专利名称：人组织型纤溶酶原激活剂突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种对人血栓性疾病有潜在疗效的多肽，特别是涉及人组织型纤溶酶原激活剂突变体。
从目前的有关文献资料和已上市的h-tPA突变体情况看，尽管它们的半衰期较h-tPA长，可采用更简单、更低剂量的治疗方案，但它们的溶栓特异性均未获提高，因此其疗效并未超过h-tPA。而且，目前报道的h-tPA突变体的突变位点都很有限。以下是文献公开的主要突变位点L66A/Y67S这两个突变由本专利发明人根据吸血蝙蝠纤溶酶原激活剂对应氨基酸序列自行设计而成，分别是把h-tPA第66位的亮氨酸和第67位的酪氨酸替换为丙氨酸和丝氨酸。这两个突变，显著降低了肝实质细胞h-tpa受体介导的、对含有这两个突变位点的h-tPA突变体的内吞和降解。同时，含有这两个突变位点的h-tPA突变体其β折叠处的氨基酸序列几乎与吸血蝙蝠纤溶酶原激活剂相同，从而使第66位和第67位的氨基酸突变对蛋白分子的其它关键结构的影响降至最低(Bassel-Duby et al.1992，J Biol Chem 267(14)9668；GardeLL SJ，et al.，1989 J Biol Chem 264(30)17947)。
N117Q/N184Q该突变去除h-tPA分子中的117和184位的糖基化位点，可以使得h-tPA不能与肝内皮细胞上的寡聚甘露糖受体结合。该受体在体内介导h-tPA在血中的快速清除，因此117位和184位糖基化的去除使其半衰期延长(Kuiper J，et al.，1988，J Biol Chem 26318220；Smedsord B，et al.，1990，Thromb Haemost 63(1)60)。
口(296-302)该突变去除了h-tPA上第296至302位的7个碱基，这些氨基酸是PAI-1与h-tPA的结合位点，删除后，两者就不能结合，因而能抗PAI-1的抑制作用(Madison EL，et al.，1989，Nature 339721)。
K416Yh-tPA分子的溶栓特异性主要是由分子内一些关键位置的氨基酸所决定的。实验发现如果对这些氨基酸进行特定的突变则有可能进一步提高h-tPA的溶栓特异性(Heckel A，et al.，1988，J Comput Aided Mol Des 2(1)7；Petersen LC，et al.，1984，Biochemistry 293451)。
本发明所述的人组织型纤溶酶原激活剂的突变体的氨基酸序列如下Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Glnl 5 10 15Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu20 25 30Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val Pro Val35 40 45Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln50 55 60Ala Ala Ser Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala65 70 75 80Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln85 90 95Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu100 105 110Cys Thr Asn Trp Gln Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly115 120 125Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys
130 135 140Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala145 150 155 160Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly165 170 175Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Gln Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His180 185 190Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile195 200 205Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu210 215 220Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys225 230 235 240Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys245 250 255Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro260 265 270Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro275 280 285Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu290 295 300Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg305 310 315 320Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val325 330 335Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val340 345 350His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu355 360 365Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val370 375 380Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr385 390 395 400Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Tyr His Glu Ala Leu Ser Pro Phe405 410 415Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser420 425 430Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met435 440 445Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His450 455 460Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp465 470 475 480Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly485 490 495Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp500 505 510Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro515 520在本发明所述的h-tPA突变体的氨基酸序列中，h-tPA中的第66位点上的亮氨酸被替换为丙氨酸，h-tPA中的第67位点上的酪氨酸被替换为丝氨酸，h-tPA中的第117位点上的天冬酰胺被替换为谷氨酰胺，h-tPA中的第184位点上的天冬酰胺被替换为谷氨酰胺，删除了h-tPA上从第296至第302位点的7个氨基酸，h-tPA中的第416位点上的赖氨酸被替换为酪氨酸。
本发明与现有技术相比具有如下优点本发明相对于h-tPA和现有的突变体而言，其半衰期延长、溶栓特异性提高，并且可保持溶栓性能基本不变。因此，本发明具有开发成新型有效的溶栓药物的巨大潜在应用价值。
图1是h-tPA的一级结构示意图。
图2是本发明实施例中采用S2390法测定h-tPA活性的标准曲线。
图3是本发明实施例中采用纤维蛋白板溶圈法测定的活性鉴定。
将上述重组质粒pTZ-tPA转化含dut和ung双突变的CJ236细菌中，感染辅助噬菌体M13KO7，提取噬菌体，纯化出单链pTZ-tPA DNA。将其与突变引物配对，加入T7聚合酶和T4连接酶进行聚合和连接反应，这样就可获得含突变引物的双链DNA分子。重复上述过程即可获得编码本发明上面所述的突变体的DNA分子。
取得该DNA分子后，把它装入杆状病毒表达载体pBACPAC8，对齐读码框，调整欲翻译序列与载体启动子之间的关系，然后转化大肠杆菌JM109，获得重组质粒pBACPAC-tPA突变体。采用脂质体共转染法，将此重组质粒和经Bsu 361酶切的线性化野生型BacPAK6病毒DNA共同转染Tn-5B1-4昆虫细胞株。经同源重组，多角体蛋白基因启动子及其下游的h-tPA突变体基因就转移至病毒基因组中，从而形成重组病毒。通过空斑筛选和PCR后，筛选出纯的重组病毒株。使用该病毒株感染Tn-5B1-4昆虫细胞株，72小时后即可获得含本发明所述的突变体蛋白分子的上清液。该上清液的生物学活性研究结果如下根据S2390底物生色法对表达本发明所述的突变体的基因工程细胞株培养液上清进行分析，测得活性为3.3×10-3IU/μl，该检测方法详述如下按Chromogenix公司产品说明，向装有冷冻干燥的标准h-tPA的试剂瓶中，加入100μl 1M KHCO3溶解，获得浓度为536IU/μl的标准h-tPA溶液。用50mM Tris-HCl，pH8.5稀释成0.5×10-2、1×10-2、2×10-2、3×10-3、4×10-2、5×10-2IU/μl。取10μl缓冲液和各个稀释度的标准h-tPA，加到100μl h-tPA活性测定反应液中，以缓冲液作为对照，测出各个样品在405nm处的OD值。每个稀释度测三次，取其平均值。然后，作出OD405与h-tPA浓度标准曲线，如图2所示。根据曲线，获得活性计算公式A＝41.65×C+0.006，其中A代表OD405值，C代表h-tPA的活性单位(IU/μl)。样品的h-tPA活性按照上述公式计算得到。
按照S2390底物生色法，在37℃保温5小时后，测出含本发明所述的突变体的样品的OD405值为0.9。由于OD405值与保温时间的平方成正比，因此37℃保温2小时后的OD405值为0.144。根据上述活性测定计算公式，推算出表达本发明所述的突变体的基因工程细胞株培养液上清的活性为3.3×10-3IU/μl。
纤维蛋白板溶圈法对上述同一样品的测定结果为0.2～0.5IU/μl，该检测方法详述如下将0.827％琼脂糖融化，并保温于42℃水浴中；取3.3ml 2.5％的琼脂糖，向其中加入0.3ml浓度为10mg/ml的牛纤维蛋白原(37℃预热)；混合均匀，再加入37℃预热的0.3ml牛凝血酶(10IU/ml)；快速混匀，倒入3×7厘米塑料盖中；待凝固后，打孔(直径4毫米)；向孔中分别加入20μl待测样品和不同浓度的标准h-tPA溶液，37℃于带盖潮湿容器中过夜。
应用纤维蛋白板溶圈法对上述同一样品的测定结果如下其溶圈大小如图3所示，图中的1至6为标准h-tPA样品，7和8是含本发明所述突变体的样品，由比较可以看出该样品的的溶栓活性为0.2～0.5IU/μl。
S2390底物生色法采用的刺激剂为纤维蛋白原(0.5mg/ml)，根据降解人工合成底物S2390，形成有颜色的物质来测定样品的纤溶活性。而纤维蛋白板溶圈法则模拟体内血栓形成过程，根据纤维蛋白溶解后形成的溶圈来鉴定样品中的纤溶活性。两者采用的刺激物不同S2390底物生色法使用纤维蛋白原，纤维蛋白板溶圈法使用纤维蛋白。因此可根据这两种方法测出表达的突变体蛋白分子的特异性与h-tPA蛋白分子之比。本突变体的特异性提高倍数＝(0.2～0.5)/3.3×10-3约等于100。
综上所述，可以看出本发明所获得的h-tPA的突变体(L66A/Y67S/N117Q/N184Q/Δ(296-302)/K416Y)与h-tPA相比，其溶栓活性基本不变，其溶栓特异性显著提高，因此是一个具有潜在疗效以及巨大市场的h-tPA的突变体。
权利要求
1.人组织型纤溶酶原激活剂突变体，其特征是其氨基酸序列如下Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln1 5 10 15Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu20 25 30Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val Pro Val35 40 45Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln50 55 60Ala Ala Ser Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala65 70 75 80Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln85 90 95Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu100 105 110Cys Thr Asn Trp Gln Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly115 120 125Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys130 135 140Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala145 150 155 160Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly165 170 175Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Gln Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His180 185 190Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile195 200 205Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu210 215 220Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys225 230 235 240Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys245 250 255Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro260 265 270Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro275 280 285Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu290 295 300Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg305 310 315 320Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val325 330 335Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val340 345 350His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu355 360 365Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val370 375 380Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr385 390 395 400Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Tyr His Glu Ala Leu Ser Pro Phe405 410 415Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser420 425 430Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met435 440 445Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His450 455 460Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp465 470 475 480Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly485 490 495Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp500 505 510Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro515 520上述h-tPA突变体的氨基酸序列中，h-tPA中的第66位点上的亮氨酸被替换为丙氨酸，h-tPA中的第67位点上的酪氨酸被替换为丝氨酸，h-tPA中的第117位点上的天冬酰胺被替换为谷氨酰胺，h-tPA中的第184位点上的天冬酰胺被替换为谷氨酰胺，删除了h-tPA上从第296至第302位点的7个氨基酸，h-tPA中的第416位点上的赖氨酸被替换为酪氨酸。
全文摘要
本发明公开了一种人组织型纤溶酶原激活剂突变体，在其氨基酸序列中，h－tPA中的第66位点上的亮氨酸被替换为丙氨酸，h－tPA中的第67位点上的酪氨酸被替换为丝氨酸，h－tPA中的第117位点上的天冬酰胺被替换为谷氨酰胺，h－tPA中的第184位点上的天冬酰胺被替换为谷氨酰胺，删除了h－tPA上从第296至第302位点的7个氨基酸，h－tPA中的第416位点上的赖氨酸被替换为酪氨酸。本发明相对于h－tPA和现有的突变体而言，其半衰期延长、溶栓特异性提高，并且可保持溶栓性能基本不变。因此，本发明具有开发成新型有效的溶栓药物的巨大潜在应用价值。
文档编号C07K14/47GK1397564SQ02114988
公开日2003年2月19日 申请日期2002年3月21日 优先权日2002年3月21日
发明者李宝健, 刘军波, 陆阳 申请人:李宝健, 刘军波, 陆阳