专利名称：一种应用重组技术对生长因子进行改造的方法
技术领域：
本发明涉及应用基因工程手段对人酸性成纤维细胞生长因子进行N末端改造。
背景技术：
创伤修复是一个基本的医学问题，数千年来，无数的医学专家为寻找快捷、完美、简便的方法作出了不懈的努力，然而直到80年代末，传统的创伤修复方法仍然停留在清创术、缝合术等被动等待机件修复的治疗措施上。
90年代以来，随着分子生物学，基因工程克隆技术的飞速发展，对创伤修复的研究也出现了根本的突破。研究提示，机体受损伤时，损伤部位周围的组织或细胞会以自分泌或旁分泌的方式释放出多种能够促进愈合的内源性细胞因子，如aFGF、bFGF、EGF、PDGF等，这些细胞因子在体内尽管含量甚微，但对创伤修复则起着举足轻重的作用。
酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)是具有多种生物效应的多肽调节因子，也是人体内分布最为广泛的生长因子之一，其广泛存在于中框及外周神经系统组织中，含量较其他组织都多，主要对中胚层和神经外胚层来源的多种细胞有营养和促分裂分化作用，是新一代治疗创面愈合和难治性溃疡等疾病突破性产品，临床疗效十分显著。
酸性成纤维生长因子具有广泛的靶细胞，包括成纤维细胞、上皮细胞、神经原细胞等。由于人酸性成纤维生长因子的自然来源十分有限；应用基因工程手段进行基因克隆、重组表达和商效的纯化，是目前众多细胞因子在基础研究和临床应用上的重要手段。
人酸性成纤维生长因子(human acidic fibroblast growth factor，haFGF)是具有多种生物功能的蛋白。天然成熟人酸性成纤维生长因子由140个氨基酸组成，分子量为16KD。
发明内容
本发明应用基因工程重组手段对人人酸性成纤维生长因子进行N末端改造的方法在其N末端加上Met和一个非极性氨基酸，比如Ala或Val。
具体实施例方式
实例说明I一.重组人酸性成纤维生长因子衍生物表达系统的构建和测序选用大肠杆菌表达质粒pTrc99A(Pharmacia)作为构建的载体，此载体含有人酸性成纤维生长因子的cDNA序列，以及增加的Met和Ala的编码碱基。
其中人酸性成纤维细胞生长因子cDNA序列用RT-PCR获得，经过DNA的酶切操作装载在大肠杆菌表达质粒pTrc99A的NcoI和BamHI位点。经ABI全自动基因测序后得到插入的人酸性成纤维生长因子的基因序列以及相对应的氨基酸序列，结果分析与设计的完全一致。
二.重组A+2人酸性成纤维生长因子衍生物的重组表达和制备A+2人酸性成纤维生长因子基因的pTrc99A转化大肠杆菌JM109，在含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中摇瓶过夜(37~C，200rpm)，再按1∶30接种含有100蝗gJml氨苄青霉素的LB培养基中，37~C培养3小时后，加入0.5mM IPTG诱导4小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现人酸性成纤维生长因子(16kd)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的20％以上。
用1000ml发酵液，离心收集菌体约15克，用50mM磷酸缓冲液(pH70)含1％Triton溶液混悬菌体，在室温下破菌20分钟，破菌液经超声波处理至无粘稠后离心去沉淀。上清经SP-sepharose Fast Flow离子交换层析和Heparin sepharose4B进行亲和层析纯化，最终产物的纯度超过98％，热原含量每mg蛋白低于10EU内毒素。
三.重组人酸性成纤维生长因子衍生物的理化性质和生物活性本方法制备的重组人酸性成纤维生长因子衍生物分子量为16KD，等电点大于10.0，紫外最大吸收峰为281nm，溴化氰肽图分析含有二个甲硫氨酸。氨基酸约6，组成分析与理论值一致，由142个氨基酸组成。N末端测序证实与预期一致。
用依赖于人酸性成纤维生长因子的3T3细胞株的MTT方法测活，参照Sigma人酸性成纤维生长因子，测得本方法制备的重组人酸性成纤维生长因子衍生物的比活性是2.5X106U/mg与Sigma人酸性成纤维生长因子的比活性完全一致。
实例说明II一.重组人酸性成纤维生长因子衍生物融合表达系统的构建和测序选用大肠杆菌表达质粒pTrc99A(Pharmacia)作为构建的载体，此载体含有人酸性成纤维生长因子的cDNA序列，以及增加的Met和Ala的编码碱基。其中人酸性成纤维细胞生长因子cDNA序列用RT-PCR获得，经过DNA的酶切操作装载在大肠杆菌表达质粒pTrc99A的NcoI和BamHI位点。经ABI全自动基因测序后得到插入的人酸性成纤维生长因子的基因序列以及相对应的氨基酸序列，结果分析与设计的完全一致。
二.重组人酸性成纤维生长因子衍生物的重组表达和制备含A+2人酸性成纤维生长因子基因的pTrc99A转化大肠杆菌JM109，在含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中摇瓶过夜(37~C，200rpm)，再按1∶30接种含有100蝗gJml氨苄青霉素的LB培养基中，37~C培养3小时后，加入0.5mM IPTG诱导4小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现人酸性成纤维生长因子(16kd)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的20％以上。
用1000ml发酵液，离心收集菌体约15克，用50mM磷酸缓冲液(pH70)含1％Triton溶液混悬菌体，在室温下破菌20分钟，破菌液经超声波处理至无粘稠后离心去沉淀。上清经SP-sepharose Fast Flow离子交换层析和Heparin sepharose4B进行亲和层析纯化，最终产物的纯度超过98％，热原含量每mg蛋白低于10EU内毒素。
三.重组人酸性成纤维生长因子衍生物的理化性质和生物活性本方法制备的重组人酸性成纤维生长因子分子量为16KD，等电点约为6，紫外最大吸收峰为280nm。氨基酸组成分析与理论设计值一致，由142个氨基酸组成，N末端测序与设计的重组人酸性成纤维生长因子N末端序列完全一致。
用依赖于人酸性成纤维生长因子的3T3细胞株的MTT方法测活，参照Sigma人酸性成纤维生长因子，测得本方法制备的重组人酸性成纤维生长因子衍生物的比活性是2.5X106U/mg与Sigma人酸性成纤维生长因子的比活性完全一致。
权利要求
1.一种应用重组技术对生长因子进行改造的方法，其特征是，所述A+2人酸性成纤维生长因子衍生物，是在天然人人酸性成纤维生长因子N末端增加1个Met和一个非极性氨基酸的衍生物。
2.根据权利要求1所述的一种应用重组技术对生长因子进行改造的方法，其特征是，所述增加的第一个氨基酸主要为Ala和Val。
3.根据权利要求1所述的一种应用重组技术对生长因子进行改造的方法，其特征是，所述缺失和替换是应用基因工程技术的方法。
4.根据权利要求1所述的一种应用重组技术对生长因子进行改造的方法，其特征是，所述A+2人酸性成纤维生长因子衍生物可以是重组形式和人工合成形式。
5.根据权利要求1所述的一种应用重组技术对生长因子进行改造的方法，其特征是，所述重组形式适用于原核和真核表达体系，以及转基因动植物体系来完成。
6.根据权利要求1所述的一种应用重组技术对生长因子进行改造的方法，其特征是，所述人工合成形式适用于蛋白多肽的自动合成和手工非自动合成方法来完成。
7.根据权利要求1所述的一种应用重组技术对生长因子进行改造的方法，其特征是，所述A+2人酸性成纤维生长因子衍生物具有人酸性成纤维生长因子相应的生物学功效。
8.根据权利要求1所述一种应用重组技术对生长因子进行改造的方法，其特征是，所述A+2人酸性成纤维生长因子衍生物具有治疗和预防疾病的功效，主要指创伤、难愈合或慢性溃疡和神经损伤等。
9.根据权利要求1所述的一种应用重组技术对生长因子进行改造的方法，其特征是，所述生物功效和药用功效具有药物和非药物价值。
10.根据权利要求1所述的一种应用重组技术对生长因子进行改造的方法，其特征是，所述药物价值指各种剂型的药品。
11.根据权利要求1所述的一种应用重组技术对生长因子进行改造的方法，其特征是，所述非药物价值指各种形式的商业产品。
全文摘要
本发明涉及一种应用基因工程重组手段对人人酸性成纤维细胞生长因子进行N末端改造的方法在其N末端加上Met和一个非极性氨基酸，比如Ala或Val。经本发明改造的重组人酸性成纤维细胞生长因子与人酸性成纤维细胞生长因子，在构建和测序以及理化性质和生物活性完全一致。
文档编号C07K14/50GK1485341SQ0213095
公开日2004年3月31日 申请日期2002年9月23日 优先权日2002年9月23日
发明者李贵玲, 彭红卫, 赵斌 申请人:武汉格瑞生物工程有限公司