专利名称：一种石斑鱼生长激素基因、含有该基因的载体、菌株及其表达产物的生产和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，特别是一种石斑鱼生长激素基因。本发明还公开了含有该基因的载体和大肠杆菌菌株及其表达产物的生产和应用。
背景技术：
石斑鱼是海洋珊瑚礁鱼类，属鮨科(Serranidae)，石斑鱼属(Epinephelus)，有30多种。石斑鱼是一种名贵的海水鱼类，具有极高的经济价值。目前，石斑鱼人工养殖业的发展除了受到鱼苗和病害等因素的影响之外，还受到饲料因素的制约。现在广泛应用于淡水鱼养殖的饲料和饲料添加剂等并不适合于大规模的海水鱼类养殖，因此，研制出更适合于海水鱼类的饲料及促生长的添加剂就显得尤为重要。
生长激素是鱼类和其他脊椎动物体内一种重要的促生长的因子，具有促进个体生长发育，加速蛋白质合成和脂类降解的生理功能，因此，鱼类生长激素在鱼类养殖业具有极大的应用价值。基因重组的某些生长激素在淡水鱼养殖中已被应用，并起到了加速个体生长，缩短养殖时间，改善肉质，提高产值的作用。
发明内容本发明的目的在于提供一种石斑鱼生长激素基因，它以石斑鱼脑垂体mRNA为模板，经RT-PCR和RACE的方法而得到的具有石斑鱼生长激素全长cDNA序列的基因片段，基因序列及氨基酸序列见附图1。
本发明的另一目的在于利用基因工程技术，获得石斑鱼生长激素的cDNA的序列的基础上，进一步构建含有石斑鱼生长激素cDNA的大肠杆菌表达载体。
本发明的另一目的在于提供由上述菌株高效表达、生产重组石斑鱼生长激素的方法。
本发明的另一目的在于提供上述表达产物在制备促生长剂或添加剂的制品中的应用。
本发明从石斑鱼脑垂体中提取总RNA，采用逆转录的方法，合成cDNA的第一条链。针对生长激素部分保守的区域，在该区域设计简并引物，以cDNA的第一条链为模板，经PCR方法扩增得到石斑鱼生长激素的一段特异性的基因片段。再采用RACE的方法，分别扩增得到全长cDNA片段的5’末端和3’末端，最终得到石斑鱼生长激素的全长cDNA序列。
本发明还构建了含有上述石斑鱼生长激素的全长cDNA序列的克隆载体pGEMT-GPGH，以此载体为模板，扩增出含有石斑鱼生长激素187个氨基酸的成熟多肽的基因片段，该片段经酶切和分离纯化后，接入到载体pRSET相应的酶切位点之间，进而构建含有此成熟多肽的大肠杆菌表达载体pRSET-GPGH。
本发明还用上述含有石斑鱼生长激素的相应表达载体构建了能高效表达石斑鱼生长激素的大肠杆菌重组株。即优选由含有石斑鱼生长激素基因的表达载体pRSETB-GPGH转化大肠杆菌BL21(DE3)而得到的菌株pRSETB-GPGH-BL21。
本发明还提供了利用上述大肠杆菌重组株生产石斑鱼生长激素的方法。先将菌株进行培养发酵并经IPTG诱导使其高效表达石斑鱼生长激素重组蛋白，再收集菌体，经分离纯化得到重组石斑鱼生长激素产品。
利用该大肠杆菌重组菌株pRSETB-GPGH-BL21生产石斑鱼生长激素的具体方法为(1)菌种的培养将菌种pRSETB-GPGH-BL21接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基，过夜培养，再按1∶25-50接种到1L LB液体培养基，培养至菌液OD600为0.6时，加入1mM IPTG诱导培养6小时，5000g，30分钟离心收集细菌(2)表达产物的纯化收集上述培养的菌体，采用反复冻融和超声波破碎的方法，使大部分细菌裂解。用含0.1％Triton X-100的洗涤液悬浮细菌裂解物，得到纯净的包涵体。向包涵体中加入含8M Urea的裂解液，待包涵体完全溶解后，离心取上清。上清融合蛋白用HisTrap Kit(Amersham pharmaciaBiotech)亲合层析柱纯化，即可得到纯化的重组石斑鱼生长激素。上述方法所得到的重组石斑鱼生长激素可以作为有效成分用于制备促鱼(含亲鱼和苗种)生长剂或添加剂。
本发明的所构建的表达重组石斑鱼生长激素的表达载体可转化到相应的微生物菌株中高效表达，经分离纯化即可获得高纯度的重组石斑鱼生长激素，并具有表达水平高，容易纯化的优点。本发明的由含有石斑鱼生长激素基因的表达载体pRSETB-GPGH转化到大肠杆菌BL21(DE3)，其所表达的石斑鱼生长激素重组蛋白占总蛋白的43％。所以，通过本发明，可方便地大量生产重组石斑鱼生长激素，而且成本较低，因此可以获得来源稳定、成本便宜的重组石斑鱼生长激素并进一步制备适合海水鱼类使用的促鱼(含亲鱼和苗种)生长剂或添加剂。
生长剂或添加剂的制品中的应用。
图1石斑鱼生长激素的全长cDNA序列及推导出的氨基酸序列；图2是从石斑鱼脑垂体中提取总RNA，采用逆转录和PCR的方法，扩增得到石斑鱼生长激素的一段特异性的基因片段的电泳分析图；图3是采用RACE的方法，扩增得到全长cDNA中的5’末端的电泳分析图；图4是采用RACE的方法，扩增得到全长cDNA中的3’末端电泳分析图；图5是重组表达载体pRSET-GPGH的构建过程示意图；图6是鉴定重组表达载体pRSET-GPGH的酶切分析图；图7是石斑鱼生长激素在胚胎发育过程中基因表达的分析图。
图2中1-1脑垂体的总RNA；1-2逆转录后首轮PCR合成的DNA片段；1-3嵌套PCR合成的特异性基因片段；M分子量标准；PPCR产物；CPCR阴性对照。图3中2-15’RACE首轮PCR合成的DNA片段；2-25’RACE嵌套PCR合成的特异性基因片段；。图4中3-13’RACE首轮PCR合成的DNA片段；3-23’RACE嵌套PCR合成的特异性基因片段；M分子量标准；PPCR产物；CPCR阴性对照。图5中PT7是大肠杆菌的启动子，6Xhis是亲和层析纯化的识别位点。图6中M分子量标准；KpnI+EcoRI用KpnI和EcoRI对质粒pRSET-GPGH进行双酶切鉴定。图7中M分子量标准；1受精后1小时的胚胎；2受精后20小时的胚胎；3刚孵出的仔鱼；4孵出后1天的幼鱼；5孵出后5天的幼鱼；6孵出后15天的幼鱼；7孵出后25天的幼鱼；8孵出后60天的幼鱼；9孵出后120天的幼鱼；10成鱼的脑垂体；11阴性对照。
具体实施方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1 石斑鱼生长激素全长cDNA的合成从石斑鱼脑垂体中提取总RNA，采用逆转录的方法，合成cDNA的第一条链。另外，通过氨基酸序列分析表明，生长激素的氨基酸序列中有部分片段是比较保守的区域，根据这一特点在该区域设计简并引物，以cDNA的第一条链为模板，经PCR方法扩增得到石斑鱼生长激素的一段特异性的基因片段。在此基础上，采用RACE的方法，分别扩增得到全长cDNA片段的5’末端和3’末端，最终可得到石斑鱼生长激素的全长cDNA序列并推导其氨基酸序列。
实施例2 含石斑鱼生长激素基因的大肠杆菌表达载体pRSET-GPGH的构建通过采用限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳分离纯化的方法，连接构成含有石斑鱼生长激素全长cDNA的克隆载体pGEMT-GPGH后，以此为模板，扩增出含有石斑鱼生长激素187个氨基酸的成熟多肽的基因片段，该片段经KpnI和EcoRI酶切和琼脂糖凝胶电泳分离纯化，得到约560bp的DNA片段；同时，大肠杆菌表达质粒pRSET也采用KpnI和EcoRI进行酶切，分离纯化后得到约2.9kb的大片段，再与560bp的石斑鱼生长激素基因片段按1∶2混合，用T4连接酶在4℃连接16小时后用标准的氯化钙法转入大肠杆菌中，筛选具有氨卞青霉素抗性的转化子，以标准方法提取质粒，筛选大小约为3.4kb的重组质粒，用KpnI和EcoRI酶切该质粒，得到560bp和2.9kb的两个片段，分别与石斑鱼生长激素成熟多肽的基因片段及表达载体pRSET大小相同，证明石斑鱼生长激素已克隆到大肠杆菌表达载体pRSET中。
上述含石斑鱼生长激素基因的大肠杆菌载体优选由本发明合成的含有石斑鱼生长激素187个氨基酸的成熟多肽的基因片段和大肠杆菌表达载体pRSET构建成的重组表达载体pRSET-GPGH。
实施例3 能高效表达石斑鱼生长激素的大肠杆菌重组株pRSET-GPGH-BL21的构建用氯化钙法将pRSET-GPGH-转入大肠杆菌BL21中，在含氨卞青霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含pRSET-GPGH的重组转化子pRSET-GPGH-BL21。
实施例4 利用大肠杆菌基因工程菌pRSETB-GPGH-BL21生产重组石斑鱼生长激素(1)菌种的培养发酵挑取大肠杆菌基因工程菌pRSETB-GPGH-BL21单菌落接种在含有100ug/ml氨卞青霉素的液体LB培养基中，37℃，200转/分钟振荡培养过夜，次日按1∶25-50接种1L同样的LB液体培养基中，37℃，200转/分钟振荡培养至菌液OD600为0.6时，加入1mMIPTG进行诱导，再培养6小时，然后以5000g，30分钟离心收集细菌。
(2)表达的重组石斑鱼生长激素的纯化收集高效表达重组石斑鱼生长激素的菌体，将细菌颗粒悬于悬浮液(10mMTris.Cl pH7.1)，按0.5mg/ml浓度加入溶菌酶，室温作用30分钟。-20℃冻融三次，以利于细胞裂解。将菌悬液于冰上用超声波打碎细胞，作用3-6次，30秒/次，中间间隔30秒，使大部分细菌裂解。再用9倍体积的洗涤液(10mM Tris.ClpH7.1-0.1％Triton X-100)悬浮细菌裂解物，4℃，12000g，30分钟离心洗涤包涵体三次，得到纯净的包涵体。向包涵体中加入200ml裂解液(0.1mMNaH2PO4-0.01 mM Tris.Cl pH8.0-8M Urea)慢慢混匀，直至包涵体完全溶解，离心取上清，经0.45um微孔滤膜过滤，滤出液用于下步纯化。1.5％SDS-PAGE检测融合蛋白浓度情况。
将融合蛋白浓度稀释成200ug/ml，用HisTrap Kit(Amersham pharmaciaBiotech)亲合层析柱纯化目的蛋白，所用试剂为(Charge buffer0.1 M NiSO4；MTPBS150mM NaCl-16mM Na2HPO4-4mM NaH2PO4Ph8.0；Binding buffer20mM phosphate buffer pH7.6-0.5M NaCl-30mM imidazole；Elution buffer20mMphosphate buffer pH7.6-0.5M NaCl-400mM imidazole；Strip buffer100mMEDTA-20mM phosphate buffer pH7.6)。操作方法按试剂盒说明准备好HisTrap1ml预装柱及以上试剂，用注射器加10ml binding buffer平衡柱，然后加样品，流速控制在1-3ml/min，并用10ml binding buffer洗柱，收集洗出液，再加5mlelution buffer洗脱，按1ml每管收集洗脱液。以上各收集液用SDS-PAGE电泳检测，合并含单一目的条带收集液，于20mM phosphate buffer pH7.6透析去imidazole，用BCA蛋白定量试剂盒测定目的蛋白的浓度，分装后冻存于-80℃。
实施例5 石斑鱼生长激素在胚胎发育过程中基因表达的分析分别收集石斑鱼受精后1小时和20小时的胚胎，刚孵出的仔鱼，孵出后1天，5天，15天，25天，以及60天和120天的幼鱼RNA样品，用非常灵敏的RT-PCR的方法检测石斑鱼生长激素基因的表达情况。结果发现，受精后1小时的胚胎没有生长激素的表达；在20小时，刚孵出的仔鱼和1天的样品中显示有微弱的条带；在5天仔鱼的样品中出现了明显的生长激素基因表达水平的提高，随后在15天时生长激素基因表达水平显著下降，但在25天时生长激素基因表达水平再次升高，并在60天和120天的幼鱼RNA样品能检测到同样水平的PCR产物。在此过程中，作为参照的βactin基因的表达水平则保持稳定，无显著变化。以上结果表明，在石斑鱼的胚胎发育过程中，在受精后20小时的胚胎中开始出现了生长激素的表达，在仔鱼孵化后的120天的发育过程中，生长激素的表达出现了两个高峰(5天和25天)。通过这项研究结果，可以证明生长激素在石斑鱼胚胎发育过程中起着重要的作用，并与仔鱼的变态过程有关。因此，如果在培育鱼苗的饵料中添加生长激素，将能有效地促进鱼苗的生长，提高其成活率。
<110>中山大学<120>一种石斑鱼生长激素基因、含有该基因的载体、菌株及其表达产物的生产和应用<160>2<210>1<211>956<212>DNA<213>石斑鱼(Epinephelus coioides)<220><221>CDS<222>(86)…(700)<220><221>Sig_peptide<222>(86)…(136)<220><221>polyA_signal<222>(937)…(956)<400>1agaatgctct gagcagctga actcagacct gatccaccac agccagacct gatccaccag 60agccagacct gatcccagac cagccatgga ccgagtcgtc ctcctgctgt cagtagtgtc 120tctgggtgtt tcctctcagc caatcacaga cggccagcgt ctgttctcca tcgccgtcag 180cagagttcaa catctccacc tgcttgctca gagactcttc tccgactttg agagcactct 240gcagacggag gagcagcgac agctcaacaa gatcttcctg caggacttct gtaactctga 300ttacatcatc agccccatcg acaagcacga gacgcagcgc agctccgtgt tgaagctgtt 360gtcgatctcc tatcggttgg tggagtcctg ggagttcccc agtcggtccc tgtccggagg 420ttctgctccc agaaaccaga tttctcccaa actgtctgaa ttgaagaccg ggatcctgct 480gctgatcagg gccaatcagg acggagcgga gctcttccct gacagctccg ccctccagct 540ggctccttat gggaactatt atcagagtct gggcgccgac gagtcactgc gacgaacgta 600cgaactgctg gcttgtttca agaaagacat gcacaaggtg gagacctacc tgacggtggc 660taaatgtcga ctctctcctg aggccaactg taccctgtag tcccgcctct ccagtatgaa 720gacacgctcc catgtggatg atgtaatgct gtgtgttctg tagtcccgcc cacatgtttt 780ctgactctgc taattagcat tagcatttgt gttagccaca gtgttagcct gtgttcagtt 840gtttgttgga gcaggtgtta ttatgatgac agccatcaac aggaggtgat gtcatactgt 900caccatgtgt aataaagtgt gtgctgtgtt gcattcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 956<210>2<211>204<212>PRT<213>石斑鱼(Epinephelus coioides)<400>1Met Asp Arg Val Val Leu Leu Leu Ser Val Val Ser Leu Gly Val Ser-17 -15 -10 -5Ser Gln Pro Ile Thr Asp Gly Gln Arg Leu Phe Ser Ile Ala Val Ser-1 1 510 15Arg Val Gln His Leu His Leu Leu Ala Gln Arg Leu Phe Ser Asp Phe2025 30Glu Ser Thr Leu Gln Thr Glu Glu Gln Arg Gln Leu Asn Lys Ile Phe35 4045Leu Gln Asp Phe Cys Asn Ser Asp Tyr Ile Ile Ser Pro Ile Asp Lys5055 60His Glu Thr Gln Arg Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu Ser Ile Ser Tyr65 7075Arg Leu Val Glu Ser Trp Glu Phe Pro Ser Arg Ser Leu Ser Gly Gly8085 9095Ser Ala Pro Arg Asn Gln Ile Ser Pro Lys Leu Ser Glu Leu Lys Thr100 105 110Gly Ile Leu Leu Leu Ile Arg Ala Asn Gln Asp Gly Ala Glu Leu Phe115 120 125Pro Asp Ser Ser Ala Leu Gln Leu Ala Pro Tyr Gly Asn Tyr Tyr Gln130 135 140Ser Leu Gly Ala Asp Glu Ser Leu Arg Arg Thr Tyr Glu Leu Leu Ala145 150 155Cys Phe Lys Lys Asp Met His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Thr Val Ala160 165 170 175Lys Cys Arg Leu Ser Pro Glu Ala Asn Cys Thr Leu180 18权利要求
1.一种石斑鱼生长激素基因，其特征是它以石斑鱼脑垂体mRNA为模板，经RT-PCR和RACE的方法而得到的具有石斑鱼生长激素全长cDNA序列的基因片段，基因序列及氨基酸序列见附图1。
2.一种载体，其特征是该载体含有权利要求1所述的石斑鱼生长激素基因。
3.按照权利要求2述的载体，其特征是该载体为大肠杆菌克隆载体。
4.按照权利要求3所述的载体，其特征是该载体为pGEMT-GPGH。
5.按照权利要求3或4所述的载体，其特征是该载体转化的能复制石斑鱼生长激素全长cDNA的大肠杆菌，该大肠杆菌是由克隆载体pGEMT-GPGH转入大肠杆菌E.coli.DH5α中所形成的大肠杆菌重组株pGEMT-GPGH-DH5α。
6.按照权利要求2所述的载体，其特征是该载体为大肠杆菌表达载体pRSET-GPGH。
7.按照权利要求6的载体，其特征是该载体转化的能表达携带石斑鱼生长激素187个氨基酸成熟多肽的大肠杆菌，该大肠杆菌是由表达载体pRSET-GPGH转入大肠杆菌BL21(DE3)中所形成的大肠杆菌重组株pRSET-GPGH-BL21。
8.利用权利要求7的大肠杆菌重组株生产石斑鱼生长激素的方法，先将菌株培养并经IPTG诱导使其高效表达石斑鱼生长激素重组蛋白，再收集菌体经分离纯化得到石斑鱼生长激素制品。
9.权利要求8所述的方法获得的重组石斑鱼生长激素用于制备促鱼生长剂或添加剂的制品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种石斑鱼生长激素基因,其特征是它以石斑鱼脑垂体mRNA为模板,经RT－PCR和RACE的方法而得到的具有石斑鱼生长激素全长cDNA序列的基因片段。本发明还公开了本发明还公开了含有该基因的载体和大肠杆菌菌株及其表达产物的生产和应用。本发明的由含有石斑鱼生长激素基因的表达载体pRSETB－GPGH转化到大肠杆菌BL21(DE3),其所表达的石斑鱼生长激素重组蛋白占总蛋白的43%。所以,通过本发明,可方便地大量生产重组石斑鱼生长激素,而且成本较低,因此可以获得来源稳定、成本便宜的重组石斑鱼生长激素并进一步制备适合海水鱼类使用的促鱼(含亲鱼和苗种)生长剂或添加剂。
文档编号C07K14/435GK1385539SQ02115270
公开日2002年12月18日 申请日期2002年5月24日 优先权日2002年5月24日
发明者李文笙, 林浩然 申请人:中山大学