编码抗肌萎缩蛋白小基因的dna序列及其使用方法

专利名称：编码抗肌萎缩蛋白小基因的dna序列及其使用方法
技术领域：
本发明涉及保留了全长抗肌萎缩蛋白基因基本生物功能的新抗肌萎缩蛋白小基因，并涉及使用该新抗肌萎缩蛋白小基因对哺乳动物受试者的迪谢纳肌营养不良(DMD)和贝克肌营养不良(BMD)进行治疗的方法。
抗肌萎缩蛋白为具有3685个氨基酸(aa)的巨大棒状蛋白质，其定位于肌细胞膜内表面的下面(Watkins，S.C.等，自然333，863-866 )。它通过四个主要的结构域起作用N-末端结构域(1-756aa)、中央棒状结构域(757-3122aa)、富含半胱氨酸(CR)的结构域(3123-3409aa)和远端的C-末端结构域(3410-3685aa)。N-末端结构域与细胞骨架结构的F-肌动蛋白结合，而CR结构域与远端的C-末端结构域一同通过抗肌萎缩蛋白相关蛋白(DAP)复合体锚定于细胞膜，这样抗肌萎缩蛋白交联并稳定肌细胞膜和细胞骨架。中央棒状结构域含有24个三股螺旋棒状重复序列(R1-R24)和4个铰合部(H1-H4)。每一重复序列长约109aa。(Koenig等，生物化学杂志(J Biol Chem)265，4560-4566 )。认为中央棒状结构域在肌肉收缩期间起“减震器”的作用。抗肌萎缩蛋白交联并稳定肌肉细胞膜和细胞骨架。功能性抗肌萎缩蛋白的缺乏导致DAP复合体的失去并引起肌纤维质膜的不稳定性。这些缺陷接下来导致慢性肌肉损害和退化性病理现象。
绝大多数DMD突变为破坏了抗肌萎缩蛋白mRNA阅读框或导入了提前结束蛋白质翻译的终止密码子(Monaco等，基因组学(Genomics)2，90-95 )。该疾病的较不严重等位形式为贝克肌营养不良(BMD)，抗肌萎缩蛋白基因的突变通常为保留了mRNA阅读框。这样，对BMD患者而言，合成了一些功能性基因产物，但量和/或质减少，导致较轻的表型(Hoffman等，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)318，1363-1368 )。
mdx小鼠(Bulfield等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81，1189-1192 )为DMD的动物模型。mdx抗肌萎缩蛋白基因中的遗传损坏为在mRNA的碱基3185处的无义突变，这引起翻译在外显子23内的提前终止。该无义突变排除了功能性蛋白质的合成。
由于对DMD缺乏有效的治疗，人们积极探索了一些新的遗传方法，包括细胞治疗和基因治疗。但成肌细胞移植的临床试验并不成功，这是因为移植细胞的存活性差(Gussoni等，自然医学(Nature Med)3，970-977 )。最近报道了用庆大霉素处理mdx小鼠导致对抗肌萎缩蛋白基因中提前终止密码子的抑制，并导致接下来表达功能性抗肌萎缩蛋白且将其定位至细胞膜(Barton-Davis等，临床研究杂志(J Clin Invest.)104，375-381 )。这种治疗对高达15％的DMD患者证明是有效的。
体细胞基因转移提供了一种新的置换缺陷抗肌萎缩蛋白基因的方法。用于将编码基因产物的遗传物质导入器官或组织的一种优选方法是使用病毒载体。在这种情况下，将编码基因产物的遗传物质插入病毒基因组(或部分的病毒基因组)。指导基因产物表达的调控元件可与遗传物质一起插入病毒基因组(即与基因连接插入病毒基因组)，或指导基因产物表达的调控元件可由病毒基因组自身提供，如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)或腺伴随病毒(AAV)末端反向重复序列(ITR)。用病毒载体感染细胞的优点在于病毒载体编码的分子(如由包含在病毒载体内的cDNA编码的分子)可在已摄入了病毒载体核酸的细胞中有效表达，且病毒载体系统可在体内使用。在下面的子部分中分别描述了不同的病毒载体。
1.腺病毒载体可对腺病毒基因组进行操作，使其编码并表达目标基因产物且丧失在正常裂解性病毒生活周期中复制的能力(Curiel，纽约科学院纪事(Ann N Y Acad Sci)886，158-71 )。来自腺病毒Ad5型dl324毒株或其它腺病毒(如Ad2，Ad3，Ad7等)毒株的合适腺病毒载体为本领域技术人员熟知。重组腺病毒是有利的，因为它们不需要分裂的细胞而成为有效的基因递送载体，且可用于感染大量的细胞类型，包括呼吸道上皮细胞、内皮细胞和肌细胞。另外，导入的腺病毒DNA(以及其中含有的外源DNA)不整合入宿主细胞的基因组并仍为游离的，因此避免了当导入的DNA在整合入宿主基因组(例如逆病毒DNA)时由于插入诱变而可引发的潜在问题。
而且，腺病毒基因组携带外源DNA的容量相对于其它基因递送载体要大(高达8千个碱基)(Haj-Ahmand等，病毒学杂志(J.Virol.)57，267-273 )。目前使用的大多数复制缺陷型腺病毒载体为缺失了全部或部分的病毒E1和E3基因，但保留了多达80％的腺病毒遗传物质。Kochanek等和Chamberlain等也描述了缺失全部病毒编码区的腺病毒载体(美国专利号5,985,846和美国专利号6,083,750)。
已在营养不良的动物模型中成功测试了腺病毒载体(Ragot等，自然361，647-50 ；Howell等，人类基因治疗(Hum Gene Ther)9，629-34 )。但腺病毒载体的免疫原性和不能感染成熟肌细胞仍是其在可安全用于人之前有待克服的主要障碍。
2.单纯疱疹病毒(HSV)载体HSV载体的主要特征在于它有非常大的包装容量，它通常是复制缺陷的且不整合入宿主基因组。HSV感染神经系统的细胞(Fink等，神经科学年鉴(Annu Rev Neurosci)19，265-287， )。该病毒含有80多种基因，可替换其中之一(IE3)以产生HSV载体。产生缺失了许多立即早期基因产物的HSV载体可导致载体的毒性和抗原性降低且体内表达时间延长。但这些改变也导致较低的病毒产量。美国专利号5,661,033中描述了HSV载体的构建。
3.逆转录病毒载体对缺陷的逆转录病毒为用于基因治疗目的而在基因转移中的用途进行了充分描述(Miller AD，血液(Blood)76，271-278 )。逆转录病毒科成员的特点在于在它们的毒粒中存在逆转录酶。在该科中包括一些属，包括Cisternavirus A、肿瘤病毒A、肿瘤病毒B、肿瘤病毒C、肿瘤病毒D、慢病毒和泡沫病毒。
重组逆转录病毒可通过将编码目标基因产物的核酸插入逆转录病毒基因组而构建。另外，可去除部分的逆转录病毒基因组，使逆转录病毒复制缺陷。然后将复制缺陷的逆转录病毒包装入毒粒，毒粒再通过标准技术使用辅助病毒可感染靶细胞。在“最新分子生物学方法(Current Protocols inMolecular Biology)，Ausubel，F.M.等(编辑)Greene Publishing Associates，(1989)，第9.10-9.14部分”和其它标准实验手册中可找到产生重组逆转录病毒的方法及用此类病毒体外或体内感染细胞的方法。合适的逆转录病毒载体的实例包括为本领域技术人员熟知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。合适的包装病毒细胞系的实例包括.psi.Crip、.psi.Cre、.psi.2和.psi.Am。
逆转录病毒已被用于在体内和/或体外将多种基因导入许多种不同的细胞类型，包括上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、成肌细胞、肝细胞及造血干细胞(美国专利号4,868,116；美国专利号5,449,614和美国专利号6,207,455)。逆转录病毒载体需要靶细胞分裂，以便整合入宿主细胞的基因组，从而将核酸稳定导入细胞。因此，刺激靶细胞复制是必需的。已报道了在间接体内法中用逆转录病毒载体对造血干细胞或祖细胞的成功转导。但重组逆转录病毒载体只能容纳约8kb至10kb的外源DNA。此包装容量也限制了它在DMD遗传治疗中的用途。
4.慢病毒载体慢病毒也属于逆转录病毒科，但它们可感染分裂及非分裂细胞。最为人们所知的慢病毒为人免疫缺陷病毒(HIV)，其已被灭活并被开发为用于体内基因递送的载体。像简单的逆转录病毒一样，HIV具有称为gag、pol和env的三种基因，它也携带有六种辅助蛋白的基因，称为tat、rev、vpr、vpu、nef和vif。用逆转录病毒载体作为样板，已制备了慢病毒载体，其中转基因位于LTRs和包装序列之间(Naldni等，科学(Science)272，263-267 )。可去除部分的辅助蛋白同时不影响载体的产生或感染效率。
当慢病毒载体注射入啮齿动物脑、肝脏、肌肉、眼或胰岛细胞时，它们可持续表达六个月以上。人们对与慢病毒载体相关的可能存在的免疫问题知之甚少。而且似乎没有强的抗体反应。关于慢病毒载体的主要担心是它在人类应用时的安全性。但是最近对在病毒基因中具更多缺失以及安全性改善的第三代慢病毒载体的研发使得慢病毒载体可广泛用于体内基因治疗。
5.腺伴随病毒(AAV)载体AAV是一种天然存在的缺陷病毒，它需要另一种病毒如腺病毒或疱疹病毒作为有效复制和生产性生活周期的辅助病毒(Muzyczka等，微生物学和免疫学的最新专题(Curr.Topics in Micro.and Immunol.)158，97-129 )。AAV载体是仅有的一种基于非致病的且复制缺陷病毒的病毒载体体系。它也是少有的几种可将其DNA整合入非分裂细胞并表现高频率稳定整合的病毒之一(Flotte等，美国呼吸细胞分子生物学杂志(Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.)7，349-356 ；Samulski等，病毒学杂志63，3822-3828 )。可包装含有小至300个碱基对的AAVDNA的载体。
AAV载体已成功地用于在体内大量的组织中建立高效和长期的基因表达，且无明显的免疫反应或毒性(Xiao等，病毒学杂志70，8098-108 ；Kessler等，美国国家科学院院报93，14082-7 ；Xiao等，病毒学杂志72，10222-6 )。不像其它的病毒载体，AAV因其具有小的病毒颗粒大小(20nm)而易于越过胞外屏障，它有利于对不同成熟期肌纤维进行有效转导(Pruchnic等，人类基因治疗11，521-36 )。AAV也可通过血管递送至大量的肌肉群(Greelish等，自然医学5，439-443 )。空前的高效和安全性导致人们对AAV介导的遗传性肌肉疾病和代谢性疾病的基因治疗的兴趣增加。而AAV载体应用的主要障碍在于它有限的包装容量，其仅可包装小于4.7kb的基因(Song等，美国国家科学院院报95，14384-8 ；Kay等，自然遗传学(Nat Genet)24，257-261 )，因而排除了像抗肌萎缩蛋白那样具有14kb cDNA的大基因。
可用于本发明的其它病毒载体体系来自痘苗病毒(Chen等，免疫治疗杂志(J Immunother)24，46-57 )以及一些RNA病毒。正在研发将正链RNA病毒科如脊髓灰质炎病毒(Bledsoe等，自然生物技术(NatBiotechnol.)18，964-9 )、肝炎病毒A(Romano G.干细胞(StemCells)18，19-39 )和辛德毕斯病毒(Wahlfors等，基因治疗(GeneTher)7，472-80 )在病毒感染后或用非病毒体系递送核酸后，用于高水平的基因表达。这些病毒表达可特异性复制病毒RNA的复制酶蛋白质。通过插入转基因而取代病毒的衣壳基因，可产生在细胞中自主复制的嵌合RNA，并从RNA的正编码链高水平表达蛋白质。这些病毒载体非常适用于免疫策略，后者需要高的、瞬时基因表达，以诱导对被转导细胞的免疫反应。
除了病毒基因转移载体外，在过去的几年中，有效的非病毒基因转移载体也变得可临床应用(Ropert等，巴西医学生物学研究杂志(Braz J MedBiol Res.)32，163-9 ；Lee RJ等，治疗用药物载体体系的关键性评论(Crit Rev Ther Drug Carrier Syst)14，173-206 )。这些载体依赖哺乳动物细胞使用的大分子摄入和胞内转运的正常机制来将遗传物质递送入细胞。这些载体包括阳离子和其它脂质体、DNA-病毒结合物、RNA/DNA寡核苷酸以及令人吃惊地为裸DNA分子。物理方法如基于流体力学和基于电穿孔的方法已用于提高一些非病毒载体的基因转移效率(Zhang G等，基因治疗7，1344-9 ；Yamashita等，癌研究(Cancer Res.)61，1005-12 )。最近，也报道了用与人免疫缺陷病毒TAT蛋白质的蛋白转导结构域融合的β-半乳糖苷酶腹膜内注射导致该融合蛋白质递送至小鼠的所有组织(Schwarze等，科学3，1569-1572 )。
已尝试了用携带抗肌萎缩蛋白基因的非病毒载体进行体细胞基因转移[Acsadi等，自然352，815-818 ；Rando等，美国国家科学院院报97，5363-5368 ]。所获得的转基因表达只有非常有限的效率。
以前对产生较全长抗肌萎缩蛋白的1/2短的抗肌萎缩蛋白小基因的尝试未能保留基本的保护功能。Cox等和Greenberg等报道了在抗肌萎缩蛋白缺陷mdx小鼠的骨骼肌中Dp71的表达使其恢复了正常水平的抗肌萎缩蛋白相关蛋白(DAPs)，其中所述Dp71为抗肌萎缩蛋白基因的一种71kD非肌肉产物，其由抗肌萎缩蛋白的富含半胱氨酸和C-末端结构域(外显子63-79)组成。但是Dp71的表达不能减轻肌肉退化的症状[Cox等，自然遗传学8，333-339 ；Greenburg等，自然遗传学8，340-344 ]。同样地，Yuasa等(Yuasa等，欧洲生物化学会联合会快报(FEBS Lett)425，329-336 ；Yamamoto等，人类基因治疗11，669-80 )显示在小鼠骨骼肌中具有完整N-和C-末端结构域以及1至3中央棒状重复序列的抗肌萎缩蛋白小基因的表达足以恢复DAP复合体，但不足以恢复肌纤维形态和防止营养不良的病理现象。
图2a示出了用构建体AAV-MCK-Δ3849或AAV-MCK-Δ3990处理后第3个月对mdx小鼠的腓肠肌中抗肌萎缩蛋白和DAP复合体的免疫荧光(IF)分析。
图2b示出了对来自15周龄正常C57/B10小鼠、来自用载体AAV-MCK-Δ3849、AAV-MCK-Δ3990或AAV-MCK-Δ4173处理的mdx小鼠或来自未处理的mdx小鼠的腓肠肌中抗肌萎缩蛋白和DAP复合体的IF分析。
图3a示出了用AAV-MCKΔ3849处理10日龄mdx小鼠，小抗肌萎缩蛋白的表达。动物在病毒感染后的6个月处死。
图3b示出了在未处理的6月龄mdx小鼠中抗肌萎缩蛋白的表达。
图3c示出了用AAV-MCKΔ3849处理成年mdx小鼠，小抗肌萎缩蛋白的表达。动物在病毒感染后的2个月处死。
图3d示出了用AAV-MCKΔ3990处理成年mdx小鼠，小抗肌萎缩蛋白的表达。动物在病毒感染后的2个月处死。
图3e示出了用AAV-MCKΔ3849处理成年mdx小鼠，小抗肌萎缩蛋白的表达。动物在病毒感染后的4个月处死。
图3f示出了用AAV-MCKΔ3990处理成年mdx小鼠，小抗肌萎缩蛋白的表达。动物在病毒感染后的4个月处死。
图3g示出了用AAV-MCKΔ3849处理成年mdx小鼠，小抗肌萎缩蛋白的表达。动物在病毒感染后的6个月处死。
图3h示出了用AAV-MCKΔ3990处理成年mdx小鼠，小抗肌萎缩蛋白的表达。动物在病毒感染后的6个月处死。
图4a示出了处理10日龄mdx小鼠，抗肌萎缩蛋白小基因对肌肉质膜完整性的保护。
图4b示出了处理成年mdx小鼠，抗肌萎缩蛋白小基因对肌肉质膜完整性的保护。
图5a示出了含有两个棒(棒1和棒24，见

图1)的构建体Δ2796的小抗肌萎缩蛋白表达的IF分析。注意在它注入年幼的mdx小鼠后肌细胞形态学和中央成核现象未改善。
图5b示出了来自含有一个棒(棒1和棒24的杂合棒，见图1和Yuasa等)的构建体CMV-M3的小抗肌萎缩蛋白表达的IF分析。注意在它注入年幼的mdx小鼠后肌细胞形态学和中央成核现象未改善。
图6示出了在AAV-MCK-Δ3990载体注射入成年mdx小鼠的TA肌后，肌肉力量的改善。对未处理的mdx TA肌(n＝8)进行10个循环的拉长活化后，只有23％的力输出保留，而AAV处理的mdx TA肌(n＝8)具有近40％的力输出保留。
发明详述及优选的实施方案除非另外指出，本发明的操作规程采用本领域内组织学、病毒学、微生物学、免疫学和分子生物学的常规方法进行。此类技术在文献中有充分解释。上文或下文中引用的所有出版物、专利和专利申请全部并入作为本文的参考。
如在本说明书和所附的权利要求书中所用，单数形式的″a″、″an″和″the″包括复数形式，除非内容明确指出并非如此。
A.定义在描述本发明时，将用到以下一些术语，下面将对这些术语进行定义。
“基因转移”或“基因递送”指的是可靠地将特定的核苷酸序列(如DNA)导入靶细胞的方法或体系。导入的核苷酸序列在体内可以游离形式存在，或整合入靶细胞的基因组中。基因转移提供了一种治疗获得性疾病和遗传性疾病的独特方法，本领域已开发了许多体系用于将基因转移入哺乳动物细胞。参见例如美国专利号5,399,346。
如此处所用，术语“有效量”指的是通过本发明的方法，在所感染的器官或组织至少可引起部分所希望的治疗或预防效果的感染水平。这样用有效量的携带目标遗传物质的载体感染可导致用本发明方法感染的器官或组织中细胞活性的改变(如表型改变)。在一个优选的实施方案中，用有效量的携带目标遗传物质的载体感染导致了受感染器官或组织的显著量的细胞中细胞活性的改变。
基因转移“载体”指的是可将基因序列转移入细胞的任一介质，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、脂质体、DNA-病毒结合物、RNA/DNA寡核苷酸、病毒、细菌等。这样，该术语包括克隆载体和表达载体，以及病毒载体和非病毒载体。通过将靶分子连接至载体，可使载体靶向特异的细胞。靶分子是对目标细胞或组织类型具特异性的任一介质，包括如配体、抗体、糖、受体或其它结合分子。本发明也包括起同等作用以及今后为本领域所知的此类其它载体形式。
“AAV载体”指来自一种腺伴随病毒血清型的载体以及来自多于一种AAV血清型的载体(杂合AAV载体)，其中所述腺伴随病毒血清型包括人AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、禽AAV、绵羊AAV等。例如，杂合AAV载体可包括来自AAV-1和AAV-2的DNA序列。AAV载体可为将一种或多种AAV野生型基因优选地为rep和/或cap基因全部或部分删除，但保留了功能性的侧翼ITR序列。AAV载体可通过本领域公知的重组技术构建，以包含一段或多段在两端(5’和3’)侧翼具有功能性AAV ITRs的异源核苷酸序列。在操作本发明时，AAV载体可包括位于异源核苷酸序列上游的至少一个AAV ITR和一个合适的启动子序列，以及位于异源序列下游的至少一个AAV ITR。
“重组AAV载体质粒”指一类重组AAV载体，其中载体包含质粒。它通常和AAV载体一样，5’和3’ITRs在所选择的异源核苷酸序列侧翼。AAV载体也可包含转录序列(如聚腺苷酸化位点)和选择性标记基因和报告基因、增强子序列，以及其它诱导转录的调控元件。这些控制元件将在下面更充分地描述。另外，“AAV载体”可被稳定导入一株或多株细胞系以产生病毒颗粒。这样的细胞系通常被称为AAV包装细胞系。
在此用到的术语“重组AAV”、“重组AAV颗粒”或“重组AAV毒粒”定义为感染性的复制缺陷病毒，它由AAV蛋白外壳包裹(即外被以蛋白衣壳)一段异源核苷酸序列组成，该序列5’和3’侧翼同样也为AAV ITRs。关于这一点，单链AAV核酸分子(不论是有义/编码链还是反义/反编码链，如它们通常被定义的那样)可被包装入AAV毒粒；有义链和反义链同样具有感染性。当重组AAV DNA等于或小于病毒基因组全长的50％(约5,000个核苷酸)时，它能以双链发夹状DNA的形式包装入AAV毒粒。这样的颗粒也完全具有感染性。
术语“重组AAV颗粒”或“重组AAV毒粒”也指这样的杂合AAV颗粒，其中AAV蛋白外壳和被包裹的核苷酸序列可来自不同血清型的AAV。例如，杂合AAV颗粒可含有AAV-1衣壳蛋白和AAV-2 ITRs，或者反之亦然。也可用来自两种或更多的AAV衣壳蛋白基因编码序列来产生杂合的AAV衣壳蛋白。另外，通过氨基酸序列的突变、缺失和/或插入可对重组AAV的衣壳蛋白进行操作，以改变重组AAV的向性(Wu等，病毒学杂志74，8635-47 ；Girod等，自然医学5，1052-1056 )。
一些构建重组AAV的技术为本领域所公知。参见例如美国专利号5,173,414，Lebkowski等，分子细胞生物学(Mol Cell Biol)8，3988-3996 ；Carter BJ，生物技术中的最新观点(Current Opinion inBiotechnology)3，533-539 ；Muzyczka N，同上；和Zhou等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)179，1867-1875 ；Xiao等，病毒学杂志72，2224-32 。
术语“表达调控元件”或“调节元件”总起来说是指启动子序列、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等，它们在受体细胞中共同提供编码序列的复制、转录和翻译。只要所选的编码序列在合适的宿主细胞中能够被复制、转录和翻译，就并不总是需要存在所有的这些调控元件。这里用到的术语“启动子”通常指的是能够被RNA聚合酶识别、结合并起始转录的一段DNA调控序列。另外，启动子包含调节RNA聚合酶识别、结合和转录起始活性的序列。此类序列可为顺式作用序列或可对反式作用因子起反应。依据启动子的调节特性，它们可为组成型或调节型启动子。启动子的实例有SP6、T4、T7、SV40早期启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、小鼠乳房瘤病毒(MMTV)类固醇诱导的启动子、莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、肌球蛋白启动子、α-肌动蛋白启动子等。另外，以上启动子的经修饰变体以及甚至合成的肌肉启动子(Li等，自然生物技术17,241-245， )也包括在内。最后，启动子也可以是内源AAV启动子或AAV末端反向重复序列(ITR)。
术语“转导”指在体内或体外用复制缺陷病毒载体，如用重组AAV毒粒，将DNA分子递送入受体细胞。
术语“肌细胞”或“组织”指来自肌肉的细胞或细胞群，它包括但不限于来自骨骼肌、心肌、平滑肌(如来自消化道、膀胱和血管)的细胞或组织。本术语包括体外和体内的肌细胞。因此，例如分离的心肌细胞构成本发明的“肌细胞”，存在于受试对象体内肌肉组织中的肌细胞也构成本发明的“肌细胞”。本术语也包括分化及未分化肌细胞，如肌原细胞、肌管、成肌细胞、心肌细胞、成心肌细胞和祖细胞，其中所述祖细胞如经分化后可成为肌细胞的肌源性干细胞或骨髓源性干细胞。
“可操作地连接”指的是元件的排列，其中所描述的组分以行使它们通常功能的方式排列。因此可操作地连接至编码序列的调控元件能影响编码序列的表达。调控元件不必与编码序列相邻，只要这些调控元件能起到指导编码序列表达的作用即可。这样，例如在启动子序列和编码序列之间可存在插入的不被翻译但可转录的序列，且仍认为启动子序列为“可操作地连接”至编码序列。
术语“抗肌萎缩蛋白小基因”是指大范围删除了人类抗肌萎缩蛋白cDNA中央棒状结构域和大范围删除了C-末端结构域而产生的新抗肌萎缩蛋白构建体。此外，抗肌萎缩蛋白小基因可包含改变的N-末端结构域，其中原始的蛋白质翻译起始密码子ATG周围的DNA序列被改变。这些改变的序列可增强小抗肌萎缩蛋白的合成。另外，抗肌萎缩蛋白小基因也可为杂合基因，其中一些结构域被来自utrophin或血影蛋白基因的同源结构域替代(Tinsley等，自然360，591-593 ；Koenig等，细胞(Cell)53，219-216 )。尤其是utrophin与抗肌萎缩蛋白在结构和功能上是高度同源的，因此它们的主要结构域应该是可以互换的(Tinsley等，自然384，349-353 ；Deconinck等，自然医学3，1216-21 ；Rafael等，自然遗传学19，79-82 )。例如，在抗肌萎缩蛋白小基因中，抗肌萎缩蛋白的N-末端和/或C-末端结构域可被utrophin的相应部分替代。同样地，其中央棒状结构域可由来自utrophin或血影蛋白基因的棒状重复序列组成。抗肌萎缩蛋白小基因小于AAV病毒载体的5kb包装极限。另外，使用与本发明所描述的构建抗肌萎缩蛋白小基因的类似方式来构建utrophin小基因也成为可能。因为一些DMD患者完全缺乏抗肌萎缩蛋白，故抗肌萎缩蛋白小基因的产物也可能为一种新抗原。将抗肌萎缩蛋白的结构域用utrophin的那些结构域替换可降低免疫应答。
术语“小抗肌萎缩蛋白”指由抗肌萎缩蛋白小基因编码的多肽。最重要的是，小抗肌萎缩蛋白具有使肌肉免于发生营养不良的病理现象和症状的生物学功能。
符号“Δ”(δ)是包含有上述缺失的抗肌萎缩蛋白小基因的前缀。
“哺乳动物受试对象”指哺乳动物纲的任何成员，包括但不限于人类和非人类的灵长目动物(如黑猩猩)和其它类人猿和猴；农场动物如牛、绵羊、猪、山羊和马；驯养的哺乳动物如狗和猫；实验动物包括啮齿类动物如小鼠、大鼠和豚鼠等。本术语不指具体的年龄和性别。这样，不论是雄性的还是雌性的成年、新生及胎儿受试对象都含盖在其中了。
术语“表达盒”指的是遗传物质构建体，它包含编码序列和足够的在受体细胞中指导编码序列正确转录和翻译的调控信息。
B.发明详述为了探究用病毒载体作为DMD基因治疗的可行性，我们设计了产生新抗肌萎缩蛋白小基因的策略，其中所述抗肌萎缩蛋白小基因足够小，以至于可被包装入逆转录病毒或AAV载体，且仍保留了保护肌肉免于病理症状所需的基本功能。我们已产生了这样的小基因，其删除了高达75％的中央棒状结构域(24个棒中的20个；4个铰合部中的2个)以及几乎所有的C-末端结构域(外显子71-78)(图1)。这些新抗肌萎缩蛋白小基因只有11kb全长抗肌萎缩蛋白编码序列的三分之一(1/3)，明显小于广泛用于mdx小鼠的转基因和基因治疗研究的6.3kb贝克-型小抗肌萎缩蛋白基因(England等，自然343，180-2 )。该小基因包含抗肌萎缩蛋白基因的N-末端序列、抗肌萎缩蛋白基因的C-末端富含半胱氨酸(CR)结构域、抗肌萎缩蛋白基因的至少H1和H4以及至少4个棒状重复序列。棒状重复序列可选自抗肌萎缩蛋白、utrophin或血影蛋白基因的棒状重复序列，优选地选自抗肌萎缩蛋白基因的24个棒状重复序列，且最优选地选自抗肌萎缩蛋白基因的R1、R2、R3、R22、R23和R24棒状重复序列。可改变抗肌萎缩蛋白小基因的N-末端，以提高表达效率且不影响基因产物的功能。例如原来在抗肌萎缩蛋白基因翻译起始ATG密码子周围的序列可用Kozak序列替换，以增加蛋白质合成的效率。在本发明的一个实施方案中，在编码序列上游的三个核苷酸可由“AAA”变为“CCA”且编码序列中的第四个核苷酸可由“C”变为“G”。此外N-末端的一部分或全部可由utrophin基因的对应部分替换。同样，抗肌萎缩蛋白小基因的CR结构域也可用utrophin基因的对应部分替换。
可用多种方法将抗肌萎缩蛋白小基因导入哺乳动物受试对象。可用或不用基于流体动力学的方法或基于电穿孔的方法，将在表达盒中的该基因以裸DNA形式导入受试对象。可用非病毒载体如脂质体或病毒-脂质体复合体，或用病毒载体如腺病毒、HSV、杆状病毒、逆转录病毒、慢病毒且优选地用AAV，将该基因导入受试对象。抗肌萎缩蛋白小基因的表达可受一系列调控元件的调控，后者包括但不限于AAV末端反向重复序列(ITR)、逆转录病毒长末端重复序列(LTR)、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子和/或增强子、CMV增强子和小鸡β-肌动蛋白启动子(CB启动子)、α-肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、肌肉特异的肌酸激酶(MCK)启动子和/或增强子等。另外，也可使用上述启动子的修饰变体和合成的肌肉启动子(Li等，同上)等。
可用免疫荧光染色和免疫印迹(Western印迹)来检测抗肌萎缩蛋白小基因的表达。该小抗肌萎缩蛋白的功能可通过测定小抗肌萎缩蛋白是否可在肌纤维质膜上恢复失去的DAP复合体(包括肌聚糖复合体)来检测，其中所述肌聚糖复合体在未经治疗的由于原发性抗肌萎缩蛋白缺陷而引起的营养不良肌肉中未发现。为了进一步研究新的小抗肌萎缩蛋白的功能，必须证实它们可保护肌肉免于病理表型。在mdx小鼠中病理变化开始于大约三周龄时，此时出现明显的肌纤维的退化/再生。此过程的特点在于在肌纤维中出现中央核，这是肌营养不良的初级病理征象。基因治疗后中央成核现象的消失或减少说明治疗是成功的。肌纤维中核的位置可由DAPI染色或H&E染色确定。
可用来自Vector Laboratories(Burlingame，CA)的Mouse-on-MouseKit，除了冷冻切片可立即用封闭缓冲液处理而无需固定步骤外，按照厂商提供的方法对厚度为8μm的肌肉冷冻切片进行免疫荧光染色，(Li等，基因治疗(Gene Ther)6，74-82 )。抗肌萎缩蛋白的单克隆抗体(NCL-Dys3和NCL-Dys2)和抗α-、β-和γ-肌聚糖的单克隆抗体(NCL-α-SARC，NCL-β-SARC和NCL-γ-SARC)可购自Novocastra LaboratoriesLtd(Burlingame，CA)。肌细胞核可用0.01％DAPI(Sigma，St.Louis，MO)复染10分钟。用Nikon TE-300荧光显微镜照相。
在营养不良的肌肉中，质膜的损伤和渗漏是其主要的生理缺陷，也是主要的病理原因。为了判断AAV小抗肌萎缩蛋白治疗是否可以有效地保护质膜免受机械损害，通过静脉内注射伊文氏蓝染料进行肌纤维膜完整性试验。伊文氏蓝是一种广泛用于活体的红色荧光染料，它可被正常肌纤维排除，但可被由于收缩性受损而含有营养不良肌纤维的渗漏细胞膜摄入。以前对mdx小鼠的研究揭示凋亡肌核主要在伊文氏蓝染色阳性的肌纤维中找到，因此质膜渗漏和肌细胞凋亡相关(Matsuda等，生物化学杂志(JBiochem)(东京)118，959-64 )。
可将伊文氏蓝染料(10mg/ml，PBS配制)以0.1mg/g体重注射入C57/B10小鼠、mdx小鼠和AAV载体处理的mdx小鼠尾静脉。染料注射后，使得小鼠继续游泳20分钟。伊文氏蓝注射后15小时，收集肌肉并冷冻切片。可在荧光显微镜下用罗丹明滤光片观察伊文氏蓝染色阳性的肌纤维。
对用含抗肌萎缩蛋白小基因的AAV载体处理后mdx小鼠肌收缩力的改善进行了评估。向2至3月龄的mdx小鼠胫骨前(TA)肌肉注射AAV-MCK-3990载体。注射方式为处理同一动物的一条腿，而另一条腿不处理。后者用作对照。AAV处理后6个月，mdx小鼠用戊巴比妥钠麻醉(70mg/kg，i.p.)，并移去所有的TA肌，将TA肌置于直立组织室内用于体外进行力测量。肌肉用阴极电流的单相位矩形脉冲(持续1.0-ms)刺激(Grassmodel S-88刺激器和电流增幅器)。用递送持续500ms的75pps刺激频率来评估最大僵直力(P0)。测定P0后，测定TA肌在反复的拉长活化期间(这会诱发对肌肉的最大损伤)持续力产生的能力。在拉长前测定的最大力称为PISO。接下来，以1.0L0/s的恒速将肌肉从100拉长至110％L0。刺激训练每2分钟重复一次(工作负载循环为0.004)，共进行10个循环。PISO的改变用于指示与由拉长活化造成的损伤相关的肌肉功能损伤。
C.优选的实施方案下列实施例仅用于例示一些实施方案，而并不用于限制本权利要求的范围，权利要求的范围只受本说明的限制。
实施例1抗肌萎缩蛋白小基因和携带该小基因的AAV载体本实施例描述了高度截短的抗肌萎缩蛋白小基因和携带该小基因的AAV载体的构建。该抗肌萎缩蛋白小基因构建体主要通过PCR克隆法制备，PCR克隆法使用了Pfu聚合酶(Stratagene，CA)并以人抗肌萎缩蛋白cDNA(GenBank#NM 004006)作为模板。为了一致，核苷酸的编号只包括11,058bp抗肌萎缩蛋白的蛋白质编码序列(SEQ ID NO1)。
如在图1中所描述的那样，抗肌萎缩蛋白小基因Δ4173(SEQ ID NO2)包含核苷酸1-1992(N-末端，铰合部H1以及棒R1、R2和R3，SEQ ID NO3)和8059-10227(棒R22、R23和R24，铰合部H4以及CR结构域，SEQ IDNO4)和11047-11058(抗肌萎缩蛋白的最后3个氨基酸，SEQ ID NO5)。
抗肌萎缩蛋白小基因Δ3990(SEQ ID NO6)包含核苷酸1-1668(N-末端，铰合部H1以及棒R1和R2，SEQ ID NO7)、7270-7410(铰合部H3，SEQ ID NO8)、8059-10227(棒R22、R23和R24，铰合部H4和CR结构域，SEQ ID NO4)和11047-11058(抗肌萎缩蛋白的最后3个氨基酸，SEQID NO5)。
抗肌萎缩蛋白小基因Δ3849(SEQ ID NO9)包含核苷酸1-1668(N-末端，铰合部H1以及棒R1和R2，SEQ ID NO7)、8059-10227(棒R22、R23和R24，铰合部H4和CR结构域，SEQ ID NO4)和11047-11058(抗肌萎缩蛋白的最后3个氨基酸，SEQ ID NO5)。
抗肌萎缩蛋白小基因Δ3531(SEQ ID NO10)包含核苷酸1-1341(N-末端，铰合部H1和棒R1，SEQ ID NO11)、8059-10277 (棒R22、R23和R24，铰合部H4和CR结构域，SEQ ID NO4)和11047-11058(抗肌萎缩蛋白的最后3个氨基酸，SEQ ID NO5)。
抗肌萎缩蛋白小基因Δ3510(SEQ ID NO12)包含核苷酸1-1668(N-末端，铰合部H1和棒R1和R2，SEQ ID NO7)、8407-10277(棒R23和R24，铰合部H4和CR结构域，SEQ ID NO13)和11047-11058(抗肌萎缩蛋白的最后3个氨基酸，SEQ ID NO5)。
抗肌萎缩蛋白小基因Δ3447(SEQ ID NO14)包含核苷酸1-1992(N-末端，铰合部H1以及棒R1、R2和R3，SEQ ID N03)、8794-10277(棒R24，铰合部H4和CR结构域，SEQ ID NO15)和11047-11058(抗肌萎缩蛋白的最后3个氨基酸，SEQ ID NO5)。
通过平末端连接Pfu扩增的每一单独片段的PCR产物而制备上述构建体，这样所有的蛋白质编码序列被一起精确地剪接在一个框架内。反应中用到的PCR引物列在表1中
表1抗肌萎缩蛋白片段的克隆中所用的PCR引物引物名称 引物序列(5′-3′) 序列位置正向引物F1(ATG-A)ATTTTCACCATGGTTTGGTGGGAAGAAG 1-19(28bp) SEQ ID NO16F2(H3-1) CAGCCTGACCTAGCTCCTGGACTGA 7270-7294(25bp) SEQ ID NO17F3(R22-1)ACTCATAGATTACTGCAACAGTTCC 8059-8083(25bp) SEQ ID NO18F4(R23-1)AGTTCTGACCAGTGGAAGCG 8407-8427(20bp) SEQ ID NO19F5(R24-1)ACCCTTGAAAGACTCCAGGAAC 8794-8816(22bp) SEQ ID NO20反向引物R1(R1-2) TCTATGTAAATTGCTTTGTT 1341-1361(20bp) SEQ ID NO21R2(R2-2) GTAAAAGAACCCAGCGGTCT 1668-1644(25bp) SEQ ID NO22R3(R3-2) CTGTGCTGTACTCTTTTCAAGTTTT 1992-1968(25bp) SEQ ID NO23R4(H3-2) AGGTACCTCCAACATCAAGGAAGAT 7410-7386(25bp) SEQ ID NO24R5(Tail-2A) CTACATTGTGTCGGGAGTTTCCATGTTGTC 11058-11047 SEQ ID NO2510227-10210(30bp)然后将抗肌萎缩蛋白小基因亚克隆入包含一个MCK启动子、一个来自质粒p(+enh206)358MCKCAT的595bp Hind III/BstE II片段(Shield等，分子细胞生物学(Mol Cell Biol)16，5058-68 )和一个60bp小polyA信号序列的AAV载体质粒(SEQ ID NO26)，产生AAV载体构建体AAV-MCK-Δ4173(SEQ ID NO27)，AAV-MCK-Δ3990(SEQ ID NO28)，AAV-MCK-Δ3849(SEQ ID NO29)，AAV-MCK-Δ3531(SEQ IDNO30)，AAV-MCK-Δ3510(SEQ ID NO31)和AAV-MCK-3447(SEQID NO32)。
同样，也可将抗肌萎缩蛋白小基因克隆入包含一个CMV启动子(620bp)和小polyA信号序列的AAV载体质粒(SEQ ID NO33)，产生AAV载体构建体AAV-CMV-Δ3990(SEQ ID NO34)，AAV-CMV-Δ3849(SEQID NO35)。此外，将抗肌萎缩蛋白小基因Δ3849克隆入包含一个MCK增强子、一个CMV启动子和小polyA信号序列的AAV载体质粒，产生AAV载体构建体AAV-E-CMV-Δ3849(SEQ ID NO36)。
按照Xiao等人所描述的三质粒共转染法精确产生重组病毒载体原液(引用同上)。接下来用以前公开的方法经CsCl密度梯度超速离心纯化AAV病毒载体两次(Snyder等，人类遗传学最新方法(Current Protocols inHuman Genetics)，编辑Dracopoli等[John Wiley & Sons Ltd.，纽约]，12.1.1-12.2.23页 )。病毒颗粒数的载体滴度通过DNA斑点印迹法测定(Snyder等，引用同上)，每毫升约有5×1012个基因组拷贝(GC)。
实施例2DAP复合体的恢复本实施例描述了抗肌萎缩蛋白小基因产物能否仍保留其主要的生物化学功能，其中所述主要的生物化学功能包括膜下定位和与抗肌萎缩蛋白相关蛋白(DAP)复合体的相互作用。健康C57/B10小鼠和营养不良mdx小鼠购自The Jackson Laboratory(Bar Harbor，Maine)。将50μl(5×1010GC)不同的AAV小抗肌萎缩蛋白载体注入十日龄mdx幼鼠或50日龄mdx成鼠后腿腓肠肌。
在载体注射后第3月和第6月时，收集肌肉以评估小抗肌萎缩蛋白的表达和DAP复合体的生物化学恢复情况，其中所述DAP复合体由于抗肌萎缩蛋白的原发性缺陷而缺失。对AAV处理肌肉的薄切片上用人抗肌萎缩蛋白特异性抗体(Dys3)进行IF染色，在大多数肌纤维中显示出广泛的载体转导以及小抗肌萎缩蛋白的正确膜下定位，尤其在用含有抗肌萎缩蛋白小基因Δ3849或Δ3990的AAV载体处理的肌肉中(图2a和2b；图3a)。如所预期的那样，当用能够识别小鼠和人抗肌萎缩蛋白C-末端区域的抗体(Dys2)对年龄相当的健康C57/B10小鼠的相应肌肉进行染色时，显示出难区分的抗肌萎缩蛋白染色模式(图2b)。如所预期的那样，该抗体(Dys2)不能对AAV处理的mdx肌肉染色，因为我们的抗肌萎缩蛋白小基因缺乏C-末端区域(数据未显示)。这个结果进一步证明了小抗肌萎缩蛋白是来自AAV载体的。相一致的是，除了极少数发生体细胞回复突变的肌纤维可被Dys2抗体识别外，未处理的mdx对照肌肉显示无抗肌萎缩蛋白染色(图2b)。而且，用AAV小抗肌萎缩蛋白载体注射成年mdx肌肉(腓肠肌)，在注射AAV MCK载体后第2月和第4月(图3c-3f)或注射AAV CMV载体后第6月(图3g和3h)检查抗肌萎缩蛋白表达时，显示出相似的结果。重要的是，没有针对持续表达来自AAV载体的人源性小抗肌萎缩蛋白的肌纤维进行损害的细胞毒T淋巴细胞(CTL)，无论这些AAV载体是由CMV启动子驱动的，还是由肌肉特异性的MCK启动子驱动的。
分别用抗α，β和γ肌聚糖的三种抗体进行免疫荧光染色，在邻近于抗肌萎缩蛋白抗体染色处的所有连续薄切片中都显示阳性结果。这些结果为小抗肌萎缩蛋白的生物化学功能提供了证据，它们虽缺乏C-末端结构域但仍能与DAP复合体相互作用。
实施例3营养不良病理学的改善本实施例显示抗肌萎缩蛋白小基因产物可保护肌肉免于表现出营养不良的病理表型。mdx小鼠的病理现象开始于约三周龄时，表现为大量的肌纤维退化/再生。该过程的特点在于肌纤维中存在中央核，是肌肉营养不良的主要病理迹象。基因治疗后中央成核现象的消失或减少表明治疗是成功的。因此，我们最初选择对出现中央成核现象前的mdx幼鼠(10日龄)检测AAV抗肌萎缩蛋白构建体，以了解是否可预防肌肉的退化/再生。
在中央成核现象开始前用AAV小抗肌萎缩蛋白(包含多于两个棒状结构域)处理，处理后第3月和第6月时对mdx肌肉进行组织学检查，通过抗肌萎缩蛋白免疫染色和肌核DAPI复染，可观察到在小抗肌萎缩蛋白阳性的肌纤维中几乎全是(～98％)外周成核现象(图2a，图2b第一列，图3a和表2)。在载体处理的mdx肌肉中小抗肌萎缩蛋白的表达和中央成核现象之间的相互排斥恰好反映出正常肌肉中的情况(图2b和表2)。另外，小抗肌萎缩蛋白表达阳性的肌纤维也显示一致的肌纤维大小和多边形形状，与正常肌肉没有明显不同(图2a和2b)。相反，未处理的mdx肌肉显示出广泛的(75.4％)中央成核现象(表2)及其它营养不良的病理征象，包括肌纤维大小的广泛变异、圆形肌纤维和纤维化(图2b)。值得注意的是，用构建体Δ2796和M3(分别含2个棒和1个棒，见图1)处理的mdx肌肉除了小抗肌萎缩蛋白的IF染色阳性外显示出与未处理的mdx肌肉相同的形态，其中小抗肌萎缩蛋白的IF染色阳性在改善肌肉形态学、病理学及预防肌肉变性/再生和中央成核现象方面是没有作用的(图5a和5b，表2)。因此，用携带含有两个以上棒(见图1)的小基因的AAV载体处理营养不良肌肉可预防营养不良病理现象，并在小抗肌萎缩蛋白阳性区域中导致正常的组织学形态(包括外周成核现象、一致的肌纤维大小和无纤维化等)。这些结果明确地证明了在mdx幼鼠中由于新的小抗肌萎缩蛋白的治疗作用而使肌肉退化不存在。
我们随后在已发生了广泛退化/再生的成年mdx小鼠(45日龄)中对携带含两个以上棒的抗肌萎缩蛋白小基因的AAV载体进行测试，以了解是否能停止或逆转这些病理进程。在载体注射时，大多数(～75％)的肌纤维已经经历了退化/再生，并显示出中央成核现象。在AAV小抗肌萎缩蛋白注射后第2月、第4月和第6月时，观察到广泛的抗肌萎缩蛋白的表达，并且在抗肌萎缩蛋白阳性区域中出现正常的肌纤维形态和无纤维化(图3a和3b)。相反，未处理的mdx小鼠肌肉(图3b)或未成功进行载体基因转移的处理肌肉区则显示出进行性退化和纤维化。另外，在小抗肌萎缩蛋白阳性肌纤维中观察到中央成核现象的减少(从载体处理前的约75％到载体处理后的35～50％，见表2)。在健康小鼠的肌肉中也观察到了中央成核现象的部分逆转，其中所述健康小鼠的肌肉曾经历过如肌毒素处理的瞬时病理变化，大多数肌核仍保持中央定位(Martin等，肌神经(Muscle Nerve)11；588-96 )。在以携带全长抗肌萎缩蛋白cDNA的无功能腺病毒载体处理成年mdx肌肉后也观察到持续存在的中央成核现象。基于以上观察，我们新的小抗肌萎缩蛋白基因(含两个以上棒)在改善年幼和成年mdx肌肉营养不良的病理学方面显示出治疗效果。
实施例4保护肌纤维膜的完整性本实施例显示了含两个以上棒的小抗肌萎缩蛋白(见图1)能够保护肌纤维膜的完整性。最初，将伊文氏蓝注射入mdx小鼠的尾静脉，其中mdx小鼠在三个月前的幼年时间(10日龄)已用AAV载体处理。年龄相当的未处理mdx小鼠和健康C57/B10小鼠用作对照。使得小鼠不停游泳20分钟以诱生机械应力。然后收集肌肉，进行抗肌萎缩蛋白表达和伊文氏蓝染料摄入的检查。如所预料的，健康小鼠的肌肉在肌肉切片中表现出一致的抗肌萎缩蛋白染色且染料不被肌纤维摄取(见图4a，第一行)。AAV载体处理的肌肉表现出和健康肌肉一致的结果，因此抗肌萎缩蛋白的表达与伊文氏蓝染料的摄取之间相互排斥(见图4a，第二行到第四行)。染料摄取(红色荧光)仅仅出现在缺乏小抗肌萎缩蛋白表达的肌纤维中，位于未被AAV载体转导的区域中(见图4a，第二、三、四行)。相反，未处理的mdx肌肉显示出抗肌萎缩蛋白的缺乏和广泛的染料摄入(图4a，最下行)。更重要的是，以AAV小抗肌萎缩蛋白处理成年mdx肌肉，载体注射后2个月和6个月时进行分析，在保护肌纤维免于发生质膜渗漏方面也达到了类似结果(图4b)。这些结果明确地表明了，不论在mdx幼鼠还是在成年mdx小鼠，新的小抗肌萎缩蛋白都具有维护膜完整性和保护肌纤维免受机械损伤的生理功能。
表2.在幼年和成年mdx小鼠中AAV小抗肌萎缩蛋白基因转移动物*载体注射时注射后％抗肌萎缩蛋白和载体n的年龄的月份阳性纤维 ％中央核**mdx+Δ3510412天 3 35～80 1.06(68/6413)mdx+Δ3531412天 3 25～40 1.72(37/2140)mdx+Δ3849410天 3 56～88 1.02(72/7098)mdx+Δ3990410天 3 50～80 0.99(56/5652)mdx+Δ4173410天 3 15～25 0.93(26/2791)mdx+Δ3849410天 6 40～60 2.80(51/1824)mdx+Δ3990210天 6 35～45 2.30(34/1478)mdx+Δ3849250天 2 35～50 34.76(510/1467)mdx+Δ3990250天 2 35～4034.18(685/2004)mdx+Δ3849450天 4 20～2544.24(615/1390)mdx+Δ3990450天 4 20～3046.18(695/1505)C57/B10 4不注射 N/A 100 1.45(56/3860)mdx 4不注射 N/A ＜1 75.4(2382/3160)mdx+Δ2796412天 3 30～4572(3888/5400)mdx+M3810～12天 3 20～6581(5589/6900)注*未处理的对照mdx和C57/B10小鼠在实验结束时约三个月大。AAV载体由MCK启动子驱动。
**所有这些数据均收集自免疫荧光染色和DAPI复染后所拍摄的抗肌萎缩蛋白阳性肌纤维，除了具有广泛的中央成核现象和极少的抗肌萎缩蛋白阳性的未处理mdx小鼠外。
实施例5肌肉力量的恢复本实施例表明了在mdx小鼠中小抗肌萎缩蛋白可恢复肌肉力量。在用含抗肌萎缩蛋白小基因的AAV载体处理mdx小鼠后，对肌肉收缩力的提高进行了评估。将AAV-MCK-Δ3990载体注射入2～3月龄mdx小鼠的胫骨前(TA)肌肉。注射方式为处理同一动物的一条腿，而另一条腿不处理。后者用作对照。AAV处理后6个月时，以戊巴比妥钠(70mg/kg，i.p.)麻醉mdx鼠，移除整个TA肌，并将TA肌置于直立组织室内用于体外进行力测量。肌肉用阴极电流的单相位矩形脉冲(持续1.0-ms)刺激(Grass modelS-88刺激器和电流增幅器)。用递送持续500ms的75pps刺激频率来评估最大僵直力(P0)。测定P0后，测定TA肌在反复的拉长活化期间(这会诱发对肌肉的最大损伤)持续力产生的能力。在拉长前测定的最大力称为PISO。接下来，以1.0L0/s的恒速将肌肉从100拉长至110％L0。刺激训练每2分钟重复一次(工作负载循环为0.004)，共进行10个循环。PISO的改变用于指示与由拉长活化造成的损伤相关的肌肉功能损伤。如图6所示，在10个循环的拉长活化后，未处理的TA肌(n＝8)只有23％的力输出保留，而以AAV处理的TA肌(n＝8)具有近40％的力输出保留。该结果强有力地表明抗肌萎缩蛋白小基因能保护肌肉免于机械力引起的损伤，因此恢复了肌肉力量。
总之，这些实施例表明抗肌萎缩蛋白基因能成功地减少到其11kb全长编码序列的1/3，且无损于其保护肌肉免于营养不良类型的基本功能。另外，我们首次证明了携带新的人抗肌萎缩蛋白小基因的AAV载体的肌肉注射在哺乳动物模型中可产生有效的且长期的治疗作用。来自AAV载体的小抗肌萎缩蛋白的持续表达，以及明显缺乏针对表达人抗肌萎缩蛋白的肌纤维的CTL免疫反应，都使我们认识到了在营养不良的肌肉中生物化学的和生理学的缺陷能得到长期矫正。
实施例6逆转录病毒载体的构建和测试基于逆转录病毒的基因转移载体被广泛用于将转基因永久导入到体外培养的细胞中。这些靶细胞可以是稳定的细胞系，或是来自新分离的组织或骨髓的原代细胞培养物。部分原代细胞培养物可能包含有祖细胞或干细胞，如造血干细胞和肌源性干细胞。这些干细胞具有分化成成熟肌细胞即肌管和肌纤维的能力。因此，从由于抗肌萎缩蛋白基因突变所致抗肌萎缩蛋白缺乏的患者体内分离出干细胞，然后在体外经逆转录病毒载体感染干细胞将抗肌萎缩蛋白小基因进行基因转移可能是一种治疗肌营养不良的有效方法。为了检测逆转录病毒载体的可用性，我们将抗肌萎缩蛋白小基因Δ3990或Δ3849(PCR产物)克隆入逆转录病毒载体质粒pLNCX(Clontech，加利福尼亚，美国)的StuI位点。分别获得在CMV启动子控制下携带抗肌萎缩蛋白小基因Δ3990或Δ3849的两种逆转录病毒载体质粒。通过将载体质粒pLNCXΔ3990或pLNCXΔ3849转染入包装细胞系AmphoPack293(Clontech，加利福尼亚，美国)产生逆转录病毒载体颗粒。以上这些逆转录病毒颗粒用于感染从mdx小鼠肌组织中分离的成肌细胞。选择性药物G418用于杀死那些未被逆转录病毒载体感染的细胞，其中逆转录病毒载体携带Neor基因，可赋予G418抗性。含Δ3990或Δ3849小基因的G418抗性成肌细胞用含2％马血清的DMED培养基培养，诱导分化为肌管。这些分化的肌管用抗小基因蛋白产物的单克隆抗体(Dys-3)进行免疫荧光染色。大多数的肌管因抗肌萎缩蛋白小基因的表达而阳性染色，这说明小基因可通过逆转录病毒成功地导入肌祖细胞。此类逆转录病毒载体感染的祖细胞或干细胞可用于迪谢纳肌营养不良和贝克肌营养不良的间接体内基因治疗。
序列表<110>肖啸<120>编码抗肌萎缩蛋白小基因的DNA序列及其使用方法<130>DE1142<140><141><150>60/200,777<151>2000-04-28<160>36<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>11058<212>DNA<213>人<400>1atgctttggt gggaagaagt agaggactgt tatgaaagag aagatgttca aaagaaaaca 60ttcacaaaat gggtaaatgc acaattttct aagtttggga agcagcatat tgagaacctc 120ttcagtgacc tacaggatgg gaggcgcctc ctagacctcc tcgaaggcct gacagggcaa 180aaactgccaa aagaaaaagg atccacaaga gttcatgccc tgaacaatgt caacaaggca 240ctgcgggttt tgcagaacaa taatgttgat ttagtgaata ttggaagtac tgacatcgta 300gatggaaatc ataaactgac tcttggtttg atttggaata taatcctcca ctggcaggtc 360aaaaatgtaa tgaaaaatat catggctgga ttgcaaccaa ccaacagtga aaagattctc 420ctgagctggg tccgacaatc aactcgtaat tatccacagg ttaatgtaat caacttcacc 480accagctggt ctgatggcct ggctttgaat gctctcatcc atagtcatag gccagaccta 540tttgactgga atagtgtggt ttgccagcag tcagccacac aacgactgga acatgcattc 600aacatcgcca gatatcaatt aggcatagag aaactactcg atcctgaaga tgttgatacc 660acctatccag ataagaagtc catcttaatg tacatcacat cactcttcca agttttgcct 720caacaagtga gcattgaagc catccaggaa gtggaaatgt tgccaaggcc acctaaagtg 780actaaagaag aacattttca gttacatcat caaatgcact attctcaaca gatcacggtc 840agtctagcac agggatatga gagaacttct tcccctaagc ctcgattcaa gagctatgcc 900tacacacagg ctgcttatgt caccacctct gaccctacac ggagcccatt tccttcacag 960catttggaag ctcctgaaga caagtcattt ggcagttcat tgatggagag tgaagtaaac 1020ctggaccgtt atcaaacagc tttagaagaa gtattatcgt ggcttctttc tgctgaggac 1080acattgcaag cacaaggaga gatttctaat gatgtggaag tggtgaaaga ccagtttcat 1140actcatgagg ggtacatgat ggatttgaca gcccatcagg gccgggttgg taatattcta 1200caattgggaa gtaagctgat tggaacagga aaattatcag aagatgaaga aactgaagta 1260caagagcaga tgaatctcct aaattcaaga tgggaatgcc tcagggtagc tagcatggaa 1320aaacaaagca atttacatag agttttaatg gatctccaga atcagaaact gaaagagttg 1380aatgactggc taacaaaaac agaagaaaga acaaggaaaa tggaggaaga gcctcttgga 1440cctgatcttg aagacctaaa acgccaagta caacaacata aggtgcttca agaagatcta 1500gaacaagaac aagtcagggt caattctctc actcacatgg tggtggtagt tgatgaatct 1560agtggagatc acgcaactgc tgctttggaa gaacaactta aggtattggg agatcgatgg 1620gcaaacatct gtagatggac agaagaccgc tgggttcttt tacaagacat cctgctcaaa 1680tggcaacgtc ttactgaaga acagtgcctt tttagtgcat ggctttcaga aaaagaagat 1740gcagtgaaca agattcacac aactggcttt aagatcaaa atgaaatgtt atcaagtctt 1800caaaaactgg ccgttttaaa agcggatcta gaaaagaaaa agcaatccat gggcaaactg 1860tattcaatca aacaagatct tctttcaaca ctgaagaata agtcagtgac ccagaagacg 1920gaagcatggc tggataactt tgcccggtgt tgggataatt tagtccaaaa acttgaaaag 1980agtacagcac agatttcaca ggctgtcacc accactcagc catcactaac acagacaact 2040gtaatggaaa cagtaactac ggtgaccaca agggaacaga tcctggtaaa gcatgctcaa 2100gaggaacttc caccaccacc tccccaaaag aagaggcaga ttactgtgga ttctgaaatt 2160aggaaaaggt tggatgttga tataactgaa cttcacagct ggattactcg ctcagaagct 2220gtgttgcaga gtcctgaatt tgcaatcttt cggaaggaag gcaacttctc agacttaaaa 2280gaaaaagtca atgccataga gcgagaaaaa gctgagaagt tcagaaaact gcaagatgcc 2340agcagatcag gtcaggccct ggtggaacag atggtgaatg agggtgttaa tgcagatagc 2400atcaaacaag cctcagaaca actgaacagc cggtggatcg aattctgcca gttgctaagt 2460gagagactta actggctgga gtatcagaac aacatcatcg ctttctataa tcagctacaa 2520caattggagc agatgacaac tactgctgaa aactggttga aaatccaacc caccacccca 2580tcagagccaa cagcaattaa aagtcagtta aaaatttgta aggatgaagt caaccggcta 2640tcaggtcttc aacctcaaat tgaacgatta aaaattcaaa gcatagccct gaaagagaaa 2700ggacaaggac ccatgttcct ggatgcagac tttgtggcct ttacaaatca ttttaagcaa 2760gtcttttctg atgtgcaggc cagagagaaa gagctacaga caatttttga cactttgcca 2820ccaatgcgct atcaggagac catgagtgcc atcaggacat gggtccagca gtcagaaacc 2880aaactctcca tacctcaact tagtgtcacc gactatgaaa tcatggagca gagactcggg 2940gaattgcagg ctttacaaag ttctctgcaa gagcaacaaa gtggcctata ctatctcagc 3000accactgtga aagagatgtc gaagaaagcg ccctctgaaa ttagccggaa atatcaatca 3060gaatttgaag aaattgaggg acgctggaag aagctctcct cccagctggt tgagcattgt 3120caaaagctag aggagcaaat gaataaactc cgaaaaattc agaatcacat acaaaccctg 3180aagaaatgga tggctgaagt tgatgttttt ctgaaggagg aatggcctgc ccttggggat 3240tcagaaattc taaaaaagca gctgaaacag tgcagacttt tagtcagtga tattcagaca 3300attcagccca gtctaaacag tgtcaatgaa ggtgggcaga agataaagaa tgaagcagag 3360ccagagtttg cttcgagact tgagacagaa ctcaaagaac ttaacactca gtgggatcac 3420atgtgccaac aggtctatgc cagaaaggag gccttgaagg gaggtttgga gaaaactgta 3480agcctccaga aagatctatc agagatgcac gaatggatga cacaagctga agaagagtat 3540cttgagagag attttgaata taaaactcca gatgaattac agaaagcatt tgaagagatg 3600aagagagcta aagaagaggc ccaacaaaaa gaagcgaaag tgaaactcct tactgagtct 3660gtaaatagtg tcatagctca agctccacct gtagcacaag aggccttaaa aaaggaactt 3720gaaactctaa ccaccaacta ccagtggctc tgcactaggc tgaatgggaa atgcaagact 3780ttggaagaag tttgggcatg ttggcatgag ttattgtcat acttggagaa agcaaacaag 3840tggctaaatg aagtagaatt taaacttaaa accactgaaa acattcctgg cggagctgag 3900gaaatctctg aggtgctaga ttcacttgaa aatttgatgc gacattcaga ggataaccca 3960aatcagattc gcatattggc acagacccta acagatggcg gagtcatgga tgagctaatc 4020aatgaggaac ttgagacatt taattctcgt tggagggaac tacatgaaga ggctgtaagg 4080aggcaaaagt tgcttgaaca gagcatccag tctgcccagg agactgaaaa ttccttacac 4140ttaatccagg agtccctcac attcattgac aagcagttgg cagcttatat tgcagacaag 4200gtggacgcag ctcaaatgcc tcaggaagcc cagaaaatcc aatctgattt gacaagtcat 4260gagatcagtt tagaagaaat gaagaaacat aatcagggga aggaggctgc ccaaagagtc 4320ctgtctcaga ttgatgttgc acagaaaaaa ttacaagatg tctccatgaa gtttcgatta 4380ttccagaaac cagccaattt tgagcagcgt ctacaagaaa gtaagatgat tttagatgaa 4440gtgaagatgc acttgcctgc attggaaaca aagagtgtgg aacaggaagt agtacagtca 4500cagctaaatc attgtgtgaa cttgtataaa agtctgagtg aagtgaagtc tgaagtggaa 4560atggtgataa agactggacg tcagattgta cagaaaaagc agacggaaaa tcccaaagaa 4620cttgatgaaa gagtaacagc tttgaaattg cattataatg agctgggagc aaaggtaaca 4680gaaagaaagc aacagttgga gaaatgcttg aaattgtccc gtaagatgcg aaaggaaatg 4740aatgtcttga cagaatggct ggcagctaca gatatggaat tgacaaagag atcagcagtt 4800gaaggaatgc ctagtaattt ggattctgaa gttgcctggg gaaaggctac tcaaaaagag 4860attgagaaac agaaggtgca cctgaagagt atcacagagg taggagaggc cttgaaaaca 4920gttttgggca agaaggagac gttggtggaa gataaactca gtcttctgaa tagtaattgg 4980atagctgtca cctcccgagc agaagagtgg ttaaatcttt tgttggaata ccagaaacac 5040atggaaactt ttgaccagaa tgtggaccac atcacaaagt ggatcattca ggctgacaca 5100cttttggatg aatcagagaa aaagaaaccc cagcaaaaag aagacgtgct taagcgttta 5160aaggcagaac tgaatgacat acgcccaaag gtggactcta cacgtgacca agcagcaaac 5220ttgatggcaa accacggtga ccactgcagg aaattagtag agccccaaat ctcagagctc 5280aaccatcgat ttgcagccat ttcacacaga attaagactg gaaaggcctc cattcctttg 5340aaggaattgg agcagtttaa ctcagatata caaaaattgc ttgaaccact ggaggctgaa 5400attcagcagg gggtgaatct gaaagaggaa gacttcaata aagatatgaa tgaagacaat 5460gagggtactg taaaagaatt gttgcaaaga ggagacaact tacaacaaag aatcacagat 5520gagagaaaga gcgaggaaat aaagataaaa cagcagctgt tacagacaaa acataatgct 5580ctcaaggatt tgaggtctca aagaagaaaa aaggctctag aaatttctca tcagtggtat 5640cagtacaaga ggcaggctga tgatctcctg aaatgcttgg atgacattga aaaaaaatta 5700gccagcctac ctgagcccag agatgaaagg aaaataaagg aaattgatcg ggaattgcag 5760aagaagaaag aggagctgaa tgcagtgcgt aggcaagctg agggcttgtc tgaggatggg 5820gccgcaatgg cagtggagcc aactcagatc cagctcagca agcgctggcg ggaaattgag 5880agcaaatttg ctcagtttcg aagactcaac tttgcacaaa ttcacactgt ccgtgaagaa 5940acgatgatgg tgatgactga agacatgcct ttggaaattt cttatgtgcc ttctacttat 6000ttgactgaaa tcactcatgt ctcacaagcc ctattagaag tggaacaact tctcaatgct 6060cctgacctct gtgctaagga ctttgaagat ctctttaagc aagaggagtc tctgaagaat 6120ataaaagata gtctacaaca aagctcaggt cggattgaca ttattcatag caagaagaca 6180gcagcattgc aaagtgcaac gcctgtggaa agggtgaagc tacaggaagc tctctcccag 6240cttgatttcc aatgggaaaa agttaacaaa atgtacaagg accgacaagg gcgatttgac 6300agatctgttg agaaatggcg gcgttttcat tatgatataa agatatttaa tcagtggcta 6360acagaagctg aacagtttct cagaaagaca caaattcctg agaattggga acatgctaaa 6420tacaaatggt atcttaagga actccaggat ggcattgggc agcggcaaac tgttgtcaga 6480acattgaatg caactgggga agaaataatt cagcaatcct caaaaacaga tgccagtatt 6540ctacaggaaa aattgggaag cctgaatctg cggtggcagg aggtctgcaa acagctgtca 6600gacagaaaaa agaggctaga agaacaaaag aatatcttgt cagaatttca aagagattta 6660aatgaatttg ttttatggtt ggaggaagca gataacattg ctagtatccc acttgaacct 6720ggaaaagagc agcaactaaa agaaaagctt gagcaagtca agttactggt ggaagagttg 6780cccctgcgcc agggaattct caaacaatta aatgaaactg gaggacccgt gcttgtaagt 6840gctcccataa gcccagaaga gcaagataaa cttgaaaata agctcaagca gacaaatctc 6900cagtggataa aggtttccag agctttacct gagaaacaag gagaaattga agctcaaata 6960aaagaccttg ggcagcttga aaaaaagctt gaagaccttg aagagcagtt aaatcatctg 7020ctgctgtggt tatctcctat taggaatcag ttggaaattt ataaccaacc aaaccaagaa 7080ggaccatttg acgttaagga aactgaaata gcagttcaag ctaaacaacc ggatgtggaa 7140gagattttgt ctaaagggca gcatttgtac aaggaaaaac cagccactca gccagtgaag 7200aggaagttag aagatctgag ctctgagtgg aaggcggtaa accgtttact tcaagagctg 7260agggcaaagc agcctgacct agctcctgga ctgaccacta ttggagcctc tcctactcag 7320actgttactc tggtgacaca acctgtggtt actaaggaaa ctgccatctc caaactagaa 7380atgccatctt ccttgatgtt ggaggtacct gctctggcag atttcaaccg ggcttggaca 7440gaacttaccg actggctttc tctgcttgat caagttataa aatcacagag ggtgatggtg 7500ggtgaccttg aggatatcaa cgagatgatc atcaagcaga aggcaacaat gcaggatttg 7560gaacagaggc gtccccagtt ggaagaactc attaccgctg cccaaaattt gaaaaacaag 7620accagcaatc aagaggctag aacaatcatt acggatcgaa ttgaaagaat tcagaatcag 7680tgggatgaag tacaagaaca ccttcagaac cggaggcaac agttgaatga aatgttaaag 7740gattcaacac aatggctgga agctaaggaa gaagctgagc aggtcttagg acaggccaga 7800gccaagcttg agtcatggaa ggagggtccc tatacagtag atgcaatcca aaagaaaatc 7860acagaaacca agcagttggc caaagacctc cgccagtggc agacaaatgt agatgtggca 7920aatgacttgg ccctgaaact tctccgggat tattctgcag atgataccag aaaagtccac 7980atgataacag agaatatcaa tgcctcttgg agaagcattc ataaaagggt gagtgagcga 8040gaggctgctt tggaagaaac tcatagatta ctgcaacagt tccccctgga cctggaaaag 8100tttcttgcct ggcttacaga agctgaaaca actgccaatg tcctacagga tgctacccgt 8160aaggaaaggc tcctagaaga ctccaaggga gtaaaagagc tgatgaaaca atggcaagac 8220ctccaaggtg aaattgaagc tcacacagat gtttatcaca acctggatga aaacagccaa 8280aaaatcctga gatccctgga aggttccgat gatgcagtcc tgttacaaag acgtttggat 8340aacatgaact tcaagtggag tgaacttcgg aaaaagtctc tcaacattag gtcccatttg 8400gaagccagtt ctgaccagtg gaagcgtctg cacctttctc tgcaggaact tctggtgtgg 8460ctacagctga aagatgatga attaagccgg caggcaccta ttggaggcga ctttccagca 8520gttcagaagc agaacgatgt acatagggcc ttcaagaggg aattgaaaac taaagaacct 8580gtaatcatga gtactcttga gactgtacga atatttctga cagagcagcc tttggaagga 8640ctagagaaac tctaccagga gcccagagag ctgcctcctg aggagagagc ccagaatgtc 8700actcggcttc tacgaaagca ggctgaggag gtcaatactg agtgggaaaa attgaacctg 8760cactccgctg actggcagag aaaaatagat gagacccttg aaagactcca ggaacttcaa 8820gaggccacgg atgagctgga cctcaagctg cgccaagctg aggtgatcaa gggatcctgg 8880cagcccgtgg gcgatctcct cattgactct ctccaagatc acctcgagaa agtcaaggca 8940cttcgaggag aaattgcgcc tctgaaagag aacgtgagcc acgtcaatga ccttgctcgc 9000cagcttacca ctttgggcat tcagctctca ccgtataacc tcagcactct ggaagacctg 9060aacaccagat ggaagcttct gcaggtggcc gtcgaggacc gagtcaggca gctgcatgaa 9120gcccacaggg actttggtcc agcatctcag cactttcttt ccacgtctgt ccagggtccc 9180tgggagagag ccatctcgcc aaacaaagtg ccctactata tcaaccacga gactcaaaca 9240acttgctggg accatcccaa aatgacagag ctctaccagt ctttagctga cctgaataat 9300gtcagattct cagcttatag gactgccatg aaactccgaa gactgcagaa ggccctttgc 9360ttggatctct tgagcctgtc agctgcatgt gatgccttgg accagcacaa cctcaagcaa 9420aatgaccagc ccatggatat cctgcagatt attaattgtt tgaccactat ttatgaccgc 9480ctggagcaag agcacaacaa tttggtcaac gtccctctct gcgtggatat gtgtctgaac 9540tggctgctga atgtttatga tacgggacga acagggagga tccgtgtcct gtcttttaaa 9600actggcatca tttccctgtg taaagcacat ttggaagaca agtacagata ccttttcaag 9660caagtggcaa gttcaacagg attttgtgac cagcgcaggc tgggcctcct tctgcatgat 9720tctatccaaa ttccaagaca gttgggtgaa gttgcatcct ttgggggcag taacattgag 9780ccaagtgtcc ggagctgctt ccaatttgct aataataagc cagagatcga agcggccctc 9840ttcctagact ggatgagact ggaaccccag tccatggtgt ggctgcccgt cctgcacaga 9900gtggctgctg cagaaactgc caagcatcag gccaaatgta acatctgcaa agagtgtcca 9960atcattggat tcaggtacag gagtctaaag cactttaatt atgacatctg ccaaagctgc 10020tttttttctg gtcgagttgc aaaaggccat aaaatgcact atcccatggt ggaatattgc 10080actccgacta catcaggaga agatgttcga gactttgcca aggtactaaa aaacaaattt 10140cgaaccaaaa ggtattttgc gaagcatccc cgaatgggct acctgccagt gcagactgtc 10200ttagaggggg acaacatgga aactcccgtt actctgatca acttctggcc agtagattct 10260gcgcctgcct cgtcccctca gctttcacac gatgatactc attcacgcat tgaacattat 10320gctagcaggc tagcagaaat ggaaaacagc aatggatctt atctaaatga tagcatctct 10380cctaatgaga gcatagatga tgaacatttg ttaatccagc attactgcca aagtttgaac 10440caggactccc ccctgagcca gcctcgtagt cctgcccaga tcttgatttc cttagagagt 10500gaggaaagag gggagctaga gagaatccta gcagatcttg aggaagaaaa caggaatctg 10560caagcagaat atgaccgtct aaagcagcag cacgaacata aaggcctgtc cccactgccg 10620tcccctcctg aaatgatgcc cacctctccc cagagtcccc gggatgctga gctcattgct 10680gaggccaagc tactgcgtca acacaaaggc cgcctggaag ccaggatgca aatcctggaa 10740gaccacaata aacagctgga gtcacagtta cacaggctaa ggcagctgct ggagcaaccc 10800caggcagagg ccaaagtgaa tggcacaacg gtgtcctctc cttctacctc tctacagagg 10860tccgacagca gtcagcctat gctgctccga gtggttggca gtcaaacttc ggactccatg 10920ggtgaggaag atcttctcag tcctccccag gacacaagca cagggttaga ggaggtgatg 10980gagcaactca acaactcctt ccctagttca agaggaagaa atacccctgg aaagccaatg 11040agagaggaca caatgtag 11058<210>2<211>4182<212>DNA<213>人<400>2attttcacca tggtttggtg ggaagaagta gaggactgtt atgaaagaga agatgttcaa 60aagaaaacat tcacaaaatg ggtaaatgca caattttcta agtttgggaa gcagcatatt 120gagaacctct tcagtgacct acaggatggg aggcgcctcc tagacctcct cgaaggcctg 180acagggcaaa aactgccaaa agaaaaagga tccacaagag ttcatgccct gaacaatgtc 240aacaaggcac tgcgggtttt gcagaacaat aatgttgatt tagtgaatat tggaagtact 300gacatcgtag atggaaatca taaactgact cttggtttga tttggaatat aatcctccac 360tggcaggtca aaaatgtaat gaaaaatatc atggctggat tgcaacaaac caacagtgaa 420aagattctcc tgagctgggt ccgacaatca actcgtaatt atccacaggt taatgtaatc 480aacttcacca ccagctggtc tgatggcctg gctttgaatg ctctcatcca tagtcatagg 540ccagacctat ttgactggaa tagtgtggtt tgccagcagt cagccacaca acgactggaa 600catgcattca acatcgccag atatcaatta ggcatagaga aactactcga tcctgaagat 660gttgatacca cctatccaga taagaagtcc atcttaatgt acatcacatc actcttccaa 720gttttgcctc aacaagtgag cattgaagcc atccaggaag tggaaatgtt gccaaggcca 780cctaaagtga ctaaagaaga acattttcag ttacatcatc aaatgcacta ttctcaacag 840atcacggtca gtctagcaca gggatatgag agaacttctt cccctaagcc tcgattcaag 900agctatgcct acacacaggc tgcttatgtc accacctctg accctacacg gagcccattt 960ccttcacagc atttggaagc tcctgaagac aagtcatttg gcagttcatt gatggagagt 1020gaagtaaacc tggaccgtta tcaaacagct ttagaagaag tattatcgtg gcttctttct 1080gctgaggaca cattgcaagc acaaggagag atttctaatg atgtggaagt ggtgaaagac 1140cagtttcata ctcatgaggg gtacatgatg gatttgacag cccatcaggg ccgggttggt 1200aatattctac aattgggaag taagctgatt ggaacaggaa aattatcaga agatgaagaa 1260actgaagtac aagagcagat gaatctccta aattcaagat gggaatgcct cagggtagct 1320agcatggaaa aacaaagcaa tttacataga gttttaatgg atctccagaa tcagaaactg 1380aaagagttga atgactggct aacaaaaaca gaagaaagaa caaggaaaat ggaggaagag 1440cctcttggac ctgatcttga agacctaaaa cgccaagtac aacaacataa ggtgcttcaa 1500gaagatctag aacaagaaca agtcagggtc aattctctca ctcacatggt ggtggtagtt 1560gatgaatcta gtggagatca cgcaactgct gctttggaag aacaacttaa ggtattggga 1620gatcgatggg caaacatctg tagatggaca gaagaccgct gggttctttt acaagacatc 1680cttctcaaat ggcaacgtct tactgaagaa cagtgccttt ttagtgcatg gctttcagaa 1740aaagaagatg cagtgaacaa gattcacaca actggcttta aagatcaaaa tgaaatgtta 1800tcaagtcttc aaaaactggc cgttttaaaa gcggatctag aaaagaaaaa gcaatccatg 1860ggcaaactgt attcactcaa acaagatctt ctttcaacac tgaagaataa gtcagtgacc 1920cagaagacgg aagcatggct ggataacttt gcccggtgtt gggataattt agtccaaaaa 1980cttgaaaaga gtacagcaca gactcataga ttactgcaac agttccccct ggacctggaa 2040aagtttcttg cctggcttac agaagctgaa acaactgcca atgtcctaca ggatgctacc 2100cgtaaggaaa ggctcctaga agactccaag ggagtaaaag agctgatgaa acaatggcaa 2160gacctccaag gtgaaattga agctcacaca gatgtttatc acaacctgga tgaaaacagc 2220caaaaaatcc tgagatccct ggaaggttcc gatgatgcag tcctgttaca aagacgtttg 2280gataacatga acttcaagtg gagtgaactt cggaaaaagt ctctcaacat taggtcccat 2340ttggaagcca gttctgacca gtggaagcgt ctgcaccttt ctctgcagga acttctggtg 2400tggctacagc tgaaagatga tgaattaagc cggcaggcac ctattggagg cgactttcca 2460gcagttcaga agcagaacga tgtacatagg gccttcaaga gggaattgaa aactaaagaa 2520cctgtaatca tgagtactct tgagactgta cgaatatttc tgacagagca gcctttggaa 2580ggactagaga aactctacca ggagcccaga gagctgcctc ctgaggagag agcccagaat 2640gtcactcggc ttctacgaaa gcaggctgag gaggtcaata ctgagtggga aaaattgaac 2700ctgcactccg ctgactggca gagaaaaata gatgagaccc ttgaaagact ccaggaactt 2760caagaggcca cggatgagct ggacctcaag ctgcgccaag ctgaggtgat caagggatcc 2820tggcagcccg tgggcgatct cctcattgac tctctccaag atcacctcga gaaagtcaag 2880gcacttcgag gagaaattgc gcctctgaaa gagaacgtga gccacgtcaa tgaccttgct 2940cgccagctta ccactttggg cattcagctc tcaccgtata acctcagcac tctggaagac 3000ctgaacacca gatggaagct tctgcaggtg gccgtcgagg accgagtcag gcagctgcat 3060gaagcccaca gggactttgg tccagcatct cagcactttc tttccacgtc tgtccagggt 3120ccctgggaga gagccatctc gccaaacaaa gtgccctact atatcaacca cgagactcaa 3180acaacttgct gggaccatcc caaaatgaca gagctctacc agtctttagc tgacctgaat 3240aatgtcagat tctcagctta taggactgcc atgaaactcc gaagactgca gaaggccctt 3300tgcttggatc tcttgagcct gtcagctgca tgtgatgcct tggaccagca caacctcaag 3360caaaatgacc agcccatgga tatcctgcag attattaatt gtttgaccac tatttatgac 3420cgcctggagc aagagcacaa caatttggtc aacgtccctc tctgcgtgga tatgtgtctg 3480aactggctgc tgaatgttta tgatacggga cgaacaggga ggatccgtgt cctgtctttt 3540aaaactggca tcatttccct gtgtaaagca catttggaag acaagtacag ataccttttc 3600aagcaagtgg caagttcaac aggattttgt gaccagcgca ggctgggcct ccttctgcat 3660gattctatcc aaattccaag acagttgggt gaagttgcat cctttggggg cagtaacatt 3720gagccaagtg tccggagctg cttccaattt gctaataata agccagagat cgaagcggcc 3780ctcttcctag actggatgag actggaaccc cagtccatgg tgtggctgcc cgtcctgcac 3840agagtggctg ctgcagaaac tgccaagcat caggccaaat gtaacatctg caaagagtgt 3900ccaatcattg gattcaggta caggagtcta aagcacttta attatgacat ctgccaaagc 3960tgcttttttt ctggtcgagt tgcaaaaggc cataaaatgc actatcccat ggtggaatat 4020tgcactccga ctacatcagg agaagatgtt cgagactttg ccaaggtact aaaaaacaaa 4080tttcgaacca aaaggtattt tgcgaagcat ccccgaatgg gctacctgcc agtgcagact 4140gtcttagagg gggacaacat ggaaactccc gacacaatgt ag4182<210>3<211>1991<212>DNA<213>人<400>3atgctttggt gggaagaagt agaggactgt tatgaaagag aagatgttca aaagaaaaca 60ttcacaaaat gggtaaatgc acaattttct aagtttggga agcagcatat tgagaacctc 120ttcagtgacc tacaggatgg gaggcgcctc ctagacctcc tcgaaggcct gacagggcaa 180aaactgccaa aagaaaaagg atccacaaga gttcatgccc tgaacaatgt caacaaggca 240ctgcgggttt tgcagaacaa taatgttgat ttagtgaata ttggaagtac tgacatcgta 300gatggaaatc ataaactgac tcttggtttg atttggaata taatcctcca ctggcaggtc 360aaaaatgtaa tgaaaaatat catggctgga ttgcaaccaa ccaacagtga aaagattctc 420ctgagctggg tccgacaatc aactcgtaat tatccacagg ttaatgtaat caacttcacc 480accagctggt ctgatggcct ggctttgaat gctctcatcc atagtcatag gccagaccta 540tttgactgga atagtgtggt ttgccagcag tcagccacac aacgactgga acatgcattc 600aacatcgcca gatatcaatt aggcatagag aaactactcg atcctgaaga tgttgatacc 660acctatccag ataagaagtc catcttaatg tacatcacat cactcttcca agttttgcct 720caacaagtga gcattgaagc catccaggaa gtggaaatgt tgccaaggcc acctaaagtg 780actaaagaag aacattttca gttacatcat caaatgcact attctcaaca gatcacggtc 840agtctagcac agggatatga gagaacttct tcccctaagc ctcgattcaa gagctatgcc 900tacacacagg ctgcttatgt caccacctct gaccctacac ggagcccatt tccttcacag 960catttggaag ctcctgaaga caagtcattt ggcagttcat tgatggagag tgaagtaaac 1020ctggaccgtt atcaaacagc tttagaagaa gtattatcgt ggcttctttc tgctgaggac 1080acattgcaag cacaaggaga gatttctaat gatgtggaag tggtgaaaga ccagtttcat 1140actcatgagg ggtacatgat ggatttgaca gcccatcagg gccgggttgg taatattcta 1200caattgggaa gtaagctgat tggaacagga aaattatcag aagatgaaga aactgaagta 1260caagagcaga tgaatctcct aaattcaaga tgggaatgcc tcagggtagc tagcatggaa 1320aaacaaagca atttacatag agttttaatg gatctccaga atcagaaact gaaagagttg 1380aatgactggc taacaaaaac agaagaaaga acaaggaaaa tggaggaaga gcctcttgga 1440cctgatcttg aagacctaaa acgccaagta caacaacata aggtgcttca agaagatcta 1500gaacaagaac aagtcagggt caattctctc actcacatgg tggtggtagt tgatgaatct 1560agtggagatc acgcaactgc tgctttggaa gaacaactta aggtattggg agatcgatgg 1620gcaaacatct gtagatggac agaagaccgc tgggttcttt tacaagacat cctgctcaaa 1680tggcaacgtc ttactgaaga acagtgcctt tttagtgcat ggctttcaga aaaagaagat 1740gcagtgaaca agattcacac aactggcttt aaagatcaaa atgaaatgtt atcaagtctt 1800caaaaactgg ccgttttaaa agcggatcta gaaaagaaaa agcaatccat gggcaaactg 1860tattcaatca aacaagatct tctttcaaca ctgaagaata agtcagtgac ccagaagacg 1920gaagcatggc tggataactt tgcccggtgt tgggataatt tagtccaaaa acttgaaaag 1980agtacagcac a 1991<210>4<211>2169<212>DNA<213>人<400>4aactcataga ttactgcaac agttccccct ggacctggaa aagtttcttg cctggcttac 60agaagctgaa acaactgcca atgtcctaca ggatgctacc cgtaaggaaa ggctcctaga 120agactccaag ggagtaaaag agctgatgaa acaatggcaa gacctccaag gtgaaattga 180agctcacaca gatgtttatc acaacctgga tgaaaacagc caaaaaatcc tgagatccct 240ggaaggttcc gatgatgcag tcctgttaca aagacgtttg gataacatga acttcaagtg 300gagtgaactt cggaaaaagt ctctcaacat taggtcccat ttggaagcca gttctgacca 360gtggaagcgt ctgcaccttt ctctgcagga acttctggtg tggctacagc tgaaagatga 420tgaattaagc cggcaggcac ctattggagg cgactttcca gcagttcaga agcagaacga 480tgtacatagg gccttcaaga gggaattgaa aactaaagaa cctgtaatca tgagtactct 540tgagactgta cgaatatttc tgacagagca gcctttggaa ggactagaga aactctacca 600ggagcccaga gagctgcctc ctgaggagag agcccagaat gtcactcggc ttctacgaaa 660gcaggctgag gaggtcaata ctgagtggga aaaattgaac ctgcactccg ctgactggca 720gagaaaaata gatgagaccc ttgaaagact ccaggaactt caagaggcca cggatgagct 780ggacctcaag ctgcgccaag ctgaggtgat caagggatcc tggcagcccg tgggcgatct 840cctcattgac tctctccaag atcacctcga gaaagtcaag gcacttcgag gagaaattgc 900gcctctgaaa gagaacgtga gccacgtcaa tgaccttgct cgccagctta ccactttggg 960cattcagctc tcaccgtata acctcagcac tctggaagac ctgaacacca gatggaagct 1020tctgcaggtg gccgtcgagg accgagtcag gcagctgcat gaagcccaca gggactttgg 1080tccagcatct cagcactttc tttccacgtc tgtccagggt ccctgggaga gagccatctc 1140gccaaacaaa gtgccctact atatcaacca cgagactcaa acaacttgct gggaccatcc 1200caaaatgaca gagctctacc agtctttagc tgacctgaat aatgtcagat tctcagctta 1260taggactgcc atgaaactcc gaagactgca gaaggccctt tgcttggatc tcttgagcct 1320gtcagctgca tgtgatgcct tggaccagca caacctcaag caaaatgacc agcccatgga 1380tatcctgcag attattaatt gtttgaccac tatttatgac cgcctggagc aagagcacaa 1440caatttggtc aacgtccctc tctgcgtgga tatgtgtctg aactggctgc tgaatgttta 1500tgatacggga cgaacaggga ggatccgtgt cctgtctttt aaaactggca tcatttccct 1560gtgtaaagca catttggaag acaagtacag ataccttttc aagcaagtgg caagttcaac 1620aggattttgt gaccagcgca ggctgggcct ccttctgcat gattctatcc aaattccaag 1680acagttgggt gaagttgcat cctttggggg cagtaacatt gagccaagtg tccggagctg 1740cttccaattt gctaataata agccagagat cgaagcggcc ctcttcctag actggatgag 1800actggaaccc cagtccatgg tgtggctgcc cgtcctgcac agagtggctg ctgcagaaac 1860tgccaagcat caggccaaat gtaacatctg caaagagtgt ccaatcattg gattcaggta 1920caggagtcta aagcacttta attatgacat ctgccaaagc tgcttttttt ctggtcgagt 1980tgcaaaaggc cataaaatgc actatcccat ggtggaatat tgcactccga ctacatcagg 2040agaagatgtt cgagactttg ccaaggtact aaaaaacaaa tttcgaacca aaaggtattt 2100tgcgaagcat ccccgaatgg gctacctgcc agtgcagact gtcttagagg gggacaacat 2160ggaaactcc 2169<210>5<211>12<212>DNA<213>人<400>5ggacacaatg ta 12<210>6<211>3999<212>DNA<213>人<400>6attttcacca tggtttggtg ggaagaagta gaggactgtt atgaaagaga agatgttcaa 60aagaaaacat tcacaaaatg ggtaaatgca caattttcta agtttgggaa gcagcatatt 120gagaacctct tcagtgacct acaggatggg aggcgcctcc tagacctcct cgaaggcctg 180acagggcaaa aactgccaaa agaaaaagga tccacaagag ttcatgccct gaacaatgtc 240aacaaggcac tgcgggtttt gcagaacaat aatgttgatt tagtgaatat tggaagtact 300gacatcgtag atggaaatca taaactgact cttggtttga tttggaatat aatcctccac 360tggcaggtca aaaatgtaat gaaaaatatc atggctggat tgcaacaaac caacagtgaa 420aagattctcc tgagctgggt ccgacaatca actcgtaatt atccacaggt taatgtaatc 480aacttcacca ccagctggtc tgatggcctg gctttgaatg ctctcatcca tagtcatagg 540ccagacctat ttgactggaa tagtgtggtt tgccagcagt cagccacaca acgactggaa 600catgcattca acatcgccag atatcaatta ggcatagaga aactactcga tcctgaagat 660gttgatacca cctatccaga taagaagtcc atcttaatgt acatcacatc actcttccaa 720gttttgcctc aacaagtgag cattgaagcc atccaggaag tggaaatgtt gccaaggcca 780cctaaagtga ctaaagaaga acattttcag ttacatcatc aaatgcacta ttctcaacag 840atcacggtca gtctagcaca gggatatgag agaacttctt cccctaagcc tcgattcaag 900agctatgcct acacacaggc tgcttatgtc accacctctg accctacacg gagcccattt 960ccttcacagc atttggaagc tcctgaagac aagtcatttg gcagttcatt gatggagagt 1020gaagtaaacc tggaccgtta tcaaacagct ttagaagaag tattatcgtg gcttctttct 1080gctgaggaca cattgcaagc acaaggagag atttctaatg atgtggaagt ggtgaaagac 1140cagtttcata ctcatgaggg gtacatgatg gatttgacag cccatcaggg ccgggttggt 1200aatattctac aattgggaag taagctgatt ggaacaggaa aattatcaga agatgaagaa 1260actgaagtac aagagcagat gaatctccta aattcaagat gggaatgcct cagggtagct 1320agcatggaaa aacaaagcaa tttacataga gttttaatgg atctccagaa tcagaaactg 1380aaagagttga atgactggct aacaaaaaca gaagaaagaa caaggaaaat ggaggaagag 1440cctcttggac ctgatcttga agacctaaaa cgccaagtac aacaacataa ggtgcttcaa 1500gaagatctag aacaagaaca agtcagggtc aattctctca ctcacatggt ggtggtagtt 1560gatgaatcta gtggagatca cgcaactgct gctttggaag aacaacttaa ggtattggga 1620gatcgatggg caaacatctg tagatggaca gaagaccgct gggttctttt acaagaccag 1680cctgacctag ctcctggact gaccactatt ggagcctctc ctactcagac tgttactctg 1740gtgacacaac ctgtggttac taaggaaact gccatctcca aactagaaat gccatcttcc 1800ttgatgttgg aggtacctac tcatagatta ctgcaacagt tccccctgga cctggaaaag 1860tttcttgcct ggcttacaga agctgaaaca actgccaatg tcctacagga tgctacccgt 1920aaggaaaggc tcctagaaga ctccaaggga gtaaaagagc tgatgaaaca atggcaagac 1980ctccaaggtg aaattgaagc tcacacagat gtttatcaca acctggatga aaacagccaa 2040aaaatcctga gatccctgga aggttccgat gatgcagtcc tgttacaaag acgtttggat 2100aacatgaact tcaagtggag tgaacttcgg aaaaagtctc tcaacattag gtcccatttg 2160gaagccagtt ctgaccagtg gaagcgtctg cacctttctc tgcaggaact tctggtgtgg 2220ctacagctga aagatgatga attaagccgg caggcaccta ttggaggcga ctttccagca 2280gttcagaagc agaacgatgt acatagggcc ttcaagaggg aattgaaaac taaagaacct 2340gtaatcatga gtactcttga gactgtacga atatttctga cagagcagcc tttggaagga 2400ctagagaaac tctaccagga gcccagagag ctgcctcctg aggagagagc ccagaatgtc 2460actcggcttc tacgaaagca ggctgaggag gtcaatactg agtgggaaaa attgaacctg 2520cactccgctg actggcagag aaaaatagat gagacccttg aaagactcca ggaacttcaa 2580gaggccacgg atgagctgga cctcaagctg cgccaagctg aggtgatcaa gggatcctgg 2640cagcccgtgg gcgatctcct cattgactct ctccaagatc acctcgagaa agtcaaggca 2700cttcgaggag aaattgcgcc tctgaaagag aacgtgagcc acgtcaatga ccttgctcgc 2760cagcttacca ctttgggcat tcagctctca ccgtataacc tcagcactct ggaagacctg 2820aacaccagat ggaagcttct gcaggtggcc gtcgaggacc gagtcaggca gctgcatgaa 2880gcccacaggg actttggtcc agcatctcag cactttcttt ccacgtctgt ccagggtccc 2940tgggagagag ccatctcgcc aaacaaagtg ccctactata tcaaccacga gactcaaaca 3000acttgctggg accatcccaa aatgacagag ctctaccagt ctttagctga cctgaataat 3060gtcagattct cagcttatag gactgccatg aaactccgaa gactgcagaa ggccctttgc 3120ttggatctct tgagcctgtc agctgcatgt gatgccttgg accagcacaa cctcaagcaa 3180aatgaccagc ccatggatat cctgcagatt attaattgtt tgaccactat ttatgaccgc 3240ctggagcaag agcacaacaa tttggtcaac gtccctctct gcgtggatat gtgtctgaac 3300tggctgctga atgtttatga tacgggacga acagggagga tccgtgtcct gtcttttaaa 3360actggcatca tttccctgtg taaagcacat ttggaagaca agtacagata ccttttcaag 3420caagtggcaa gttcaacagg attttgtgac cagcgcaggc tgggcctcct tctgcatgat 3480tctatccaaa ttccaagaca gttgggtgaa gttgcatcct ttgggggcag taacattgag 3540ccaagtgtcc ggagctgctt ccaatttgct aataataagc cagagatcga agcggccctc 3600ttcctagact ggatgagact ggaaccccag tccatggtgt ggctgcccgt cctgcacaga 3660gtggctgctg cagaaactgc caagcatcag gccaaatgta acatctgcaa agagtgtcca 3720atcattggat tcaggtacag gagtctaaag cactttaatt atgacatctg ccaaagctgc 3780tttttttctg gtcgagttgc aaaaggccat aaaatgcact atcccatggt ggaatattgc 3840actccgacta catcaggaga agatgttcga gactttgcca aggtactaaa aaacaaattt 3900cgaaccaaaa ggtattttgc gaagcatccc cgaatgggct acctgccagt gcagactgtc 3960ttagaggggg acaacatgga aactcccgac acaatgtag3999<210>7<211>1667<212>DNA<213>人<400>7atgctttggt gggaagaagt agaggactgt tatgaaagag aagatgttca aaagaaaaca 60ttcacaaaat gggtaaatgc acaattttct aagtttggga agcagcatat tgagaacctc 120ttcagtgacc tacaggatgg gaggcgcctc ctagacctcc tcgaaggcct gacagggcaa 180aaactgccaa aagaaaaagg atccacaaga gttcatgccc tgaacaatgt caacaaggca 240ctgcgggttt tgcagaacaa taatgttgat ttagtgaata ttggaagtac tgacatcgta 300gatggaaatc ataaactgac tcttggtttg atttggaata taatcctcca ctggcaggtc 360aaaaatgtaa tgaaaaatat catggctgga ttgcaaccaa ccaacagtga aaagattctc 420ctgagctggg tccgacaatc aactcgtaat tatccacagg ttaatgtaat caacttcacc 480accagctggt ctgatggcct ggctttgaat gctctcatcc atagtcatag gccagaccta 540tttgactgga atagtgtggt ttgccagcag tcagccacac aacgactgga acatgcattc 600aacatcgcca gatatcaatt aggcatagag aaactactcg atcctgaaga tgttgatacc 660acctatccag ataagaagtc catcttaatg tacatcacat cactcttcca agttttgcct 720caacaagtga gcattgaagc catccaggaa gtggaaatgt tgccaaggcc acctaaagtg 780actaaagaag aacattttca gttacatcat caaatgcact attctcaaca gatcacggtc 840agtctagcac agggatatga gagaacttct tcccctaagc ctcgattcaa gagctatgcc 900tacacacagg ctgcttatgt caccacctct gaccctacac ggagcccatt tccttcacag 960catttggaag ctcctgaaga caagtcattt ggcagttcat tgatggagag tgaagtaaac 1020ctggaccgtt atcaaacagc tttagaagaa gtattatcgt ggcttctttc tgctgaggac 1080acattgcaag cacaaggaga gatttctaat gatgtggaag tggtgaaaga ccagtttcat 1140actcatgagg ggtacatgat ggatttgaca gcccatcagg gccgggttgg taatattcta 1200caattgggaa gtaagctgat tggaacagga aaattatcag aagatgaaga aactgaagta 1260caagagcaga tgaatctcct aaattcaaga tgggaatgcc tcagggtagc tagcatggaa 1320aaacaaagca atttacatag agttttaatg gatctccaga atcagaaact gaaagagttg 1380aatgactggc taacaaaaac agaagaaaga acaaggaaaa tggaggaaga gcctcttgga 1440cctgatcttg aagacctaaa acgccaagta caacaacata aggtgcttca agaagatcta 1500gaacaagaac aagtcagggt caattctctc actcacatgg tggtggtagt tgatgaatct 1560agtggagatc acgcaactgc tgctttggaa gaacaactta aggtattggg agatcgatgg 1620gcaaacatct gtagatggac agaagaccgc tgggttcttt tacaaga 1667<210>8<211>147<212>DNA<213>人<400>8ggcaaagcag cctgacctag ctcctggact gaccactatt ggagcctctc ctactcagac 60tgttactctg gtgacacaac ctgtggttac taaggaaact gccatctcca aactagaaat 120gccatcttcc ttgatgttgg aggtacc 147<210>9<211>3858<212>DNA<213>人<400>9attttcacca tggtttggtg ggaagaagta gaggactgtt atgaaagaga agatgttcaa 60aagaaaacat tcacaaaatg ggtaaatgca caattttcta agtttgggaa gcagcatatt 120gagaacctct tcagtgacct acaggatggg aggcgcctcc tagacctcct cgaaggcctg 180acagggcaaa aactgccaaa agaaaaagga tccacaagag ttcatgccct gaacaatgtc 240aacaaggcac tgcgggtttt gcagaacaat aatgttgatt tagtgaatat tggaagtact 300gacatcgtag atggaaatca taaactgact cttggtttga tttggaatat aatcctccac 360tggcaggtca aaaatgtaat gaaaaatatc atggctggat tgcaacaaac caacagtgaa 420aagattctcc tgagctgggt ccgacaatca actcgtaatt atccacaggt taatgtaatc 480aacttcacca ccagctggtc tgatggcctg gctttgaatg ctctcatcca tagtcatagg 540ccagacctat ttgactggaa tagtgtggtt tgccagcagt cagccacaca acgactggaa 600catgcattca acatcgccag atatcaatta ggcatagaga aactactcga tcctgaagat 660gttgatacca cctatccaga taagaagtcc atcttaatgt acatcacatc actcttccaa 720gttttgcctc aacaagtgag cattgaagcc atccaggaag tggaaatgtt gccaaggcca 780cctaaagtga ctaaagaaga acattttcag ttacatcatc aaatgcacta ttctcaacag 840atcacggtca gtctagcaca gggatatgag agaacttctt cccctaagcc tcgattcaag 900agctatgcct acacacaggc tgcttatgtc accacctctg accctacacg gagcccattt 960ccttcacagc atttggaagc tcctgaagac aagtcatttg gcagttcatt gatggagagt 1020gaagtaaacc tggaccgtta tcaaacagct ttagaagaag tattatcgtg gcttctttct 1080gctgaggaca cattgcaagc acaaggagag atttctaatg atgtggaagt ggtgaaagac 1140cagtttcata ctcatgaggg gtacatgatg gatttgacag cccatcaggg ccgggttggt 1200aatattctac aattgggaag taagctgatt ggaacaggaa aattatcaga agatgaagaa 1260actgaagtac aagagcagat gaatctccta aattcaagat gggaatgcct cagggtagct 1320agcatggaaa aacaaagcaa tttacataga gttttaatgg atctccagaa tcagaaactg 1380aaagagttga atgactggct aacaaaaaca gaagaaagaa caaggaaaat ggaggaagag 1440cctcttggac ctgatcttga agacctaaaa cgccaagtac aacaacataa ggtgcttcaa 1500gaagatctag aacaagaaca agtcagggtc aattctctca ctcacatggt ggtggtagtt 1560gatgaatcta gtggagatca cgcaactgct gctttggaag aacaacttaa ggtattggga 1620gatcgatggg caaacatctg tagatggaca gaagaccgct gggttctttt acaagacact 1680catagattac tgcaacagtt ccccctggac ctggaaaagt ttcttgcctg gcttacagaa 1740gctgaaacaa ctgccaatgt cctacaggat gctacccgta aggaaaggct cctagaagac 1800tccaagggag taaaagagct gatgaaacaa tggcaagacc tccaaggtga aattgaagct 1860cacacagatg tttatcacaa cctggatgaa aacagccaaa aaatcctgag atccctggaa 1920ggttccgatg atgcagtcct gttacaaaga cgtttggata acatgaactt caagtggagt 1980gaacttcgga aaaagtctct caacattagg tcccatttgg aagccagttc tgaccagtgg 2040aagcgtctgc acctttctct gcaggaactt ctggtgtggc tacagctgaa agatgatgaa 2100ttaagccggc aggcacctat tggaggcgac tttccagcag ttcagaagca gaacgatgta 2160catagggcct tcaagaggga attgaaaact aaagaacctg taatcatgag tactcttgag 2220actgtacgaa tatttctgac agagcagcct ttggaaggac tagagaaact ctaccaggag 2280cccagagagc tgcctcctga ggagagagcc cagaatgtca ctcggcttct acgaaagcag 2340gctgaggagg tcaatactga gtgggaaaaa ttgaacctgc actccgctga ctggcagaga 2400aaaatagatg agacccttga aagactccag gaacttcaag aggccacgga tgagctggac 2460ctcaagctgc gccaagctga ggtgatcaag ggatcctggc agcccgtggg cgatctcctc 2520attgactctc tccaagatca cctcgagaaa gtcaaggcac ttcgaggaga aattgcgcct 2580ctgaaagaga acgtgagcca cgtcaatgac cttgctcgcc agcttaccac tttgggcatt 2640cagctctcac cgtataacct cagcactctg gaagacctga acaccagatg gaagcttctg 2700caggtggccg tcgaggaccg agtcaggcag ctgcatgaag cccacaggga ctttggtcca 2760gcatctcagc actttctttc cacgtctgtc cagggtccct gggagagagc catctcgcca 2820aacaaagtgc cctactatat caaccacgag actcaaacaa cttgctggga ccatcccaaa 2880atgacagagc tctaccagtc tttagctgac ctgaataatg tcagattctc agcttatagg 2940actgccatga aactccgaag actgcagaag gccctttgct tggatctctt gagcctgtca 3000gctgcatgtg atgccttgga ccagcacaac ctcaagcaaa atgaccagcc catggatatc 3060ctgcagatta ttaattgttt gaccactatt tatgaccgcc tggagcaaga gcacaacaat 3120ttggtcaacg tccctctctg cgtggatatg tgtctgaact ggctgctgaa tgtttatgat 3180acgggacgaa cagggaggat ccgtgtcctg tcttttaaaa ctggcatcat ttccctgtgt 3240aaagcacatt tggaagacaa gtacagatac cttttcaagc aagtggcaag ttcaacagga 3300ttttgtgacc agcgcaggct gggcctcctt ctgcatgatt ctatccaaat tccaagacag 3360ttgggtgaag ttgcatcctt tgggggcagt aacattgagc caagtgtccg gagctgcttc 3420caatttgcta ataataagcc agagatcgaa gcggccctct tcctagactg gatgagactg 3480gaaccccagt ccatggtgtg gctgcccgtc ctgcacagag tggctgctgc agaaactgcc 3540aagcatcagg ccaaatgtaa catctgcaaa gagtgtccaa tcattggatt caggtacagg 3600agtctaaagc actttaatta tgacatctgc caaagctgct ttttttctgg tcgagttgca 3660aaaggccata aaatgcacta tcccatggtg gaatattgca ctccgactac atcaggagaa 3720gatgttcgag actttgccaa ggtactaaaa aacaaatttc gaaccaaaag gtattttgcg 3780aagcatcccc gaatgggcta cctgccagtg cagactgtct tagaggggga caacatggaa 3840actcccgaca caatgtag 3858<210>10<211>3531<212>DNA<213>人<400>10attttcacca tggtttggtg ggaagaagta gaggactgtt atgaaagaga agatgttcaa 60aagaaaacat tcacaaaatg ggtaaatgca caattttcta agtttgggaa gcagcatatt 120gagaacctct tcagtgacct acaggatggg aggcgcctcc tagacctcct cgaaggcctg 180acagggcaaa aactgccaaa agaaaaagga tccacaagag ttcatgccct gaacaatgtc 240aacaaggcac tgcgggtttt gcagaacaat aatgttgatt tagtgaatat tggaagtact 300gacatcgtag atggaaatca taaactgact cttggtttga tttggaatat aatcctccac 360tggcaggtca aaaatgtaat gaaaaatatc atggctggat tgcaacaaac caacagtgaa 420aagattctcc tgagctgggt ccgacaatca actcgtaatt atccacaggt taatgtaatc 480aacttcacca ccagctggtc tgatggcctg gctttgaatg ctctcatcca tagtcatagg 540ccagacctat ttgactggaa tagtgtggtt tgccagcagt cagccacaca acgactggaa 600catgcattca acatcgccag atatcaatta ggcatagaga aactactcga tcctgaagat 660gttgatacca cctatccaga taagaagtcc atcttaatgt acatcacatc actcttccaa 720gttttgcctc aacaagtgag cattgaagcc atccaggaag tggaaatgtt gccaaggcca 780cctaaagtga ctaaagaaga acattttcag ttacatcatc aaatgcacta ttctcaacag 840atcacggtca gtctagcaca gggatatgag agaacttctt cccctaagcc tcgattcaag 900agctatgcct acacacaggc tgcttatgtc accacctctg accctacacg gagcccattt 960ccttcacagc atttggaagc tcctgaagac aagtcatttg gcagttcatt gatggagagt 1020gaagtaaacc tggaccgtta tcaaacagct ttagaagaag tattatcgtg gcttctttct 1080gctgaggaca cattgcaagc acaaggagag atttctaatg atgtggaagt ggtgaaagac 1140cagtttcata ctcatgaggg gtacatgatg gatttgacag cccatcaggg ccgggttggt 1200aatattctac aattgggaag taagctgatt ggaacaggaa aattatcaga agatgaagaa 1260actgaagtac aagagcagat gaatctccta aattcaagat gggaatgcct cagggtagct 1320agcatggaaa aacaaagcaa tttacataga actcatagat tactgcaaca gttccccctg 1380gacctggaaa agtttcttgc ctggcttaca gaagctgaaa caactgccaa tgtcctacag 1440gatgctaccc gtaaggaaag gctcctagaa gactccaagg gagtaaaaga gctgatgaaa 1500caatggcaag acctccaagg tgaaattgaa gctcacacag atgtttatca caacctggat 1560gaaaacagcc aaaaaatcct gagatccctg gaaggttccg atgatgcagt cctgttacaa 1620agacgtttgg ataacatgaa cttcaagtgg agtgaacttc ggaaaaagtc tctcaacatt 1680aggtcccatt tggaagccag ttctgaccag tggaagcgtc tgcacctttc tctgcaggaa 1740cttctggtgt ggctacagct gaaagatgat gaattaagcc ggcaggcacc tattggaggc 1800gactttccag cagttcagaa gcagaacgat gtacataggg ccttcaagag ggaattgaaa 1860actaaagaac ctgtaatcat gagtactctt gagactgtac gaatatttct gacagagcag 1920cctttggaag gactagagaa actctaccag gagcccagag agctgcctcc tgaggagaga 1980gcccagaatg tcactcggct tctacgaaag caggctgagg aggtcaatac tgagtgggaa 2040aaattgaacc tgcactccgc tgactggcag agaaaaatag atgagaccct tgaaagactc 2100caggaacttc aagaggccac ggatgagctg gacctcaagc tgcgccaagc tgaggtgatc 2160aagggatcct ggcagcccgt gggcgatctc ctcattgact ctctccaaga tcacctcgag 2220aaagtcaagg cacttcgagg agaaattgcg cctctgaaag agaacgtgag ccacgtcaat 2280gaccttgctc gccagcttac cactttgggc attcagctct caccgtataa cctcagcact 2340ctggaagacc tgaacaccag atggaagctt ctgcaggtgg ccgtcgagga ccgagtcagg 2400cagctgcatg aagcccacag ggactttggt ccagcatctc agcactttct ttccacgtct 2460gtccagggtc cctgggagag agccatctcg ccaaacaaag tgccctacta tatcaaccac 2520gagactcaaa caacttgctg ggaccatccc aaaatgacag agctctacca gtctttagct 2580gacctgaata atgtcagatt ctcagcttat aggactgcca tgaaactccg aagactgcag 2640aaggcccttt gcttggatct cttgagcctg tcagctgcat gtgatgcctt ggaccagcac 2700aacctcaagc aaaatgacca gcccatggat atcctgcaga ttattaattg tttgaccact 2760atttatgacc gcctggagca agagcacaac aatttggtca acgtccctct ctgcgtggat 2820atgtgtctga actggctgct gaatgtttat gatacgggac gaacagggag gatccgtgtc 2880ctgtctttta aaactggcat catttccctg tgtaaagcac atttggaaga caagtacaga 2940taccttttca agcaagtggc aagttcaaca ggattttgtg accagcgcag gctgggcctc 3000cttctgcatg attctatcca aattccaaga cagttgggtg aagttgcatc ctttgggggc 3060agtaacattg agccaagtgt ccggagctgc ttccaatttg ctaataataa gccagagatc 3120gaagcggccc tcttcctaga ctggatgaga ctggaacccc agtccatggt gtggctgccc 3180gtcctgcaca gagtggctgc tgcagaaact gccaagcatc aggccaaatg taacatctgc 3240aaagagtgtc caatcattgg attcaggtac aggagtctaa agcactttaa ttatgacatc 3300tgccaaagct gctttttttc tggtcgagtt gcaaaaggcc ataaaatgca ctatcccatg 3360gtggaatatt gcactccgac tacatcagga gaagatgttc gagactttgc caaggtacta 3420aaaaacaaat ttcgaaccaa aaggtatttt gcgaagcatc cccgaatggg ctacctgcca 3480gtgcagactg tcttagaggg ggacaacatg gaaactcccg acacaatgta g 3531<210>11<211>1340<212>DNA<213>人<400>11atgctttggt gggaagaagt agaggactgt tatgaaagag aagatgttca aaagaaaaca 60ttcacaaaat gggtaaatgc acaattttct aagtttggga agcagcatat tgagaacctc 120ttcagtgacc tacaggatgg gaggcgcctc ctagacctcc tcgaaggcct gacagggcaa 180aaactgccaa aagaaaaagg atccacaaga gttcatgccc tgaacaatgt caacaaggca 240ctgcgggttt tgcagaacaa taatgttgat ttagtgaata ttggaagtac tgacatcgta 300gatggaaatc ataaactgac tcttggtttg atttggaata taatcctcca ctggcaggtc 360aaaaatgtaa tgaaaaatat catggctgga ttgcaaccaa ccaacagtga aaagattctc 420ctgagctggg tccgacaatc aactcgtaat tatccacagg ttaatgtaat caacttcacc 480accagctggt ctgatggcct ggctttgaat gctctcatcc atagtcatag gccagaccta 540tttgactgga atagtgtggt ttgccagcag tcagccacac aacgactgga acatgcattc 600aacatcgcca gatatcaatt aggcatagag aaactactcg atcctgaaga tgttgatacc 660acctatccag ataagaagtc catcttaatg tacatcacat cactcttcca agttttgcct 720caacaagtga gcattgaagc catccaggaa gtggaaatgt tgccaaggcc acctaaagtg 780actaaagaag aacattttca gttacatcat caaatgcact attctcaaca gatcacggtc 840agtctagcac agggatatga gagaacttct tcccctaagc ctcgattcaa gagctatgcc 900tacacacagg ctgcttatgt caccacctct gaccctacac ggagcccatt tccttcacag 960catttggaag ctcctgaaga caagtcattt ggcagttcat tgatggagag tgaagtaaac 1020ctggaccgtt atcaaacagc tttagaagaa gtattatcgt ggcttctttc tgctgaggac 1080acattgcaag cacaaggaga gatttctaat gatgtggaag tggtgaaaga ccagtttcat 1140actcatgagg ggtacatgat ggatttgaca gcccatcagg gccgggttgg taatattcta 1200caattgggaa gtaagctgat tggaacagga aaattatcag aagatgaaga aactgaagta 1260caagagcaga tgaatctcct aaattcaaga tgggaatgcc tcagggtagc tagcatggaa 1320aaacaaagca atttacatag 1340<210>12<211>3510<212>DNA<213>人<400>12attttcacca tggtttggtg ggaagaagta gaggactgtt atgaaagaga agatgttcaa 60aagaaaacat tcacaaaatg ggtaaatgca caattttcta agtttgggaa gcagcatatt 120gagaacctct tcagtgacct acaggatggg aggcgcctcc tagacctcct cgaaggcctg 180acagggcaaa aactgccaaa agaaaaagga tccacaagag ttcatgccct gaacaatgtc 240aacaaggcac tgcgggtttt gcagaacaat aatgttgatt tagtgaatat tggaagtact 300gacatcgtag atggaaatca taaactgact cttggtttga tttggaatat aatcctccac 360tggcaggtca aaaatgtaat gaaaaatatc atggctggat tgcaacaaac caacagtgaa 420aagattctcc tgagctgggt ccgacaatca actcgtaatt atccacaggt taatgtaatc 480aacttcacca ccagctggtc tgatggcctg gctttgaatg ctctcatcca tagtcatagg 540ccagacctat ttgactggaa tagtgtggtt tgccagcagt cagccacaca acgactggaa 600catgcattca acatcgccag atatcaatta ggcatagaga aactactcga tcctgaagat 660gttgatacca cctatccaga taagaagtcc atcttaatgt acatcacatc actcttccaa 720gttttgcctc aacaagtgag cattgaagcc atccaggaag tggaaatgtt gccaaggcca 780cctaaagtga ctaaagaaga acattttcag ttacatcatc aaatgcacta ttctcaacag 840atcacggtca gtctagcaca gggatatgag agaacttctt cccctaagcc tcgattcaag 900agctatgcct acacacaggc tgcttatgtc accacctctg accctacacg gagcccattt 960ccttcacagc atttggaagc tcctgaagac aagtcatttg gcagttcatt gatggagagt 1020gaagtaaacc tggaccgtta tcaaacagct ttagaagaag tattatcgtg gcttctttct 1080gctgaggaca cattgcaagc acaaggagag atttctaatg atgtggaagt ggtgaaagac 1140cagtttcata ctcatgaggg gtacatgatg gatttgacag cccatcaggg ccgggttggt 1200aatattctac aattgggaag taagctgatt ggaacaggaa aattatcaga agatgaagaa 1260actgaagtac aagagcagat gaatctccta aattcaagat gggaatgcct cagggtagct 1320agcatggaaa aacaaagcaa tttacataga gttttaatgg atctccagaa tcagaaactg 1380aaagagttga atgactggct aacaaaaaca gaagaaagaa caaggaaaat ggaggaagag 1440cctcttggac ctgatcttga agacctaaaa cgccaagtac aacaacataa ggtgcttcaa 1500gaagatctag aacaagaaca agtcagggtc aattctctca ctcacatggt ggtggtagtt 1560gatgaatcta gtggagatca cgcaactgct gctttggaag aacaacttaa ggtattggga 1620gatcgatggg caaacatctg tagatggaca gaagaccgct gggttctttt acaagacagt 1680tctgaccagt ggaagcgtct gcacctttct ctgcaggaac ttctggtgtg gctacagctg 1740aaagatgatg aattaagccg gcaggcacct attggaggcg actttccagc agttcagaag 1800cagaacgatg tacatagggc cttcaagagg gaattgaaaa ctaaagaacc tgtaatcatg 1860agtactcttg agactgtacg aatatttctg acagagcagc ctttggaagg actagagaaa 1920ctctaccagg agcccagaga gctgcctcct gaggagagag cccagaatgt cactcggctt 1980ctacgaaagc aggctgagga ggtcaatact gagtgggaaa aattgaacct gcactccgct 2040gactggcaga gaaaaataga tgagaccctt gaaagactcc aggaacttca agaggccacg 2100gatgagctgg acctcaagct gcgccaagct gaggtgatca agggatcctg gcagcccgtg 2160ggcgatctcc tcattgactc tctccaagat cacctcgaga aagtcaaggc acttcgagga 2220gaaattgcgc ctctgaaaga gaacgtgagc cacgtcaatg accttgctcg ccagcttacc 2280actttgggca ttcagctctc accgtataac ctcagcactc tggaagacct gaacaccaga 2340tggaagcttc tgcaggtggc cgtcgaggac cgagtcaggc agctgcatga agcccacagg 2400gactttggtc cagcatctca gcactttctt tccacgtctg tccagggtcc ctgggagaga 2460gccatctcgc caaacaaagt gccctactat atcaaccacg agactcaaac aacttgctgg 2520gaccatccca aaatgacaga gctctaccag tctttagctg acctgaataa tgtcagattc 2580tcagcttata ggactgccat gaaactccga agactgcaga aggccctttg cttggatctc 2640ttgagcctgt cagctgcatg tgatgccttg gaccagcaca acctcaagca aaatgaccag 2700cccatggata tcctgcagat tattaattgt ttgaccacta tttatgaccg cctggagcaa 2760gagcacaaca atttggtcaa cgtccctctc tgcgtggata tgtgtctgaa ctggctgctg 2820aatgtttatg atacgggacg aacagggagg atccgtgtcc tgtcttttaa aactggcatc 2880atttccctgt gtaaagcaca tttggaagac aagtacagat accttttcaa gcaagtggca 2940agttcaacag gattttgtga ccagcgcagg ctgggcctcc ttctgcatga ttctatccaa 3000attccaagac agttgggtga agttgcatcc tttgggggca gtaacattga gccaagtgtc 3060cggagctgct tccaatttgc taataataag ccagagatcg aagcggccct cttcctagac 3120tggatgagac tggaacccca gtccatggtg tggctgcccg tcctgcacag agtggctgct 3180gcagaaactg ccaagcatca ggccaaatgt aacatctgca aagagtgtcc aatcattgga 3240ttcaggtaca ggagtctaaa gcactttaat tatgacatct gccaaagctg ctttttttct 3300ggtcgagttg caaaaggcca taaaatgcac tatcccatgg tggaatattg cactccgact 3360acatcaggag aagatgttcg agactttgcc aaggtactaa aaaacaaatt tcgaaccaaa 3420aggtattttg cgaagcatcc ccgaatgggc tacctgccag tgcagactgt cttagagggg 3480gacaacatgg aaactcccga cacaatgtag 3510<210>13<211>1821<212>DNA<213>人<400>13cagttctgac cagtggaagc gtctgcacct ttctctgcag gaacttctgg tgtggctaca 60gctgaaagat gatgaattaa gccggcaggc acctattgga ggcgactttc cagcagttca 120gaagcagaac gatgtacata gggccttcaa gagggaattg aaaactaaag aacctgtaat 180catgagtact cttgagactg tacgaatatt tctgacagag cagcctttgg aaggactaga 240gaaactctac caggagccca gagagctgcc tcctgaggag agagcccaga atgtcactcg 300gcttctacga aagcaggctg aggaggtcaa tactgagtgg gaaaaattga acctgcactc 360cgctgactgg cagagaaaaa tagatgagac ccttgaaaga ctccaggaac ttcaagaggc 420cacggatgag ctggacctca agctgcgcca agctgaggtg atcaagggat cctggcagcc 480cgtgggcgat ctcctcattg actctctcca agatcacctc gagaaagtca aggcacttcg 540aggagaaatt gcgcctctga aagagaacgt gagccacgtc aatgaccttg ctcgccagct 600taccactttg ggcattcagc tctcaccgta taacctcagc actctggaag acctgaacac 660cagatggaag cttctgcagg tggccgtcga ggaccgagtc aggcagctgc atgaagccca 720cagggacttt ggtccagcat ctcagcactt tctttccacg tctgtccagg gtccctggga 780gagagccatc tcgccaaaca aagtgcccta ctatatcaac cacgagactc aaacaacttg 840ctgggaccat cccaaaatga cagagctcta ccagtcttta gctgacctga ataatgtcag 900attctcagct tataggactg ccatgaaact ccgaagactg cagaaggccc tttgcttgga 960tctcttgagc ctgtcagctg catgtgatgc cttggaccag cacaacctca agcaaaatga 1020ccagcccatg gatatcctgc agattattaa ttgtttgacc actatttatg accgcctgga 1080gcaagagcac aacaatttgg tcaacgtccc tctctgcgtg gatatgtgtc tgaactggct 1140gctgaatgtt tatgatacgg gacgaacagg gaggatccgt gtcctgtctt ttaaaactgg 1200catcatttcc ctgtgtaaag cacatttgga agacaagtac agataccttt tcaagcaagt 1260ggcaagttca acaggatttt gtgaccagcg caggctgggc ctccttctgc atgattctat 1320ccaaattcca agacagttgg gtgaagttgc atcctttggg ggcagtaaca ttgagccaag 1380tgtccggagc tgcttccaat ttgctaataa taagccagag atcgaagcgg ccctcttcct 1440agactggatg agactggaac cccagtccat ggtgtggctg cccgtcctgc acagagtggc 1500tgctgcagaa actgccaagc atcaggccaa atgtaacatc tgcaaagagt gtccaatcat 1560tggattcagg tacaggagtc taaagcactt taattatgac atctgccaaa gctgcttttt 1620ttctggtcga gttgcaaaag gccataaaat gcactatccc atggtggaat attgcactcc 1680gactacatca ggagaagatg ttcgagactt tgccaaggta ctaaaaaaca aatttcgaac 1740caaaaggtat tttgcgaagc atccccgaat gggctacctg ccagtgcaga ctgtcttaga 1800gggggacaac atggaaactc c 1821<210>14<211>3446<212>DNA<213>人<400>14attttcacca tggtttggtg ggaagaagta gaggactgtt atgaaagaga agatgttcaa 60aagaaaacat tcacaaaatg ggtaaatgca caattttcta agtttgggaa gcagcatatt 120gagaacctct tcagtgacct acaggatggg aggcgcctcc tagacctcct cgaaggcctg 180acagggcaaa aactgccaaa agaaaaagga tccacaagag ttcatgccct gaacaatgtc 240aacaaggcac tgcgggtttt gcagaacaat aatgttgatt tagtgaatat tggaagtact 300gacatcgtag atggaaatca taaactgact cttggtttga tttggaatat aatcctccac 360tggcaggtca aaaatgtaat gaaaaatatc atggctggat tgcaacaaac caacagtgaa 420aagattctcc tgagctgggt ccgacaatca actcgtaatt atccacaggt taatgtaatc 480aacttcacca ccagctggtc tgatggcctg gctttgaatg ctctcatcca tagtcatagg 540ccagacctat ttgactggaa tagtgtggtt tgccagcagt cagccacaca acgactggaa 600catgcattca acatcgccag atatcaatta ggcatagaga aactactcga tcctgaagat 660gttgatacca cctatccaga taagaagtcc atcttaatgt acatcacatc actcttccaa 720gttttgcctc aacaagtgag cattgaagcc atccaggaag tggaaatgtt gccaaggcca 780cctaaagtga ctaaagaaga acattttcag ttacatcatc aaatgcacta ttctcaacag 840atcacggtca gtctagcaca gggatatgag agaacttctt cccctaagcc tcgattcaag 900agctatgcct acacacaggc tgcttatgtc accacctctg accctacacg gagcccattt 960ccttcacagc atttggaagc tcctgaagac aagtcatttg gcagttcatt gatggagagt 1020gaagtaaacc tggaccgtta tcaaacagct ttagaagaag tattatcgtg gcttctttct 1080gctgaggaca cattgcaagc acaaggagag atttctaatg atgtggaagt ggtgaaagac 1140cagtttcata ctcatgaggg gtacatgatg gatttgacag cccatcaggg ccgggttggt 1200aatattctac aattgggaag taagctgatt ggaacaggaa aattatcaga agatgaagaa 1260actgaagtac aagagcagat gaatctccta aattcaagat gggaatgcct cagggtagct 1320agcatggaaa aacaaagcaa tttacataga gttttaatgg atctccagaa tcgaaactga 1380aagagttgaa tgactggcta acaaaaacag aagaaagaac aaggaaaatg gaggaagagc 1440ctcttggacc tgatcttgaa gacctaaaac gccaagtaca acaacataag gtgcttcaag 1500aagatctaga acaagaacaa gtcagggtca attctctcac tcacatggtg gtggtagttg 1560atgaatctag tggagatcac gcaactgctg ctttggaaga acaacttaag gtattgggag 1620atcgatgggc aaacatctgt agatggacag aagaccgctg ggttctttta caagacatcc 1680ttctcaaatg gcaacgtctt actgaagaac agtgcctttt tagtgcatgg ctttcagaaa 1740aagaagatgc agtgaacaag attcacacaa ctggctttaa agatcaaaat gaaatgttat 1800caagtcttca aaaactggcc gttttaaaag cggatctaga aaagaaaaag caatccatgg 1860gcaaactgta ttcactcaaa caagatcttc tttcaacact gaagaataag tcagtgaccc 1920agaagacgga agcatggctg gataactttg cccggtgttg ggataattta gtccaaaaac 1980ttgaaaagag tacagcacag acccttgaaa gactccagga acttcaagag gccacggatg 2040agctggacct caagctgcgc caagctgagg tgatcaaggg atcctggcag cccgtgggcg 2100atctcctcat tgactctctc caagatcacc tcgagaaagt caaggcactt cgaggagaaa 2160ttgcgcctct gaaagagaac gtgagccacg tcaatgacct tgctcgccag cttaccactt 2220tgggcattca gctctcaccg tataacctca gcactctgga agacctgaac accagatgga 2280agcttctgca ggtggccgtc gaggaccgag tcaggcagct gcatgaagcc cacagggact 2340ttggtccagc atctcagcac tttctttcca cgtctgtcca gggtccctgg gagagagcca 2400tctcgccaaa caaagtgccc tactatatca accacgagac tcaaacaact tgctgggacc 2460atcccaaaat gacagagctc taccagtctt tagctgacct gaataatgtc agattctcag 2520cttataggac tgccatgaaa ctccgaagac tgcagaaggc cctttgcttg gatctcttga 2580gcctgtcagc tgcatgtgat gccttggacc agcacaacct caagcaaaat gaccagccca 2640tggatatcct gcagattatt aattgtttga ccactattta tgaccgcctg gagcaagagc 2700acaacaattt ggtcaacgtc cctctctgcg tggatatgtg tctgaactgg ctgctgaatg 2760tttatgatac gggacgaaca gggaggatcc gtgtcctgtc ttttaaaact ggcatcattt 2820ccctgtgtaa agcacatttg gaagacaagt acagatacct tttcaagcaa gtggcaagtt 2880caacaggatt ttgtgaccag cgcaggctgg gcctccttct gcatgattct atccaaattc 2940caagacagtt gggtgaagtt gcatcctttg ggggcagtaa cattgagcca agtgtccgga 3000gctgcttcca atttgctaat aataagccag agatcgaagc ggccctcttc ctagactgga 3060tgagactgga accccagtcc atggtgtggc tgcccgtcct gcacagagtg gctgctgcag 3120aaactgccaa gcatcaggcc aaatgtaaca tctgcaaaga gtgtccaatc attggattca 3180ggtacaggag tctaaagcac tttaattatg acatctgcca aagctgcttt ttttctggtc 3240gagttgcaaa aggccataaa atgcactatc ccatggtgga atattgcact ccgactacat 3300caggagaaga tgttcgagac tttgccaagg tactaaaaaa caaatttcga accaaaaggt 3360attttgcgaa gcatccccga atgggctacc tgccagtgca gactgtctta gagggggaca 3420acatggaaac tcccgacaca atgtag 3446<210>15<211>1434<212>DNA<213>人<400>15gacccttgaa agactccagg aacttcaaga ggccacggat gagctggacc tcaagctgcg 60ccaagctgag gtgatcaagg gatcctggca gcccgtgggc gatctcctca ttgactctct 120ccaagatcac ctcgagaaag tcaaggcact tcgaggagaa attgcgcctc tgaaagagaa 180cgtgagccac gtcaatgacc ttgctcgcca gcttaccact ttgggcattc agctctcacc 240gtataacctc agcactctgg aagacctgaa caccagatgg aagcttctgc aggtggccgt 300cgaggaccga gtcaggcagc tgcatgaagc ccacagggac tttggtccag catctcagca 360ctttctttcc acgtctgtcc agggtccctg ggagagagcc atctcgccaa acaaagtgcc 420ctactatatc aaccacgaga ctcaaacaac ttgctgggac catcccaaaa tgacagagct 480ctaccagtct ttagctgacc tgaataatgt cagattctca gcttatagga ctgccatgaa 540actccgaaga ctgcagaagg ccctttgctt ggatctcttg agcctgtcag ctgcatgtga 600tgccttggac cagcacaacc tcaagcaaaa tgaccagccc atggatatcc tgcagattat 660taattgtttg accactattt atgaccgcct ggagcaagag cacaacaatt tggtcaacgt 720ccctctctgc gtggatatgt gtctgaactg gctgctgaat gtttatgata cgggacgaac 780agggaggatc cgtgtcctgt cttttaaaac tggcatcatt tccctgtgta aagcacattt 840ggaagacaag tacagatacc ttttcaagca agtggcaagt tcaacaggat tttgtgacca 900gcgcaggctg ggcctccttc tgcatgattc tatccaaatt ccaagacagt tgggtgaagt 960tgcatccttt gggggcagta acattgagcc aagtgtccgg agctgcttcc aatttgctaa 1020taataagcca gagatcgaag cggccctctt cctagactgg atgagactgg aaccccagtc 1080catggtgtgg ctgcccgtcc tgcacagagt ggctgctgca gaaactgcca agcatcaggc 1140caaatgtaac atctgcaaag agtgtccaat cattggattc aggtacagga gtctaaagca 1200ctttaattat gacatctgcc aaagctgctt tttttctggt cgagttgcaa aaggccataa 1260aatgcactat cccatggtgg aatattgcac tccgactaca tcaggagaag atgttcgaga 1320ctttgccaag gtactaaaaa acaaatttcg aaccaaaagg tattttgcga agcatccccg 1380aatgggctac ctgccagtgc agactgtctt agagggggac aacatggaaa ctcc 1434<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>16attttcacca tggtttggtg ggaagaag28<210>17<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>17cagcctgacc tagctcctgg actga 25<210>18<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>18actcatagat tactgcaaca gttcc 25<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>19agttctgacc agtggaagcg 20<210>20<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>20acccttgaaa gactccagga ac 22<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>21tctatgtaaa ttgctttgtt 20<210>22<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>22gtcttgtaaa agaacccagc ggtct 25<210>23<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>23ctgtgctgta ctcttttcaa gtttt 25<210>24<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>24aggtacctcc aacatcaagg aagat 25<210>25<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>25ctacattgtg tcgggagttt ccatgttgtc 30<210>26<211>955<212>DNA<213>人<400>26ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120gccaactcca tcactagggg ttcctagatc agcttgcatg cccactacgg gtctaggctg 180cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taacccagac 240atgtggctgc cccccccccc ccaacacctg ctgcctgagc ctcaccccca ccccggtgcc 300tgggtcttag gctctgtaca ccatggagga gaagctcgct ctaaaaataa ccctgtccct 360ggtggatccc ctgcatgccc aatcaaggct gtgggggact gagggcaggc tgtaacaggc 420ttgggggcca gggcttatac gtgcctggga ctcccaaagt attactgttc catgttcccg 480gcgaagggcc agctgtcccc cgccagctag actcagcact tagtttagga accagtgagc 540aagtcagccc ttggggcagc ccatacaagg ccatggggct gggcaagctg cacgcctggg 600tccggggtgg gcacggtgcc cgggcaacga gctgaaagct catctgctct caggggcccc 660tccctgggga cagcccctcc tggctagtca caccctgtag gctcctctat ataacccagg 720ggcacagggg ctgcccccgg gtcactcgag aggcctaata aagagctcag atgcatcgat 780cagagtgtgt tggttttttg tgtgagatct aggaacccct agtgatggag ttggccactc 840cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga 900cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaa 955<210>27<211>5149<212>DNA<213>人<400>27ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120gccaactcca tcactagggg ttcctagatc tgaattcgag cttgcatgcc cactacgggt 180ctaggctgcc catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc gagatgcctg gttataatta 240acccagacat gtggctgccc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct cacccccacc 300ccggtgcctg ggtcttaggc tctgtacacc atggaggaga agctcgctct aaaaataacc 360ctgtccctgg tggatcccct gcatgcccaa tcaaggctgt gggggactga gggcaggctg 420taacaggctt gggggccagg gcttatacgt gcctgggact cccaaagtat tactgttcca 480tgttcccggc gaagggccag ctgtcccccg ccagctagac tcagcactta gtttaggaac 540cagtgagcaa gtcagccctt ggggcagccc atacaaggcc atggggctgg gcaagctgca 600cgcctgggtc cggggtgggc acggtgcccg ggcaacgagc tgaaagctca tctgctctca 660ggggcccctc cctggggaca gcccctcctg gctagtcaca ccctgtaggc tcctctatat 720aacccagggg cacaggggct gcccccgggt cactcgaatt ttcaccatgg tttggtggga 780agaagtagag gactgttatg aaagagaaga tgttcaaaag aaaacattca caaaatgggt 840aaatgcacaa ttttctaagt ttgggaagca gcatattgag aacctcttca gtgacctaca 900ggatgggagg cgcctcctag acctcctcga aggcctgaca gggcaaaaac tgccaaaaga 960aaaaggatcc acaagagttc atgccctgaa caatgtcaac aaggcactgc gggttttgca 1020gaacaataat gttgatttag tgaatattgg aagtactgac atcgtagatg gaaatcataa 1080actgactctt ggtttgattt ggaatataat cctccactgg caggtcaaaa atgtaatgaa 1140aaatatcatg gctggattgc aacaaaccaa cagtgaaaag attctcctga gctgggtccg 1200acaatcaact cgtaattatc cacaggttaa tgtaatcaac ttcaccacca gctggtctga 1260tggcctggct ttgaatgctc tcatccatag tcataggcca gacctatttg actggaatag 1320tgtggtttgc cagcagtcag ccacacaacg actggaacat gcattcaaca tcgccagata 1380tcaattaggc atagagaaac tactcgatcc tgaagatgtt gataccacct atccagataa 1440gaagtccatc ttaatgtaca tcacatcact cttccaagtt ttgcctcaac aagtgagcat 1500tgaagccatc caggaagtgg aaatgttgcc aaggccacct aaagtgacta aagaagaaca 1560ttttcagtta catcatcaaa tgcactattc tcaacagatc acggtcagtc tagcacaggg 1620atatgagaga acttcttccc ctaagcctcg attcaagagc tatgcctaca cacaggctgc 1680ttatgtcacc acctctgacc ctacacggag cccatttcct tcacagcatt tggaagctcc 1740tgaagacaag tcatttggca gttcattgat ggagagtgaa gtaaacctgg accgttatca 1800aacagcttta gaagaagtat tatcgtggct tctttctgct gaggacacat tgcaagcaca 1860aggagagatt tctaatgatg tggaagtggt gaaagaccag tttcatactc atgaggggta 1920catgatggat ttgacagccc atcagggccg ggttggtaat attctacaat tgggaagtaa 1980gctgattgga acaggaaaat tatcagaaga tgaagaaact gaagtacaag agcagatgaa 2040tctcctaaat tcaagatggg aatgcctcag ggtagctagc atggaaaaac aaagcaattt 2100acatagagtt ttaatggatc tccagaatca gaaactgaaa gagttgaatg actggctaac 2160aaaaacagaa gaaagaacaa ggaaaatgga ggaagagcct cttggacctg atcttgaaga 2220cctaaaacgc caagtacaac aacataaggt gcttcaagaa gatctagaac aagaacaagt 2280cagggtcaat tctctcactc acatggtggt ggtagttgat gaatctagtg gagatcacgc 2340aactgctgct ttggaagaac aacttaaggt attgggagat cgatgggcaa acatctgtag 2400atggacagaa gaccgctggg ttcttttaca agacatcctt ctcaaatggc aacgtcttac 2460tgaagaacag tgccttttta gtgcatggct ttcagaaaaa gaagatgcag tgaacaagat 2520tcacacaact ggctttaaag atcaaaatga aatgttatca agtcttcaaa aactggccgt 2580tttaaaagcg gatctagaaa agaaaaagca atccatgggc aaactgtatt cactcaaaca 2640agatcttctt tcaacactga agaataagtc agtgacccag aagacggaag catggctgga 2700taactttgcc cggtgttggg ataatttagt ccaaaaactt gaaaagagta cagcacagac 2760tcatagatta ctgcaacagt tccccctgga cctggaaaag tttcttgcct ggcttacaga 2820agctgaaaca actgccaatg tcctacagga tgctacccgt aaggaaaggc tcctagaaga 2880ctccaaggga gtaaaagagc tgatgaaaca atggcaagac ctccaaggtg aaattgaagc 2940tcacacagat gtttatcaca acctggatga aaacagccaa aaaatcctga gatccctgga 3000aggttccgat gatgcagtcc tgttacaaag acgtttggat aacatgaact tcaagtggag 3060tgaacttcgg aaaaagtctc tcaacattag gtcccatttg gaagccagtt ctgaccagtg 3120gaagcgtctg cacctttctc tgcaggaact tctggtgtgg ctacagctga aagatgatga 3180attaagccgg caggcaccta ttggaggcga ctttccagca gttcagaagc agaacgatgt 3240acatagggcc ttcaagaggg aattgaaaac taaagaacct gtaatcatga gtactcttga 3300gactgtacga atatttctga cagagcagcc tttggaagga ctagagaaac tctaccagga 3360gcccagagag ctgcctcctg aggagagagc ccagaatgtc actcggcttc tacgaaagca 3420ggctgaggag gtcaatactg agtgggaaaa attgaacctg cactccgctg actggcagag 3480aaaaatagat gagacccttg aaagactcca ggaacttcaa gaggccacgg atgagctgga 3540cctcaagctg cgccaagctg aggtgatcaa gggatcctgg cagcccgtgg gcgatctcct 3600cattgactct ctccaagatc acctcgagaa agtcaaggca cttcgaggag aaattgcgcc 3660tctgaaagag aacgtgagcc acgtcaatga ccttgctcgc cagcttacca ctttgggcat 3720tcagctctca ccgtataacc tcagcactct ggaagacctg aacaccagat ggaagcttct 3780gcaggtggcc gtcgaggacc gagtcaggca gctgcatgaa gcccacaggg actttggtcc 3840agcatctcag cactttcttt ccacgtctgt ccagggtccc tgggagagag ccatctcgcc 3900aaacaaagtg ccctactata tcaaccacga gactcaaaca acttgctggg accatcccaa 3960aatgacagag ctctaccagt ctttagctga cctgaataat gtcagattct cagcttatag 4020gactgccatg aaactccgaa gactgcagaa ggccctttgc ttggatctct tgagcctgtc 4080agctgcatgt gatgccttgg accagcacaa cctcaagcaa aatgaccagc ccatggatat 4140cctgcagatt attaattgtt tgaccactat ttatgaccgc ctggagcaag agcacaacaa 4200tttggtcaac gtccctctct gcgtggatat gtgtctgaac tggctgctga atgtttatga 4260tacgggacga acagggagga tccgtgtcct gtcttttaaa actggcatca tttccctgtg 4320taaagcacat ttggaagaca agtacagata ccttttcaag caagtggcaa gttcaacagg 4380attttgtgac cagcgcaggc tgggcctcct tctgcatgat tctatccaaa ttccaagaca 4440gttgggtgaa gttgcatcct ttgggggcag taacattgag ccaagtgtcc ggagctgctt 4500ccaatttgct aataataagc cagagatcga agcggccctc ttcctagact ggatgagact 4560ggaaccccag tccatggtgt ggctgcccgt cctgcacaga gtggctgctg cagaaactgc 4620caagcatcag gccaaatgta acatctgcaa agagtgtcca atcattggat tcaggtacag 4680gagtctaaag cactttaatt atgacatctg ccaaagctgc tttttttctg gtcgagttgc 4740aaaaggccat aaaatgcact atcccatggt ggaatattgc actccgacta catcaggaga 4800agatgttcga gactttgcca aggtactaaa aaacaaattt cgaaccaaaa ggtattttgc 4860gaagcatccc cgaatgggct acctgccagt gcagactgtc ttagaggggg acaacatgga 4920aactcccgac acaatgtagt cgagaggcct aataaagagc tcagatgcat cgatcagagt 4980gtgttggttt tttgtgtgag atctaggaac ccctagtgat ggagttggcc actccctctc 5040tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgccc gggcaaagcc cgggcgtcgg gcgacctttg 5100gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaa 5149<210>28<211>4966<212>DNA<213>人<400>28ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120gccaactcca tcactagggg ttcctagatc tgaattcgag cttgcatgcc cactacgggt 180ctaggctgcc catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc gagatgcctg gttataatta 240acccagacat gtggctgccc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct cacccccacc 300ccggtgcctg ggtcttaggc tctgtacacc atggaggaga agctcgctct aaaaataacc 360ctgtccctgg tggatcccct gcatgcccaa tcaaggctgt gggggactga gggcaggctg 420taacaggctt gggggccagg gcttatacgt gcctgggact cccaaagtat tactgttcca 480tgttcccggc gaagggccag ctgtcccccg ccagctagac tcagcactta gtttaggaac 540cagtgagcaa gtcagccctt ggggcagccc atacaaggcc atggggctgg gcaagctgca 600cgcctgggtc cggggtgggc acggtgcccg ggcaacgagc tgaaagctca tctgctctca 660ggggcccctc cctggggaca gcccctcctg gctagtcaca ccctgtaggc tcctctatat 720aacccagggg cacaggggct gcccccgggt cactcgaatt ttcaccatgg tttggtggga 780agaagtagag gactgttatg aaagagaaga tgttcaaaag aaaacattca caaaatgggt 840aaatgcacaa ttttctaagt ttgggaagca gcatattgag aacctcttca gtgacctaca 900ggatgggagg cgcctcctag acctcctcga aggcctgaca gggcaaaaac tgccaaaaga 960aaaaggatcc acaagagttc atgccctgaa caatgtcaac aaggcactgc gggttttgca 1020gaacaataat gttgatttag tgaatattgg aagtactgac atcgtagatg gaaatcataa 1080actgactctt ggtttgattt ggaatataat cctccactgg caggtcaaaa atgtaatgaa 1140aaatatcatg gctggattgc aacaaaccaa cagtgaaaag attctcctga gctgggtccg 1200acaatcaact cgtaattatc cacaggttaa tgtaatcaac ttcaccacca gctggtctga 1260tggcctggct ttgaatgctc tcatccatag tcataggcca gacctatttg actggaatag 1320tgtggtttgc cagcagtcag ccacacaacg actggaacat gcattcaaca tcgccagata 1380tcaattaggc atagagaaac tactcgatcc tgaagatgtt gataccacct atccagataa 1440gaagtccatc ttaatgtaca tcacatcact cttccaagtt ttgcctcaac aagtgagcat 1500tgaagccatc caggaagtgg aaatgttgcc aaggccacct aaagtgacta aagaagaaca 1560ttttcagtta catcatcaaa tgcactattc tcaacagatc acggtcagtc tagcacaggg 1620atatgagaga acttcttccc ctaagcctcg attcaagagc tatgcctaca cacaggctgc 1680ttatgtcacc acctctgacc ctacacggag cccatttcct tcacagcatt tggaagctcc 1740tgaagacaag tcatttggca gttcattgat ggagagtgaa gtaaacctgg accgttatca 1800aacagcttta gaagaagtat tatcgtggct tctttctgct gaggacacat tgcaagcaca 1860aggagagatt tctaatgatg tggaagtggt gaaagaccag tttcatactc atgaggggta 1920catgatggat ttgacagccc atcagggccg ggttggtaat attctacaat tgggaagtaa 1980gctgattgga acaggaaaat tatcagaaga tgaagaaact gaagtacaag agcagatgaa 2040tctcctaaat tcaagatggg aatgcctcag ggtagctagc atggaaaaac aaagcaattt 2100acatagagtt ttaatggatc tccagaatca gaaactgaaa gagttgaatg actggctaac 2160aaaaacagaa gaaagaacaa ggaaaatgga ggaagagcct cttggacctg atcttgaaga 2220cctaaaacgc caagtacaac aacataaggt gcttcaagaa gatctagaac aagaacaagt 2280cagggtcaat tctctcactc acatggtggt ggtagttgat gaatctagtg gagatcacgc 2340aactgctgct ttggaagaac aacttaaggt attgggagat cgatgggcaa acatctgtag 2400atggacagaa gaccgctggg ttcttttaca agaccagcct gacctagctc ctggactgac 2460cactattgga gcctctccta ctcagactgt tactctggtg acacaacctg tggttactaa 2520ggaaactgcc atctccaaac tagaaatgcc atcttccttg atgttggagg tacctactca 2580tagattactg caacagttcc ccctggacct ggaaaagttt cttgcctggc ttacagaagc 2640tgaaacaact gccaatgtcc tacaggatgc tacccgtaag gaaaggctcc tagaagactc 2700caagggagta aaagagctga tgaaacaatg gcaagacctc caaggtgaaa ttgaagctca 2760cacagatgtt tatcacaacc tggatgaaaa cagccaaaaa atcctgagat ccctggaagg 2820ttccgatgat gcagtcctgt tacaaagacg tttggataac atgaacttca agtggagtga 2880acttcggaaa aagtctctca acattaggtc ccatttggaa gccagttctg accagtggaa 2940gcgtctgcac ctttctctgc aggaacttct ggtgtggcta cagctgaaag atgatgaatt 3000aagccggcag gcacctattg gaggcgactt tccagcagtt cagaagcaga acgatgtaca 3060tagggccttc aagagggaat tgaaaactaa agaacctgta atcatgagta ctcttgagac 3120tgtacgaata tttctgacag agcagccttt ggaaggacta gagaaactct accaggagcc 3180cagagagctg cctcctgagg agagagccca gaatgtcact cggcttctac gaaagcaggc 3240tgaggaggtc aatactgagt gggaaaaatt gaacctgcac tccgctgact ggcagagaaa 3300aatagatgag acccttgaaa gactccagga acttcaagag gccacggatg agctggacct 3360caagctgcgc caagctgagg tgatcaaggg atcctggcag cccgtgggcg atctcctcat 3420tgactctctc caagatcacc tcgagaaagt caaggcactt cgaggagaaa ttgcgcctct 3480gaaagagaac gtgagccacg tcaatgacct tgctcgccag cttaccactt tgggcattca 3540gctctcaccg tataacctca gcactctgga agacctgaac accagatgga agcttctgca 3600ggtggccgtc gaggaccgag tcaggcagct gcatgaagcc cacagggact ttggtccagc 3660atctcagcac tttctttcca cgtctgtcca gggtccctgg gagagagcca tctcgccaaa 3720caaagtgccc tactatatca accacgagac tcaaacaact tgctgggacc atcccaaaat 3780gacagagctc taccagtctt tagctgacct gaataatgtc agattctcag cttataggac 3840tgccatgaaa ctccgaagac tgcagaaggc cctttgcttg gatctcttga gcctgtcagc 3900tgcatgtgat gccttggacc agcacaacct caagcaaaat gaccagccca tggatatcct 3960gcagattatt aattgtttga ccactattta tgaccgcctg gagcaagagc acaacaattt 4020ggtcaacgtc cctctctgcg tggatatgtg tctgaactgg ctgctgaatg tttatgatac 4080gggacgaaca gggaggatcc gtgtcctgtc ttttaaaact ggcatcattt ccctgtgtaa 4140agcacatttg gaagacaagt acagatacct tttcaagcaa gtggcaagtt caacaggatt 4200ttgtgaccag cgcaggctgg gcctccttct gcatgattct atccaaattc caagacagtt 4260gggtgaagtt gcatcctttg ggggcagtaa cattgagcca agtgtccgga gctgcttcca 4320atttgctaat aataagccag agatcgaagc ggccctcttc ctagactgga tgagactgga 4380accccagtcc atggtgtggc tgcccgtcct gcacagagtg gctgctgcag aaactgccaa 4440gcatcaggcc aaatgtaaca tctgcaaaga gtgtccaatc attggattca ggtacaggag 4500tctaaagcac tttaattatg acatctgcca aagctgcttt ttttctggtc gagttgcaaa 4560aggccataaa atgcactatc ccatggtgga atattgcact ccgactacat caggagaaga 4620tgttcgagac tttgccaagg tactaaaaaa caaatttcga accaaaaggt attttgcgaa 4680gcatccccga atgggctacc tgccagtgca gactgtctta gagggggaca acatggaaac 4740tcccgacaca atgtagtcga gaggcctaat aaagagctca gatgcatcga tcagagtgtg 4800ttggtttttt gtgtgagatc taggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc 4860gcgctcgctc gctcactgag gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg acctttggtc 4920gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaa4966<210>29<211>4825<212>DNA<213>人<400>29ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120gccaactcca tcactagggg ttcctagatc tgaattcgag cttgcatgcc cactacgggt 180ctaggctgcc catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc gagatgcctg gttataatta 240acccagacat gtggctgccc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct cacccccacc 300ccggtgcctg ggtcttaggc tctgtacacc atggaggaga agctcgctct aaaaataacc 360ctgtccctgg tggatcccct gcatgcccaa tcaaggctgt gggggactga gggcaggctg 420taacaggctt gggggccagg gcttatacgt gcctgggact cccaaagtat tactgttcca 480tgttcccggc gaagggccag ctgtcccccg ccagctagac tcagcactta gtttaggaac 540cagtgagcaa gtcagccctt ggggcagccc atacaaggcc atggggctgg gcaagctgca 600cgcctgggtc cggggtgggc acggtgcccg ggcaacgagc tgaaagctca tctgctctca 660ggggcccctc cctggggaca gcccctcctg gctagtcaca ccctgtaggc tcctctatat 720aacccagggg cacaggggct gcccccgggt cactcgaatt ttcaccatgg tttggtggga 780agaagtagag gactgttatg aaagagaaga tgttcaaaag aaaacattca caaaatgggt 840aaatgcacaa ttttctaagt ttgggaagca gcatattgag aacctcttca gtgacctaca 900ggatgggagg cgcctcctag acctcctcga aggcctgaca gggcaaaaac tgccaaaaga 960aaaaggatcc acaagagttc atgccctgaa caatgtcaac aaggcactgc gggttttgca 1020gaacaataat gttgatttag tgaatattgg aagtactgac atcgtagatg gaaatcataa 1080actgactctt ggtttgattt ggaatataat cctccactgg caggtcaaaa atgtaatgaa 1140aaatatcatg gctggattgc aacaaaccaa cagtgaaaag attctcctga gctgggtccg 1200acaatcaact cgtaattatc cacaggttaa tgtaatcaac ttcaccacca gctggtctga 1260tggcctggct ttgaatgctc tcatccatag tcataggcca gacctatttg actggaatag 1320tgtggtttgc cagcagtcag ccacacaacg actggaacat gcattcaaca tcgccagata 1380tcaattaggc atagagaaac tactcgatcc tgaagatgtt gataccacct atccagataa 1440gaagtccatc ttaatgtaca tcacatcact cttccaagtt ttgcctcaac aagtgagcat 1500tgaagccatc caggaagtgg aaatgttgcc aaggccacct aaagtgacta aagaagaaca 1560ttttcagtta catcatcaaa tgcactattc tcaacagatc acggtcagtc tagcacaggg 1620atatgagaga acttcttccc ctaagcctcg attcaagagc tatgcctaca cacaggctgc 1680ttatgtcacc acctctgacc ctacacggag cccatttcct tcacagcatt tggaagctcc 1740tgaagacaag tcatttggca gttcattgat ggagagtgaa gtaaacctgg accgttatca 1800aacagcttta gaagaagtat tatcgtggct tctttctgct gaggacacat tgcaagcaca 1860aggagagatt tctaatgatg tggaagtggt gaaagaccag tttcatactc atgaggggta 1920catgatggat ttgacagccc atcagggccg ggttggtaat attctacaat tgggaagtaa 1980gctgattgga acaggaaaat tatcagaaga tgaagaaact gaagtacaag agcagatgaa 2040tctcctaaat tcaagatggg aatgcctcag ggtagctagc atggaaaaac aaagcaattt 2100acatagagtt ttaatggatc tccagaatca gaaactgaaa gagttgaatg actggctaac 2160aaaaacagaa gaaagaacaa ggaaaatgga ggaagagcct cttggacctg atcttgaaga 2220cctaaaacgc caagtacaac aacataaggt gcttcaagaa gatctagaac aagaacaagt 2280cagggtcaat tctctcactc acatggtggt ggtagttgat gaatctagtg gagatcacgc 2340aactgctgct ttggaagaac aacttaaggt attgggagat cgatgggcaa acatctgtag 2400atggacagaa gaccgctggg ttcttttaca agacactcat agattactgc aacagttccc 2460cctggacctg gaaaagtttc ttgcctggct tacagaagct gaaacaactg ccaatgtcct 2520acaggatgct acccgtaagg aaaggctcct agaagactcc aagggagtaa aagagctgat 2580gaaacaatgg caagacctcc aaggtgaaat tgaagctcac acagatgttt atcacaacct 2640ggatgaaaac agccaaaaaa tcctgagatc cctggaaggt tccgatgatg cagtcctgtt 2700acaaagacgt ttggataaca tgaacttcaa gtggagtgaa cttcggaaaa agtctctcaa 2760cattaggtcc catttggaag ccagttctga ccagtggaag cgtctgcacc tttctctgca 2820ggaacttctg gtgtggctac agctgaaaga tgatgaatta agccggcagg cacctattgg 2880aggcgacttt ccagcagttc agaagcagaa cgatgtacat agggccttca agagggaatt 2940gaaaactaaa gaacctgtaa tcatgagtac tcttgagact gtacgaatat ttctgacaga 3000gcagcctttg gaaggactag agaaactcta ccaggagccc agagagctgc ctcctgagga 3060gagagcccag aatgtcactc ggcttctacg aaagcaggct gaggaggtca atactgagtg 3120ggaaaaattg aacctgcact ccgctgactg gcagagaaaa atagatgaga cccttgaaag 3180actccaggaa cttcaagagg ccacggatga gctggacctc aagctgcgcc aagctgaggt 3240gatcaaggga tcctggcagc ccgtgggcga tctcctcatt gactctctcc aagatcacct 3300cgagaaagtc aaggcacttc gaggagaaat tgcgcctctg aaagagaacg tgagccacgt 3360caatgacctt gctcgccagc ttaccacttt gggcattcag ctctcaccgt ataacctcag 3420cactctggaa gacctgaaca ccagatggaa gcttctgcag gtggccgtcg aggaccgagt 3480caggcagctg catgaagccc acagggactt tggtccagca tctcagcact ttctttccac 3540gtctgtccag ggtccctggg agagagccat ctcgccaaac aaagtgccct actatatcaa 3600ccacgagact caaacaactt gctgggacca tcccaaaatg acagagctct accagtcttt 3660agctgacctg aataatgtca gattctcagc ttataggact gccatgaaac tccgaagact 3720gcagaaggcc ctttgcttgg atctcttgag cctgtcagct gcatgtgatg ccttggacca 3780gcacaacctc aagcaaaatg accagcccat ggatatcctg cagattatta attgtttgac 3840cactatttat gaccgcctgg agcaagagca caacaatttg gtcaacgtcc ctctctgcgt 3900ggatatgtgt ctgaactggc tgctgaatgt ttatgatacg ggacgaacag ggaggatccg 3960tgtcctgtct tttaaaactg gcatcatttc cctgtgtaaa gcacatttgg aagacaagta 4020cagatacctt ttcaagcaag tggcaagttc aacaggattt tgtgaccagc gcaggctggg 4080cctccttctg catgattcta tccaaattcc aagacagttg ggtgaagttg catcctttgg 4140gggcagtaac attgagccaa gtgtccggag ctgcttccaa tttgctaata ataagccaga 4200gatcgaagcg gccctcttcc tagactggat gagactggaa ccccagtcca tggtgtggct 4260gcccgtcctg cacagagtgg ctgctgcaga aactgccaag catcaggcca aatgtaacat 4320ctgcaaagag tgtccaatca ttggattcag gtacaggagt ctaaagcact ttaattatga 4380catctgccaa agctgctttt tttctggtcg agttgcaaaa ggccataaaa tgcactatcc 4440catggtggaa tattgcactc cgactacatc aggagaagat gttcgagact ttgccaaggt 4500actaaaaaac aaatttcgaa ccaaaaggta ttttgcgaag catccccgaa tgggctacct 4560gccagtgcag actgtcttag agggggacaa catggaaact cccgacacaa tgtagtcgag 4620aggcctaata aagagctcag atgcatcgat cagagtgtgt tggttttttg tgtgagatct 4680aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 4740ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc 4800gagcgcgcag agagggagtg gccaa 4825<210>30<211>4498<212>DNA<213>人<400>30ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120gccaactcca tcactagggg ttcctagatc tgaattcgag cttgcatgcc cactacgggt 180ctaggctgcc catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc gagatgcctg gttataatta 240acccagacat gtggctgccc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct cacccccacc 300ccggtgcctg ggtcttaggc tctgtacacc atggaggaga agctcgctct aaaaataacc 360ctgtccctgg tggatcccct gcatgcccaa tcaaggctgt gggggactga gggcaggctg 420taacaggctt gggggccagg gcttatacgt gcctgggact cccaaagtat tactgttcca 480tgttcccggc gaagggccag ctgtcccccg ccagctagac tcagcactta gtttaggaac 540cagtgagcaa gtcagccctt ggggcagccc atacaaggcc atggggctgg gcaagctgca 600cgcctgggtc cggggtgggc acggtgcccg ggcaacgagc tgaaagctca tctgctctca 660ggggcccctc cctggggaca gcccctcctg gctagtcaca ccctgtaggc tcctctatat 720aacccagggg cacaggggct gcccccgggt cactcgaatt ttcaccatgg tttggtggga 780agaagtagag gactgttatg aaagagaaga tgttcaaaag aaaacattca caaaatgggt 840aaatgcacaa ttttctaagt ttgggaagca gcatattgag aacctcttca gtgacctaca 900ggatgggagg cgcctcctag acctcctcga aggcctgaca gggcaaaaac tgccaaaaga 960aaaaggatcc acaagagttc atgccctgaa caatgtcaac aaggcactgc gggttttgca 1020gaacaataat gttgatttag tgaatattgg aagtactgac atcgtagatg gaaatcataa 1080actgactctt ggtttgattt ggaatataat cctccactgg caggtcaaaa atgtaatgaa 1140aaatatcatg gctggattgc aacaaaccaa cagtgaaaag attctcctga gctgggtccg 1200acaatcaact cgtaattatc cacaggttaa tgtaatcaac ttcaccacca gctggtctga 1260tggcctggct ttgaatgctc tcatccatag tcataggcca gacctatttg actggaatag 1320tgtggtttgc cagcagtcag ccacacaacg actggaacat gcattcaaca tcgccagata 1380tcaattaggc atagagaaac tactcgatcc tgaagatgtt gataccacct atccagataa 1440gaagtccatc ttaatgtaca tcacatcact cttccaagtt ttgcctcaac aagtgagcat 1500tgaagccatc caggaagtgg aaatgttgcc aaggccacct aaagtgacta aagaagaaca 1560ttttcagtta catcatcaaa tgcactattc tcaacagatc acggtcagtc tagcacaggg 1620atatgagaga acttcttccc ctaagcctcg attcaagagc tatgcctaca cacaggctgc 1680ttatgtcacc acctctgacc ctacacggag cccatttcct tcacagcatt tggaagctcc 1740tgaagacaag tcatttggca gttcattgat ggagagtgaa gtaaacctgg accgttatca 1800aacagcttta gaagaagtat tatcgtggct tctttctgct gaggacacat tgcaagcaca 1860aggagagatt tctaatgatg tggaagtggt gaaagaccag tttcatactc atgaggggta 1920catgatggat ttgacagccc atcagggccg ggttggtaat attctacaat tgggaagtaa 1980gctgattgga acaggaaaat tatcagaaga tgaagaaact gaagtacaag agcagatgaa 2040tctcctaaat tcaagatggg aatgcctcag ggtagctagc atggaaaaac aaagcaattt 2100acatagaact catagattac tgcaacagtt ccccctggac ctggaaaagt ttcttgcctg 2160gcttacagaa gctgaaacaa ctgccaatgt cctacaggat gctacccgta aggaaaggct 2220cctagaagac tccaagggag taaaagagct gatgaaacaa tggcaagacc tccaaggtga 2280aattgaagct cacacagatg tttatcacaa cctggatgaa aacagccaaa aaatcctgag 2340atccctggaa ggttccgatg atgcagtcct gttacaaaga cgtttggata acatgaactt 2400caagtggagt gaacttcgga aaaagtctct caacattagg tcccatttgg aagccagttc 2460tgaccagtgg aagcgtctgc acctttctct gcaggaactt ctggtgtggc tacagctgaa 2520agatgatgaa ttaagccggc aggcacctat tggaggcgac tttccagcag ttcagaagca 2580gaacgatgta catagggcct tcaagaggga attgaaaact aaagaacctg taatcatgag 2640tactcttgag actgtacgaa tatttctgac agagcagcct ttggaaggac tagagaaact 2700ctaccaggag cccagagagc tgcctcctga ggagagagcc cagaatgtca ctcggcttct 2760acgaaagcag gctgaggagg tcaatactga gtgggaaaaa ttgaacctgc actccgctga 2820ctggcagaga aaaatagatg agacccttga aagactccag gaacttcaag aggccacgga 2880tgagctggac ctcaagctgc gccaagctga ggtgatcaag ggatcctggc agcccgtggg 2940cgatctcctc attgactctc tccaagatca cctcgagaaa gtcaaggcac ttcgaggaga 3000aattgcgcct ctgaaagaga acgtgagcca cgtcaatgac cttgctcgcc agcttaccac 3060tttgggcatt cagctctcac cgtataacct cagcactctg gaagacctga acaccagatg 3120gaagcttctg caggtggccg tcgaggaccg agtcaggcag ctgcatgaag cccacaggga 3180ctttggtcca gcatctcagc actttctttc cacgtctgtc cagggtccct gggagagagc 3240catctcgcca aacaaagtgc cctactatat caaccacgag actcaaacaa cttgctggga 3300ccatcccaaa atgacagagc tctaccagtc tttagctgac ctgaataatg tcagattctc 3360agcttatagg actgccatga aactccgaag actgcagaag gccctttgct tggatctctt 3420gagcctgtca gctgcatgtg atgccttgga ccagcacaac ctcaagcaaa atgaccagcc 3480catggatatc ctgcagatta ttaattgttt gaccactatt tatgaccgcc tggagcaaga 3540gcacaacaat ttggtcaacg tccctctctg cgtggatatg tgtctgaact ggctgctgaa 3600tgtttatgat acgggacgaa cagggaggat ccgtgtcctg tcttttaaaa ctggcatcat 3660ttccctgtgt aaagcacatt tggaagacaa gtacagatac cttttcaagc aagtggcaag 3720ttcaacagga ttttgtgacc agcgcaggct gggcctcctt ctgcatgatt ctatccaaat 3780tccaagacag ttgggtgaag ttgcatcctt tgggggcagt aacattgagc caagtgtccg 3840gagctgcttc caatttgcta ataataagcc agagatcgaa gcggccctct tcctagactg 3900gatgagactg gaaccccagt ccatggtgtg gctgcccgtc ctgcacagag tggctgctgc 3960agaaactgcc aagcatcagg ccaaatgtaa catctgcaaa gagtgtccaa tcattggatt 4020caggtacagg agtctaaagc actttaatta tgacatctgc caaagctgct ttttttctgg 4080tcgagttgca aaaggccata aaatgcacta tcccatggtg gaatattgca ctccgactac 4140atcaggagaa gatgttcgag actttgccaa ggtactaaaa aacaaatttc gaaccaaaag 4200gtattttgcg aagcatcccc gaatgggcta cctgccagtg cagactgtct tagaggggga 4260caacatggaa actcccgaca caatgtagtc gagaggccta ataaagagct cagatgcatc 4320gatcagagtg tgttggtttt ttgtgtgaga tctaggaacc cctagtgatg gagttggcca 4380ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg 4440cgacctttgg tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaa 4498<210>31<211>4476<212>DNA<213>人<400>31ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120gccaactcca tcactagggg ttcctagatc tgaattcgag cttgcatgcc cactacgggt 180ctaggctgcc catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc gagatgcctg gttataatta 240acccagacat gtggctgccc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct cacccccacc 300ccggtgcctg ggtcttaggc tctgtacacc atggaggaga agctcgctct aaaaataacc 360ctgtccctgg tggatcccct gcatgcccaa tcaaggctgt gggggactga gggcaggctg 420taacaggctt gggggccagg gcttatacgt gcctgggact cccaaagtat tactgttcca 480tgttcccggc gaagggccag ctgtcccccg ccagctagac tcagcactta gtttaggaac 540cagtgagcaa gtcagccctt ggggcagccc atacaaggcc atggggctgg gcaagctgca 600cgcctgggtc cggggtgggc acggtgcccg ggcaacgagc tgaaagctca tctgctctca 660ggggcccctc cctggggaca gcccctcctg gctagtcaca ccctgtggct cctctatata 720acccaggggc acaggggctg cccccgggtc actcgaattt tcaccatggt ttggtgggaa 780gaagtagagg actgttatga aagagaagat gttcaaaaga aaacattcac aaaatgggta 840aatgcacaat tttctaagtt tgggaagcag catattgaga acctcttcag tgacctacag 900gatgggaggc gcctcctaga cctcctcgaa ggcctgacag ggcaaaaact gccaaaagaa 960aaaggatcca caagagttca tgccctgaac aatgtcaaca aggcactgcg ggttttgcag 1020aacaataatg ttgatttagt gaatattgga agtactgaca tcgtagatgg aaatcataaa 1080ctgactcttg gtttgatttg gaatataatc ctccactggc aggtcaaaaa tgtaatgaaa 1140aatatcatgg ctggattgca acaaaccaac agtgaaaaga ttctcctgag ctgggtccga 1200caatcaactc gtaattatcc acaggttaat gtaatcaact tcaccaccag ctggtctgat 1260ggcctggctt tgaatgctct catccatagt cataggccag acctatttga ctggaatagt 1320gtggtttgcc agcagtcagc cacacaacga ctggaacatg cattcaacat cgccagatat 1380caattaggca tagagaaact actcgatcct gaagatgttg ataccaccta tccagataag 1440aagtccatct taatgtacat cacatcactc ttccaagttt tgcctcaaca agtgagcatt 1500gaagccatcc aggaagtgga aatgttgcca aggccaccta aagtgactaa agaagaacat 1560tttcagttac atcatcaaat gcactattct caacagatca cggtcagtct agcacaggga 1620tatgagagaa cttcttcccc taagcctcga ttcaagagct atgcctacac acaggctgct 1680tatgtcacca cctctgaccc tacacggagc ccatttcctt cacagcattt ggaagctcct 1740gaagacaagt catttggcag ttcattgatg gagagtgaag taaacctgga ccgttatcaa 1800acagctttag aagaagtatt atcgtggctt ctttctgctg aggacacatt gcaagcacaa 1860ggagagattt ctaatgatgt ggaagtggtg aaagaccagt ttcatactca tgaggggtac 1920atgatggatt tgacagccca tcagggccgg gttggtaata ttctacaatt gggaagtaag 1980ctgattggaa caggaaaatt atcagaagat gaagaaactg aagtacaaga gcagatgaat 2040ctcctaaatt caagatggga atgcctcagg gtagctagca tggaaaaaca aagcaattta 2100catagagttt taatggatct ccagaatcag aaactgaaag agttgaatga ctggctaaca 2160aaaacagaag aaagaacaag gaaaatggag gaagagcctc ttggacctga tcttgaagac 2220ctaaaacgcc aagtacaaca acataaggtg cttcaagaag atctagaaca agaacaagtc 2280agggtcaatt ctctcactca catggtggtg gtagttgatg aatctagtgg agatcacgca 2340actgctgctt tggaagaaca acttaaggta ttgggagatc gatgggcaaa catctgtaga 2400tggacagaag accgctgggt tcttttacaa gacagttctg accagtggaa gcgtctgcac 2460ctttctctgc aggaacttct ggtgtggcta cagctgaaag atgatgaatt aagccggcag 2520gcacctattg gaggcgactt tccagcagtt cagaagcaga acgatgtaca tagggccttc 2580aagagggaat tgaaaactaa agaacctgta atcatgagta ctcttgagac tgtacgaata 2640tttctgacag agcagccttt ggaaggacta gagaaactct accaggagcc cagagagctg 2700cctcctgagg agagagccca gaatgtcact cggcttctac gaaagcaggc tgaggaggtc 2760aatactgagt gggaaaaatt gaacctgcac tccgctgact ggcagagaaa aatagatgag 2820acccttgaaa gactccagga acttcaagag gccacggatg agctggacct caagctgcgc 2880caagctgagg tgatcaaggg atcctggcag cccgtgggcg atctcctcat tgactctctc 2940caagatcacc tcgagaaagt caaggcactt cgaggagaaa ttgcgcctct gaaagagaac 3000gtgagccacg tcaatgacct tgctcgccag cttaccactt tgggcattca gctctcaccg 3060tataacctca gcactctgga agacctgaac accagatgga agcttctgca ggtggccgtc 3120gaggaccgag tcaggcagct gcatgaagcc cacagggact ttggtccagc atctcagcac 3180tttctttcca cgtctgtcca gggtccctgg gagagagcca tctcgccaaa caaagtgccc 3240tactatatca accacgagac tcaaacaact tgctgggacc atcccaaaat gacagagctc 3300taccagtctt tagctgacct gaataatgtc agattctcag cttataggac tgccatgaaa 3360ctccgaagac tgcagaaggc cctttgcttg gatctcttga gcctgtcagc tgcatgtgat 3420gccttggacc agcacaacct caagcaaaat gaccagccca tggatatcct gcagattatt 3480aattgtttga ccactattta tgaccgcctg gagcaagagc acaacaattt ggtcaacgtc 3540cctctctgcg tggatatgtg tctgaactgg ctgctgaatg tttatgatac gggacgaaca 3600gggaggatcc gtgtcctgtc ttttaaaact ggcatcattt ccctgtgtaa agcacatttg 3660gaagacaagt acagatacct tttcaagcaa gtggcaagtt caacaggatt ttgtgaccag 3720cgcaggctgg gcctccttct gcatgattct atccaaattc caagacagtt gggtgaagtt 3780gcatcctttg ggggcagtaa cattgagcca agtgtccgga gctgcttcca atttgctaat 3840aataagccag agatcgaagc ggccctcttc ctagactgga tgagactgga accccagtcc 3900atggtgtggc tgcccgtcct gcacagagtg gctgctgcag aaactgccaa gcatcaggcc 3960aaatgtaaca tctgcaaaga gtgtccaatc attggattca ggtacaggag tctaaagcac 4020tttaattatg acatctgcca aagctgcttt ttttctggtc gagttgcaaa aggccataaa 4080atgcactatc ccatggtgga atattgcact ccgactacat caggagaaga tgttcgagac 4140tttgccaagg tactaaaaaa caaatttcga accaaaaggt attttgcgaa gcatccccga 4200atgggctacc tgccagtgca gactgtctta gagggggaca acatggaaac tcccgacaca 4260atgtagtcga gaggcctaat aaagagctca gatgcatcga tcagagtgtg ttggtttttt 4320gtgtgagatc taggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc 4380gctcactgag gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 4440agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaa 4476<210>32<211>4414<212>DNA<213>人<400>32ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120gccaactcca tcactagggg ttcctagatc tgaattcgag cttgcatgcc cactacgggt 180ctaggctgcc catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc gagatgcctg gttataatta 240acccagacat gtggctgccc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct cacccccacc 300ccggtgcctg ggtcttaggc tctgtacacc atggaggaga agctcgctct aaaaataacc 360ctgtccctgg tggatcccct gcatgcccaa tcaaggctgt gggggactga gggcaggctg 420taacaggctt gggggccagg gcttatacgt gcctgggact cccaaagtat tactgttcca 480tgttcccggc gaagggccag ctgtcccccg ccagctagac tcagcactta gtttaggaac 540cagtgagcaa gtcagccctt ggggcagccc atacaaggcc atggggctgg gcaagctgca 600cgcctgggtc cggggtgggc acggtgcccg ggcaacgagc tgaaagctca tctgctctca 660ggggcccctc cctggggaca gcccctcctg gctagtcaca ccctgtaggc tcctctatat 720aacccagggg cacaggggct gcccccgggt cactcgaatt ttcaccatgg tttggtggga 780agaagtagag gactgttatg aaagagaaga tgttcaaaag aaaacattca caaaatgggt 840aaatgcacaa ttttctaagt ttgggaagca gcatattgag aacctcttca gtgacctaca 900ggatgggagg cgcctcctag acctcctcga aggcctgaca gggcaaaaac tgccaaaaga 960aaaaggatcc acaagagttc atgccctgaa caatgtcaac aaggcactgc gggttttgca 1020gaacaataat gttgatttag tgaatattgg aagtactgac atcgtagatg gaaatcataa 1080actgactctt ggtttgattt ggaatataat cctccactgg caggtcaaaa atgtaatgaa 1140aaatatcatg gctggattgc aacaaaccaa cagtgaaaag attctcctga gctgggtccg 1200acaatcaact cgtaattatc cacaggttaa tgtaatcaac ttcaccacca gctggtctga 1260tggcctggct ttgaatgctc tcatccatag tcataggcca gacctatttg actggaatag 1320tgtggtttgc cagcagtcag ccacacaacg actggaacat gcattcaaca tcgccagata 1380tcaattaggc atagagaaac tactcgatcc tgaagatgtt gataccacct atccagataa 1440gaagtccatc ttaatgtaca tcacatcact cttccaagtt ttgcctcaac aagtgagcat 1500tgaagccatc caggaagtgg aaatgttgcc aaggccacct aaagtgacta aagaagaaca 1560ttttcagtta catcatcaaa tgcactattc tcaacagatc acggtcagtc tagcacaggg 1620atatgagaga acttcttccc ctaagcctcg attcaagagc tatgcctaca cacaggctgc 1680ttatgtcacc acctctgacc ctacacggag cccatttcct tcacagcatt tggaagctcc 1740tgaagacaag tcatttggca gttcattgat ggagagtgaa gtaaacctgg accgttatca 1800aacagcttta gaagaagtat tatcgtggct tctttctgct gaggacacat tgcaagcaca 1860aggagagatt tctaatgatg tggaagtggt gaaagaccag tttcatactc atgaggggta 1920catgatggat ttgacagccc atcagggccg ggttggtaat attctacaat tgggaagtaa 1980gctgattgga acaggaaaat tatcagaaga tgaagaaact gaagtacaag agcagatgaa 2040tctcctaaat tcaagatggg aatgcctcag ggtagctagc atggaaaaac aaagcaattt 2100acatagagtt ttaatggatc tccagaatca gaaactgaaa gagttgaatg actggctaac 2160aaaaacagaa gaaagaacaa ggaaaatgga ggaagagcct cttggacctg atcttgaaga 2220cctaaaacgc caagtacaac aacataaggt gcttcaagaa gatctagaac aagaacaagt 2280cagggtcaat tctctcactc acatggtggt ggtagttgat gaatctagtg gagatcacgc 2340aactgctgct ttggaagaac aacttaaggt attgggagat cgatgggcaa acatctgtag 2400atggacagaa gaccgctggg ttcttttaca agacatcctt ctcaaatggc aacgtcttac 2460tgaagaacag tgccttttta gtgcatggct ttcagaaaaa gaagatgcag tgaacaagat 2520tcacacaact ggctttaaag atcaaaatga aatgttatca agtcttcaaa aactggccgt 2580tttaaaagcg gatctagaaa agaaaaagca atccatgggc aaactgtatt cactcaaaca 2640agatcttctt tcaacactga agaataagtc agtgacccag aagacggaag catggctgga 2700taactttgcc cggtgttggg ataatttagt ccaaaaactt gaaaagagta cagcacagac 2760ccttgaaaga ctccaggaac ttcaagaggc cacggatgag ctggacctca agctgcgcca 2820agctgaggtg atcaagggat cctggcagcc cgtgggcgat ctcctcattg actctctcca 2880agatcacctc gagaaagtca aggcacttcg aggagaaatt gcgcctctga aagagaacgt 2940gagccacgtc aatgaccttg ctcgccagct taccactttg ggcattcagc tctcaccgta 3000taacctcagc actctggaag acctgaacac cagatggaag cttctgcagg tggccgtcga 3060ggaccgagtc aggcagctgc atgaagccca cagggacttt ggtccagcat ctcagcactt 3120tctttccacg tctgtccagg gtccctggga gagagccatc tcgccaaaca aagtgcccta 3180ctatatcaac cacgagactc aaacaacttg ctgggaccat cccaaaatga cagagctcta 3240ccagtcttta gctgacctga ataatgtcag attctcagct tataggactg ccatgaaact 3300ccgaagactg cagaaggccc tttgcttgga tctcttgagc ctgtcagctg catgtgatgc 3360cttggaccag cacaacctca agcaaaatga ccagcccatg gatatcctgc agattattaa 3420ttgtttgacc actatttatg accgcctgga gcaagagcac aacaatttgg tcaacgtccc 3480tctctgcgtg gatatgtgtc tgaactggct gctgaatgtt tatgatacgg gacgaacagg 3540gaggatccgt gtcctgtctt ttaaaactgg catcatttcc ctgtgtaaag cacatttgga 3600agacaagtac agataccttt tcaagcaagt ggcaagttca acaggatttt gtgaccagcg 3660caggctgggc ctccttctgc atgattctat ccaaattcca agacagttgg gtgaagttgc 3720atcctttggg ggcagtaaca ttgagccaag tgtccggagc tgcttccaat ttgctaataa 3780taagccagag atcgaagcgg ccctcttcct agactggatg agactggaac cccagtccat 3840ggtgtggctg cccgtcctgc acagagtggc tgctgcagaa actgccaagc atcaggccaa 3900atgtaacatc tgcaaagagt gtccaatcat tggattcagg tacaggagtc taaagcactt 3960taattatgac atctgccaaa gctgcttttt ttctggtcga gttgcaaaag gccataaaat 4020gcactatccc atggtggaat attgcactcc gactacatca ggagaagatg ttcgagactt 4080tgccaaggta ctaaaaaaca aatttcgaac caaaaggtat tttgcgaagc atccccgaat 4140gggctacctg ccagtgcaga ctgtcttaga gggggacaac atggaaactc ccgacacaat 4200gtagtcgaga ggcctaataa agagctcaga tgcatcgatc agagtgtgtt ggttttttgt 4260gtgagatcta ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc 4320tcactgaggc cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag 4380tgagcgagcg agcgcgcaga gagggagtgg ccaa 4414<210>33<211>987<212>DNA<213>人<400>33ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120gccaactcca tcactagggg ttcctagatc tgaattcggt acccgttaca taacttacgg 180taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt 240atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac 300ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg 360acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact 420ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt 480ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc 540ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc 600gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 660taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg 720acctccatag aagacaccgg gaccgatcca gcctccggac tctagaggat ccggtactcg 780agaggcctaa taaagagctc agatgcatcg atcagagtgt gttggttttt tgtgtgagat 840ctaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga 900ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga 960gcgagcgcgc agagagggag tggccaa 987<210>34<211>4990<212>DNA<213>人<400>34ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120gccaactcca tcactagggg ttcctagatc tgaattcggt acccgttaca taacttacgg 180taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt 240atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac 300ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg 360acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact 420ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt 480ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc 540ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc 600gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 660taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg 720acctccatag aagacaccgg gaccgatcca gcctccggac tctagaggat ccggtactcg 780aattttcacc atggtttggt gggaagaagt agaggactgt tatgaaagag aagatgttca 840aaagaaaaca ttcacaaaat gggtaaatgc acaattttct aagtttggga agcagcatat 900tgagaacctc ttcagtgacc tacaggatgg gaggcgcctc ctagacctcc tcgaaggcct 960gacagggcaa aaactgccaa aagaaaaagg atccacaaga gttcatgccc tgaacaatgt 1020caacaaggca ctgcgggttt tgcagaacaa taatgttgat ttagtgaata ttggaagtac 1080tgacatcgta gatggaaatc ataaactgac tcttggtttg atttggaata taatcctcca 1140ctggcaggtc aaaaatgtaa tgaaaaatat catggctgga ttgcaacaaa ccaacagtga 1200aaagattctc ctgagctggg tccgacaatc aactcgtaat tatccacagg ttaatgtaat 1260caacttcacc accagctggt ctgatggcct ggctttgaat gctctcatcc atagtcatag 1320gccagaccta tttgactgga atagtgtggt ttgccagcag tcagccacac aacgactgga 1380acatgcattc aacatcgcca gatatcaatt aggcatagag aaactactcg atcctgaaga 1440tgttgatacc acctatccag ataagaagtc catcttaatg tacatcacat cactcttcca 1500agttttgcct caacaagtga gcattgaagc catccaggaa gtggaaatgt tgccaaggcc 1560acctaaagtg actaaagaag aacattttca gttacatcat caaatgcact attctcaaca 1620gatcacggtc agtctagcac agggatatga gagaacttct tcccctaagc ctcgattcaa 1680gagctatgcc tacacacagg ctgcttatgt caccacctct gaccctacac ggagcccatt 1740tccttcacag catttggaag ctcctgaaga caagtcattt ggcagttcat tgatggagag 1800tgaagtaaac ctggaccgtt atcaaacagc tttagaagaa gtattatcgt ggcttctttc 1860tgctgaggac acattgcaag cacaaggaga gatttctaat gatgtggaag tggtgaaaga 1920ccagtttcat actcatgagg ggtacatgat ggatttgaca gcccatcagg gccgggttgg 1980taatattcta caattgggaa gtaagctgat tggaacagga aaattatcag aagatgaaga 2040aactgaagta caagagcaga tgaatctcct aaattcaaga tgggaatgcc tcagggtagc 2100tagcatggaa aaacaaagca atttacatag agttttaatg gatctccaga atcagaaact 2160gaaagagttg aatgactggc taacaaaaac agaagaaaga acaaggaaaa tggaggaaga 2220gcctcttgga cctgatcttg aagacctaaa acgccaagta caacaacata aggtgcttca 2280agaagatcta gaacaagaac aagtcagggt caattctctc actcacatgg tggtggtagt 2340tgatgaatct agtggagatc acgcaactgc tgctttggaa gaacaactta aggtattggg 2400agatcgatgg gcaaacatct gtagatggac agaagaccgc tgggttcttt tacaagacca 2460gcctgaccta gctcctggac tgaccactat tggagcctct cctactcaga ctgttactct 2520ggtgacacaa cctgtggtta ctaaggaaac tgccatctcc aaactagaaa tgccatcttc 2580cttgatgttg gaggtaccta ctcatagatt actgcaacag ttccccctgg acctggaaaa 2640gtttcttgcc tggcttacag aagctgaaac aactgccaat gtcctacagg atgctacccg 2700taaggaaagg ctcctagaag actccaaggg agtaaaagag ctgatgaaac aatggcaaga 2760cctccaaggt gaaattgaag ctcacacaga tgtttatcac aacctggatg aaaacagcca 2820aaaaatcctg agatccctgg aaggttccga tgatgcagtc ctgttacaaa gacgtttgga 2880taacatgaac ttcaagtgga gtgaacttcg gaaaaagtct ctcaacatta ggtcccattt 2940ggaagccagt tctgaccagt ggaagcgtct gcacctttct ctgcaggaac ttctggtgtg 3000gctacagctg aaagatgatg aattaagccg gcaggcacct attggaggcg actttccagc 3060agttcagaag cagaacgatg tacatagggc cttcaagagg gaattgaaaa ctaaagaacc 3120tgtaatcatg agtactcttg agactgtacg aatatttctg acagagcagc ctttggaagg 3180actagagaaa ctctaccagg agcccagaga gctgcctcct gaggagagag cccagaatgt 3240cactcggctt ctacgaaagc aggctgagga ggtcaatact gagtgggaaa aattgaacct 3300gcactccgct gactggcaga gaaaaataga tgagaccctt gaaagactcc aggaacttca 3360agaggccacg gatgagctgg acctcaagct gcgccaagct gaggtgatca agggatcctg 3420gcagcccgtg ggcgatctcc tcattgactc tctccaagat cacctcgaga aagtcaaggc 3480acttcgagga gaaattgcgc ctctgaaaga gaacgtgagc cacgtcaatg accttgctcg 3540ccagcttacc actttgggca ttcagctctc accgtataac ctcagcactc tggaagacct 3600gaacaccaga tggaagcttc tgcaggtggc cgtcgaggac cgagtcaggc agctgcatga 3660agcccacagg gactttggtc cagcatctca gcactttctt tccacgtctg tccagggtcc 3720ctgggagaga gccatctcgc caaacaaagt gccctactat atcaaccacg agactcaaac 3780aacttgctgg gaccatccca aaatgacaga gctctaccag tctttagctg acctgaataa 3840tgtcagattc tcagcttata ggactgccat gaaactccga agactgcaga aggccctttg 3900cttggatctc ttgagcctgt cagctgcatg tgatgccttg gaccagcaca acctcaagca 3960aaatgaccag cccatggata tcctgcagat tattaattgt ttgaccacta tttatgaccg 4020cctggagcaa gagcacaaca atttggtcaa cgtccctctc tgcgtggata tgtgtctgaa 4080ctggctgctg aatgtttatg atacgggacg aacagggagg atccgtgtcc tgtcttttaa 4140aactggcatc atttccctgt gtaaagcaca tttggaagac aagtacagat accttttcaa 4200gcaagtggca agttcaacag gattttgtga ccagcgcagg ctgggcctcc ttctgcatga 4260ttctatccaa attccaagac agttgggtga agttgcatcc tttgggggca gtaacattga 4320gccaagtgtc cggagctgct tccaatttgc taataataag ccagagatcg aagcggccct 4380cttcctagac tggatgagac tggaacccca gtccatggtg tggctgcccg tcctgcacag 4440agtggctgct gcagaaactg ccaagcatca ggccaaatgt aacatctgca aagagtgtcc 4500aatcattgga ttcaggtaca ggagtctaaa gcactttaat tatgacatct gccaaagctg 4560ctttttttct ggtcgagttg caaaaggcca taaaatgcac tatcccatgg tggaatattg 4620cactccgact acatcaggag aagatgttcg agactttgcc aaggtactaa aaaacaaatt 4680tcgaaccaaa aggtattttg cgaagcatcc ccgaatgggc tacctgccag tgcagactgt 4740cttagagggg gacaacatgg aaactcccga cacaatgtag tcgagaggcc taataaagag 4800ctcagatgca tcgatcagag tgtgttggtt ttttgtgtga gatctaggaa cccctagtga 4860tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc 4920ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg 4980gagtggccaa4990<210>35<211>4848<212>DNA<213>人<400>35tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc 60gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga gagggagtgg 120ccaactccat cactaggggt tcctagatct gaattcggta cccgttacat aacttacggt 180aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta 240tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg 300gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 360cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt 420tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg 480gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc 540cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg 600taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat 660aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga 720cctccataga agacaccggg accgatccag cctccggact ctagaggatc cggtactcga 780attttcacca tggtttggtg ggaagaagta gaggactgtt atgaaagaga agatgttcaa 840aagaaaacat tcacaaaatg ggtaaatgca caattttcta agtttgggaa gcagcatatt 900gagaacctct tcagtgacct acaggatggg aggcgcctcc tagacctcct cgaaggcctg 960acagggcaaa aactgccaaa agaaaaagga tccacaagag ttcatgccct gaacaatgtc 1020aacaaggcac tgcgggtttt gcagaacaat aatgttgatt tagtgaatat tggaagtact 1080gacatcgtag atggaaatca taaactgact cttggtttga tttggaatat aatcctccac 1140tggcaggtca aaaatgtaat gaaaaatatc atggctggat tgcaacaaac caacagtgaa 1200aagattctcc tgagctgggt ccgacaatca actcgtaatt atccacaggt taatgtaatc 1260aacttcacca ccagctggtc tgatggcctg gctttgaatg ctctcatcca tagtcatagg 1320ccagacctat ttgactggaa tagtgtggtt tgccagcagt cagccacaca acgactggaa 1380catgcattca acatcgccag atatcaatta ggcatagaga aactactcga tcctgaagat 1440gttgatacca cctatccaga taagaagtcc atcttaatgt acatcacatc actcttccaa 1500gttttgcctc aacaagtgag cattgaagcc atccaggaag tggaaatgtt gccaaggcca 1560cctaaagtga ctaaagaaga acattttcag ttacatcatc aaatgcacta ttctcaacag 1620atcacggtca gtctagcaca gggatatgag agaacttctt cccctaagcc tcgattcaag 1680agctatgcct acacacaggc tgcttatgtc accacctctg accctacacg gagcccattt 1740ccttcacagc atttggaagc tcctgaagac aagtcatttg gcagttcatt gatggagagt 1800gaagtaaacc tggaccgtta tcaaacagct ttagaagaag tattatcgtg gcttctttct 1860gctgaggaca cattgcaagc acaaggagag atttctaatg atgtggaagt ggtgaaagac 1920cagtttcata ctcatgaggg gtacatgatg gatttgacag cccatcaggg ccgggttggt 1980aatattctac aattgggaag taagctgatt ggaacaggaa aattatcaga agatgaagaa 2040actgaagtac aagagcagat gaatctccta aattcaagat gggaatgcct cagggtagct 2100agcatggaaa aacaaagcaa tttacataga gttttaatgg atctccagaa tcagaaactg 2160aaagagttga atgactggct aacaaaaaca gaagaaagaa caaggaaaat ggaggaagag 2220cctcttggac ctgatcttga agacctaaaa cgccaagtac aacaacataa ggtgcttcaa 2280gaagatctag aacaagaaca agtcagggtc aattctctca ctcacatggt ggtggtagtt 2340gatgaatcta gtggagatca cgcaactgct gctttggaag aacaacttaa ggtattggga 2400gatcgatggg caaacatctg tagatggaca gaagaccgct gggttctttt acaagacact 2460catagattac tgcaacagtt ccccctggac ctggaaaagt ttcttgcctg gcttacagaa 2520gctgaaacaa ctgccaatgt cctacaggat gctacccgta aggaaaggct cctagaagac 2580tccaagggag taaaagagct gatgaaacaa tggcaagacc tccaaggtga aattgaagct 2640cacacagatg tttatcacaa cctggatgaa aacagccaaa aaatcctgag atccctggaa 2700ggttccgatg atgcagtcct gttacaaaga cgtttggata acatgaactt caagtggagt 2760gaacttcgga aaaagtctct caacattagg tcccatttgg aagccagttc tgaccagtgg 2820aagcgtctgc acctttctct gcaggaactt ctggtgtggc tacagctgaa agatgatgaa 2880ttaagccggc aggcacctat tggaggcgac tttccagcag ttcagaagca gaacgatgta 2940catagggcct tcaagaggga attgaaaact aaagaacctg taatcatgag tactcttgag 3000actgtacgaa tatttctgac agagcagcct ttggaaggac tagagaaact ctaccaggag 3060cccagagagc tgcctcctga ggagagagcc cagaatgtca ctcggcttct acgaaagcag 3120gctgaggagg tcaatactga gtgggaaaaa ttgaacctgc actccgctga ctggcagaga 3180aaaatagatg agacccttga aagactccag gaacttcaag aggccacgga tgagctggac 3240ctcaagctgc gccaagctga ggtgatcaag ggatcctggc agcccgtggg cgatctcctc 3300attgactctc tccaagatca cctcgagaaa gtcaaggcac ttcgaggaga aattgcgcct 3360ctgaaagaga acgtgagcca cgtcaatgac cttgctcgcc agcttaccac tttgggcatt 3420cagctctcac cgtataacct cagcactctg gaagacctga acaccagatg gaagcttctg 3480caggtggccg tcgaggaccg agtcaggcag ctgcatgaag cccacaggga ctttggtcca 3540gcatctcagc actttctttc cacgtctgtc cagggtccct gggagagagc catctcgcca 3600aacaaagtgc cctactatat caaccacgag actcaaacaa cttgctggga ccatcccaaa 3660atgacagagc tctaccagtc tttagctgac ctgaataatg tcagattctc agcttatagg 3720actgccatga aactccgaag actgcagaag gccctttgct tggatctctt gagcctgtca 3780gctgcatgtg atgccttgga ccagcacaac ctcaagcaaa atgaccagcc catggatatc 3840ctgcagatta ttaattgttt gaccactatt tatgaccgcc tggagcaaga gcacaacaat 3900ttggtcaacg tccctctctg cgtggatatg tgtctgaact ggctgctgaa tgtttatgat 3960acgggacgaa cagggaggat ccgtgtcctg tcttttaaaa ctggcatcat ttccctgtgt 4020aaagcacatt tggaagacaa gtacagatac cttttcaagc aagtggcaag ttcaacagga 4080ttttgtgacc agcgcaggct gggcctcctt ctgcatgatt ctatccaaat tccaagacag 4140ttgggtgaag ttgcatcctt tgggggcagt aacattgagc caagtgtccg gagctgcttc 4200caatttgcta ataataagcc agagatcgaa gcggccctct tcctagactg gatgagactg 4260gaaccccagt ccatggtgtg gctgcccgtc ctgcacagag tggctgctgc agaaactgcc 4320aagcatcagg ccaaatgtaa catctgcaaa gagtgtccaa tcattggatt caggtacagg 4380agtctaaagc actttaatta tgacatctgc caaagctgct ttttttctgg tcgagttgca 4440aaaggccata aaatgcacta tcccatggtg gaatattgca ctccgactac atcaggagaa 4500gatgttcgag actttgccaa ggtactaaaa aacaaatttc gaaccaaaag gtattttgcg 4560aagcatcccc gaatgggcta cctgccagtg cagactgtct tagaggggga caacatggaa 4620actcccgaca caatgtagtc gagaggccta ataaagagct cagatgcatc gatcagagtg 4680tgttggtttt ttgtgtgaga tctaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct 4740gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 4800tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaa 4848<210>36<211>5060<212>DNA<213>人<400>36ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120gccaactcca tcactagggg ttcctagatc tgaattcggt accactacgg gtctaggctg 180cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taacccagac 240atgtggctgc cccccccccc ccaacacctg ctgcctgagc ctcaccccca ccccggtgcc 300tgggtcttag gctctgtaca ccatggagga gaagctcgct ctaaaaataa ccctgtccct 360ggtggatcgg tacccgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac 420gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact 480ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa 540gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg 600cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta 660gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg 720tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg 780caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg 840ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag 900atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc 960agcctccgga ctctagagga tccggtactc gaattttcac catggtttgg tgggaagaag 1020tagaggactg ttatgaaaga gaagatgttc aaaagaaaac attcacaaaa tgggtaaatg 1080cacaattttc taagtttggg aagcagcata ttgagaacct cttcagtgac ctacaggatg 1140ggaggcgcct cctagacctc ctcgaaggcc tgacagggca aaaactgcca aaagaaaaag 1200gatccacaag agttcatgcc ctgaacaatg tcaacaaggc actgcgggtt ttgcagaaca 1260ataatgttga tttagtgaat attggaagta ctgacatcgt agatggaaat cataaactga 1320ctcttggttt gatttggaat ataatcctcc actggcaggt caaaaatgta atgaaaaata 1380tcatggctgg attgcaacaa accaacagtg aaaagattct cctgagctgg gtccgacaat 1440caactcgtaa ttatccacag gttaatgtaa tcaacttcac caccagctgg tctgatggcc 1500tggctttgaa tgctctcatc catagtcata ggccagacct atttgactgg aatagtgtgg 1560tttgccagca gtcagccaca caacgactgg aacatgcatt caacatcgcc agatatcaat 1620taggcataga gaaactactc gatcctgaag atgttgatac cacctatcca gataagaagt 1680ccatcttaat gtacatcaca tcactcttcc aagttttgcc tcaacaagtg agcattgaag 1740ccatccagga agtggaaatg ttgccaaggc cacctaaagt gactaaagaa gaacattttc 1800agttacatca tcaaatgcac tattctcaac agatcacggt cagtctagca cagggatatg 1860agagaacttc ttcccctaag cctcgattca agagctatgc ctacacacag gctgcttatg 1920tcaccacctc tgaccctaca cggagcccat ttccttcaca gcatttggaa gctcctgaag 1980acaagtcatt tggcagttca ttgatggaga gtgaagtaaa cctggaccgt tatcaaacag 2040ctttagaaga agtattatcg tggcttcttt ctgctgagga cacattgcaa gcacaaggag 2100agatttctaa tgatgtggaa gtggtgaaag accagtttca tactcatgag gggtacatga 2160tggatttgac agcccatcag ggccgggttg gtaatattct acaattggga agtaagctga 2220ttggaacagg aaaattatca gaagatgaag aaactgaagt acaagagcag atgaatctcc 2280taaattcaag atgggaatgc ctcagggtag ctagcatgga aaaacaaagc aatttacata 2340gagttttaat ggatctccag aatcagaaac tgaaagagtt gaatgactgg ctaacaaaaa 2400cagaagaaag aacaaggaaa atggaggaag agcctcttgg acctgatctt gaagacctaa 2460aacgccaagt acaacaacat aaggtgcttc aagaagatct agaacaagaa caagtcaggg 2520tcaattctct cactcacatg gtggtggtag ttgatgaatc tagtggagat cacgcaactg 2580ctgctttgga agaacaactt aaggtattgg gagatcgatg ggcaaacatc tgtagatgga 2640cagaagaccg ctgggttctt ttacaagaca ctcatagatt actgcaacag ttccccctgg 2700acctggaaaa gtttcttgcc tggcttacag aagctgaaac aactgccaat gtcctacagg 2760atgctacccg taaggaaagg ctcctagaag actccaaggg agtaaaagag ctgatgaaac 2820aatggcaaga cctccaaggt gaaattgaag ctcacacaga tgtttatcac aacctggatg 2880aaaacagcca aaaaatcctg agatccctgg aaggttccga tgatgcagtc ctgttacaaa 2940gacgtttgga taacatgaac ttcaagtgga gtgaacttcg gaaaaagtct ctcaacatta 3000ggtcccattt ggaagccagt tctgaccagt ggaagcgtct gcacctttct ctgcaggaac 3060ttctggtgtg gctacagctg aaagatgatg aattaagccg gcaggcacct attggaggcg 3120actttccagc agttcagaag cagaacgatg tacatagggc cttcaagagg gaattgaaaa 3180ctaaagaacc tgtaatcatg agtactcttg agactgtacg aatatttctg acagagcagc 3240ctttggaagg actagagaaa ctctaccagg agcccagaga gctgcctcct gaggagagag 3300cccagaatgt cactcggctt ctacgaaagc aggctgagga ggtcaatact gagtgggaaa 3360aattgaacct gcactccgct gactggcaga gaaaaataga tgagaccctt gaaagactcc 3420aggaacttca agaggccacg gatgagctgg acctcaagct gcgccaagct gaggtgatca 3480agggatcctg gcagcccgtg ggcgatctcc tcattgactc tctccaagat cacctcgaga 3540aagtcaaggc acttcgagga gaaattgcgc ctctgaaaga gaacgtgagc cacgtcaatg 3600accttgctcg ccagcttacc actttgggca ttcagctctc accgtataac ctcagcactc 3660tggaagacct gaacaccaga tggaagcttc tgcaggtggc cgtcgaggac cgagtcaggc 3720agctgcatga agcccacagg gactttggtc cagcatctca gcactttctt tccacgtctg 3780tccagggtcc ctgggagaga gccatctcgc caaacaaagt gccctactat atcaaccacg 3840agactcaaac aacttgctgg gaccatccca aaatgacaga gctctaccag tctttagctg 3900acctgaataa tgtcagattc tcagcttata ggactgccat gaaactccga agactgcaga 3960aggccctttg cttggatctc ttgagcctgt cagctgcatg tgatgccttg gaccagcaca 4020acctcaagca aaatgaccag cccatggata tcctgcagat tattaattgt ttgaccacta 4080tttatgaccg cctggagcaa gagcacaaca atttggtcaa cgtccctctc tgcgtggata 4140tgtgtctgaa ctggctgctg aatgtttatg atacgggacg aacagggagg atccgtgtcc 4200tgtcttttaa aactggcatc atttccctgt gtaaagcaca tttggaagac aagtacagat 4260accttttcaa gcaagtggca agttcaacag gattttgtga ccagcgcagg ctgggcctcc 4320ttctgcatga ttctatccaa attccaagac agttgggtga agttgcatcc tttgggggca 4380gtaacattga gccaagtgtc cggagctgct tccaatttgc taataataag ccagagatcg 4440aagcggccct cttcctagac tggatgagac tggaacccca gtccatggtg tggctgcccg 4500tcctgcacag agtggctgct gcagaaactg ccaagcatca ggccaaatgt aacatctgca 4560aagagtgtcc aatcattgga ttcaggtaca ggagtctaaa gcactttaat tatgacatct 4620gccaaagctg ctttttttct ggtcgagttg caaaaggcca taaaatgcac tatcccatgg 4680tggaatattg cactccgact acatcaggag aagatgttcg agactttgcc aaggtactaa 4740aaaacaaatt tcgaaccaaa aggtattttg cgaagcatcc ccgaatgggc tacctgccag 4800tgcagactgt cttagagggg gacaacatgg aaactcccga cacaatgtag tcgagaggcc 4860taataaagag ctcagatgca tcgatcagag tgtgttggtt ttttgtgtga gatctaggaa 4920cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc 4980cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg 5040cgcagagagg gagtggccaa 5060
权利要求
1.编码抗肌萎缩蛋白小基因的分离的核苷酸序列，其包含(a)一个N-末端结构域；(b)四至六个棒状重复序列；(c)抗肌萎缩蛋白基因的H1结构域和抗肌萎缩蛋白基因的H4结构域；以及(d)富含半胱氨酸的结构域，其中N-末端结构域选自抗肌萎缩蛋白基因的N-末端结构域、抗肌萎缩蛋白基因改变的N-末端结构域或utrophin基因的N-末端结构域；棒状重复序列选自抗肌萎缩蛋白基因的棒状重复序列、utrophin基因的棒状重复序列或血影蛋白基因的棒状重复序列；富含半胱氨酸的结构域为抗肌萎缩蛋白基因的富含半胱氨酸结构域或utrophin基因的富含半胱氨酸结构域。
2.权利要求1的分离的核苷酸序列，其还包含抗肌萎缩蛋白基因的C-末端结构域的最后三个氨基酸。
3.编码抗肌萎缩蛋白小基因的分离的核苷酸序列，其包含a)抗肌萎缩蛋白基因的N-末端结构域或抗肌萎缩蛋白基因改变的N-末端结构域；b)抗肌萎缩蛋白基因的四至六个棒状重复序列；c)抗肌萎缩蛋白基因的H1结构域和抗肌萎缩蛋白基因的H4结构域；d)抗肌萎缩蛋白基因的富含半胱氨酸结构域，其中所述核苷酸序列少于5,000个核苷酸。
4.权利要求3的分离的核苷酸序列，其还包含抗肌萎缩蛋白基因的H2结构域和/或抗肌萎缩蛋白基因的H3结构域。
5.权利要求3的分离的核苷酸序列，其包含抗肌萎缩蛋白基因的四个棒状重复序列。
6.权利要求3的分离的核苷酸序列，其包含抗肌萎缩蛋白基因的五个棒状重复序列。
7.权利要求3的分离的核苷酸序列，其包含抗肌萎缩蛋白基因的六个棒状重复序列。
8.权利要求3的分离的核苷酸序列，其由SEQ ID NO2组成，或由SEQ ID NO2的充分互补链组成。
9.权利要求3的分离的核苷酸序列，其由SEQ ID NO6组成，或由SEQ ID NO6的充分互补链组成。
10.权利要求3的分离的核苷酸序列，其由SEQ ID NO9组成，或由SEQ ID NO9的充分互补链组成。
11.权利要求3的分离的核苷酸序列，其由SEQ ID NO10组成，或由SEQ ID NO10的充分互补链组成。
12.权利要求3的分离的核苷酸序列，其由SEQ ID NO12组成，或由SEQ ID NO12的充分互补链组成。
13.权利要求3的分离的核苷酸序列，其由SEQ ID NO14组成，或由SEQ ID NO14的充分互补链组成。
14.重组腺伴随病毒载体，其包含可操作地连接至表达调控元件的权利要求1的核苷酸序列。
15.权利要求14的重组腺伴随病毒载体，其中表达调控元件为MCK启动子或CMV启动子。
16.重组腺伴随病毒载体，其包含任一可操作地连接至表达调控元件的权利要求8、9、10、11、12和13的核苷酸序列。
17.权利要求16的重组腺伴随病毒载体，其中调控元件为MCK启动子或CMV启动子。
18.对哺乳动物受试者的迪谢纳肌营养不良和贝克肌营养不良进行治疗的方法，其包括(i)提供包含可操作地连接至表达调控元件的权利要求1的抗肌萎缩蛋白小基因的载体；(ii)对哺乳动物受试者在一定条件下施用有效量的所述载体，其中所述条件导致抗肌萎缩蛋白小基因在所述哺乳动物受试者体内以提供治疗效果的水平表达。
19.权利要求18的方法，其中载体为重组腺伴随病毒。
20.权利要求18的方法，其中载体为逆转录病毒。
21.对哺乳动物受试者的迪谢纳肌营养不良和贝克肌营养不良进行治疗的方法，其包括(i)提供包含可操作地连接至表达调控元件的权利要求1的抗肌萎缩蛋白小基因的载体；(ii)对哺乳动物受试者在一定条件下施用有效量的所述载体，其中所述条件导致抗肌萎缩蛋白小基因在所述哺乳动物受试者体内以提供治疗效果的水平表达，其中抗肌萎缩蛋白小基因具有的核苷酸少于5,000，该核苷酸包含(a)抗肌萎缩蛋白基因的N-末端结构域或抗肌萎缩蛋白基因改变的N-末端结构域；(b)抗肌萎缩蛋白基因的四至六个棒状重复序列；(c)抗肌萎缩蛋白基因的H1结构域和抗肌萎缩蛋白基因的H4结构域；以及(d)抗肌萎缩蛋白基因的富含半胱氨酸结构域。
22.权利要求21的方法，其中载体为重组腺伴随病毒。
23.权利要求21的方法，其中载体为逆转录病毒。
全文摘要
本发明提供了一系列保留了基本生物功能的新抗肌萎缩蛋白小基因。抗肌萎缩蛋白小基因的表达可被一个调节元件及一个小的聚腺苷酸化信号调控。整个基因表达盒可轻易地包装入病毒载体，优选地为AAV载体。本发明还定义了抗肌萎缩蛋白的最小功能结构域，并提供了优化和产生抗肌萎缩蛋白小基因新变体的方式。最后，本发明提供了治疗迪谢纳肌营养不良(DMD)和贝克肌营养不良(BMD)的方法。
文档编号C07K14/47GK1439051SQ01809935
公开日2003年8月27日 申请日期2001年4月27日 优先权日2000年4月28日
发明者肖啸 申请人:肖啸