磷酸酶、青霉素酶，或热稳定性肠毒素II前导序列。当采用酵母分泌时，可以将IL-1ra-L多肽天然信号序列替换成酵母转化酶、α因子或酸性磷酸酶前导序列。当在哺乳动物细胞中表达时，天然信号序列能够满足需要，而其他哺乳动物信号序列也同样适用。
在某些情况下，例如，当需要在真核宿主细胞的表达系统中进行糖基化时，可以对不同的原序列进行操作，以促进糖基化作用或提高其产量。举例来说，可以改变特定信号肽的肽酶剪切位点，也可添加能够影响糖基化作用的前序列。蛋白终产物可以在-1位置(相对于成熟蛋白的第一个氨基酸)含有一个或多个易于表达的额外氨基酸，这些氨基酸可以不被完全去除。例如，蛋白终产物可以在肽酶剪切位点内含有一个或两个与氨基末端联接的氨基酸残基。作为选择，也可使用能够在成熟多肽内部剪切的一些酶的剪切位点，由此产生的是稍有截断的所需IL-1ra-L多肽。
在许多情况下，载体内一种或多种内含子的存在可以加强核酸分子的转录；在真核宿主细胞，特别是在哺乳动物宿主细胞内产生多肽时尤其如此。使用的内含子可以是IL-1ra-L基因中天然存在的内含子，尤其在所用基因为全长基因组序列或其片段的情况下。当基因中没有天然存在的内含子时(大多数cDNAs都是如此)，可由另一来源获得内含子。由于内含子必须被转录才可以生效，所以内含子相对于侧翼序列和IL-1ra-L基因的位置通常都很重要。因此，在IL-1ra-L的cDNA分子需要被转录的情况下，内含子的优选位置是在转录起始位点的3’端和poly-A转录终止序列的5’端。优选的是，内含子都位于cDNA的一侧(即5’端或3’端)，这样就不会打断编码序列。任何来源的任何内含子，其中包括病毒、原核生物及真核生物(植物或动物)来源的内含子，均可用来实现本发明，条件是该内含子与插入的宿主细胞能够相容。此外还包括合成的内含子。可以在载体中选择性地使用一种以上的内含子。
本发明的表达载体和克隆载体一般都含有可被宿主生物识别并且与IL-1ra-L多肽编码分子有效连接的一种启动子。启动子是位于结构基因(一般约含有100-1000bp)起始密码子上游(即5’端)的非转录序列，该序列能调控这种结构基因的转录。启动子通常被分为两类诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子可以对培养条件的某些变化产生反应，如添加或去除一种营养物或改变温度，从而启动其调控的DNA的高水平转录。组成型启动子则启动连续基因产物的产生；也就是说，基因的表达不受调控。已知有许多启动子可以被多种潜在的宿主细胞识别。将适当启动子与编码IL-1ra-L多肽的DNA有效连接的方法是，通过限制酶消化由源DNA获得启动子，并将所需启动子序列插入到载体中。可以用IL-1ra-L的天然启动子序列来指导IL-1ra-L核酸分子的扩增和/或表达。如果异源启动子与天然启动子相比可以使表达蛋白的转录水平和产量提高，并且能够与选定的宿主细胞系统相容，则优选的为异源启动子。
适用于原核宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统；碱性磷酸酶；色氨酸(trp)启动子系统；以及tac启动子等杂合启动子。已知的其他细菌启动子也同样适用。其序列均已公开，所以该领域的技术人员可将其与所需DNA序列相连接，并可在需要的情况下使用接头或连接物，以提供任何有益的限制性位点。
适用于酵母宿主的启动子已为该领域所熟知。可以将有利的酵母增强子与酵母启动子共同适用。适用于哺乳动物宿主细胞的启动子已众所周知，其中包括，但不局限于，由病毒基因组获得的启动子，如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、鸟肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒和乙肝病毒，最优选的则是猿病毒40(SV40)。其他适当的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，如热休克启动子和肌动蛋白启动子。
可能用于IL-1ra-L基因表达调控的其他启动子包括，但不局限于，SV40早期启动子区(Bernoist and Chambon，1981，Nature 290304-10)；CMV启动于；劳斯肉瘤病毒的3’长末端重复序列中包含的启动子(Yamamoto，et al.，1980，Cell 22787-97)；疱疹胸腺嘧啶激酶启动子(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781444-45)；金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster et al.，1982，Nature 29639-42)；β-内酰胺酶启动子等原核表达载体(Villa-Kamaroff et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，753727-31)；或tac启动子(DeBoer et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，8021-25)。具有组织特异性并且已用于转基因动物的下述动物转录调控区也应给予关注在胰腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因调控区(Swift et al.，1984，Cell 38639-46；Ornitz et al.，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50399-409(1986)；MacDonald，1987，Hepatology 7425-515)；在胰β细胞中具有活性的胰岛素基因调控区(Hanahan，1985，Nature 315115-22)；在淋巴样细胞中具有活性的免疫球蛋白基因调控区(Grosschedl et al.，1984，Cell 38647-58；Adames et al.，1985，Nature 318533-38；Alexander et al.，1987，Mol.Cell.Biol.，71436-44)；在睾丸细胞、乳房细胞、淋巴样细胞和肥大细胞中具有活性的鼠乳腺肿瘤病毒调控区(Leder et al.，1986，Cell 45485-95)；在肝脏中具有活性的白蛋白基因调控区(Pinkert et al.，1987，Genes and Devel.1268-76)；在肝脏中具有活性的甲胎蛋白基因调控区(Krumlauf et al.，1985，Mol.Cell.Biol.，51639-48；Hammer et al.，1987，Science 23553-58)；在肝脏中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因调控区(Kelsey et al.，1987，Genesand Devel.1161-71)；在髓样细胞中具有活性的β-珠蛋白基因调控区(Mogram et al.，1985，Nature 315338-40；Kollias et al.，1986，Cell 4689-94)；在脑的少突胶质细胞中具有活性的髓磷脂碱蛋白基因调控区(Readhead et al.，1987，Cell 48703-12)；在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因调控区(Sani，1985，Nature 314283-86)；以及在下丘脑中具有活性的促性腺释放激素基因调控区(Mason et al.，1986，Science2341372-78)。
可以在载体中插入增强子序列，以加强本发明所述IL-1ra-L多肽的编码DNA在高等真核生物中的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，其长度一般约为10-300 bp，它可作用于启动子而增强转录。相对而言，增强子不受取向和位置的约束。在转录单位的5’和3’端均可以发现增强子。已知有几种来源于哺乳动物基因(如珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。但通常使用的是病毒增强子。用于激活真核启动子的典型增强子元件包括SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤增强子和腺病毒增强子。尽管载体中插入的增强子可以位于IL-1ra-L核酸分子的5’或3’端，但典型的是位于启动子的5’端。
可利用商品化载体等起始载体来构建本发明的表达载体。这些载体可含有全部所需侧翼序列，也可以不包含所有侧翼序列。当载体中还不具备文中描述的一种或多种侧翼序列时，可以分别获得这些侧翼序列并将其连接到载体中。各种侧翼序列的获得方法已为该领域的技术人员所熟知。
用于实现本发明的优选载体是能够与细菌、昆虫和哺乳动物宿主细胞相容的那些载体。其中尤其包括pCRII、pCR3和pcDNA3.1(Invitrogen，San Diego，CA)、pBSII(Stratagene，La Jolla，CA)、pET15(Novagen，Madison，WI)、pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)、pEGFP-N2(Clontech，Palo Alto，CA)、pETL(BlueBacII，Invitrogen)、pDSR-α(PCTPub.No.WO90/14363)和pFastBacDual(Gibco-BRL，Grand Island，NY)。
其他的适当载体包括，但不局限于，粘粒、质粒或改良病毒，但应该了解的是，载体系统必须与选定的宿主细胞相容。这些载体包括，但不局限于，质粒，如Bluescript质粒衍生物(一种基于ColE1的高拷贝数噬菌粒，Stratagene Cloning Systems，La Jolla CA)、用于克隆由Taq酶扩增的PCR产物的PCR克隆质粒(如TOPOTMTA CloningKit，PCR2.1质粒衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)，以及哺乳动物载体、酵母载体或病毒载体，如杆状病毒表达载体(pBacPAK质粒衍生物，Clontech，Palo Alto，CA)。
当载体构建完成，并且将编码IL-1ra-L多肽的核酸分子插入到载体的适当部位之后，可以将所得载体插入到适当的宿主细胞内，用于载体的扩增和/或表达。可以用众所周知的方法将IL-1ra-L多肽表达载体转化到选定的宿主细胞内，这些方法包括，例如，转染法、感染法、氯化钙法、电穿孔法、显微注射法、脂转染法、DEAE-葡聚糖法，或已知的其他方法。选择的方法会根据所用宿主细胞的类型而有部分变化。这些方法以及其他适当的方法已为该领域的技术人员所熟知，并且在诸如上文的Sambrook et al.，中均有所描述。
宿主细胞可以是原核宿主细胞(如大肠杆菌)，也可以是真核宿主细胞(如酵母细胞、昆虫细胞或脊椎动物细胞)。在适当条件下培养的宿主细胞能够合成IL-1ra-L多肽，然后可由培养基(若宿主细胞将多肽分泌到培养基中)或直接由产生多肽的宿主细胞(若多肽不被分泌)收集IL-1ra-L多肽。适当宿主细胞的选择取决于多种因素，如所需的表达水平、所需的或活性必需的多肽修饰(如糖基化或磷酸化)，以及折叠成生物活性分子的难易程度。
已知有多种宿主细胞可以使用，其中有许多可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA中获得。这些宿主细胞的实例包括，但不局限于，哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵细胞(CHO)、CHO DHFR(-)细胞()、人胚肾(HEK)293或293T细胞，或3T3细胞。适当的哺乳动物宿主细胞以及转化方法、培养方法、扩增方法、筛选方法、产物产生方法和纯化方法的选择方法已为该领域所了解。其他适当的哺乳动物细胞系有猴COS-1和COS-7细胞系，以及CV-1细胞系。典型的哺乳动物宿主细胞还包括灵长类细胞系和啮齿类细胞系，其中包括转化的细胞系。正常二倍体细胞、来源于原代组织体外培养物的细胞株和原代外植体也同样适用。候选的细胞可以在选择基因方面具有基因型缺陷，也可含有一种显性开放选择基因。其他适当的哺乳动物细胞系还包括，但不局限于，鼠神经母细胞瘤N2A细胞、HeLa、鼠L-929细胞、来源于Swiss、Balb-c或NIH小鼠的3T3细胞系、BHK或HaK仓鼠细胞系。这些细胞系均为该领域的技术人员所了解，并且可用于蛋白表达。
适用于本发明的有效宿主细胞还包括细菌细胞。例如，在生物技术领域中，有多种众所周知的大肠杆菌菌株(如HB101、DH5α、DH10和MC1061)可作为宿主细胞使用。该方法还可以采用枯草芽孢杆菌、假单孢菌、其他芽孢杆菌、链霉菌等的不同菌株。
该领域技术人员所了解的许多酵母细胞菌株也可作为宿主细胞用于本发明所述多肽的表达。优选的酵母细胞包括，例如，酿酒酵母和巴斯赤毕酵母。
此外，如果需要，还可以在本发明的方法中采用昆虫细胞系统。这些系统在，例如，Kitts et al.，1993，Biotechniques，14810-17；Lucklow，1993，Curr.Opin.Biotechnol.4564-72；和Lucklow et al.，1993，J.Virol.，674566-79中均有所描述。优选的昆虫细胞为Sf-9和Hi5(Invitrogen)。
还可以用转基因动物来表达糖基化的IL-1ra-L多肽。例如，可以使用转基因的产奶动物(如牛或山羊)并在该动物的奶中获得本发明的糖基化多肽。还可以用植物来产生IL-1ra-L多肽，但植物中的糖基化一般与哺乳动物细胞中的糖基化不同，因而可导致糖基化产物不适用于人类的治疗。
多肽的产生可以用技术人员所熟知的标准培养基来培养含有IL-1ra-L多肽表达载体的宿主细胞。这些培养基通常含有细胞生长和存活所必需的所有营养物。适于培养大肠杆菌细胞的培养基包括，例如，Luria Broth(LB)和/或Terrific Broth(TB)培养基。适于培养真核细胞的培养基包括RoswellPark Memorial Institute培养基1640(RPMI 1640)、极限必需培养基(MEM)和/或Dulbecco’s Modified Eagle培养基(DMEM)，在培养的特定细胞系时，可以在这些培养基中补加血清和/或必需的生长因子。适用于昆虫培养的培养基为Grace’s培养基，在需要的情况下可以添加酵母提取物、乳清蛋白水解物和/或胎牛血清。
培养基中通常补加有一种抗生素或可用于转染细胞或转化细胞选择性生长的其他化合物。使用的化合物由转化宿主细胞的质粒上存在的选择标记元件决定。例如，若选择标记元件为卡那霉素抗性，则培养基中添加的化合物为卡那霉素。用于选择性生长的其他化合物还包括氨苄青霉素、四环素和新霉素。
宿主细胞产生IL-1ra-L多肽的量可以由该领域熟知的标准方法来测定。这些方法包括，但不局限于，蛋白质印迹分析法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、非变性凝胶电泳法、高效液相层析(HPLC)分离法、免疫沉淀法，印迹(或者)DNA结合凝胶移位测定法等活性测定法。
如果将IL-1ra-L多肽设计成可以被宿主细胞分泌，则大部分多肽都存在于培养基中。如果IL-1ra-L多肽不能被宿主细胞分泌，则会存在于细胞质和/或细胞核中(对真核宿主细胞而言)或存在于细胞溶质中(对革兰氏阴性菌宿主细胞而言)。
当IL-1ra-L多肽存在于宿主细胞的细胞质和/或细胞核中(对真核宿主细胞而言)或存在于细胞溶质中(对革兰氏阴性菌宿主细胞而言)时，可以用技术人员所了解的任一种标准技术由宿主细胞抽提出细胞内物质(包括革兰氏阴性菌的包涵体)。例如，可以用弗氏压碎、匀浆和/或超声，然后离心的方法将宿主细胞裂解，以释放出周质(胞质)内容物。
如果IL-1ra-L多肽在细胞溶质中形成了包涵体，则这些包涵体通常会与细胞内膜和/或外膜相结合，因而离心之后会主要存在于沉淀物中。因此，在碱性pH时存在二硫苏糖醇等还原剂的情况下，或在酸性pH时存在tris羧乙基膦的情况下，可以用极端pH或去污剂、胍、胍衍生物、脲或脲衍生物等离液剂处理沉淀物，以释放、分裂和溶解包涵体。然后可利用凝胶电泳、免疫沉淀等方法对溶解的IL-1ra-L多肽进行分析。若需分离IL-1ra-L多肽，则可利用标准方法来进行分离，如文中描述的方法以及Marston et al.，1990，Meth.Enz.，182264-75中描述的方法。
分离的IL-1ra-L多肽有时会不具有生物活性。可以用“重折叠”或将多肽转变成四级结构的不同方法以及产生二硫键的不同方法来恢复其生物活性。这些方法包括，在存在特定浓度离液剂的情况下将溶解的多肽暴露于通常大于7的pH值下。离液剂的选择与溶解包涵体时的选择方法十分相似，但通常使用较低浓度的离液剂，并且该离液剂不一定与溶解使用的离液剂相同。重折叠/氧化溶液中通常还含有一种还原剂，或含有特定比例的还原剂与其氧化形式，这样可产生特定的氧化还原电势，用于在蛋白形成半胱氨酸桥的过程中进行二硫键变位。常用的氧化还原偶包括半胱氨酸/胱氨、谷胱甘肽(GSH)/二硫双GSH、氯化铜、二硫苏糖醇(DTT)/二噻烷DTT和2-2-巯基乙醇(bME)/二硫-b(ME)。在许多情况下，可以用或需要用潜溶剂来提高重折叠的效率，常用于此目的的试剂包括甘油、不同分子量的聚乙二醇、精氨酸等。
如果IL-1ra-L多肽表达时形成包涵体的程度并不明显，则将细胞匀浆物离心之后，多肽主要存在于上清液中。利用文中描述的方法可以从上清液中进一步分离出这些多肽。
有多种技术可用于从溶液中纯化IL-1ra-L多肽。如果合成的多肽在羧基末端或氨基末端含有一种标记，如六聚组氨酸(IL-1ra-L多肽/六聚组氨酸)或FLAG(Eastman Kodak Co.，New Haven，CT)或myc(Invitrogen，Carlsbad，CA)等其他小肽，则可通过单步处理进行纯化，方法是使溶液穿过一种亲和柱，柱中装有对该标记具有高度亲和力的柱填料。
例如，多聚组氨酸能够以很高的亲和力和特异性与镍结合。因此，可以用镍亲和柱(如Qiagen镍柱)来纯化IL-1ra-L多肽/多聚组氨酸。可参考，例如，新编分子生物学手册§10.11.8(Ausubel et al.，eds.，GreenPublishers Inc.and Wiley and Sons 1993)。
此外，还可使用能够特异性识别并结合IL-1ra-L多肽的单克隆抗体来纯化IL-1ra-L多肽。
适用于纯化的其他方法包括，但不局限于，亲和层析法、免疫亲和层析法、离子交换层析法、分子筛层析法、HPLC、电泳(包括天然凝胶电泳)然后凝胶洗脱的方法，以及制备型等电聚焦法(“Isoprime”装置/技术，Hoefer Scientific，San Francisco，CA)。有时需要将两种或多种纯化技术组合使用，以获得更高的纯度。
还可利用该领域已知的技术由化学合成方法(如固相肽合成法)制备IL-1ra-L多肽，如Merrifield et al.，1963，J.Am Chem.Soc.852149；Houghten et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825132和Stewart andYoung，固相肽合成(Pierce Chemical Co.1984)中描述的方法。这些合成的多肽在氨基末端可以含有甲硫氨酸，也可以不含甲硫氨酸。可以用参考文献中列举的方法对化学合成的IL-1ra-L多肽进行氧化，以形成二硫键。化学合成的IL-1ra-L多肽可以具有与重组产生的或由天然资源纯化的相应IL-1ra-L多肽类似的生物活性，因此可以与重组的或天然的IL-1ra-L多肽交替使用。
获得IL-1ra-L多肽的另一种方法是从生物样品中纯化，如天然存在IL-1ra-L多肽的源组织和/或流体。这种纯化可由文中描述的蛋白纯化方法来实现。在纯化过程中可以对IL-1ra-L多肽进行监测，例如，使用由重组产生的IL-1ra-L多肽或其片段制备的抗体进行监测。
该领域还有许多产生核酸和多肽的其他方法，这些方法可用来产生对IL-1ra-L多肽具有特异性的多肽。可参考，例如，Roberts et al.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.9412297-303中描述的在mRNA及其编码的肽之间产生融合蛋白的方法。还可参考Roberts，1999，Curr.Opin.Chem.Biol.3268-73。此外，美国专利5,824,469中描述了能够实现特定生物学功能的寡核苷酸的获得方法。该方法涉及产生一种异源寡核苷酸库，每种寡核苷酸都含有一段5’随机序列和一段3’随机序列，中间是预先选定的序列。将所得的异源库引入不表现出所需生物学功能的细胞群体。然后在亚细胞群体中筛选出具有预定生物学功能的细胞。从这些亚细胞群体中可以分离出能实现所需生物学功能的寡核苷酸。
美国专利5,763,192、5,814,476、5,723,323和5,817,483描述了肽或多肽的产生方法。该方法是产生随机基因或其片段，然后将这些基因引入宿主细胞，使其产生一种或多种由这些随机基因编码的蛋白。然后对宿主细胞进行筛选，以鉴定那些能够产生具有所需活性的肽或多肽的宿主细胞。
Athersys，Inc.提交的PCT/US98/20094(WO99/15650)中描述了另一种产生肽或多肽的方法。这种被称为“用于发现基因的基因表达随机激活”(RAGE-GD)的方法涉及利用体内重组方法来激活内源基因的表达或超表达。例如，可以将调控序列整合到一种能通过非同源重组或非常规重组来激活一种内源基因表达的靶细胞内，从而激活或加强该基因的表达。首先对靶DNA进行辐射，然后插入一种遗传启动子。该启动子可最终定位于基因前的断裂部位，并启动该基因转录。从而可导致所需多肽或肽的表达。
应该了解的是，这些方法还可用来创建IL-1ra-L多肽的综合表达库，然后可以在生化测定、细胞测定和全生物体测定(如植物、小鼠等)等多种测定中利用这些库进行高通量的表型筛选。
合成该领域的技术人员都了解，利用重组方法和其他方法也可以产生文中描述的核酸和多肽分子。
选择性结合剂术语“选择性结合剂”是指对一种或多种IL-1ra-L多肽具有特异性的一种分子。适当的选择性结合剂包括，但不局限于，抗体或其衍生物、多肽和小分子。可以用该领域已知的方法来制备适当的选择性结合剂。本发明的典型的IL-1ra-L多肽选择性结合剂能够与IL-1ra-L多肽的一定部位结合，从而抑制这种多肽与IL-1ra-L多肽受体的结合。
本发明的选择性结合剂还包括能够与IL-1ra-L多肽结合的抗体和抗体片段。这些抗体可以是多克隆抗体，其中包括单特异性多克隆抗体；也可以是单克隆抗体(MAbs)；嵌合抗体；人源化抗体，如CDR嫁接抗体；人抗体；单链抗体；和/或双特异性抗体；及其片段、变异体或衍生物。抗体片段包括抗体中能够与IL-1ra-L多肽的表位结合的部分。这些片段的实例包括全长抗体经酶切后产生的Fab和F(ab’)片段。其他结合片段还包括由DNA重组技术产生的结合片段，例如，由包含抗体可变区核酸编码序列的重组质粒的表达产生的结合片段。
在动物(如兔或小鼠)体内产生抗IL-1ra-L多肽多克隆抗体的方法一般是用IL-1ra-L多肽和佐剂进行多次皮下注射或腹腔内注射。使IL-1ra-L多肽与一种对免疫动物具有免疫原性的载体蛋白相结合可以提高效率，如钥孔血蓝素、血清、白蛋白、牛甲状腺球蛋白，或大豆胰蛋白酶抑制剂。此外，还可以用明矾等聚集剂来加强免疫应答。将免疫后的动物取血，并测定血清的抗IL-1ra-L抗体效价。
产生抗IL-1ra-L多肽单克隆抗体的方法可以是任一种由培养的连续细胞系产生抗体分子的方法。用于制备单克隆抗体的适当方法的实例包括Kohler et al.，1975，Nature 256495-97的杂交瘤方法和人B细胞杂交瘤方法(Kozbor，1984，J.Immunol.1333001；Brodeur et al.，单克隆抗体产生技术及应用51-63，Marcel Dekker，Inc.，1987)。本发明还提供能够产生与IL-1ra-L多肽反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
当用作治疗剂时，可以对本发明的单克隆抗体进行修饰。一种实施方案是“嵌合”抗体，其中，重链(H)和/或轻链(L)的一部分与来自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，剩余部分则与来自另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源。另外还包括这些抗体的片段，条件是这些片段具有所需的生物学活性。可参考美国专利4,816,567；Morrison et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.816851-55。
在另一项实施方案中，本发明的单克隆抗体是一种“人源化”抗体。非人类抗体的人源化方法已为该领域所熟知。可参考美国专利5,585,089和5,693,762。人源化抗体通常含有一个或多个从非人类来源引入的氨基酸残基。实现人源化的方法可以是，例如，通过该领域已知的方法(Joneset al.，1986，Nature 321522-25；Riechmann et al.，1998，Nature 332323-27；Verhoeyen et al.，1988，Science 2391534-36)用啮齿类互补决定区(CDR)的至少一部分替换人类抗体的相应区域。
本发明还包括能够与IL-1ra-L多肽结合的人类抗体。这些抗体的产生方法是用IL-1ra-L多肽抗原(即至少含有6个连续氨基酸)免疫那些能产生人类抗体库并且不产生内源免疫球蛋白的转基因动物(如小鼠)，还可选择性地利用与载体结合的IL-1ra-L多肽抗原进行免疫。可参考，例如，Jakobovits et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.902552-55；Jakobovitset al.，1993，Nature 362255-58；Bruggermann et al.，1993，Year in Immuno.733。在该方法中，这些转基因动物的产生方法是将其编码免疫球蛋白重链和轻链的内源基因座灭活，并将编码人类重链和轻链蛋白的基因座插入其基因组中。然后用部分改造的动物，即改造不完全的动物进行杂交，以获得完全被改造成具有所需免疫系统的动物。经抗原给药后，这些转基因动物可产生具有人类(而不是，例如，小鼠)氨基酸序列的抗体，其中包括对这些抗原具有免疫特异性的可变区。可参考PCT申请PCT/US96/05928和PCT/US93/06926。在美国专利5,545,807、PCT申请PCT/US91/245和PCT/GB89/01207，以及欧洲专利546073B1和546073A1中还描述了其他一些方法。产生人类抗体的方法还可以是文中描述的宿主细胞表达重组DNA的方法或在杂交瘤细胞中表达的方法。
在可选实施方案中，还可通过噬菌体展示库来产生人类抗体(Hoogenboom et al.，1991，J.Mol.Biol.227381；Marks et al.，1991，J.Mol.Biol.222581)。类似于免疫筛选的这些方法是将抗体库展示在丝状噬菌体表面，然后通过与选定抗原的结合来筛选噬菌体。这种技术在PCT申请PCT/US98/17364中有所描述，该申请利用这种方法分离出对MPL-和msk-受体具有强亲和力和对抗功能的抗体。
嵌合抗体、CDR嫁接抗体和人源化抗体通常是由重组方法产生。可利用文中描述的材料和方法将编码抗体的核酸引入宿主细胞并加以表达。在优选实施方案中，抗体是在CHO细胞等哺乳动物宿主细胞中产生。产生单克隆(如人类)抗体的方法还可以是文中描述的宿主细胞表达重组DNA的方法或在杂交瘤细胞中表达的方法。
本发明的抗IL-1ra-L抗体可用于任何已知的测定方法，例如检测和定量IL-1ra-L多肽的竞争性结合测定法、直接或间接夹层测定法，和免疫沉淀测定法(Sola，单克隆抗体技术手册147-158(CRC Press，Inc.，1987))。这些抗体与IL-1ra-L多肽结合的亲和力适用于所采用的测定方法。
在一些实施方案中，应用于诊断的抗IL-1ra-L抗体可带有一种可检测标记。这种可检测标记可以是任一种能够直接或间接产生可检测信号的部分。例如，这种可检测标记可以是一种放射性同位素，如3H、14C、32P、35S、125I、99Tc、111In或67Ga；也可以是一种荧光或化学发光化合物，如异硫氰酸荧光素、罗丹明或虫荧光素；也可以是一种酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶(Bayer，et al.，1990，Meth.Enz.184138-63)。
竞争性结合测定法依赖于标准标记物(如IL-1ra-L多肽或其免疫活性部分)和测试样品分析物(一种IL-1ra-L多肽)与有限剂量的抗IL-1ra-L抗体竞争性结合的能力。测试样品中的IL-1ra-L多肽量与已结合抗体的标准物的量成反比。为便于测定已结合标准物的量，使用的抗体一般在竞争前或竞争后为不溶形式，从而可以方便地将已结合抗体的标准物或分析物与未结合的标准物和分析物分离。
夹层测定法通常涉及使用两种抗体，每种抗体能够与待检测和/或待定量蛋白的不同免疫原性部分或不同表位相结合。在夹层测定法中，一般是测试样品分析物与固定在固体支持物上的第一抗体结合，然后是第二抗体与该分析物结合，这样就形成一种不溶的三元复合物。可参考，例如，美国专利4,376,110。第二抗体可以本身带有一种可检测标记(直接夹层测定法)，也可利用带有可检测标记的抗免疫球蛋白抗体来检测(间接夹层测定法)。例如，酶联免疫吸附测定法(ELISA)就是一种夹层测定法，该方法的可检测部分是一种酶。
包括抗IL-1ra-L抗体在内的选择性结合剂还可用于体内成像。将带有可检测标记的抗体给药于一种动物，优选的是给药到血流中，然后检测标记抗体在宿主中的存在情况和定位。该抗体可带有一种能够在动物体内检测的标记，检测方法可以是核磁共振法、放射检测法，或该领域已知的其他检测方法。
本发明的选择性结合剂，包括抗体，还可作为治疗剂使用。这些治疗剂可提高或降低IL-1ra-L多肽的至少一种生物学活性，因而一般属于显效剂或拮抗剂。在一项实施方案中，本发明的拮抗型抗体是能够特异性结合IL-1ra-L多肽并抑制或消除其体内或体外功能活性的抗体或其结合片段。在优选实施方案中，本发明的选择性结合剂，如拮抗型抗体，可将IL-1ra-L多肽的功能活性至少抑制约50％，优选的是至少抑制约80％。在另一项实施方案中，本发明的选择性结合剂是一种能够与IL-1ra-L多肽的结合配偶体(如配体或受体)相互作用从而抑制或消除IL-1ra-L多肽的体外或体内活性的抗IL-1ra-L多肽抗体。利用该领域熟知的筛选测定法可鉴定出选择性结合剂，其中包括显效型和拮抗型抗IL-1ra-L多肽抗体。
本发明还涉及一种试剂盒，其中含有IL-1ra-L选择性结合剂(如抗体)和其他可用于检测生物样品中的IL-1ra-L多肽水平的试剂。这些试剂可包括一种可检测标记、封闭血清、阳性和阴性对照样品，以及检测试剂。
微阵列应该了解的是，可以根据本发明使用DNA微阵列技术。DNA微阵列是指核酸在玻璃等固体支持物上的高密度微缩排列。该阵列的每个单元或部件各含有多个拷贝的一种核酸，可作为与互补核酸序列(如mRNA)杂交的靶。在利用DNA微阵列技术进行表达谱测定的方法中，首先要从细胞或组织样品中提取出mRNA，然后用酶学方法将其转变成荧光标记的cDNA。再用该物质与微阵列杂交，并通过清洗去除未结合的cDNA。然后测定与每种靶核酸分子特异性结合的标记cDNA的量，以观测阵列上的离散基因表达。这样就可利用单一生物材料样品以高通量的并行方式对数千种基因的表达进行定量。
与本发明所述IL-1ra-L分子有关的这种高通量表达谱测定法具有广泛的应用领域，其中包括，但不局限于鉴定和确认与IL-1ra-L疾病有关的基因以作为治疗的对象；IL-1ra-L相关分子及其抑制剂的分子毒理学；群体分层和产生用于临床试验的替代标记；以及在高通量筛选过程中协助鉴定选择性化合物，以加快IL-1ra-L多肽相关小分子药物的发现。
化学衍生物该领域的技术人员可根据文中的公开内容来制备IL-1ra-L多肽的化学修饰衍生物。IL-1ra-L多肽衍生物的修饰方式在其天然联接分子的类型或部位方面有所不同。衍生物包括由一种或多种天然联接化学基团的缺失而形成的分子。可通过与一种或多种聚合物共价联接的方式对含有序列编号2所示氨基酸序列的多肽或其他IL-1ra-L多肽进行修饰。例如，选择的聚合物通常可溶于水，因此，与其联接的蛋白不会在生理环境等水性环境中沉淀。适用于本发明的聚合物可以是聚合物的一种混合物。当终产物要用于治疗时，优选的是使用药学容许的聚合物。
每种聚合物的分子量可以是任意大小，可以使用分支聚合物，也可以使用未分支聚合物。每种聚合物的平均分子量一般约为2kDa-100kDa(术语“约”是指，在水溶性聚合物制品中，一些分子的分子量会大于规定值，一些分子的分子量会小于规定值)。优选的是，每种聚合物的平均分子量约为5kDa-50kDa，更优选的则约为12kDa-40kDa，最优选的则约为20kDa-35kDa。
适当的水溶性聚合物或其混合物包括，但不局限于，N联或O联糖、糖类、磷酸盐、聚乙二醇(PEG)(其中包括在蛋白衍化中使用的PEG形式，例如单-(C1-C10)-聚乙二醇、烷氧聚乙二醇或芳氧聚乙二醇)、单甲氧基聚乙二醇、葡聚糖(例如约6kD的低分子量葡聚糖)、纤维素或其他糖类聚合物、聚-(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧化乙烯多元醇(如甘油)，以及聚乙烯醇。本发明还包括双功能交联分子，这些分子可用来制备共价联接的IL-1ra-L多肽多聚体。
一般而言，化学衍化可以在适用于蛋白与活化聚合物分子反应的任何条件下进行。多肽化学衍生物的制备方法一般包括(a)在能够使包含序列编号2所示氨基酸序列的多肽或其他IL-1ra-L多肽与一种或多种聚合物分子联接的条件下用多肽和活化聚合物分子(如聚合物分子的活性酯衍生物或醛衍生物)进行反应，和(b)获得反应产物。根据已知的参数和想得到的结果可以确定最佳的反应条件。例如，聚合物分子与蛋白的比例越大，联接聚合物分子的百分率越高。在一项实施方案中，IL-1ra-L多肽衍生物可以在氨基末端具有单一的聚合物分子。可参考，例如，美国专利5,234,784。
利用该领域已知的任一种聚乙二醇化反应可以对多肽进行特定的聚乙二醇化。例如，下述参考文献对这些反应进行了描述Francis et al.，1992，Focus on Growth Factors 34-10；欧洲专利0154316和0401384；以及美国专利4,179,337。举例来说，可以按本文所述通过与活性聚乙二醇分子(或类似的活性水溶性聚合物)的酰化或烷化反应来实现聚乙二醇化。用于酰化反应的选定聚合物应具有单一的活性酯基。用于还原性烷化反应的选定聚合物应具有单一的活性醛基。活性醛基可以是，例如，水溶性聚乙二醇丙醛或其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(参考美国专利5,252,714)。
在另一项实施方案中，可以用生物素与IL-1ra-L多肽化学偶联。然后使生物素/IL-1ra-L多肽分子与亲和素结合，从而获得4价的亲和素/生物素/IL-1ra-L多肽分子。还可以用二硝基苯酚(DNP)或三硝基苯酚(TNP)与IL-1ra-L多肽共价联接，并用抗DNP或抗TNP-IgM使所得结合物沉淀，以形成10价的十聚体结合物。
可通过本发明所述IL-1ra-L多肽衍生物的给药来缓解或调整的病情通常包括文中描述的适合于IL-1ra-L多肽的病情。但本文公开的IL-1ra-L多肽衍生物还可具有额外的活性、增强的或降低的生物学活性，或其他特性，例如与非衍化分子相比具有更长的或更短的半衰期。
非人类基因工程动物本发明还包括天然IL-1ra-L多肽编码基因已被破坏(即敲除)从而IL-1ra-L多肽表达水平显著降低或完全丧失的非人类动物，如小鼠、大鼠，或其他啮齿类动物；兔、山羊、绵羊，或其他农畜。制备这些动物的技术和方法可以是，例如，美国专利5,557,032中描述的技术和方法。
本发明还包括天然IL-1ra-L基因或异源IL-1ra-L基因被超表达的“转基因”非人类动物，如小鼠、大鼠，或其他啮齿类动物；兔、山羊、绵羊，或其他农畜。这些转基因动物可通过众所周知的方法来制备，如美国专利5,489,743和PCT专利WO94/28122中描述的方法。
本发明还包括可以将本发明所述一种或多种IL-1ra-L多肽的启动子激活或灭活(例如用同源重组方法)从而改变一种或多种天然IL-1ra-L多肽的表达水平的非人类动物。
这些非人类动物可用于候选药物的筛选。在筛选过程中，可以检测候选药物对该动物的影响。例如，候选药物的作用可以是降低或提高IL-1ra-L基因的表达。在某些实施方案中，可以将动物暴露于这种候选药物，然后测量其产生的IL-1ra-L多肽量。此外，在某些实施方案中，还可以检测这种候选药物对动物的实际影响。例如，特定基因的超表达可导致或伴随有某种疾病或病理状况。此时，可以对候选药物降低该基因表达的能力进行检测，也可以对预防或抑制病理状况的能力进行检测。在其他实例中，诸如多肽片段等特定代谢产物的产生可导致或伴随有某种疾病或病理状况。此时，可以对候选药物降低该代谢产物产生的能力进行检测，也可以对预防或抑制病理状况的能力进行检测。
其他IL-1ra-L多肽活性调节剂的鉴定在某些情况下，需要鉴定IL-1ra-L多肽的活性调节剂分子，即显效剂或拮抗剂。可利用一种或多种筛选测定方法，如本文描述的方法，来鉴定能够调节IL-1ra-L多肽的天然分子或合成分子。这些分子可以通过先体外后体内的方式给药，也可通过注射、口服或植入装置等体内方式进行给药。
“测试分子”是指用于评定其IL-1ra-L多肽活性调节(即提高或降低)能力的分子。大多数情况下是用测试分子与IL-1ra-L多肽直接相互作用。但是，还应考虑到测试分子能够间接调节IL-1ra-L多肽的活性，例如影响IL-1ra-L基因的表达，或与IL-1ra-L多肽的结合配偶体(如受体或配体)结合。在一项实施方案中，测试分子与IL-1ra-L多肽结合的亲和常数至少约为10-6M，优选的则约为10-8M，更优选的则约为10-9M，再更优选的则约为10-10M。
本发明还包括能够与IL-1ra-L多肽相互作用的化合物的鉴定方法。在某些实施方案中，是在允许测试分子与IL-1ra-L多肽相互作用的条件下将IL-1ra-L多肽与该测试分子共保温，然后测量这种相互作用的程度。用于筛选的测试分子可以是基本纯化的形式，也可以是粗制混合物。
在某些实施方案中，IL-1ra-L多肽的显效剂或拮抗剂可以是一种能够与IL-1ra-L多肽相互作用并调节其活性的蛋白、肽、糖类、脂类或小分子量分子。可调节IL-1ra-L多肽表达的分子包括与IL-1ra-L多肽编码核酸互补的核酸，或与指导或调控IL-1ra-L多肽表达的核酸序列互补的核酸，这些核酸可作为表达的反义调节剂。
只要确定测试分子能够与IL-1ra-L多肽相互作用，就可以进一步评定该分子提高或降低IL-1ra-L多肽活性的能力。可以用几种方法对测试分子与IL-1ra-L多肽的相互作用进行测量，其中包括基于细胞的结合测定法、膜结合测定法、液相测定法和免疫测定法。通常是把测试分子和IL-1ra-L多肽共保温特定的时间，然后用一种或多种生物学活性测定法测量IL-1ra-L多肽的活性。
还可以用多克隆抗体或单克隆抗体直接对测试分子与IL-1ra-L多肽的相互作用进行免疫测定。作为选择，还可以在液相测定和免疫测定中使用本文描述的经过修饰而含有表位标记的IL-1ra-L多肽。
当IL-1ra-L多肽是通过与结合配偶体(如受体或配体)的相互作用来表现其生物学活性时，可以用多种体外测定法来测量IL-1ra-L多肽与相应的结合配偶体(如选择性结合剂、受体或配体)的结合。这些测定法可用来筛选能够提高或降低IL-1ra-L多肽与其结合配偶体结合的速率和/或程度的测试分子。一种测定法是将IL-1ra-L多肽固定在微量滴定板的孔中。然后把放射性标记的IL-1ra-L多肽结合配偶体(例如碘化IL-1ra-L多肽结合配偶体)和测试分子依次(任意顺序)或同时添加到孔中。将孔保温，然后清洗，并利用闪烁计数器进行放射性计数，以确定结合配偶体与IL-1ra-L多肽的结合程度。通常是对一定浓度范围的分子进行测试，并在结果评定过程中利用不含一种或多种测试组分的一系列对照孔来确保准确性。该方法的替代方法则涉及改变蛋白的“位置”，也就是把IL-1ra-L多肽结合配偶体固定在微量滴定板的孔中，将测试分子和放射性标记的IL-1ra-L多肽共保温，并测定IL-1ra-L多肽的结合程度。可参考，例如，新编分子生物学手册，第18章(Ausubel et al.，eds.，GreenPublishers Inc.and Wiley and Sons 1995)。
作为放射性标记的替代方法，还可将IL-1ra-L多肽或其结合配偶体与生物素联接，然后用酶联的或荧光标记的抗生蛋白链菌素检测生物素化蛋白的存在情况，联接的酶可以是，例如，能够用比色方法检测的辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)。还可以用IL-1ra-L多肽或IL-1ra-L多肽结合配偶体的生物素偶联抗体来进行检测，然后将复合物与AP或HRP偶联的抗生蛋白链菌素共保温。
还可通过与琼脂糖小珠、丙烯酸小珠或其他惰性固相基质的联接来固定IL-1ra-L多肽或IL-1ra-L多肽结合配偶体。然后将基质-蛋白复合物置于含有互补蛋白和测试复合物的溶液中。保温，离心使小珠沉淀，然后用本文描述的方法评定IL-1ra-L多肽与其结合配偶体之间的结合量。作为选择，还可以将基质-蛋白复合物固定在柱中，并使测试分子和互补蛋白穿过该柱。然后用本文描述的任一种技术(如放射性标记或抗体结合)对IL-1ra-L多肽与结合其配偶体形成的复合物进行评定。
用于鉴定能够提高或降低IL-1ra-L多肽与IL-1ra-L多肽结合配偶体形成复合物的测试分子的另一种体外测定法是表面胞质基因共振检测系统，如BIAcore检测系统(Pharmacia，Piscataway，NI)。BIAcore系统的使用是按照厂商的规定来进行。该测定方法本质上涉及IL-1ra-L多肽或IL-1ra-L多肽结合配偶体与检测器中带有葡聚糖涂层的传感片之间共价结合。然后将测试化合物和其他互补蛋白同时或依次注射到装有传感片的容器中。用检测系统测量与传感片的葡聚糖涂层面物理结合的分子质量的变化，并根据这种变化来评定互补蛋白的结合量。
有时需要评定两种或多种测试化合物的组合对IL-1ra-L多肽与IL-1ra-L多肽结合配偶体形成复合物的提高或降低能力。此时可以对本文描述的测定方法进行简单地修改，方法是在添加第一测试化合物的同时或之后添加这些额外的测试化合物。该测定法的剩余步骤则与上文所述相同。
可以用体外测定方法，例如本文描述的方法，从大量化合物中方便地筛选出能够影响IL-1ra-L多肽与IL-1ra-L多肽结合配偶体形成复合物的化合物。可以用自动化测定方法对噬菌体展示库、合成肽库和化学合成库中产生的化合物进行筛选。
还可利用能够表达IL-1ra-L多肽或IL-1ra-L多肽结合配偶体的细胞和细胞系，从细胞培养物中筛选出能够提高或降低IL-1ra-L多肽与IL-1ra-L多肽结合配偶体形成复合物的化合物。细胞和细胞系可来源于任一种哺乳动物，但优选的是来源于人类或其他灵长类、犬类或啮齿类动物。在缺乏或存在测试分子的条件下，对IL-1ra-L多肽与能够在表面表达IL-1ra-L多肽结合配偶体的细胞之间的结合进行鉴定，并通过，例如，流式细胞计技术用IL-1ra-L多肽结合配偶体的生物素化抗体对结合的程度进行检测。可以方便地使用细胞培养测定法对上述蛋白结合测定中的阳性化合物做进一步的鉴定。
还可以用细胞培养物对候选药物的作用进行鉴别。例如，候选药物的作用可以是降低或提高IL-1ra-L基因的表达。在某些实施方案中，可以将细胞培养物暴露于候选药物，然后测量IL-1ra-L多肽或IL-1ra-L多肽片段的产量。在某些实施方案中，还可以检测候选药物对细胞培养物的实际影响。例如，特定基因的超表达可以对细胞培养物产生特定的影响。此时，可以检测候选药物提高或降低该基因表达的能力，也可以检测其预防或抑制对细胞培养物的特定影响的能力。在其他实例中，诸如多肽片段等特定代谢产物的产生可导致或伴随有某种疾病或病理状况。此时，可以对候选药物降低细胞培养物中产生这种代谢产物的能力进行检测。
内化蛋白可以用tat蛋白序列(来源于HIV)使蛋白内化到细胞内。可参考，例如，Falwell et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91664-68。例如，HIV tat蛋白的一种含有11个氨基酸残基的序列(Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R；序列编号7)(被称为“蛋白转导区”或TAT PDT)可以介导跨细胞质膜和细胞核膜的递送。可参考Schwarze et al.，1999，Science2851569-72和Nagahara et al.，1998，Nat.Med.41449-52。在这些方法中，需要制备一些能够在腹腔内给药之后渗透到组织内的FITC-构建体(FITC标记的G-G-G-G-Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R；序列编号8)，并且可通过荧光激活细胞分类(FACS)分析的方法来检测细胞与这些构建体的结合。经tat-β-gal融合蛋白处理的细胞可表现出β-gal活性。将这种构建体注射之后，可以在多种组织内检测到该构建体的表达，其中包括肝脏、肾脏、肺、心脏和脑组织。为了进入细胞，这些构建体应该进行某种程度的去折叠，因而在进入细胞之后还需要进行重折叠。
因此，可以用tat蛋白序列使所需蛋白内化到细胞内。举例来说，可以用tat蛋白序列将IL-1ra-L拮抗剂(如抗IL-1ra-L的选择性结合剂、小分子、可溶性受体或反义寡核苷酸)给药于细胞内，以抑制IL-1ra-L分子的活性。文中使用的术语“IL-1ra-L分子”既包括文中定义的IL-1ra-L核酸，也包括文中定义的IL-1ra-L多肽。如果需要，还可利用这些方法将IL-1ra-L蛋白本身给药于细胞内。还可参考Straus，1999，Science2851466-67。
利用IL-1ra-L多肽确定细胞的来源根据本发明的某些实施方案，与IL-1ra-L多肽有关的某些细胞类型的来源的确定会很有帮助。例如，疾病或病理状况来源的确定会有助于选择适当的疗法。在某些实施方案中，为了对文中描述的细胞进行鉴定，可以将IL-1ra-L多肽的编码核酸作为探针，并利用这种探针对细胞的核酸进行筛选。在其他实施方案中，还可以用抗IL-1ra-L多肽抗体来检测IL-1ra-L多肽在细胞内的存在情况，从而确定这些细胞是否属于文中描述的类型。
IL-1ra-L多肽组合物及给药方法本发明还包括治疗性组合物。这些IL-1ra-L多肽药用组合物可含有治疗有效剂量的一种IL-1ra-L多肽或一种IL-1ra-L核酸分子，以及根据给药方式选择的药学或生理学容许的适当配制剂。药用组合物可含有治疗有效剂量的一种或多种IL-1ra-L多肽选择性结合剂，以及根据给药方式选择的药学或生理学容许的适当配制剂。
优选的是，容许的配制原料在所用剂量和浓度下不对受者产生毒性。
药用组合物中包含的配制原料的作用可以是，例如，改变、维持或保护该组合物的pH、摩尔渗透压浓度、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附性或穿透性。适当的配制原料包括，但不局限于，氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、抗微生物剂、抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲液(如硼酸缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液或其他有机酸缓冲液)、膨胀剂(如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))、络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)、填充剂、单糖、二糖和其他糖类(如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成盐抗衡离子(如钠)、防腐剂(如氯苄烷铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、双氯苯双胍己烷、山梨酸或过氧化氢)、溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(如甘露醇或山梨醇)、悬浮剂、表面活性剂或润湿剂(如pluronics；PEG；山梨糖醇酯；聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；去利通；氨基丁三醇；卵磷脂；胆固醇或四丁酚醛)、增稳剂(如蔗糖或山梨醇)、增紧剂(如碱金属卤化物——优选的是氯化钠或氯化钾——或甘露醇、山梨醇)、运载剂、稀释剂、赋形剂和/或药用佐剂。可参考Remington’s PharmaceuticalSciences(18th Ed.，A.R.Gennaro，ed.，Mack Publishing Company 1990)。
技术人员可根据，例如，预定的给药途径、递送方式和所需剂量来确定最佳的药用组合物。可参考，例如，上文的Remington’sPharmaceutical Sciences。这些组合物可以影响IL-1ra-L多肽的物理状况、稳定性、体内释放速率和体内清除率。
药用组合物中的运载剂或载体可以是水性或非水性的。例如，适用于注射的运载剂或载体可以是水、生理盐水或人造脑脊液，还可以补加胃肠外给药组合物中常用的其他物质。其他典型的运载剂还包括混有血清白蛋白的中性缓冲盐溶液或生理盐水。其他典型的药用组合物可含有pH值约为7.0-8.5的Tris缓冲液，或pH值约为4.0-5.5的醋酸缓冲液，其中可进一步含有山梨醇或适当的替代物。在本发明的一项实施方案中，IL-1ra-L多肽组合物的制备方法是用任意的配制剂(见上文的Remington’s Pharmaceutical Sciences)与具有所需纯度的选定组合物混合，并以冻干块或水溶液的形式储存。此外，还可以用蔗糖等适当赋形剂将IL-1ra-L多肽产物配制成冻干品。
可以选择适用于胃肠外递送的IL-1ra-L多肽药用组合物。也可以选择适用于吸入或通过消化道递送的组合物，例如用于口服的组合物。这些药学容许的组合物的制备方法已为该领域的技术人员所了解。
配制组分的浓度应能够被给药部位所接受。例如，可以用缓冲液将组合物维持在生理pH值或稍低的pH值，pH值的范围一般约为5-8。
当考虑胃肠外给药方式时，本发明中使用的治疗组合物可采用适于胃肠外给药的无热源水溶液形式，其中含有所需的IL-1ra-L分子和药学容许的运载剂。特别适合于胃肠外注射的运载剂为无菌蒸馏水，可以在无菌蒸馏水中将IL-1ra-L分子配制成无菌等渗溶液并适当保存。另一种制备方法涉及使用一种能使产物受控释放或持续释放的制剂来配制所需分子，例如注射用微球体、可生物降解的颗粒、聚合物(如多聚乳酸或多聚乙醇酸)、小珠，或脂质体，因此，可以用长效注射剂来递送这些产物。此外，还可以使用透明质酸，这样可延长在循环系统中的持续存留时间。用于引入所需分子的其他适当方法还包括植入式药物递送装置。
在一项实施方案中，可以将药用组合物配制成用于吸入的形式。例如，可以将IL-1ra-L多肽配制成用于吸入的干粉。还可以用推进剂将IL-1ra-L多肽或核酸分子的吸入溶液配制成用于气雾剂递送的形式。在另一项实施方案中，还可以将溶液雾化。PCT专利WO94/20069进一步描述了肺部给药的方法，其中包括化学修饰蛋白的肺部递送方法。
还可以考虑用于口服给药的一些配制方法。在本发明的一项实施方案中，可以用片剂和胶囊剂等固体剂型配方中常用的载剂来配制以这种方式给药的IL-1ra-L多肽，也可以不使用这些载剂。例如，可将胶囊剂设计成能够在胃肠道部位释放制剂中的活性成分，这样可获得最佳的生物利用度，并且使前期的系统性降解减至最小。还可使用其他制剂来促进IL-1ra-L多肽的吸收。此外，还可以使用稀释剂、调味剂、低融点的蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、药片崩解剂和粘合剂。
另一种药用组合物涉及将有效剂量的IL-1ra-L多肽与适用于片剂生产的无毒赋形剂相混合。可以将片剂溶解在无菌水或另一种适当运载剂中，从而将溶液配制成单位剂量的形式。适当的赋形剂包括，但不局限于，惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
其他IL-1ra-L多肽药用组合物已为该领域的技术人员所了解，其中包括IL-lra-L多肽与缓释剂或受控递送剂配制的制剂。其他多种持续递送或受控递送方法的配制技术已为该领域技术人员所了解，例如脂质体载剂、可生物降解的微颗粒或多孔小珠和长效注射剂。可参考，例如，PCT/US93/00829中描述的利用多孔微颗粒聚合物的受控释放来递送药用组合物的方法。
缓释制剂的其他实例包括，例如，薄膜或微胶囊等形式的半透性聚合物基质。缓释基质可包括聚酯、水凝胶、聚交酯(美国专利3,773,919和欧洲专利058481)、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidmanet al.，1983，Biopolymers 22547-56)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langeret al.，1981，J.Biomed.Mater.Res.15167-277和Langer，1982，Chem.Tech.1298-105)、乙烯醋酸乙烯酯(Langer et al.，见生物)、或聚-D(-)-3-羟丁酸(欧洲专利133988)。缓释组合物还可包括脂质体，其制备方法可以是该领域已知的几种方法中的任何一种。可参考，例如，Eppstein et al.，1985、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 823688-92，以及和欧洲专利036676、088046和143949。
一般而言，用于体内给药的IL-1ra-L药用组合物必须是无菌的。这可通过除菌滤膜的过滤来实现。当组合物为冻干形式时，可以在冻干和重构之前用这种方法进行除菌，也可以在冻干和重构之后在用这种方法进行除菌。用于胃肠外给药的组合物可采用冻干形式或在溶液中储存。此外，胃肠外给药的组合物通常被置于一种带有无菌入口的容器中，如静脉内注射液袋或带有可被皮下注射针刺穿的塞子的小药水瓶。
配制好的药用组合物可采用溶液、悬浮液、凝胶、乳剂、固体或脱水干粉或冻干粉的形式储存在无菌小瓶中。这些制剂可按照即用形式或需要在给药前重构的形式(如冻干形式)加以储存。
在一项特别实施方案中，本发明涉及一些用于获得单剂量给药器械的试剂盒。这些试剂盒可各自包含一种装有干燥蛋白的第一容器和一种装有水性配制剂的第二容器。本发明还包括一些含有预装的单室和多室注射器(如流体注射器和lyosyringes)的试剂盒。
用于治疗的IL-1ra-L药用组合物的有效剂量将取决于，例如，治疗的环境和目的。该领域的技术人员都将了解，用于治疗的适当剂量水平在某种程度上会根据递送的分子、所用IL-1ra-L分子的适应症、给药途径，以及患者的大小(体重、体表或器官的大小)和状况(年龄和一般健康状况)而有所不同。因此，临床医生可以确定单位剂量的效价，并修改给药途径，以获得最佳的治疗效果。根据上述因素，典型的剂量可约为0.1μg/kg-100mg/kg或更高。在其他实施方案中，该剂量可约为0.1μg/kg-100mg/kg；或约为1μg/kg-100mg/kg；或5μg/kg-100mg/kg。
给药的频率将取决于IL-1ra-L分子在所用制剂中的药代动力学参数。一般而言，临床医生可以将组合物给药，直到其剂量能够实现所需的效果。因此，组合物的给药方式可以是单剂给药或根据时间进行二剂或多剂给药(包含的所需分子的量可以相同，也可以不同)，或通过植入装置或导管进行连续灌注。该领域的普通技术人员可以常规性地对适当剂量做进一步改进，这只是其日常的工作之一。可以用适当的剂量-反应数据来确定适当的剂量。
本发明所述药用组合物的给药途径与已知的方法一致，例如口服；静脉内注射、腹膜内注射、脑内(实质内)注射、脑室内注射、肌内注射、眼内注射、动脉内注射、门内注射或病损内注射；通过缓释系统给药；或通过植入装置给药。如果需要，还可以通过弹丸注射或连续灌注的方式或通过植入装置将组合物给药。
此外，或作为选择，还可以将组合物局部给药，方法是植入一种吸附有或封装有所需分子的膜、海绵或其他适当物质。当使用植入装置时，可将该装置植入到任何适当的组织或器官内，并通过扩散、定时释放药丸或连续给药的方式来递送所需分子。
有时需要以先体外后体内的方式来使用IL-1ra-L多肽药用组合物。此时可以将取自患者的细胞、组织或器官暴露于IL-1ra-L多肽药用组合物，然后再将这些细胞、组织或器官重新植入到该患者体内。
递送IL-1ra-L多肽的方法还可以是植入一些基因工程细胞，这些细胞经过，例如，文中所述方法的改造而能够表达和分泌IL-1ra-L多肽。这些细胞可以是动物细胞，也可以是人类细胞，可以是自身细胞、异源细胞或异种细胞。作为选择，还可以使用无限增殖细胞。为了降低免疫应答的可能性，可以将这些细胞封装，以避免周围组织渗入。封装材料通常是半透性的生物相容性聚合物外壳或膜，这些材料允许蛋白产物释放，同时可避免患者的免疫系统或周围组织的有害因子破坏这些细胞。
如文中所述，理想的是用一种或多种IL-1ra-L多肽对分离的细胞群体(如干细胞、淋巴细胞、红细胞、软骨细胞、神经元等)进行处理。当使用的多肽可透过细胞膜时，则处理方法可以是直接将分离的细胞暴露于这种多肽。
本发明的其他实施方案涉及一些用于在体外产生治疗性多肽以及通过基因疗法或细胞疗法来产生和递送治疗性多肽的细胞和方法(如同源重组和/或其他重组产生方法)。可以用同源重组或其他重组方法对正常情况下含有不转录的或低表达的IL-1ra-L基因的细胞进行改造，从而获得可表达治疗有效剂量的IL-1ra-L多肽的细胞。
最初产生的同源重组技术可用于导向基因，从而在转录活性基因中诱导突变或纠正突变。Kucherlapati，1989，Prog.in Nucl.Acid Res.&Mol.Biol.36301。这种基本技术经过发展已成为一种在哺乳动物基因组的特定区域中引入特定突变的方法(Thomas et al.，1986，Cell 44419-28；Thomas and Capecchi，1987，Cell 51503-12；Doetschman et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.858583-87)或纠正缺陷基因中的特定突变的方法(Doetschman et al.，1987，Nature 330576-78)。在美国专利5,272,071；欧洲专利9193051和505500；PCT/US90/07642以及PCT专利WO91/09955中对典型的同源重组技术进行了描述。
把需要插入基因组中的DNA序列与导向DNA相连接，然后可利用同源重组技术将该序列导向目的基因的特定区域。导向DNA是一种与基因组DNA的某一区域互补(同源)的核苷酸序列。导向DNA中与基因组特定区域互补的小片段可以在DNA复制过程中与亲本链相接触。插入到细胞内的DNA一般都可以凭借共有同源区与内源DNA的其他片段杂交，并因此产生重组。如果该互补链与含有突变或含有不同序列或含有额外核苷酸的一种寡核苷酸相联接，则同样可通过重组作用而掺入到新合成的链中。由于存在校对功能，所以DNA的新序列有可能作为模板。这样就把转移的DNA插入到基因组中。
与导向DNA的这些片段相联接的是能够影响或调控IL-1ra-L多肽表达的DNA区域，如侧翼序列。例如，可以将启动子/增强子元件、抑制子或外源转录调控元件插入到预定宿主细胞的基因组中，其位置和方向要足以对所需IL-1ra-L多肽编码DNA的转录产生影响。该调控元件可调控宿主细胞基因组中的部分DNA。因此，可以不通过转染IL-1ra-L基因本身的编码DNA来实现所需IL-1ra-L多肽的表达，而可以使用与DNA调控区段相联接的导向DNA(含有与目的内源基因同源的区域)来实现其表达，该DNA调控区段应能够为该内源基因序列提供可识别的IL-1ra-L基因转录信号。
典型的方法是引入一种至少含有调控序列、外显子和剪接供体部位的DNA，并通过同源重组到细胞基因组的选定部位来改变细胞中所需靶基因(即细胞的所需内源基因)的表达。把这些组件引入染色体(基因组)DNA的方式应能够有效地产生一种新转录单位(其中，DNA构建体上的调控序列、外显子和剪接供体部位与内源基因有效连接)。在染色体DNA中引入这些组件的结果是改变了所需内源基因的表达。
基因表达的改变，如上文所述，包括所得细胞中正常情况下沉默(不表达)的基因被激活(或导致其表达)，还包括所得细胞中表达水平不具有生理意义的基因的表达被加强。其他实施方案还包括改变调控模式或诱导模式，使其不同于所得细胞中原有的调控模式或诱导模式，以及降低(包括去除)所得细胞中可表达基因的表达。
有一种方法可利用同源重组来提高或导致细胞内源IL-1ra-L基因表达IL-1ra-L多肽，该方法包括，先利用同源重组将位点特异性重组系统中的一种重组序列(如Cre/lox、PFLP/FRT)(Sauer，1994，Curr.Opin.Biotechnol.，5521-27；Sauer，1993，Methods Enzymol.，225890-900)插入到细胞基因组中内源IL-1ra-L多肽编码区的上游(即5’端)。然后将一种质粒与适当的重组酶一同引入到被改造的细胞系中，该质粒含有一种与直接处在基因组IL-1ra-L多肽编码区上游的位点同源的重组位点。该重组酶可借助于质粒的重组位点将该质粒整合到直接位于该细胞系的基因组IL-1ra-L多肽编码区上游的重组位点中(Baubonis and Sauer，1993，Nucleic Acids Res.212025-29；O’Gorman et al.，1991，Science 2511351-55)。只要在质粒中的位置适当，任何能提高转录的侧翼序列(如增强子/启动子、内含子、翻译增强子)都可以被整合，并且可创建一种新的或改变的转录单位，从而使细胞的内源IL-1ra-L基因重新产生IL-1ra-L多肽或使其产量提高。
在内源基因组IL-1ra-L多肽编码区上游插入了一种位点特异性重组序列的细胞系的另一种使用方法是，利用同源重组在该细胞系基因组的另一位置引入第二种重组位点。然后将适当的重组酶引入到这种双重组位点的细胞系中，从而导致重组(缺失、倒位和易位)(Sauer，1994，Curr.Opin.Biotechnol.，5521-27；Sauer，1993，Methods Enzymol.，225890-900)并创建一种新的或改变的转录单位，使该细胞的内源IL-1ra-L基因重新产生IL-1ra-L多肽或使其产量提高。
还有一种方法可提高或导致细胞内源IL-1ra-L基因表达IL-1ra-L多肽，该方法涉及提高或导致一种或多种基因(如转录因子)的表达，并且(或者)降低一种或多种基因(如转录阻遏物)的表达，从而使该细胞的内源IL-1ra-L基因重新产生IL-1ra-L多肽或使其产量提高。该方法包括在细胞中引入一种非天然存在的多肽(如含有位点特异性DNA结合区和转录因子区的一种融合多肽)，从而使该细胞的内源IL-1ra-L基因重新产生IL-1ra-L多肽或使其产量提高。
本发明还涉及能够在改变靶基因表达的方法中使用的DNA构建体。在某些实施方案中，典型的DNA构建体可含有(a)一种或多种导向序列、(b)一种调控序列、(c)一种外显子，和(d)一种未配对的剪接供体位点。该DNA构建体中的导向序列可以使(a)-(d)元件整合到细胞的靶基因中，从而使(b)-(d)元件与内源靶基因的序列有效连接。在另一项实施方案中，这些DNA构建体可含有(a)一种或多种导向序列、(b)一种调控序列、(c)一种外显子、(d)一种剪接供体位点、(e)一种内含子，和(f)一种剪接受体位点，其中的导向序列可以使(a)-(f)元件整合，从而使(b)-(f)元件与内源基因有效连接。这种导向序列与细胞染色体DNA中的预定位点同源，从而可与其发生同源重组。在该构建体中，外显子一般位于调控序列的3’端，而剪接供体位点位于该外显子的3’端。
如果已知一种特定基因的序列，如本文提供的IL-1ra-L多肽的核酸序列，则可以合成一段与该基因的选定区域互补的DNA，或利用其他方法获得这种DNA，例如在目的区域内的特定识别位点对天然DNA进行适当的限制性酶切。该片段被插入细胞之后即可作为导向序列，并能够与基因组内的同源区域杂交。如果这种杂交是在DNA复制的过程中出现，则该DNA片段，及其连接的任何额外序列，可作为冈崎片段而被引入到新合成的DNA子链中。因此，本发明还包括可作为导向序列使用的IL-1ra-L多肽编码核苷酸。
还可以考虑IL-1ra-L多肽细胞疗法，例如植入可产生IL-1ra-L多肽的细胞。该实施方案涉及植入那些能够合成和分泌生物活性IL-1ra-L多肽的细胞。这些产IL-1ra-L多肽细胞可以是天然产IL-1ra-L多肽细胞，也可以是被所需IL-1ra-L多肽的编码基因或能够提高IL-1ra-L多肽表达的基因转化从而使IL-1ra-L多肽产生的能力加强的重组细胞。可利用适于递送基因并能促进其表达和分泌的载体来实现这种改造。利用异种多肽进行给药可导致免疫反应，为了使IL-1ra-L多肽给药的患者体内产生免疫反应的可能性减至最小，优选的是采用来源于人类并产生人类IL-1ra-L多肽的天然产IL-1ra-L多肽细胞。同样优选的是由包含人类IL-1ra-L多肽编码基因的表达载体转化的重组产IL-1ra-L多肽细胞。
可以将植入的细胞封装，以避免周围组织渗入。可以将人类细胞或非人类动物细胞置于半透性的生物相容性聚合物外壳或膜内再植入患者体内，这些材料允许IL-1ra-L多肽释放，同时可避免患者的免疫系统或周围组织的有害因子破坏这些细胞。作为选择，还可以对患者自身的细胞进行先体外后体内转化，使其产生IL-1ra-L多肽，然后在不封装的情况下直接将这些细胞植入该患者体内。
活细胞封装技术已为该领域所了解，可以用常规方法来制备封装细胞并将其植入患者体内。例如，Baetge et al.(PCT专利WO95/05452和PCT/US94/09299)描述了一些含有基因工程细胞的膜囊，可用于有效地递送生物活性分子。这些膜囊具有生物相容性，并且易于回收。这些膜囊封装有被重组DNA分子转染的细胞，这些DNA分子含有与启动子有效连接的生物活性分子编码DNA序列，植入哺乳动物宿主后，连接的启动子不会受体内减量调节作用的影响。这些装置可用于将活细胞产生的分子递送到受者体内的特定部位。此外，可参考美国专利4,892,538；5,011,472和5,106,627。PCT专利WO91/10425(Aebischer et al.)描述了一种用于封装活细胞的系统。还可参考PCT专利WO91/10470(Aebischeret al.)；Winn et al.，1991，Exper.Neurol.113322-29；Aebischer et al.，1991，Exper.Neurol.111269-75和Tresco et al.，1992，ASAIO 3817-23。
还可以考虑通过体内和体外基因治疗来递送IL-1ra-L多肽的方法。基因治疗技术的实例是利用一种可编码IL-1ra-L多肽的IL-1ra-L基因(基因组DNA、cDNA和/或合成的DNA)形成一种“基因治疗DNA构建体”，这种IL-1ra-L基因可以与一种组成型或诱导型启动子有效连接。该启动子可以与内源IL-1ra-L基因同源或异源，条件是该启动子在需要掺入构建体的细胞或组织内具有活性。这种基因治疗DNA构建体的其他组件可以选择性地包括，用于位点特异性整合的DNA分子(如用于同源重组的内源序列)、组织特异性启动子、增强子或沉默子、可提供高于亲代细胞的选择优势的DNA分子、可作为标记用于鉴定转化细胞的DNA分子、负选择系统、细胞特异性结合剂(用于，例如，细胞定向)、细胞特异性内化因子、可促进载体表达的转录因子，以及允许载体产生的因子。
然后可利用病毒载体或非病毒载体将基因治疗DNA构建体引入细胞(先体外后体内或体内方式)。引入基因治疗DNA构建体的一种方法是采用上述病毒载体。一些载体，如逆转录病毒载体，可将这种DNA构建体递送到细胞的染色体DNA，并且使该基因整合到染色体DNA中。其他载体则可具有附加体的作用，从而使基因治疗DNA构建体保留在细胞质中。
在其他实施方案中，还可以添加调控元件以调节靶细胞内的IL-1ra-L基因表达。这些元件可以随适当的效应剂而启动。这样就可以在需要的时候表达治疗性多肽。一种传统的调控方法涉及使用二聚体化小分子或rapalogs，以使含有的小分子结合区和生物过程启动区的嵌合蛋白形成二聚体，如DNA结合蛋白或转录激活蛋白(参考PCT专利WO96/41865、WO97/31898和WO97/31899)。可以利用这些蛋白的二聚体化来启动转基因的转录。
还有一种可选的调控技术，其方法是将目的基因表达的蛋白以聚合体或聚集簇的形式储存在细胞内。可以将目的基因作为含有一种条件性聚合区的融合蛋白来加以表达，这样可以使聚合的蛋白停留在内质网中。储存的蛋白能够在细胞内保持稳定和非活化状态。用一种能够去除条件性聚合区荠特异性地分裂聚合体或聚集簇的药物(如小分子配体)进行给药即可以使蛋白释放，从而使蛋白能够分泌到细胞外。可参考Aridor et al.，2000，Science 287816-17和Rivera et al.，2000，Science287826-30。
其他适当的调控方法或基因开关还包括，但不局限于，本文描述的系统。米非司酮可作为黄体酮的拮抗剂使用。改进型黄体酮受体的配体结合区与黄体酮拮抗剂结合可以使两种转录因子形成二聚体，这种二聚体可进入细胞核，并能够与DNA结合并激活转录。这种配体结合区经过改造使得该受体丧失了与天然配体结合的能力。有关这种改进型类固醇激素受体系统的进一步描述，可参考美国专利5,364,791以及PCT专利WO96/40911和WO97/10337。
还有一种调控系统采用的是蜕皮素(一种果蝇类固醇激素)，它能够结合并激活蜕皮素受体(胞质受体)。这种受体移至核内并与特定的DNA效应元件(蜕皮素反应性基因的启动子)相结合。蜕皮素受体含有反式激活区、DNA结合区，以及启动转录的配体结合区。有关这种蜕皮素系统的进一步描述，可参考美国专利5,514,578以及PCT专利WO97/38117、WO96/37609和WO93/03162。
另一种调控方法是采用一种可被四环素正调控的反式激活蛋白。该系统涉及一种与能够激活转录的多肽相连接的突变型tet阻遏蛋白DNA结合区(将tet R-4氨基酸突变后产生一种可被四环素反向调控的反式激活蛋白，即该蛋白在四环素存在的情况下与tet操纵子结合)。有关这些系统的描述，可参考美国专利5,464,758、5,650,298和5,654,168。
有关其他表达调控系统以及核酸构建体的描述，可参考InnovirLaboratories Inc.的美国专利5,741,679和5,834,186。
实现体内基因治疗的方法可以是，通过IL-1ra-L核酸分子的局部注射或其他适当的病毒或非病毒递送载体将IL-1ra-L多肽编码基因引入到细胞内。Hefti，1994，Neurobiology 251418-35。例如，可以用腺相关病毒(AAV)载体把包含的IL-1ra-L多肽编码核酸分子递送到靶细胞(可参考，例如，Johnson，PCT专利WO95/34670；PCT申请PCT/US95/07178)。在重组AAV的基因组中，与功能性启动子和多腺苷酸化序列有效连接的IL-1ra-L多肽编码DNA序列两侧通常含有AAV的反向末端重复。
可以选择的适当病毒载体包括，但不局限于，逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、肝炎病毒、细小病毒、乳多空病毒、痘病毒、α病毒、冠状病毒、弹状病毒、副粘病毒和乳头状瘤病毒的载体。美国专利5,672,344描述了一种病毒介导的体内基因转移系统，该系统涉及一种神经营养性HSV-1重组载体。美国专利5,399,346提供了一种方法，用于通过递送人类细胞来为患者提供治疗性蛋白，这些人类细胞已经过体外处理而被插入了一种治疗性蛋白的编码DNA片段。有关实现基因治疗的其他方法和材料的描述，可参考美国专利5,631,236(涉及腺病毒载体)、5,672,510(涉及逆转录病毒载体)、5,635,399(涉及可表达细胞因子的逆转录病毒载体)。
非病毒递送方法包括，但不局限于，脂质体介导的转移、裸DNA递送(直接注射)、受体介导的转移(配体-DNA复合物)、电穿孔、磷酸钙沉淀和微粒轰击(如基因枪)。基因治疗的材料和方法还可以包括诱导型启动子、组织特异性增强子-启动子、用于位点特异性整合的DNA序列、可提供高于亲代细胞的选择优势的DNA序列、用于鉴定转化细胞的标记、负选择系统和表达调控系统(安全措施)、细胞特异性结合剂(用于细胞定向)、细胞特异性内化因子，以及可促进载体表达的转录因子，此外还包括载体厂商提供的方法。有关实现基因治疗的这些附加方法和材料的描述，可参考美国专利4,970,154(涉及电穿孔技术)、5,679,559(描述了一种用于递送基因的含有脂蛋白的系统)、5,676,954(涉及脂质体载剂)、5,593,875(描述磷酸钙转染方法)和4,945,050(描述了一种在能够使生物活性颗粒穿透细胞表面的速度下将该颗粒推进细胞从而掺入细胞内部的方法)，以及PCT专利WO96/40958(涉及核配体)。
IL-1ra-L基因治疗或细胞治疗还可以包括同时递送一种或多种附加多肽或一种不同的细胞。可以将这些细胞分别引入患者，也可以将这些细胞装在一种可植入装置中，如上文描述的封装膜，还可以用病毒载体分别对这些细胞进行改造。
通过基因治疗来提高细胞内源IL-1ra-L多肽表达的一种方法是，在IL-1ra-L多肽的启动子中插入一种或多种增强子元件，从而用这些增强子元件来提高IL-1ra-L基因的转录活性。所用增强子元件的选择根据含有待激活基因的组织来进行——选择的增强子元件要能激活该组织中的启动子。举例来说，如果想“启动”T细胞中的IL-1ra-L多肽编码基因，则可使用lck启动子增强子元件。此时，可利用标准的克隆技术将待添加的转录元件的功能性部分插入到含有IL-1ra-L多肽启动子的DNA片段中(也可选择插入到载体和/或5’侧翼序列和/或3’侧翼序列中)。然后可通过先体外后体内或体内方式将这种被称为“同源重组构建体”的构建体引入所需细胞。
还可通过基因治疗来降低IL-1ra-L多肽的表达，方法是改造内源启动子的核苷酸序列。这种改造一般可借助同源重组方法来实现。举例来说，可以对含有全部或部分IL-1ra-L基因启动子的需要灭活的选定DNA分子进行改造，以去除和/或替换其转录调控启动子片段。例如，可以用标准的分子生物学技术去除该启动子的TATA盒和/或转录激活物结合位点；这样可抑制启动子的活性，从而抑制相应的IL-1ra-L基因的转录。去除启动子中的TATA盒或转录激活物结合位点的方法可以是，产生一种DNA构建体，其中含有整个IL-1ra-L多肽启动子(来自与待调控IL-1ra-L基因相同或相关的物种)或其相关部分，并且已通过一种或多种核苷酸的取代、缺失和/或插入方法将其中的一种或多种TATA盒和/或转录激活物结合位点核苷酸突变。从而使TATA盒和/或激活物结合位点的活性降低或完全失活。这种构建体通常还含有与被改造的启动子片段相邻的至少约500个碱基的DNA，该DNA相当于天然(内源)的5’和3’DNA序列，利用本文描述的载体或直接将这种构建体引入适当的细胞(采用先体外后体内方式或体内方式)。一般可利用同源重组将这种构建体整合到细胞的基因组DNA中，该构建体中的5’和3’DNA序列可以与内源染色体DNA杂交，从而有助于被改造的启动子区域的整合。
治疗性应用IL-1ra-L核酸分子、多肽及其显效剂和拮抗剂可用于多种疾病、病症和病情的治疗、诊断、改善或预防，其中包括文中列举的疾病、病症和病情。
IL-1ra-L多肽的显效剂和拮抗剂包括那些可调节IL-1ra-L多肽活性并能够提高或降低成熟IL-1ra-L多肽的至少一种活性的分子。显效剂或拮抗剂可以是辅因子，如能够与IL-1ra-L多肽相互作用并调节其活性的蛋白、肽、糖类、脂类或小分子量分子。潜在的多肽显效剂或拮抗剂包括，能够与含有部分或所有细胞外区域的可溶性或膜结合形式的IL-1ra-L多肽反应的抗体。可调节IL-1ra-L多肽表达的分子一般包括IL-1ra-L多肽的编码核酸，这些核酸可作为表达的反义调节剂。
举例来说，本发明的IL-1ra-L核酸分子、多肽及其显效剂和拮抗剂可用于治疗、诊断、改善或预防与免疫系统功能障碍有关的疾病、病症或病情。这些疾病的实例包括，但不局限于，类风湿性关节炎、银屑病关节炎、炎症性关节炎、骨关节炎、炎症性关节病、自身免疫性疾病(包括自身免疫性血管炎)、多发性硬化症、狼疮、糖尿病(如胰岛素糖尿病)、炎症性肠疾病、移植排异、移植物抗宿主疾病，以及由劳损、扭伤、软骨损伤、外伤、矫形手术、感染或其他疾病过程导致的炎性病症。本发明还包括由免疫系统功能障碍导致的其他疾病。
本发明的IL-1ra-L核酸分子、多肽及其显效剂和拮抗剂还可用于治疗、诊断、改善或预防与感染有关的疾病、病症或病情。这些疾病的实例包括，但不局限于，麻风病、病毒性感染(如甲肝或HIV)、细菌性感染(如梭菌相关性疾病，其中包括梭菌相关性腹泻)、肺结核、急性热性疾病、发热、肝脏的急性期反应、败血症，或脓毒性休克。本发明还包括与感染有关的其他疾病。
本发明的IL-1ra-L核酸分子、多肽及其显效剂和拮抗剂还可用于治疗、诊断、改善或预防与体重失调有关的疾病、病症或病情。这些疾病的实例包括，但不局限于，肥胖症、厌食症、恶病质(包括AIDS诱导的恶病质)、肌病(如脓毒症中的肌肉蛋白代谢)和低血糖症。本发明还包括与体重失调有关的其他疾病。
本发明的IL-1ra-L核酸分子、多肽及其显效剂和拮抗剂还可用于治疗、诊断、改善或预防与神经功能障碍有关的疾病、病症或病情。这些疾病的实例包括，但不局限于，阿耳茨海默氏病、帕金森病、神经毒性(如HIV诱导的神经毒性)、ALS、脑损伤、紧张、忧郁症、伤害感受和其他疼痛(包括与癌症有关的疼痛)、痛觉过敏、癫痫、学习功能缺损和记忆障碍、睡眠障碍，以及周围神经病和中枢神经病。本发明还包括与神经功能障碍有关的其他疾病。
本发明的IL-1ra-L核酸分子、多肽及其显效剂和拮抗剂还可用于治疗、诊断、改善或预防与肺部有关的疾病、病症或病情。这些疾病的实例包括，但不局限于，急性或慢性肺损伤(包括间质性肺疾病)、急性呼吸系统疾病综合症、肺性高血压、肺气肿、囊性纤维化、肺纤维症和哮喘。本发明还包括与肺部有关的其他疾病。
本发明的IL-1ra-L核酸分子、多肽及其显效剂和拮抗剂还可用于治疗、诊断、改善或预防与皮肤有关的疾病、病症或病情。这些疾病的实例包括，但不局限于，银屑病、湿疹和创伤愈合。本发明还包括与皮肤有关的其他疾病。
本发明的IL-1ra-L核酸分子、多肽及其显效剂和拮抗剂还可用于治疗、诊断、改善或预防与肾脏有关的疾病、病症或病情。这些疾病的实例包括，但不局限于，急性和慢性肾小球肾炎。本发明还包括与肾脏有关的其他疾病。
本发明的IL-1ra-L核酸分子、多肽及其显效剂和拮抗剂还可用于治疗、诊断、改善或预防骨性疾病、病症或病情。这些疾病的实例包括，但不局限于，骨质疏松症、骨硬化症、成骨不全、佩吉特病、牙周疾病、颞下颌关节疾病和高钙血症。本发明还包括其他骨疾病。
本发明的IL-1ra-L核酸分子、多肽及其显效剂和拮抗剂还可用于治疗、诊断、改善或预防与血管系统有关的疾病、病症或病情。这些疾病的实例包括，但不局限于，出血或中风、出血性休克、缺血(包括心脏缺血和脑缺血，例如，由创伤、癫痫、出血或中风导致的脑损伤，均可导致神经变性)、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、再狭窄、再灌注损伤，以及血管发生。本发明还包括与血管系统有关的其他疾病。
本发明的IL-1ra-L核酸分子、多肽及其显效剂和拮抗剂还可用于治疗、诊断、改善或预防与肿瘤细胞有关的疾病、病症或病情。这些疾病的实例包括，但不局限于，淋巴瘤、骨性肉瘤、慢性和急性骨髓性白血病(CML和AML)以及其他白血病、多发性骨髓瘤、肺癌、乳腺癌、肿瘤转移，以及放射治疗的副作用。本发明还包括与肿瘤细胞有关的其他疾病。
本发明的IL-1ra-L核酸分子、多肽及其显效剂和拮抗剂还可用于治疗、诊断、改善或预防与生殖系统有关的疾病、病症或病情。这些疾病的实例包括，但不局限于，不育症、流产、早产分娩和子宫内膜异位。本发明还包括与生殖系统有关的其他疾病。
本发明的IL-1ra-L核酸分子、多肽及其显效剂和拮抗剂还可用于治疗、诊断、改善或预防与眼部有关的疾病、病症或病情。这些疾病的实例包括，但不局限于，炎症性眼病(可以是与，例如，角膜移植有关的)、视网膜变性、失明、黄斑变性、青光眼、葡萄膜炎、视网膜神经病。本发明还包括与眼部有关的其他疾病。
本发明的IL-1ra-L核酸分子、多肽及其显效剂和拮抗剂还可用于治疗急性胰腺炎、慢性疲劳综合症、纤维肌痛和川崎病(MLNS)等疾病。
IL-1抑制剂包括可特异性阻碍IL-1细胞受体活化的任何蛋白，这种阻碍作用可以由多种机制造成。这些机制包括，对IL-1的产生进行减量调节、与游离IL-1结合、干扰IL-1与其受体的结合、干扰IL-1受体复合物的形成(即IL-1受体与IL-1受体附属蛋白的结合)，以及干扰IL-1与其受体结合后的信号调制。这些白介素-1抑制剂包括白介素-1受体拮抗剂，如本文描述的IL-1ra-L，抗-IL-1受体单克隆抗体(如欧洲专利623674)、IL-1结合蛋白，如可溶性IL-1受体(如美国专利5,492,888、5,488,032、5,464,937、5,319,071和5,180,812)，抗IL-1单克隆抗体(如PCT专利WO95/01997、WO94/02627、WO90/06371；美国专利4,935,343；以及欧洲专利364778、267611和220063)、IL-1受体附属蛋白及其抗体(如PCT专利WO96/23067)；能够抑制白介素-1β产生和分泌的白介素-1β转化酶(ICE)抑制剂或caspase I抑制剂，白介素-1β蛋白酶抑制剂，以及可阻断IL-1体内合成或细胞外释放的其他化合物和蛋白。
典型的IL-1抑制剂公开于美国专利5,747,444、5,359,032、5,608,035、5,843,905、5,359,032、5,866,476、5,869,660、5,869,315、5,872,095、5,955,480；PCT专利WO98/21957、WO96/09323、WO91/17184、WO96/40907、WO98/32733、WO98/42325、WO98/44940、WO98/47892、WO98/56377、WO99/03837、WO99/06426、WO99/06042、WO91/17249、WO98/32733、WO98/17661、WO97/08174、WO95/34326、WO99/36426和WO99/36415；欧洲专利534978和894795；以及法国专利申请FR2762514。
白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)是一种可作为白介素-1天然抑制剂的人类蛋白。优选的受体拮抗剂(包括IL-1ra及其变异体和衍生物)及其制备方法和使用方法在美国专利5,075,222；PCT专利WO91/08285、WO91/17184、WO92/16221、WO93/21946、WO94/06457、WO94/21275、WO94/21235、WO94/20517、WO96/22793、WO97/28828和WO99/36541；奥地利专利AU9173636；法国专利FR2706772；以及德国专利DE4219626中均有所描述。这些蛋白包括糖基化的和非糖基化的IL-1受体拮抗剂。
详细地说，在5,075,222专利中公开并描述了三种典型的IL-1ra及其变异体。第一种被称为“IL-1i”，其特征包括，在SDS-PAGE上表现为22-23kD的分子，等电点约为4.8，可以被含有约52mM NaCl的Tris缓冲液，pH7.6从MonoQ FPLC柱上洗脱。第二种被称为IL-1raβ，其特征包括，是一种22-23kD的蛋白，可以被48mM的NaCl从MonoQ柱上洗脱。IL-1raα和IL-1raβ均被糖基化。第三种是IL-1raχ，其特征包括，是一种20kD的蛋白，可以被48mM NaCl从MonoQ柱上洗脱，未被糖基化。美国专利5,075,222还公开了一些方法，用于分离这些抑制剂的编码基因、将基因克隆到适当的载体和细胞中，以及通过基因的表达产生这些抑制剂。
该领域的技术人员都了解，在所得分子具有生物活性(如能够影响一种或多种疾病和病症，如本文列举的疾病和病症)的条件下，可以在IL-1ra-L的氨基酸序列中进行多种组合形式的缺失、插入和取代(单独或集合“变异体”)。
本发明还考虑将IL-1ra-L多肽作为其他疗法的辅助手段进行给药，还可作为适用于所治适应症的其他药用组合物的辅助物进行给药。可以将IL-1ra-L多肽和任一种或多种其他疗法或药用组合物单独、依次或同时给药。
在一项特别实施方案中，本发明涉及将IL-1ra-L多肽与能够治疗或预防本文列举的疾病和病症的任一种或多种TNF抑制剂组合(治疗前、治疗后或同时治疗)使用。
这些TNF抑制剂包括可阻断TNF体内合成或细胞外释放的化合物和蛋白。在一项特别实施方案中，本发明涉及将IL-1ra-L多肽与任一种或多种下述TNF抑制剂组合(治疗前、治疗后或同时治疗)使用TNF结合蛋白(本文定义的I型可溶性TNF受体和II型可溶性TNF受体(“sTNFRs”))、抗TNF抗体、粒细胞集落刺激因子、酞胺哌啶酮、BN 50730、替尼达帕、E 5531、tiapafant PCA 4248、尼美舒利、panavir、咯利普兰、RP 73401、T肽、MDL 201、449A、(1R，3S)-顺-1-[9-(2，6-二氨基嘌呤)]-3-羟基-4-环戊烯盐酸盐、(1R，3R)-反-1-[9-(2，6-二氨基)嘌呤]-3-乙酰氧基环戊烯、(1R，3R)-反-1-(9-腺嘌呤)-3-叠氮环戊烯盐酸盐和(1R，3R)-反-1-(6-羟基嘌呤-9-基)-3-叠氮环戊烯。TNF结合蛋白已在该领域公开(美国专利5,136,021；欧洲专利308378、422339、393438、398327、412486、418014、433900、464533、512528、526905、568928、417563；PCT专利WO90/13575、WO91/03553、WO92/01002、WO92/13095、WO92/16221、WO93/07863、WO93/21946、WO93/19777、WO94/06476、PCT申请PCT/US97/12244；英国专利GB2218101和2246569；以及日本专利申请JP127,800/1991)。
举例来说，欧洲专利393438和422339讲述了被统称为“sTNFRs”的I型可溶性TNF受体(也被称为“sTNFR-I”或“30 kDa TNF抑制剂”)和II型可溶性TNF受体(也被称为“sTNFR-II”或“40 kDa TNF抑制剂”)及其改造形式(如片段、功能衍生物和变异体)的氨基酸及核酸序列。欧洲专利393438和422339还公开了一些方法，用于分离这些抑制剂的编码基因、将基因克隆到适当的载体和细胞中，以及通过基因的表达产生这些抑制剂。此外还公开了sTNFR-I和sTNFR-II的多价体(即含有一种以上活性部分的分子)。在一项实施方案中，这种多价体的构建方法可以是，利用临床容许的任何一种接头，如聚乙二醇，将至少一种TNF抑制剂与另一部分进行化学联接(PCT专利WO92/16221和WO95/34326)，也可利用肽接头来构建(Neve et al.，1996，Cytokine，8365-70)，也可通过与生物素化学联接然后与亲和素结合的方法来构建(PCT专利WO91/03553)，还可通过嵌合抗体分子的结合来构建(美国专利5,116,964；PCT专利WO89/09622和WO91/16437；以及欧洲专利315062)。
抗TNF抗体包括MAK 195F Fab(Holler et al.，1993，1st InternationalSymposium on Cytokines in Bone Marrow Transplantation 147)、CDP 571抗TNF单克隆抗体(Rankin et al.，1995，Br.J.Rheumatol.，34334-42)、BAY X 1351鼠抗肿瘤坏死因子单克隆抗体(Kieft et al.，1995，7thEuropean Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 9)；CenTNF cA2抗TNF单克隆抗体(Elliott et al.，1994，Lancet，3441125-27；Elliott et al.，1994，Lancet，3441105-10)。
在一项特别实施方案中，本发明涉及将IL-1ra-L多肽与分泌的或可溶的人fas抗原或其重组形式组合(治疗前、治疗后或同时治疗)使用(PCT专利WO96/20206；Mountz et al.，1995，J.Immunol.，1554829-37；和欧洲专利510691)。PCT专利WO96/20206公开了分泌的人fas抗原(天然的和重组的，其中包括一种Ig融合蛋白)、用于分离这种可溶性人重组fas抗原编码基因的方法、用于将该基因克隆到适当载体和细胞中的方法，以及用于通过该基因的表达产生这些抑制剂的方法。欧洲专利510691讲述了人fas抗原的编码核酸，其中包括可溶性fas抗原的编码核酸，用于表达该核酸的载体，以及被该载体转染的转化体。当用于胃肠外给药时，每种分泌的或可溶的fas抗原融合蛋白的剂量一般约为1μg/kg-100μg/kg。
目前对本文列举的疾病和病症的治疗方法，其中包括对风湿性疾病的治疗方法，通常包括用最好的药物来控制疼痛和炎症；这些药物属于非甾体抗炎药(NSAIDs)。辅助治疗包括使用皮质类固醇、慢作用的抗风湿性药物(SAARDs)或缓解疾病的(DM)药物。有关下述化合物的资料，可参考The Merck Manual of Diagnosis and Therapy(16th ed.1992)和Pharmaprojects(PJB Publications Ltd)。
在一项特别实施方案中，本发明涉及使用IL-1ra-L多肽和任一种或多种NSAIDs来治疗本文列举的疾病和病症，其中包括风湿性疾病等急性和慢性炎症，以及移植物抗宿主疾病。NSAIDs的抗炎症作用至少在某种程度上是因为能抑制前列腺素的合成(Goodman and Gilman，ThePharmacological Basis of Therapeutics(7th ed.1985))。至少可以将NSAIDs分为9组(1)水杨酸衍生物、(2)丙酸衍生物、(3)醋酸衍生物、(4)灭酸衍生物、(5)羧酸衍生物、(6)丁酸衍生物、(7)昔康类、(8)吡唑类，和(9)吡唑酮类。
在另一项特别实施方案中，本发明涉及将IL-1ra-L多肽与任一种或多种水杨酸衍生物或其酯类药物前体或药学容许的盐类组合(治疗前、治疗后或同时治疗)使用。这些水杨酸衍生物或其酯类药物前体或药学容许的盐类包括水杨酸对乙酰氨苯酯、氧化铝缩阿司匹林、阿司匹林、扑炎痛、溴水杨醇、乙酰水杨酸钙、三水杨酸胆碱镁、水杨酸镁、水杨酸胆碱、二氟苯水杨酸、依特柳酯、芬度柳、龙胆酸、水杨酸羟乙酯、水杨酸咪唑、赖氨酸乙酰水杨酸酯、氨基水杨酸、水杨酸吗啉、1-萘水杨酸酯、奥沙拉秦、帕沙米特、乙酰水杨酸苯酯、水杨酸苯酯、水杨乙酰胺、水杨酰胺O-醋酸、双水杨酯、水杨酸钠，和柳氮磺胺吡啶。该组还包括结构上相关并具有类似止痛消炎性质的水杨酸衍生物。
在另一项特别实施方案中，本发明涉及将IL-1ra-L多肽与任一种或多种丙酸衍生物或其酯类药物前体或药学容许的盐类组合(治疗前、治疗后或同时治疗)使用。这些丙酸衍生物或其酯类药物前体或药学容许的盐类包括阿明洛芬、苯恶洛芬、布氯酸、卡洛芬、右吲哚洛芬、非诺洛芬、氟诺洛芬、氟洛芬、氟联苯丙酸、呋洛芬、异丁苯丙酸、异丁苯丙酸铝、异丁普生、吲哚洛芬、异洛芬、酮洛芬、氯索洛芬、咪洛芬、萘普生、萘普生钠、奥普嗪、吡酮洛芬、匹美洛芬、吡洛芬、丙替嗪酸、吡哆洛芬、舒洛芬、噻洛芬酸，和噻克洛芬。该组还包括结构上相关并具有类似止痛消炎性质的丙酸衍生物。
在另一项特别实施方案中，本发明涉及将IL-1ra-L多肽与任一种或多种醋酸衍生物或其酯类药物前体或药学容许的盐类组合(治疗前、治疗后或同时治疗)使用。这些醋酸衍生物或其酯类药物前体或药学容许的盐类包括醋炎痛、烯氯苯乙酸、氨芬酸、丁苯羟酸、桂美辛、氯吡酸、地美辛、双氯芬酸钾、双氯芬酸钠、依托度酸、联苯乙酸、芬氯酸、苯克洛酸、芬克洛酸、芬替酸、呋罗芬酸、葡美辛、对异丁苯乙酸、吲哚美辛、三苯唑酸、伊索克酸、氯那唑酸、甲嗪酸、奥沙美辛、奥昔平酸、吡美辛、丙谷美辛、舒林酸、他美辛、噻拉米特、硫平酸、甲苯酰吡咯乙酸、甲苯酰吡咯乙酸钠、齐多美辛，和佐美酸。该组还包括结构上相关并具有类似止痛消炎性质的醋酸衍生物。
在另一项特别实施方案中，本发明涉及将IL-1ra-L多肽与任一种或多种灭酸衍生物或其酯类药物前体或药学容许的盐类组合(治疗前、治疗后或同时治疗)使用。这些灭酸衍生物或其酯类药物前体或药学容许的盐类包括苯乙氨茴酸、依托芬那酯、氯灭酸、异丙肾上腺素、甲氯灭酸、甲氯灭酸钠、美多灭酸、甲灭酸、尼氟灭酸、他尼氟酯、特罗芬那酯、托灭酸，和乌芬那酯。该组还包括结构上相关并具有类似止痛消炎性质的灭酸衍生物。
在另一项特别实施方案中，本发明涉及将IL-1ra-L多肽与任一种或多种羧酸衍生物或其酯类药物前体或药学容许的盐类组合(治疗前、治疗后或同时治疗)使用。这些羧酸衍生物或其能够使用的酯类药物前体或药学容许的盐类包括环氯茚酸、二氟苯水杨酸、氟苯柳、伊诺立定、酮咯酸，和氨苄噻吡酯。该组还包括结构上相关并具有类似止痛消炎性质的羧酸衍生物。
在另一项特别实施方案中，本发明涉及将IL-1ra-L多肽与任一种或多种丁酸衍生物或其酯类药物前体或药学容许的盐类组合(治疗前、治疗后或同时治疗)使用。这些丁酸衍生物或其酯类药物前体或药学容许的盐类包括丁丙二苯肼、布替巴芬、芬布芬，和联苯丁酸。该组还包括结构上相关并具有类似止痛消炎性质的丁酸衍生物。
在另一项特别实施方案中，本发明涉及将IL-1ra-L多肽与任一种或多种昔康类衍生物或其酯类药物前体或药学容许的盐类组合(治疗前、治疗后或同时治疗)使用。这些昔康类衍生物或其酯类药物前体或药学容许的盐类包括屈昔康、依诺利康、伊索昔康、吡罗昔康、舒多昔康、替诺昔康，和4-羟基-1，2-苯并噻嗪-1，1-二氧-4-(N-苯基)-羧酰胺。该组还包括结构上相关并具有类似止痛消炎性质的昔康类衍生物。
在另一项特别实施方案中，本发明涉及将IL-1ra-L多肽与任一种或多种吡唑类衍生物或其酯类药物前体或药学容许的盐类组合(治疗前、治疗后或同时治疗)使用。这些吡唑类衍生物或其能够使用的酯类药物前体或药学容许的盐类包括二苯咪唑和甲嘧啶唑。该组还包括结构上相关并具有类似止痛消炎性质的吡唑类衍生物。
在另一项特别实施方案中，本发明涉及将IL-1ra-L多肽与任一种或多种吡唑酮类衍生物或其酯类药物前体或药学容许的盐类组合(治疗前、治疗后或同时治疗)使用。这些吡唑酮类衍生物或其能够使用的酯类药物前体或药学容许的盐类包括阿扎丙宗、炎爽痛、苄哌立隆、非普拉宗、单苯保泰松、吗拉宗、羟基保泰松、布他酮、哌布宗、非那宗丙酯、雷米那酮、琥布宗，和噻唑啉保泰松。该组还包括结构上相关并具有类似止痛消炎性质的吡唑酮类衍生物。
在另一项特别实施方案中，本发明涉及将IL-1ra-L多肽与任一种或多种下述NSAIDs组合(治疗前、治疗后或同时治疗)使用ε-乙醚氨基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羟基丁酸、阿米西群、阿尼扎芬、安曲非宁、苄达酸、苄达酸赖氨酸酯、苄达明、苄普辛、溴哌莫、布可隆、丁苯唑酸、环丙喹宗、氯苄叉氨酯、达齐胺、地波沙美、地托咪定、联苯吡胺、联苯吡嗪酰胺、二氟水杨酸、地他唑、依莫法宗、法奈替唑甲磺酸盐、芬氟咪唑、氟喹氨苯酯、氟咪唑、氟尼辛、氟丙喹宗、福吡托林、磷柳酸、胍美柳、愈创蓝油烃、异丙肾上腺素、lefetamine HCl、来氟米特、洛非咪唑、氯替法唑、溶素氯胺烟酸盐、美西拉宗、萘丁美酮、尼克吲哚、尼美舒利、奥古蛋白、奥帕诺辛、奥沙西罗、奥沙帕朵、瑞尼托林、柠檬酸哌立索唑、哌福肟、哌甲氧萘丙酸、吡拉唑酸、吡非尼酮、普罗喹宗、普罗沙唑、thielavin B、替氟咪唑、替美加定、甲苯酰吡酸、托帕朵、磺胺色胺，以及公司指定的代码，如480156S、AA861、AD1590、AFP802、AFP860、AI77B、AP504、AU8001、BPPC、BW540C、CHINOIN127、CN100、EB382、EL508、F1044、FK-506、GV3658、ITF182、KCNTEI6090、KME4、LA2851、MR714、MR897、MY309、ONO3144、PR823、PV102、PV108、R830、RS2131、SCR152、SH440、SIR133、SPAS510、SQ27239、ST281、SY6001、TA60、TAI-901(4-苯甲酰-1-茚满羧酸)、TVX2706、U60257、UR2301和WY41770。该组还包括结构上相关并具有与NSAIDs类似的止痛消炎性质的NSAIDs。
在另一项特别实施方案中，本发明涉及将IL-1ra-L多肽与任一种或多种皮质类固醇或其酯类药物前体或药学容许的盐类组合(治疗前、治疗后或同时治疗)使用，以治疗本文列举的疾病和病症，其中包括急性和慢性炎症，如风湿性疾病、移植物抗宿主疾病和多发性硬化症。皮质类固醇及其酯类药物前体和药学容许的盐类包括皮质醇和皮质醇衍生物，如21-乙酰氧基孕烯醇酮、阿氯米松、阿尔孕酮、安西缩松、氯地米松、倍他米松、戊酸倍他米松、布地奈德、氯泼尼松、氯倍他索、丙酸氯倍他索、氯倍他松、丁酸氯倍他松、氯可托龙、氯泼尼醇、皮质酮、可的松、可的伐唑、deflazacon、丙缩羟强龙、脱氧米松、地塞米松、二氟拉松、二氟可龙、二氟泼尼酯、甘草次酸、氟扎可特、氟氯奈德、二氟美松、特戊酸二氟美松、氟轻松、氟尼缩松、氟轻松醋酸酯、丙缩氟西龙、氟考丁酯、氟可龙、氟可龙己酸酯、戊酸二氟米松、氟米龙、醋酸甲氟龙、醋酸氟甲叉龙、氟泼尼龙、flurandenolide、福莫可他、哈西奈德、卤米松、双醋溴氟龙、氢可松氨酯、氢化可的松、醋酸氢化可的松、氢化可的松丁酸酯、磷酸氢化可的松、琥钠氢可松、叔丁醋酸氢化可的松、马泼尼酮、甲羟松、甲泼尼松、甲泼尼龙、莫米松呋喃羧酸酯、对氟米松、泼尼卡酯、强的松龙、强的松龙二乙胺醋酸酯、强的松龙磷酸钠、强的松龙琥珀酸钠、强的松龙-21-间磺苯酸钠、强的松龙硬脂酰乙醇酸钠、强的松龙叔丁乙酯、强的松龙特戊酸酯、强的松、强的松龙戊酸酯、泼尼立定、泼尼立定二乙胺醋酸酯、替可的松、曲安西龙、曲安奈德、苯曲安奈德，和己曲安奈德。该组还包括结构上相关并具有类似止痛消炎性质的皮质类固醇。
在另一项特别实施方案中，本发明涉及将IL-1ra-L多肽与任一种或多种慢作用的抗风湿性药物(SAARDs)或缓解疾病的抗风湿性药物(DMARDS)或其酯类药物前体或药学容许的盐类组合(治疗前、治疗后或同时治疗)使用，以治疗本文列举的疾病和病症，其中包括急性和慢性炎症，如风湿性疾病、移植物抗宿主疾病和多发性硬化症。SAARDs或DMARDS及其酯类药物前体和药学容许的盐类包括阿洛铜钠、金诺芬、金硫葡糖、金硫醋苯胺、硫唑嘌呤、brequinar sodium、布西拉明、3-金硫-2-丙醇-1-磺酸钙、苯丁酸氮芥、氯喹、氯丁扎利、铜克索林、环磷酰胺、环孢菌素、氨苯砜、15-精胍菌素、双醋瑞因、葡糖胺、金盐(如环喹金盐、金硫丁二钠、硫代硫酸金钠)、羟氯喹、羟氯喹硫酸盐、羟基脲、酮保泰松、左旋咪唑、氯苯扎利、蜂毒肽、6-巯基嘌呤、氨甲喋呤、咪唑立宾、mofetil霉酚酸酯、金硫乙酸钙、氮芥、D-青霉胺、吡啶酚咪唑，如SKNF86002和SB203580，雷帕霉素、硫醇、促胸腺生成素和长春新碱。该组还包括结构上相关并具有类似止痛消炎性质的SAARDs或DMARDs。
在另一项特别实施方案中，本发明涉及将IL-1ra-L多肽与任一种或多种COX2抑制剂或其酯类药物前体或药学容许的盐类组合(治疗前、治疗后或同时治疗)使用，以治疗本文列举的疾病和病症，其中包括急性和慢性炎症。COX2抑制剂及其酯类药物前体和药学容许的盐类的实例包括，例如，celecoxib。该组还包括结构上相关并具有类似止痛消炎性质的COX2抑制剂。
在另一项特别实施方案中，本发明涉及将IL-1ra-L多肽与任一种或多种抗微生物剂或其酯类药物前体或药学容许的盐类组合(治疗前、治疗后或同时治疗)使用，以治疗本文列举的疾病和病症，其中包括急性和慢性炎症。抗微生物剂包括，例如，广泛的青霉素类、头孢菌素和其他β内酰胺类、氨基糖苷类、吡咯类、喹诺酮类、大环内酯类、利福霉素类、四环素类、磺胺类、林可酰胺类，以及多粘菌素类。青霉素类包括，但不局限于，青霉素G、青霉素V、甲氧苯青霉素、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、氟氯青霉素、氨苄青霉素、氨苄青霉素/舒巴坦、羟氨苄青霉素、羟氨苄青霉素/克拉维酸盐、缩酮氨苄青霉素、环青霉素、氨苄青霉素甲戊酯、羧苄青霉素、羧茚青霉素、羟噻吩青霉素、羟噻吩青霉素/克拉维酸盐、氧咪苄青霉素、美洛西林、氧哌嗪青霉素和甲亚胺青霉素。头孢菌素和其他β内酰胺类包括，但不局限于，头孢噻吩、头孢吡硫、头孢氨苄、头孢环已烯、头孢唑啉、头孢羟氨苄、头孢氯氨苄、头孢羟唑、头孢双硫唑甲氧、头孢甲氧霉素、头孢氨呋肟、头孢尼西、头孢拉定、头孢克肟、头孢氨噻、羟羧氧酰胺菌素、头孢唑肟、头孢三嗪、头孢哌酮、头孢噻甲羧肟、亚胺培南，和噻肟单酰胺菌素。氨基糖苷类包括，但不局限于，链霉素、庆大霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、乙基西梭霉素、卡那霉素，和新霉素。吡咯类包括，但不局限于，氟康唑。喹诺酮类包括，但不局限于，萘啶酸、氟哌酸、氟啶酸、环丙氟哌酸、氟嗪酸、斯帕哌酸和替马沙星。大环内酯类包括，但不局限于，红霉素、螺旋霉素和阿齐霉素。利福霉素类包括，但不局限于，利福平。四环素类包括，但不局限于，阿哌环素、氯四环素、羟甲氯四环素、去甲氯四环素、脱氧土霉素、胍哌甲基四环素、赖氨甲四环素、甲氯环素、甲烯土霉素、二甲胺四环素、土霉素、青哌环素、匹哌环素、吡甲四环素、脱甲脱氧四环素、琥氯霉素吡甲四环素，以及四环素。磺胺类包括，但不局限于，氨苯磺胺、磺胺甲基异恶唑、乙酰磺胺、磺胺嘧啶、磺胺异恶唑，以及复方新诺明(甲氧苄啶/磺胺甲基异恶唑)。林可酰胺类包括，但不局限于，氯林可霉素和林可霉素。多粘菌素类(多肽)包括，但不局限于，多粘菌素B和粘菌素。
可以将IL-1ra-L多肽的功能显效剂或拮抗剂与一种或多种适用于所治适应症的细胞因子、生长因子、抗生素、抗炎剂和/或化疗剂组合(同时或依次)使用。
本发明还包括由不合理剂量的一种或多种IL-1、IL-1ra或IL-1ra-L多肽导致的或介导的其他疾病。不合理剂量包括过量的IL-1、IL-1ra或IL-1ra-L多肽以及的低常IL-1、IL-1ra或IL-1ra-L多肽。
IL-1ra-L核酸及多肽的应用可以用本发明的核酸分子(其中包括自身不编码生物活性多肽的核酸分子)来确定IL-1ra-L基因和相关基因在染色体图谱上的位置。制图的技术已为该领域所了解，如PCR扩增和原位杂交。
在诊断测定方法中，可以将IL-1ra-L核酸分子(其中包括自身不编码生物活性多肽的核酸分子)作为杂交探针对哺乳动物组织或体液样品中IL-1ra-L核酸分子的存在情况进行定性或定量检测。
当需要抑制一种或多种IL-1ra-L多肽的活性时，还可以使用其他方法。可利用与表达调控序列(形成三螺旋)或IL-1ra-L mRNA互补并能够杂交的核酸分子来实现这种抑制。例如，可以将反义DNA分子或反义RNA分子引入细胞，这些分子含有一段至少与部分IL-1ra-L基因互补的序列。可根据本文公开的IL-1ra-L基因序列利用现有的技术来设计反义探针。每种反义探针通常是与每种选定的IL-1ra-L基因的起始位点(5’端)互补。反义分子与对应的IL-1ra-L mRNA杂交之后将会阻碍或降低该mRNA的翻译。利用反义抑制剂可以获得有关细胞或生物体中不含IL-1ra-L多肽或IL-1ra-L多肽减少的信息。
作为选择，还可通过基因治疗来创建一种或多种IL-1ra-L多肽的显性失活抑制剂。此时可以制备每种选定IL-1ra-L多肽的突变型多肽编码DNA，并利用本文描述的病毒法或非病毒法将其引入患者的细胞。每种突变体一般都可以与内源多肽的生物学作用进行竞争。
此外，具有生物活性或不具有生物活性的IL-1ra-L多肽都可作为抗原使用，即这些多肽至少含有一种可诱发抗体的表位。能够与IL-1ra-L多肽结合的选择性结合剂(如上所述)可用于体内和体外诊断，其中包括，但不局限于，以被标记的形式用于检测体液或细胞样品中的IL-1ra-L多肽存在情况。还可利用这些抗体来预防、治疗或诊断多种疾病或病症，其中包括本文列举的疾病和病症。这些抗体与IL-1ra-L多肽结合的作用可以是降低或阻断IL-1ra-L多肽的至少一种特有活性，也可以是提高IL-1ra-L多肽的至少一种特有活性(其中包括提高IL-1ra-L多肽的药代动力学)。
可以用本发明的IL-1ra-L多肽由表达克隆方法来克隆IL-1ra-L多肽受体。可以在结合测定中使用放射性标记(125I)的IL-1ra-L多肽或亲和力/活性标记(如Fc融合或碱性磷酸酶融合)的IL-1ra-L多肽来鉴定可表达IL-1ra-L多肽受体的细胞或细胞系或组织。可以将分离自这些细胞或组织的RNA转变成cDNA，并将其克隆到哺乳动物表达载体中，然后转染到哺乳动物细胞内(如COS或293细胞)，从而创建一种表达库。然后用放射性标记的或亲和力/活性标记的IL-1ra-L多肽作为亲和配体从该表达库中鉴定并分离出能够在表面表达IL-1ra-L多肽受体的部分细胞。然后从这些细胞中分离出DNA，并转染到哺乳动物细胞中，从而创建出第二表达库，其中可表达IL-1ra-L多肽受体的细胞的比例要比第一表达库高许多倍。不断重复该富集过程，直到分离出含有IL-1ra-L多肽受体的单一重组克隆。分离的IL-1ra-L多肽受体可用于鉴定或开发IL-1ra-L多肽信号通路的新型显效剂和拮抗剂。这些显效剂和拮抗剂包括可溶性IL-1ra-L多肽受体、抗IL-1ra-L多肽受体的抗体、小分子，或反义寡核苷酸，并且均可用于治疗、预防或诊断本文描述的一种或多种疾病或病症。
亚克隆到pGEM-Teasy中并转染到大肠杆菌DH10B菌株中的人IL-1ra-L多肽编码cDNA已于2000年1月20日保存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，保藏号为PTA-1215。
以下实施例只是用于说明，绝不是要限制本发明的范围。
实施例1人IL-1ra-L多肽基因的克隆人IL-1ra-L多肽编码基因的克隆和分析一般采用上文Sambrook et al.中描述的材料与方法。
根据同源性对人基因组库进行BLAST搜索，以分离人IL-1ra-L多肽的编码cDNA序列。由此鉴定出一段与人IL-1ra具有序列同源性的477 bp序列(GA_9383287_422_240)。利用该序列设计出用于鉴定cDNA来源的基因特异性寡核苷酸，并利用不同的PCR策略产生cDNA克隆。
利用扩增反应对多种cDNA库进行分析，该反应的总体积为25μl，其中含有10ng cDNA库模板DNA、引物2362-94(5’-C-A-T-G-G-A-C-C-T-G-T-A-T-G-T-G-G-A-G-A-A-G-A-3’；序列编号9)和2362-95(5’-G-C-C-A-G-G-G-T-A-A-G-A-G-A-C-T-G-A-C-T-G-A-A-3’；序列编号10)各5pmol，以及Ready-To-Go PCR小珠(Amersham-Pharmacia，Piscataway，NJ)(Pharmacia，Piscataway，NJ)。反应条件为95℃5分钟，1个循环；95℃15秒，68℃15秒，72℃1分钟，共29个循环；72℃10分钟，1个循环；以及95℃15秒，68℃15秒，72℃1分钟，共10个循环。可鉴定出具有预定大小(100bp)的PCR产物的cDNA库有很多种，其中包括来源于淋巴瘤细胞系(oligo-dT与随机引物)、胎儿肾(oligo-dT与随机引物)、成人T细胞(oligo-dT引物)、乳腺癌(oligo-dT与随机引物)、胎儿肺(oligo-dT与随机引物)、胎儿眼(oligo-dT与随机引物)和胎儿头皮(oligo-dT与随机引物)的库。选择胎儿头皮cDNA库用于进一步的扩增实验，以分离出IL-1ra-L多肽的全长编码cDNA序列。
胎儿头皮cDNA库的制备方法如下。利用标准的RNA抽提方法从人类胎儿头皮中提取总RNA，并用标准方法从中筛选poly-A+RNA。用随机引物或oligo-dT引物由这种poly-A+RNA合成cDNA，合成采用的是cDNA合成与质粒克隆试剂盒(Gibco-BRL)的Superscrip质粒系统，并根据厂商提供的方法或其他适当的方法来进行。用适当的限制酶消化所得cDNA，然后连接到pSPORT-1或其他适当的克隆载体中。用标准技术将连接产物转化到大肠杆菌中，并在含有氨苄青霉素、四环素、卡那霉素或氯霉素的培养平板上筛选细菌转化体。cDNA库包括所有这些转化体或其中的一部分。
通过5’RACE和3’RACE反应产生IL-1ra-L多肽的全长cDNA序列。利用5’RACE分离相当于IL-1ra-L多肽cDNA序列5’末端的cDNA序列，反应总体积为25μl，其中含有10ng由随机引物获得并插入pSPORT1的人类胎儿头皮cDNA库、引物870-02(5’-A-G-C-G-G-A-T-A-A-C-A-A-T-T-T-C-A-C-A-C-A-G-G-3’；序列编号11)和2366-21(5’-G-C-C-T-A-G-G-C-T-G-G-A-T-T-T-A-T-T-C-C-A-C-A-G-3’；序列编号12)各5pmol。反应条件为95℃1分钟，1个循环；保持在80℃，并添加0.5μl Advantage cDNA聚合酶混合物(Clontech)；95℃ 5秒，64℃ 5秒，68℃ 3分钟，共35个循环；以及68℃ 3分钟，1个循环。嵌套PCR反应的总体积为100μl，其中含有10μl 5’RACE扩增产物(1/50稀释)和引物1019-06(5’-G-C-T-C-T-A-A-T-A-C-G-A-C-T-C-A-C-T-A-T-A-G-G-G-3’；序列编号13)和2362-98(5’-C-T-G-A-T-G-T-G-G-T-G-G-A-G-G-T-G-G-C-T-A-T-3’；序列编号14)。嵌套PCR反应的条件为95℃1分钟，1个循环；保持在80℃，并添加0.5μl Advantage cDNA聚合酶混合物；95℃5秒，64℃5秒，68℃3分钟，共25个循环；以及68℃3分钟，1个循环。嵌套PCR结束后，直接分离扩增产物，并进行测序。
利用3’RACE分离相当于IL-1ra-L多肽cDNA序列3’末端的cDNA序列，反应总体积为25μl，其中含有10ng由oligo-dT引物获得并插入pSPORT1的人类胎儿头皮cDNA库，以及引物1340-35(5’-C-C-C-A-G-T-C-A-C-G-A-C-G-T-T-G-T-A-A-A-A-C-G-3’；序列编号15)和2362-94。反应条件为95℃1分钟，1个循环；保持在80℃，并添加0.5μl AdvantagecDNA聚合酶混合物；95℃5秒，64℃5秒，68℃3分钟，共35个循环；以及68℃3分钟，1个循环。嵌套PCR反应的总体积为100μl，其中含有10μl 3’RACE扩增产物(1/50稀释)和引物1019-05(5’-T-G-A-A-T-T-T-A-G-G-T-G-A-C-A-C-T-A-T-A-G-A-A-G-A-G-3’；序列编号16)和2362-94。嵌套PCR反应的条件为95℃ 1分钟，1个循环；保持在80℃，并添加0.5μl Advantage cDNA聚合酶混合物(Clontech)；95℃ 5秒，64℃ 5秒，68℃ 3分钟，共25个循环；以及68℃ 3分钟，1个循环。嵌套PCR结束后，直接分离扩增产物，并进行测序。
由5’和3’RACE产生的序列可以形成一段连续序列，该序列似乎包含了IL-1ra-L基因的全长可读框。利用PCR扩增方法分离出IL-1ra-L多肽的全长cDNA序列，使用的引物相当于由5’和3’RACE确定的IL-1ra-L基因的5’和3’末端。该PCR反应的总体积为50μl，其中含有100ng由oligo-dT引物获得的人类胎儿头皮cDNA库，以及扩增引物2397-15(5’-G-T-C-C-T-C-C-A-G-A-G-C-C-T-C-A-A-G-A-C-A-T-C-3’；序列编号17)和2375-10(5’-T-T-A-G-G-A-T-T-A-G-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-A-A-A-C-C-3’；序列编号18)各10pmol。反应条件为95℃1分钟，1个循环；保持在80℃，并添加1μl Advantage cDNA聚合酶混合物；95℃ 5秒，70℃ 3分钟，共5个循环；95℃ 5秒，68℃ 3分钟，共5个循环；以及95℃ 5秒，66℃ 5秒，66℃ 3分钟，共25个循环。将由此产生的PCR产物分离、克隆并测序。
对预定IL-1ra-L多肽cDNA序列的序列分析结果表明，该基因含有471bp的可读框，可编码一种含有157个氨基酸的蛋白(图1A-1B)。图2显示人IL-1δ(IL-1 delta；序列编号3)、人IL-1ra-L多肽(IL-1ra-L；序列编号2)、人IL-1ε(IL-1_epsilon；序列编号4)、人IL-1受体拮抗剂、分泌型多肽(IL-1ra_sec；序列编号9)、人IL-1β(IL-1_beta；序列编号6)的氨基酸序列对比以及共有序列(consensus)。
实施例 2IL-1ra-L mRNA的表达利用PCR分析方法检测不同cDNA库中的IL-1ra-L mRNA表达。在一系列的扩增反应中，各含有10ng cDNA库模板DNA、扩增引物2362-94和2362-98各5pmol，以及Ready-To-Go小珠，反应总体积为25μl。反应条件为95℃5分钟，1个循环；95℃15秒，68℃15秒，72℃1分钟，共29个循环；72℃10分针，1个循环；以及95℃15秒，68℃15秒，72℃1分钟，共10个循环。可鉴定出具有预定大小(100bp)的PCR产物的cDNA库有很多种，其中包括来源于淋巴瘤细胞系(oligo-dT与随机引物)、胎儿肾(oligo-dT与随机引物)、成人T细胞(oligo-dT引物)、乳腺癌(oligo-dT与随机引物)、胎儿肺(oligo-dT与随机引物)、胎儿眼(oligo-dT与随机引物)和胎儿头皮(oligo-dT与随机引物)的库。
在另一系列的扩增反应中，各含有10ng MarathonTMcDNA(Clontech)、扩增引物2362-94和2362-98各5pmol，以及0.5μl AdvantagecDNA聚合酶混合物，反应总体积为25μl。反应条件为95℃5分钟，1个循环；95℃5秒，64℃5秒，68℃1分钟，共35个循环；以及68℃1分钟，1个循环。可鉴定出具有预定大小(100bp)的PCR产物的cDNA库有几种，其中包括成人肝脏、肺、胎盘和脾脏。
IL-1ra-L mRNA的表达可通过RNA印迹来检测。可以用分离自人IL-1ra-L多肽cDNA克隆的适当限制酶切片段作为探针，对多种人类组织的RNA印迹膜(Clontech)进行检测。利用标准技术对该探针进行32P-dCTP标记。
在杂交溶液(5×SSC，50％去离子甲酰胺，5×Denhardt’s溶液，0.5％SDS和100mg/ml变性鲑鱼精DNA)中将RNA印迹膜42℃预杂交2小时，然后在含有5ng/ml标记探针的新制备的杂交溶液中42℃杂交过夜。杂交结束后，于室温下在2×SSC和0.1％SDS中将滤膜清洗两次，共10分钟，然后于65℃下在0.1×SSC和0.1％SDS中清洗两次，共30分钟。然后将印迹膜放射自显影。
利用原位杂交对IL-1ra-L mRNA的表达进行定位。将正常小鼠的胚性组织片和成体组织片置于4％多聚甲醛中固定，然后石蜡包埋，并切成5μm的切片。在0.2M HCl中将组织切片渗透，然后用蛋白酶K消化，并用三乙醇胺和乙酸酐使其乙酰化。在杂交溶液(300mM NaCl，20mMTris-HCl，pH8.0，5mM EDTA，1×Denhardt’s溶液，0.2％ SDS，10mMDTT，0.25mg/ml tRNA，25μg/ml polyA，25μg/ml polyC和50％甲酰胺)中将切片60℃预杂交1小时，然后在含有10％葡聚糖和2×104cpm/μl人IL-1ra-L mRNA互补性33P标记反义核糖探针的相同溶液中60℃杂交过夜。这种核糖探针的获得方法是利用标准技术对含有人IL-1ra-L cDNA序列的克隆进行体外转录。
杂交结束后，利用RNaseA处理的杂交溶液清洗切片，以消化未杂交的探针，然后于55℃下在0.1×SSC中清洗30分钟。然后将切片浸泡在NTB-2乳剂中(Rochester，NY)，于4℃下曝光3星期，显色，并用苏木精和曙红进行复染。利用暗场及标准映光方法对组织的形态和杂交信号同时进行分析，其中包括大脑(1个矢切片和2个冠状切片)、胃肠道(食管、胃、十二指肠、空肠、回肠、近端结肠和远端结肠)、垂体、肺、心脏、脾脏、胸腺、淋巴结、肾、肾上腺、膀胱、胰、唾液腺、雄性及雌性生殖器官(雌性的卵巢、输卵管和子宫；雄性的睾丸、附睾、前列腺、精囊和输精管)、BAT和WAT(皮下的、肾周的)、骨(股骨)、皮肤，乳腺和骨骼肌。
实施例3IL-1ra-L多肽的产生A.在细菌中表达IL-1ra-L多肽利用PCR方法扩增IL-1ra-L多肽的DNA序列模板，使用的引物相应于该序列的5’及3’末端。对扩增的DNA产物进行改造，使其含有可用于插入表达载体的限制性酶切位点。对PCR产物进行凝胶纯化，并用标准的重组DNA方法将其插入到表达载体中。典型的载体包括pAMG21(ATCC保藏号98113)，该载体含有lux启动子和编码卡那霉素抗性的基因，用BamHI和NdeI消化载体，用于定向克隆所插入的DNA。用电穿孔方法将连接混合物转化到大肠杆菌宿主中，并通过卡那霉素抗性筛选转化体。从选定的克隆中分离质粒DNA，并进行DNA测序，以证实插入序列的存在。
在含有30μg/ml卡那霉素的2×YT培养基中30℃培养转化的宿主细胞，然后进行诱导。基因表达的诱导方法是，添加终浓度为30ng/ml的N-(3-氧己酰)-dl-高丝氨酸，然后在30℃或37℃培养6小时。对IL-1ra-L多肽的表达进行评定，方法是将培养物浓缩，将细菌沉淀重悬并裂解，然后由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析宿主细胞蛋白。
含有IL-1ra-L多肽的包涵体的纯化方法如下。离心使细菌沉淀，然后将沉淀重悬于水。通过超声将细菌悬浮液裂解，然后在195,000×g条件下离心5-10分钟。弃上清液，清洗沉淀并将其转移到匀浆器中。在5mlPercoll溶液(75％液体Percoll和0.15M NaCl)中将沉淀匀浆，直到悬浮均匀，然后稀释，并在21,600条件下离心30分钟。回收含有包涵体的梯度组分，并将这些组分合并。利用SDS-PAGE对分离的包涵体进行分析。
将SDS聚丙烯酰胺凝胶上相当于大肠杆菌产生的IL-1ra-L多肽的单一条带切出，并基本按照Matsudaira et al.，1987，J.Biol.Chem.26210-35的描述确定其N-末端氨基酸序列。
B.在哺乳动物细胞中表达IL-1ra-L多肽利用PCR方法扩增IL-1ra-L多肽的DNA序列模板，使用的引物相当于该序列的5’及3’末端。对扩增的DNA产物进行改造，使其含有可用于插入表达载体的限制性酶切位点。对PCR产物进行凝胶纯化，并用标准的重组DNA方法将其插入到表达载体中。可以用一种典型的载体，pCEP4(Invitrogen，Carlsbad，CA)，在293-EBNA-1细胞中表达IL-1ra-L多肽，这种载体含有Epstein-Barr病毒的复制起始点。将扩增并经过凝胶纯化的PCR产物连接到pCEP4载体中，然后用脂转染方法将其引入293-EBNA细胞。在100μg/ml潮霉素中筛选被转染的细胞，并使具有药物抗性的所得培养物生长至铺满状态。然后在不含血清的培养基中将这些细胞培养72小时。去除条件培养基，并通过SDS-PAGE对IL-1ra-L多肽的表达进行分析。
可以用银染方法来检测IL-1ra-L多肽的表达。作为选择，也可以将IL-1ra-L多肽作为含有表位标记的一种融合蛋白来加以表达，如含有IgG恒定区或FLAG表位，这种IL-1ra-L多肽可通过蛋白印迹分析方法用其肽标记的抗体来检测。
从SDS聚丙烯酰胺凝胶上切出IL-1ra-L多肽，或利用与表位标记的亲和层析方法纯化出IL-1ra-L融合蛋白，并如上所述进行N-末端氨基酸序列分析。
C.在哺乳动物细胞中表达并纯化IL-1ra-L多肽利用脂转染或磷酸钙方法将IL-1ra-L多肽表达构建体引入293 EBNA细胞或CHO细胞。
为了对产生的IL-1ra-L多肽进行功能性研究，可以用经过潮霉素筛选的293 EBNA混合克隆来产生大量的条件培养基。在500cm Nunc TripleFlasks中将细胞培养至80％铺满的状态，然后转到无血清培养基中培养1星期，然后收集培养基。在用于纯化之前，可以将收集的条件培养基冷冻于-20℃。
利用亲和层析纯化条件培养基的方法如下。将培养基融解并利用0.2μm滤膜过滤。用pH7.0的PBS平衡蛋白G柱，然后用过滤后的培养基上样。用PBS清洗层析柱，直到A280吸光度达到基准值。用pH2.7的0.1M甘氨酸-HCl将IL-1ra-L多肽从柱上洗脱，并立即用pH8.5的1MTris-HCl中和。将含有IL-1ra-L多肽的组分合并，在PBS中透析，然后保存于-70℃。
如果要用因子Xa将人IL-1ra-L多肽-Fc融合多肽酶切，可把亲和纯化的蛋白置于50mM Tris-HCl、100mM NaCl、2mM CaCl2，pH8.0中透析。在透析过的蛋白中加入1/100(w/w)的限制性蛋白酶因子Xa，并在室温下将样品消化过夜。
实施例 4抗IL-1ra-L多肽抗体的产生用纯化的蛋白或由生物或化学合成方法产生的IL-1ra-L多肽进行免疫即可获得IL-1ra-L多肽的抗体。用于产生抗体的适当方法包括Hudsonand Bay，Proctical Immunology(2nd ed.，Blackwell Scientific Publications)中描述的方法。
用于产生抗体的一种方法是，利用IL-1ra-L抗原(如IL-1ra-L多肽)对动物(一般为小鼠或兔)进行注射，并利用ELISA方法确定血清的效价，选择效价足够高的血清，用于产生杂交瘤。取出被免疫动物的脾脏，并制备成单细胞悬浮液，然后收集脾细胞。将这些脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(如Sp2/0-Ag14细胞)相融合，先在含有200U/ml青霉素、200μg/ml硫酸链霉素和4mM谷氨酰胺的DMEM中培养，然后在HAT选择培养基(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷)中培养。然后从每个融合孔中取组织培养物上清，并利用ELISA方法检测抗IL-1ra-L抗体的产生情况。
还可以选择其他方法来获得抗IL-1ra-L抗体，例如，对带有人类Ig基因座的转基因小鼠进行免疫以产生人类抗体的方法，以及筛选合成抗体库的方法，例如由抗体可变区诱变产生的抗体库。
实施例5在转基因小鼠中表达IL-1ra-L多肽为了评定IL-1ra-L多肽的生物学活性，可以制备一种能够在肝特异性ApoE启动子的调控下编码IL-1ra-L多肽/Fc融合蛋白的构建体。递送这种构建体可能会导致一些病理变化，这些变化可以提供有关IL-1ra-L多肽功能的信息。还可以制备一种能够在β-肌动蛋白启动子的调控下编码全长IL-1ra-L多肽的类似构建体。递送这种构建体可能会导致普遍表达。
为了产生这些构建体，可以用PCR方法扩增IL-1ra-L多肽的DNA序列模板，使用的引物相当于该序列的5’及3’末端，并且掺入了可用于将扩增产物插入表达载体的限制性酶切位点。然后对扩增的PCR产物进行凝胶纯化，并用适当的限制酶进行消化，然后用标准的重组DNA技术将其与一种表达载体相连接。例如，可按照Graham et al.，1997，NatureGenetics，17272-74和Ray et al.，1991，Genes Dev.52265-73中的描述将扩增的IL-1ra-L多肽序列克隆到受人类β-肌动蛋白启动子调控的表达载体中。
连接完成后，通过电穿孔方法用反应混合物转化大肠杆菌宿主，并根据药物抗性筛选转化体。从选定的克隆中分离质粒DNA，并进行DNA测序，以证实其含有适当的插入序列，并且不含有突变。通过两次CsCl密度梯度离心将IL-1ra-L多肽表达载体纯化，用适当的限制酶剪切，并通过凝胶电泳纯化出含有IL-1ra-L多肽转基因的线性化片段。将纯化的片段以2mg/ml的浓度重悬于5mM Tris，pH7.4和0.2mM EDTA。
按前人所述(PCT专利WO97/23614)对BDF1×BDF1杂交小鼠的单细胞胚胎进行注射。将胚胎置于CO2保温箱中培养过夜，然后将15-20个二细胞胚胎植入到假孕CD1雌性小鼠的输卵管中。通过基因组DNA样品中整合转基因的PCR扩增对显微注射的胚胎植入后获得的后代进行筛选，方法如下。在20ml耳用缓冲液(20mM Tris，pH8.0，10mM EDTA，0.5％SDS和500mg/ml蛋白酶K)中将耳部组织块55℃消化过夜。然后用200ml的TE稀释该样品，取2ml样品用于采用了适当引物的PCR反应。
将8周龄的第一代转基因动物以及对照动物处死，用于解剖和病理分析。取出部分脾脏，用总RNA提取试剂盒(Qiagen)从中分离细胞总RNA，并利用RT-PCR方法检测转基因的表达情况。利用SuperScriptTMPreamplification System(Gibco-BRL)将回收自脾脏的RNA转变成cDNA，方法如下。利用表达载体序列上位于IL-1ra-L多肽转基因3’端的适当引物引发转基因转录体合成cDNA。将来源于第一代转基因动物以及对照动物的各10mg脾脏总RNA与1mM引物70℃保温10分钟，然后置于冰上。在反应体系中补加10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2.5mMMgCl2，dNTP各10mM，0.1mM DTT和200U SuperScript II逆转录酶。42℃保温50分钟，然后72℃加热15分钟以终止反应，再用2U RNase H于37℃消化20分钟。然后用IL-1ra-L多肽特异性引物对样品进行PCR扩增。
实施例6转基因小鼠中的IL-1ra-L多肽的生物活性将转基因动物称重，然后用异氟烷麻醉，并通过心脏穿刺抽取血液，然后处死动物。对样品进行血液学分析和血清化学分析。对完全失血的动物进行射线照射。然后将其完全解剖，并对主要的内脏器官进行重量分析。
从完全解剖的动物中取出组织(即肝脏、脾脏、胰、胃、整个胃肠道、肾、生殖器官、皮肤和乳腺、骨、脑、心脏、肺、胸腺、气管、食管、甲状腺、肾上腺、尿道膀胱、淋巴结和骨骼肌)，并固定在10％的缓冲Zn-福尔马林中，用于组织学检测。对固定的组织进行处理，直到包埋在石蜡块中，然后切成3mm的切片。所有切片均用苏木精和曙红染色，然后用于组织学分析。
利用B细胞和T细胞特异性抗体对转基因小鼠和对照小鼠的脾脏、淋巴结和淋巴集结进行免疫组织学分析，方法如下。将福尔马林固定、石蜡包埋的切片脱蜡，并在去离子水中水化。用3％过氧化氢对切片进行淬灭，并用Protein Block(Lipshaw，Pittsburgh，PA)阻断，然后与大鼠抗小鼠B220和CD3的单克隆抗体(Harlan，Indianapolis，IN)共保温。利用生物素化的兔抗大鼠免疫球蛋白、过氧化物酶偶联的抗生蛋白链菌素(BioGenex，San Ramon，CA)和DAB生色团(BioTek，Santa Barbara，CA)检测抗体的结合。
从解剖后的转基因动物以及同窝出生的对照动物体内取出MLN以及部分脾脏和胸腺。利用注射器的平端对100mm尼龙细胞容器(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)底部的组织进行温和研磨，以获得单细胞悬浮液。将细胞清洗两次，并进行计数，然后用体积为20μl的0.5μgCD16/32(FcγIII/II)与每种组织的约1×106个细胞共保温10分钟。然后在含有0.1％牛血清白蛋白和0.01％叠氮化钠的100μl PBS中(不含Ca+和Mg+)利用0.5μg抗CD90.2(Thy-1.2)、CD45R(B220)、CD11b(Mac-1)、Gr-1、CD4或CD8的FITC-或PE-偶联单克隆抗体(PharMingen，San Diego，CA)将样品于2-8℃染色30分钟。抗体结合完成后，清洗细胞并利用流式细胞光度计在FACScan(Becton Dickinson)上进行分析。
本发明是根据优选的实施方案来加以描述，但该领域的技术人员都了解其中可能出现的变化和改进。因此，希望这些处在本发明范围之内的等效变化都能被包含在所附权利要求之中。
序列表<110>A.A.韦尔彻(Welcher，Andrew A.)S.景(Jing，Shuqian)R.吕蒂(Luethy，Roland)<120>白介素-1受体拮抗剂样分子及其应用<130>00-1214<140><141><150>60/170,052<151>1999-12-10<160>18<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1244<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(301)..(774)<400>1gtgttgctcc actgtcagtc ctccagagcc tcaagagatc tttgggccat atcagctttc 60tttccaaaat gaacacaccc aggggcagga aagaatgctc tttccttggt cattaagggg 120cctgggagtc ctggaccagc ttttcatgca gctagaccac ttacatgcaa ctagagcctt 180gactttgaaa cgagggacaa aagcatctct tgctaaaggt aacttctgct gcttagaacc 240cagcctcctc accaccatct gatctatctt gttctcttca caaaaggctc tgaagacatc 300atg aac cca caa cgg gag gca gca ccc aaa tcc tat gct att cgt gat 348Met Asn Pro Gln Arg Glu Ala Ala Pro Lys Ser Tyr Ala Ile Arg Asp1 5 10 15tct cga cag atg gtg tgg gtc ctg agt gga aat tct tta ata gca gct 396Ser Arg Gln Met Val Trp Val Leu Ser Gly Asn Ser Leu Ile Ala Ala20 25 30cct ctt agc cgc agc att aag cct gtc act ctt cat tta ata gcc tgt 444Pro Leu Ser Arg Ser Ile Lys Pro Val Thr Leu His Leu Ile Ala 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1.一种分离的核酸分子，该核酸分子含有一种核苷酸序列，该序列选自(a)序列编号1的核苷酸序列；(b)ATCC保藏号PTA-1215中DNA插入序列的核苷酸序列；(c)可编码序列编号2所示多肽的一种核苷酸序列；(d)能够在中度或高度严格条件下与(a)-(c)之一的互补序列杂交的一种核苷酸序列；以及(e)与(a)-(c)之一的序列互补的一种核苷酸序列。
2.一种分离的核酸分子，该核酸分子含有一种核苷酸序列，该序列选自(a)可编码与序列编号2所示多肽至少具有约70％同一性的一种多肽的一种核苷酸序列，其编码的这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(b)可编码序列编号1所示核苷酸序列、ATCC保藏号PTA-1215中DNA插入序列的核苷酸序列或(a)的一种等位变异体或剪接变异体的一种核苷酸序列；(c)可编码一种至少含有约25个氨基酸残基的多肽片段的序列编号1所示核苷酸序列的一段区域、ATCC保藏号PTA-1215中DNA插入序列的一段区域、(a)的一段区域，或(b)的一段区域，其中，该多肽片段具有序列编号2所示编码多肽的一种活性或具有抗原性；(d)含有一种至少约16个核苷酸的片段的序列编号1所示核苷酸序列的一段区域、ATCC保藏号PTA-1215中DNA插入序列的一段区域，或(a)-(c)之一的一段区域；(e)能够在中度或高度严格条件下与(a)-(d)之一的互补序列杂交的一种核苷酸序列；以及(f)与(a)-(d)之一的序列互补的一种核苷酸序列。
3.一种分离的核酸分子，该核酸分子含有一种核苷酸序列，该序列选自(a)可编码如序列编号2所示并且至少有一个保守氨基酸取代的一种多肽的一种核苷酸序列，其编码的这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(b)可编码如序列编号2所示并且至少有一个氨基酸插入的一种多肽的一种核苷酸序列，其编码的这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(c)可编码如序列编号2所示并且至少有一个氨基酸缺失的一种多肽的一种核苷酸序列，其编码的这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(d)可编码如序列编号2所示并且C端和/或N端被截断的一种多肽的一种核苷酸序列，其编码的这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(e)可编码如序列编号2所示并且至少有一种选自氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失、C端截断和N端截断的修饰的一种多肽的一种核苷酸序列，其编码的这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(f)含有一种至少约16个核苷酸的片段的(a)-(e)之一的一种核苷酸序列；(g)能够在中度或高度严格条件下与(a)-(f)之一的互补序列杂交的一种核苷酸序列；以及(h)与(a)-(e)之一的序列互补的一种核苷酸序列。
4.一种载体，该载体含有权利要求1、2或3之一的核酸分子。
5.一种宿主细胞，该细胞含有权利要求4的载体。
6.权利要求5的宿主细胞，该细胞为真核细胞。
7.权利要求5的宿主细胞，该细胞为原核细胞。
8.一种产生IL-1ra-L多肽的方法，该方法包括在适合于这种多肽表达的条件下培养权利要求5的宿主细胞，并且还选择性地包括从其培养物中分离这种多肽。
9.一种由权利要求8的方法产生的多肽。
10.权利要求8的方法，其中的核酸分子含有与IL-1ra-L多肽编码DNA有效连接的启动子DNA，该启动子DNA不是IL-1ra-L多肽的天然启动子DNA。
11.权利要求2的分离的核酸分子，其中的同一性百分率是由选自GAP、BLASTN、FASTA、BLASTA、BLASTX、BestFit和Smith-Waterman算法的一种计算机程序来确定。
12.一种方法，用于确定一种化合物是否能抑制IL-1ra-L多肽活性或IL-1ra-L多肽的产生，该方法包括将权利要求5、6或7之一的一种细胞暴露于该化合物，并且检测该细胞中的IL-1ra-L多肽活性或IL-1ra-L多肽的产生。
13.一种分离的多肽，这种多肽含有一种氨基酸序列，该序列选自(a)序列编号2所示氨基酸序列；以及(b)由ATCC保藏号PTA-1215中的DNA插入序列编码的氨基酸序列。
14.一种分离的多肽，这种多肽含有一种氨基酸序列，该序列选自(a)序列编号2的一种直向同源物的一种氨基酸序列；(b)与序列编号2的氨基酸序列至少有约70％同一性的一种氨基酸序列，其中，这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(c)序列编号2所示氨基酸序列的至少含有约25个氨基酸残基的一种片段，其中，该片段具有序列编号2所示多肽的一种活性或具有抗原性；以及(d)序列编号2所示氨基酸序列、由ATCC保藏号PTA-1215中的DNA插入序列编码的氨基酸序列、(a)或(b)的一种等位变异体或剪接变异体的一种氨基酸序列。
15.一种分离的多肽，这种多肽含有一种氨基酸序列，该序列选自(a)至少有一个保守氨基酸取代的序列编号2所示氨基酸序列，其中，这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(b)至少有一个氨基酸插入的序列编号2所示氨基酸序列，其中，这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(c)至少有一个氨基酸缺失的序列编号2所示氨基酸序列，其中，这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；(d)C端和/或N端被截断的序列编号2所示氨基酸序列，其中，这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性；以及(e)至少有一种选自氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失、C端截断和N端截断的修饰的序列编号2所示氨基酸序列，其中，这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性。
16.一种由权利要求1、2或3之一的核酸分子编码的分离的多肽，其中，这种多肽具有序列编号2所示多肽的一种活性。
17.权利要求14的分离的多肽，其中的同一性百分率是由选自GAP、BLASTP、FASTA、BLASTA、BLASTX、BestFit和Smith-Waterman算法的一种计算机程序来确定。
18.一种能特异性结合权利要求13、14或15之一的多肽的选择性结合剂或其片段。
19.权利要求18的选择性结合剂或其片段，这种选择性结合剂或其片段能够与含有序列编号2所示氨基酸序列的多肽或其片段特异性结合。
20.权利要求18的选择性结合剂，这种选择性结合剂是一种抗体或其片段。
21.权利要求18的选择性结合剂，这种选择性结合剂是一种人源化抗体。
22.权利要求18的选择性结合剂，这种选择性结合剂是一种人类抗体或其片段。
23.权利要求18的选择性结合剂，这种选择性结合剂是一种多克隆抗体或其片段。
24.权利要求18的选择性结合剂，这种选择性结合剂是一种单克隆抗体或其片段。
25.权利要求18的选择性结合剂，这种选择性结合剂是一种嵌合抗体或其片段。
26.权利要求18的选择性结合剂，这种选择性结合剂是一种CDR嫁接抗体或其片段。
27.权利要求18的选择性结合剂，这种选择性结合剂是一种抗独特型抗体或其片段。
28.权利要求18的选择性结合剂，这种选择性结合剂是一种可变区片段。
29.权利要求28的可变区片段，该片段是一种Fab片段或Fab’片段。
30.一种选择性结合剂或其片段，这种选择性结合剂或其片段至少含有一种对具有序列编号2所示氨基酸序列的多肽具有特异性的互补决定区。
31.权利要求18的选择性结合剂，这种选择性结合剂结合有一种可检测标记。
32.权利要求18的选择性结合剂，这种选择性结合剂可拮抗IL-1ra-L多肽的生物学活性。
33.一种方法，用于治疗、预防或改善与IL-1ra-L多肽有关的疾病、病症或病情，该方法包括将有效剂量的权利要求18的选择性结合剂给药于患者。
34.一种选择性结合剂，该选择性结合剂的产生方法是用含有序列编号2所示氨基酸序列的一种多肽对动物进行免疫。
35.一种杂交瘤，该杂交瘤可产生一种能够与权利要求1、2或3之一的一种多肽结合的选择性结合剂。
36.一种方法，该方法是利用权利要求18的抗IL-1ra-L抗体或其片段对IL-1ra-L多肽进行检测或定量。
37.一种组合物，该组合物含有权利要求13、14或15之一的多肽和一种药学容许的配制剂。
38.权利要求37的组合物，其中的药学容许的配制剂是一种载剂、佐剂、增溶剂、稳定剂或抗氧化剂。
39.一种多肽，这种多肽含有权利要求13、14或15之一的多肽的一种衍生物。
40.权利要求39的多肽，这种多肽被一种水溶性聚合物共价修饰。
41.权利要求40的多肽，其中的水溶性聚合物选自聚乙二醇、单甲氧基聚乙二醇、葡聚糖、纤维素、聚-(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧化乙烯多元醇和聚乙烯醇。
42.一种组合物，该组合物含有权利要求1、2或3之一的一种核酸分子和一种药学容许的配制剂。
43.权利要求42的组合物，其中的核酸分子被包含在一种病毒载体中。
44.一种病毒载体，该病毒载体含有权利要求1、2或3之一的一种核酸分子。
45.一种融合蛋白，该融合蛋白含有与一种异源氨基酸序列融合的权利要求13、14或15之一的多肽。
46.权利要求45的融合蛋白，其中的异源氨基酸序列是一种IgG恒定区或其片段。
47.一种方法，用于治疗、预防或改善一种医学病症，该方法包括将权利要求13、14或15之一的多肽或由权利要求1、2或3之一的核酸编码的多肽给药于患者。
48.一种方法，用于诊断主体的一种病理状况或对一种病理状况的易感性，该方法包括(a)确定权利要求13、14或15之一的多肽或由权利要求1、2或3之一的核酸分子编码的多肽在样品中的表达情况或表达量；以及(b)根据这种多肽的表达情况或表达量来诊断一种病理状况或对一种病理状况的易感性。
49.一种装置，该装置包括(a)一种适合于植入的膜；以及(b)封装在该膜中的细胞，其中，这些细胞能够分泌权利要求13、14或15之一的一种蛋白；并且该膜可以使该蛋白通过，但不能使对这些细胞有害的物质通过。
50.一种方法，用于鉴定可结合IL-1ra-L多肽的化合物，该方法包括(a)用权利要求13、14或15之一的多肽与一种化合物相接触；以及(b)确定IL-1ra-L多肽与该化合物的结合程度。
51.权利要求50的方法，该方法还包括确定这种多肽与该化合物结合时的活性。
52.一种方法，用于调节一种多肽在一种动物体内的水平，该方法包括将权利要求1、2或3之一的核酸分子给药于该动物。
53.一种非人类转基因哺乳动物物，该哺乳动物含有权利要求1、2或3之一的核酸分子。
54.一种方法，用于确定一种化合物是否能抑制IL-1ra-L多肽活性或IL-1ra-L多肽的产生，该方法包括将权利要求53的一种转基因哺乳动物暴露于该化合物，并且检测该哺乳动物体内的IL-1ra-L多肽活性或IL-1ra-L多肽的产生。
全文摘要
本发明提供新的白介素－1受体拮抗剂样(IL－1ra－L)多肽以及编码这些多肽的核酸分子。本发明还提供用于产生(IL－1ra－L)多肽的选择性结合剂、载体、宿主细胞和方法。此外，本发明还提供用于诊断、治疗、改善和/或预防与IL－1ra－L多肽有关的疾病、病症和病情的药用组合物及方法。
文档编号C07K14/54GK1433431SQ00818890
公开日2003年7月30日 申请日期2000年11月28日 优先权日1999年12月10日
发明者A·A·韦尔彻, R·吕蒂, S·景 申请人:安姆根有限公司