专利名称：：血红蛋白-人血清白蛋白偶联物制备血液代用品及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种血液代用品，尤其涉及以血红蛋白为基质的血液代用品研究领域。
背景技术：
：输血对于临床手术、抗灾和战场救护是不可缺少的医疗手段。靠人献血不仅面临血源短缺问题，而且由于血型复杂，输血必须进行严格的配型，同时血液要低温储存，保存期短，运输不便，更为严重的是肝炎、艾滋病等病毒的污染使输血安全受到威胁。近年来，血液需求量不断增高，而安全有效的血源却日益紧缺。因此，近几十年来人血液代用品一直是国际科学界和企业界关注的研究开发热点。人血液代用品(humanbloodsubstitutes)，即人红细胞代用品(humanredcellsubstitutes)，是具有氧传递功能、维持血液渗透压和酸碱平衡及扩充容量的人工制剂。理想的血液代用品要求具有天然红细胞的传递氧功能、生物相容性、安全性和稳定性。其具有广泛的应用前景，不仅能用于和平时期和战争时期用于临床外科、急性贫血、和大量出血的治疗之外，也可用于各种疾病的治疗，如围术期常规使用、创伤治疗、血液稀释、局部缺血组织的灌流、败血症休克、多种抗体病人、肿瘤治疗等。现有的人血液代用品主要包括有机化学合成的高分子全氟碳化合物类和生物技术制备的血红蛋白类及红细胞类血液代用品。其中由于全氟碳化合物不具备天然血红蛋白的生物学载氧特性，其研究与开发已不再是重点；通过血型转换成的红细胞具有贮存期短、不易运输等缺点，其研究与应用也受到极大的限制；而来源于红细胞本身的血红蛋白(Hb)具有高效的载氧能力和维持胶体渗透压的功能，当前各国都将研制以血红蛋白为基质的携氧剂作为主攻方向，主要包括化学修饰血红蛋白以及脂质体包封血红蛋白和其它包含血红蛋白的微胶囊(WinslowRM.Hemoglobin-basedredcellsubstitute.TheJohnHopkinsUniversityPress，BaltimoreandLondon.199239)。无基质血红蛋白在体内易氧化或解离成单体和二聚体而引起肾毒性，并且存在氧亲和性高、循环半寿期短、胶体渗透压高等缺陷，采用化学修饰法实现血红蛋白分子内交联并提高血红蛋白分子量可在一定程度上解决这些问题。分子内交联增强了四聚体的稳定性，提高血红蛋白的分子量可使其不易直接透过肾而被循环代谢掉，从而延长其在体内的循环半寿期。但并非所有的化学偶联均能降低血红蛋白的免疫原性。因此修饰要求一方面提高血红蛋白分子量，消除产品在体内代谢过程中的肾毒性副作用，另一方面修饰还要保持血红蛋白的生物学活性，消除产品的免疫原性。目前常用的几种血红蛋白修饰方法有血红蛋白自身聚合(RauschCW，GawrylMS，LightWRetal.Stablepolymerizedhemoglobinblood-substitute.EP1093720.2001-04-25)，血红蛋白表面修饰大分子多聚物如PEG(DavisF，NHOK，ZALIPSKYS.Chemicallymodifiedhemoglobinasaneffective，stablenon-immunogenicredbloodcellsubstitute.US5234903.1993-08-10)，以及血红蛋白与多糖或蛋白偶联(AdamsonGJ.Hemoglobin-polysaccharideconjugates.US6500930.2002-11.31)虽然目前所研制的血液代用品很少具有天然血液的缺点，但还没有一种血液代用品具有血液的全部优点。就目前的研究水平看，血液代用品仍存在许多问题尚未解决，其中重要的是血液代用品的安全性和有效性等问题。血液代用品存在一些副作用(如血管收缩和高血压)限制了它们的应用，特别是用于有各种疾病的老年人身上。其次是产品在体内循环中存留时间短(短则几小时，最长寿命为70几小时，而天然红细胞的寿命则为120天)，只能提供短期的供氧功能，且与正常的血液功能差距较大。人血清白蛋白(HSA)分子量67,000，是血浆的主要蛋白质，在人体内具有维持血液渗透压和携带血液中多种配基(包括脂肪酸、氨基酸、类固醇、金属离子及药物)与组织进行交换等生理功能，医疗上作为重要的临床药物用于手术输血和危重病人补液。将血红蛋白与人血清白蛋白偶联制备血液代用品的优势非常明显。一方面，血红蛋白是主要的载氧蛋白质，白蛋白能够维持血液渗透压，运输营养物质，携带胆红素等积累性毒性物质从而具有解毒功能，因此该新型血液代用品与现有的血液代用品相比，将具有更完全的血液的功能。另一方面，偶联人血清白蛋白大大增加血红蛋白的分子量，同时进行的分子内交联可增强四聚体的稳定性，并且HSA在体内显负电性，由于电荷作用不易透过膜，这样更进一步延长了偶联物在体内的循环半寿期。并且更容易形成分子量较均一的的交联产物，避免多聚体的聚集，消除肾毒副作用。更重要的是，不同于其它动物的血清白蛋白，来源于人的血清白蛋白不会产生免疫原性，若与动物血红蛋白偶联，还会在很大程度上减弱或消除异体的血红蛋白输入人体内造成的免疫原性。因此本发明采取来自于人或猪、牛、马、羊、狗等动物的血红蛋白与人血清白蛋白偶联的方式，制备一种安全有效的新型血液代用品。
发明内容本发明提供了一种血红蛋白与人血清白蛋白的偶联物及其制备方法。本发明偶联物的血红蛋白来自于人或其它哺乳动物，优选为猪、牛、羊、马、狗的血红细胞。偶联物中血红蛋白数目为1～3个，优选为1～2个，人血清白蛋白数目为1～3个，优选为1个。偶联物中血红蛋白是分子内交联或未分子内交联的血红蛋白，优选为分子内交联的血红蛋白。偶联产物分子量分布在100KD～300KD之间。该偶联物用作血液代用品具有载氧、维持渗透压及运输营养成分的较完全的血液的功能。本发明提供的偶联物的制备方法，包括无基质血红蛋白的制备、血红蛋白与人血清白蛋白的偶联以及偶联产物的纯化。将膜过滤和离子交换层析集成纯化血红蛋白，可以得到电泳纯或色谱纯无基质血红蛋白。将洗净的红细胞在低渗透压下溶胀破裂(DocziJ.Injectablestromafreehemoglobinanditsmethodofmanufacture.1976，US3991181)，得到的红细胞裂解液经0.22～0.65μm膜微滤，再经10～30KD膜超过滤，优选为0.45μm膜微滤，再经30KD膜超过滤进行预处理。所得血红蛋白溶液经透过式阴离子交换层析进一步纯化，层析介质优选为DEAESepharoseFastFlow、QMASpherosilLS、QSepharoseBigBeads(Amershamphamacia，Sweden)，层析采用pH值为6.6～8.5，优选为pH值为7.0～7.8的磷酸缓冲液，缓冲液浓度为10mM～100mM，优选为20～50mM。采用PEG伴随式层析，选择PEG400～PEG4000，浓度为0.25％～10％，优选为0.5～5％，层析的回收率大于95％。纯化各单元的操作温度为4～10℃。得到用于与人血清白蛋白交联。本发明采用的偶联剂为与蛋白质氨基、巯基或羟基反应的双功能交联剂，优选为带有醛基、琥珀酰亚胺(NHS)基团、环氧基团、马来酰亚胺基团、亚胺酸酯基团的同型或异性双功能交联剂。本发明的人血清白蛋白与血红蛋白偶联方法，包括液相一步偶联法和两步偶联法，还包括将蛋白质吸附在固相介质上进行偶联的方法。一步偶联方法将蛋白质溶于pH6～12，优选为pH7.5～9.5的磷酸、HEPES、硼酸、硼砂-氢氧化钠或碳酸钠缓冲溶液中，蛋白质浓度为1～150mg/ml，优选蛋白质浓度为10～100mg/ml，加入交联剂，交联剂与蛋白质的配比为3∶1～600∶1，优选为10∶1～200∶1，控制反应温度4～55℃，优选为25～37℃，反应时间0.1～48小时，优选为0.5～10小时。两步交联方法先活化血红蛋白或先活化人血清白蛋白，将其溶于pH6～12，优选为pH7.0～9.5的磷酸、HEPES、硼酸、硼砂-氢氧化钠或碳酸钠缓冲溶液中，蛋白质浓度为1～150mg/ml，优选蛋白质浓度为5-60mg/ml，控制反应温度4～55℃之间，优选为25～37℃，加入交联剂，交联剂与蛋白质的配比为3∶1～600∶1，优选为10∶1～500∶1，反应时间0.1～48小时，优选为0.5～10小时。交联剂与血红蛋白或人血清白蛋白的活性基团反应(该活性基团可以为巯基或氨基)后，过SephadexG～25脱盐柱或低温透析脱修饰剂，同时调节缓冲液pH值，使pH与第一步反应pH相同或不同，但其pH范围仍为6～12，优选为7.5～9.5，再等量加入另一种蛋白，使交联剂与其活性基团(该活性基团可以为巯基或氨基)再继续反应1～48小时。固相介质上的偶联介质选用阴离子交换介质或阳离子交换介质，优选为DEAESepharoseFastFlow、QSepharoseBigBeads、QSepharoseFastFlow、SPSepharoseFastFlow以及CMSepharoseFastFlow(Amershamphamacia，Sweden)。用50mMpH4.0～8.5，优选为pH4.5～7.5的磷酸盐或HEPES缓冲液平衡层析介质，加入0.5～5mg/ml的血红蛋白或人血清白蛋白溶液，使蛋白质首先吸附在介质上。再加入交联剂，使交联剂与蛋白质的摩尔比为30∶1～600∶1，优选为10∶1～500∶1，反应时间0.1～12小时，优选为0.5～10小时。用上述平衡缓冲液洗柱除去过量的交联剂后，再用含有0.5MNaCl的该缓冲液将带有交联剂的活化的蛋白质洗脱，收集蛋白峰。经SephadexG-25凝胶过滤柱，脱去溶液中的NaCl。收集含蛋白的洗脱液，超过滤浓缩至蛋白浓度为1～5mg/ml，加入等摩尔的另外一种蛋白质，同时调节缓冲液pH值，使pH与第一步反应pH相同或不同，其pH范围仍为6～12，优选为7.5～9.5，使活化的蛋白质交联剂与另外一种蛋白质活性基团(该活性基团可以为巯基或氨基)再继续反应1～24小时，可以得到血红蛋白与人血清白蛋白1∶1的偶联物。本发明制备的偶联产物经过离子交换层析、超过滤以及凝胶过滤层析纯化，除去未发生偶联反应及分子量大于300KD和小于100KD的成分。将纯化后的偶联产物pH值调至7.4，对于受2，3-二磷酸甘油酸影响的血红蛋白，需要向溶液中加入2，3-DPG或磷酸吡哆醛等调节血红蛋白氧亲和力的共价调节剂。终产品其具有良好的血液代用品的特性。本发明通过以下具体实施例来描述本血液代用品，即血红蛋白与人血清白蛋白偶联物的制备方法。图1为纯化后的血红蛋白电泳扫描图谱A为血红蛋白溶胀破裂液B为纯化后的血红蛋白图2为纯化后的血红蛋白高效凝胶过滤液相色谱色谱柱为TSK3000SW，检测波长280nm图3为DEAESepharoseFastFlow阴离子交换法分离纯化偶联物图4为Superdex200凝胶过滤法鉴定偶联物a为离子交换法收集的蛋白峰上凝胶过滤柱b为反应混合物上凝胶过滤柱图5为SDS-PAGE鉴定偶联物图谱1为标准分子量蛋白，2为偶联物，3为标准牛血清白蛋白，4为纯化的无基质血红蛋白图6为偶联产物的载氧活性具体实施方法实施例1电泳纯无基质牛血红蛋白的制备取一定体积洗净的新鲜牛血红细胞，用两倍体积的冷溶胀液(含0.6％NaCl的20mmol/LKH2PO4/Na2HPO4(PBS)缓冲液，pH7.4)悬浮，4℃振荡1h；以每分钟溶液总体积10％的速度泵入2倍红细胞体积的20mmol/LPBS缓冲液(pH7.4)，振荡1h后调NaCl盐浓度为0.9％，即得血红细胞溶胀破裂液。采用MilliporePellicon错流膜过滤系统对破裂液进行预处理。先采用0.22μm膜微滤去除细胞碎片及大分子杂质，再进一步用截留分子量10KD的膜超过滤除去小分子杂质。所得血红蛋白溶液经DEAESepharoseFastFlow阴离子交换层析进一步纯化。采用PEG伴随式层析，用含有5％PEG400的20mM磷酸缓冲液，调节pH值为7.4进行层析，收集透过的血红蛋白峰经SDS-PAGE电泳检测为一条带(图1)。层析的回收率为97％。操作温度为10℃。用HEMOX血气分析仪检测纯化后的血红蛋白的50％氧饱和度(P50)为25.6mmHg，Hill系数为2.41。实施例2色谱纯无基质猪血红蛋白的制备取一定体积洗净的新鲜猪血红细胞，用两倍体积的冷溶胀液(含0.6％NaCl的20mmol/LKH2PO4/Na2HPO4(PBS)缓冲液，pH7.4)悬浮，4℃振荡1h；以每分钟溶液总体积10％的速度泵入2倍红细胞体积的20mmol/LPBS缓冲液(pH7.4)，振荡1h后调NaCl盐浓度为0.9％，即得血红细胞溶胀破裂液。采用MilliporePellicon错流膜过滤系统对破裂液进行预处理。先采用0.45μm膜微滤去除细胞碎片及大分子杂质，再进一步用截留分子量30KD的膜超过滤除去小分子杂质。所得血红蛋白溶液经QSepharoseBigBeads阴离子交换层析进一步纯化。操作温度为4℃。采用PEG伴随式层析，用含有0.5％PEG4000的20mM磷酸缓冲液，采用10mM的磷酸缓冲液，调节pH值为7.8进行层析，收集透过的血红蛋白峰经高效凝胶过滤液相色谱(HPLC)检测为单峰(图2)，层析的回收率为95％。实施例3间-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)一步交联人血红蛋白与人血清白蛋白由于HSA分子的巯基基团会与MBS反应，从而影响偶联反应。因此，在用MBS活化HSA前需要封闭剩余的巯基。向10ml的5mg/mlHSA溶液(pH7.8的HEPES缓冲液)缓慢加入0.2ml的30mM碘代乙酰胺，室温下反应20分钟。随后加入0.5ml的30mMMBS溶液(溶于二甲基甲酰胺)，室温下反应30分钟。反应混合液通过SephadexG-25凝胶过滤柱，除去过量的MBS和碘代乙酰胺，收集蛋白组分。因血红蛋白分子有反应活性的巯基基团(β-93半胱氨酸的巯基)，活化的HSA可直接与血红蛋白分子反应。收集的蛋白组分与10ml的20mg/ml血红蛋白溶液分别充氮气2小时，混合后在氮气保护下于室温反应2小时。随后，加入0.2ml的30mM碘乙酰胺来终止偶联反应。实施例4乙二醇二缩水甘油醚两步法交联羊血红蛋白与人血清白蛋白血红蛋白浓度60mg/ml，溶液体系为pH7.5的50mM的HEPES缓冲液、溶液总体系为10ml，乙二醇二缩水甘油醚与血红蛋白摩尔比为500∶1，37℃水浴摇床反应10小时，通过SephadexG-25凝胶过滤除修饰剂，换缓冲液为pH9.5的50mM的硼砂-氢氧化钠缓冲液，按血红蛋白∶白蛋白＝1∶1加入白蛋白，37℃水浴摇床反应48小时。交联产物经SDS-PAGE电泳检测，结果显示有83kD和97kD条带生成。血红蛋白单亚基分子量约为16kD，白蛋白分子量为67kD，83kD为单个血红蛋白亚基与血清白蛋白的交联物，97kD为交联的两个血红蛋白亚基与一个血清白蛋白的偶联物。说明生成了血红蛋白与血清白蛋白的偶联物。实施例5戊二醛两步法交联狗血红蛋白与人血清白蛋白白蛋白浓度1mg/ml，溶液体系为pH7.0的50mM的HEPES缓冲液、溶液总体系为10ml，戊二醛与白蛋白摩尔比为100∶1，37℃水浴摇床反应1小时，通过SephadexG-25凝胶过滤除修饰剂，换缓冲液为pH8.5的50mM的硼酸-硼砂缓冲液，按血红蛋白∶白蛋白＝1∶1加入血红蛋白，37℃水浴摇床反应10小时。交联产物经SDS-PAGE电泳检测，结果显示有83kD条带生成。血红蛋白单亚基分子量约为16kD，白蛋白分子量为67kD，83kD为单个血红蛋白亚基与血清白蛋白的交联物，说明生成了血红蛋白与血清白蛋白的偶联物。实施例6乙醇醛固相交联马血红蛋白与人血清白蛋白用50mMHEPES缓冲液(pH6.6)平衡5mlQSepharoseFastFlow介质，与10ml的2mg/ml牛血清白蛋白溶液混合，使蛋白吸附在介质上。加入乙醇醛，其与蛋白质的摩尔比为500∶1，混匀后在10℃下静置，并将柱封住。2小时后用300ml50mMHEPES缓冲液(pH6.6)洗柱，随后改用含有0.5MNaCl的50mMHEPES缓冲液(pH6.6)洗脱，收集蛋白峰。收集物随后上用50mMHEPES缓冲液(pH6.6)平衡的SephadexG-25凝胶过滤柱，脱去溶液中的NaCl。收集含蛋白的洗脱液，超过滤浓缩至蛋白浓度为5mg/ml，加入等摩尔的血红蛋白，同时调节缓冲液pH值9.5，使活化的白蛋白所带交联剂与血红蛋白再继续反应24小时，得到两种蛋白质的偶联物。实施例7戊二醛固相交联牛血红蛋白与人血清白蛋白用50mM磷酸缓冲液(pH8.0)平衡5mlDEAESepharoseFastFlow介质，与10ml的5mg/ml血红蛋白溶液混合，使蛋白吸附在介质上。加入戊二醛，其与蛋白质的摩尔比为10∶1，混匀后在4℃下静置，并将柱封住。0.5小时后用300ml50mM磷酸缓冲液(pH8.0)洗柱，随后改用含有0.5MNaCl的50mMHEPES缓冲液(pH8.0)洗脱，收集蛋白峰。收集物随后上用50mMHEPES缓冲液(pH8.0)平衡的SephadexG-25凝胶过滤柱，脱去溶液中的NaCl。收集含蛋白的洗脱液，超过滤浓缩至蛋白浓度为1mg/ml，加入等摩尔的白蛋白，缓冲液pH值仍为8.0，使活化的血红蛋白的戊二醛醛基与白蛋白再继续反应8小时，得到两种蛋白质的偶联物。实施例8偶联产物的纯化用300KD和100KD的超滤膜除去聚合产物中大于300KD和小于100KD的成分，所得产物为分子量分布在100KD～300KD之间的偶联产物，即1～3个已经分子内交联或未分子内交联的血红蛋白与1～3个人血清白蛋白分子的偶联物。实施例9偶联产物的纯化将实施例6中偶联产物的pH值调至7.0，上DEAESepharoseFastFlow阴离子交换层析柱，该柱已用含有0.1MNaCl的50mMHEPES缓冲液(pH7.0)平衡。用25ml平衡液洗脱，流速为0.5ml/min。随后改用55ml含有0.1-0.5MNaCl的50mMHEPES缓冲液(pH7.0)洗脱，流速为0.5ml/min。洗脱液在280nm下检测，图谱见图3。收集含有偶联物的蛋白峰，浓缩后上Superdex200凝胶过滤柱。以50mMHEPES缓冲液(pH7.0)为流动相，流速为0.35ml/min。洗脱后在280nm下检测出现两个洗脱峰，其中偶联物在第一个洗脱峰(图4)，收集用SDS-PAGE凝胶电泳进一步鉴定(图5)。纯化的偶联物主要含两条蛋白带(第2泳道)，分子量约为16kDa和83kDa。这是由于血红蛋白为四聚体蛋白，加入上样缓冲液煮沸后，解聚为16kDa的亚基。而血红蛋白与HSA偶联后，四聚体蛋白中的3个亚基解离出来，而剩下的1个亚基与BSA分子结合为分子量83kDa的蛋白。因此，可确定该蛋白为1∶1结合的HSA-血红蛋白偶联物。实施例10本血液代用品成品制得及特性将纯化后的偶联产物的pH值调至7.4。对于受2，3-二磷酸甘油酸影响的血红蛋白，需要向溶液中加入2，3-DPG或磷酸吡哆醛等调节血红蛋白氧亲和力的共价调节剂。实施例7中偶联产物用HEMOX血气分析仪检测纯化后的血红蛋白的P50为26.8mmHg，Hill系数为2.30(图6)。权利要求1.一种蛋白质的偶联物，其特征是血红蛋白与人血清白蛋白的偶联物。2.权利要求1所述的偶联物，其特征是血红蛋白数目为1～3个，人血清白蛋白数目为1～3个。3.权利要求1所述的偶联物，其特征是血红蛋白数目为1～2个，人血清白蛋白数目为1～2个。4.权利要求1所述的偶联物，其特征是血红蛋白数目为1个，人血清白蛋白数目为1个。5.权利要求1～4中任一权利要求所述的偶联物，其特征是偶联产物分子量分布在100KD～300KD之间。6.权利要求1～4中任一权利要求所述的偶联物，其特征是血红蛋白是分子内交联的血红蛋白。7.权利要求1中所述偶联物的制备方法，其中血红蛋白的制备方法是将膜过滤和离子交换层析集成纯化血红蛋白，步骤如下1)用0.22～0.65μm膜微滤，得到的透过液经10～30KD膜超滤；2)超过滤后的血红蛋白浓缩液经透过式阴离子交换层析，层析pH值为7.0～7.8，缓冲液浓度为10mM～50mM，采用PEG伴随式层析，选择PEG400～PEG4000，浓度为0.25％～10％，操作温度为4～10℃。8.权利要求1中所述偶联物的制备方法，是指在液相中将两种蛋白质直接与交联剂反应的一步偶联法，或者先修饰一种蛋白质再偶联另外一种蛋白质的两步偶联法，或者将蛋白质吸附在固相介质上进行偶联的方法，采用的偶联剂为与蛋白质氨基、巯基或羟基反应的双功能交联剂。9.权利要求1中所述偶联物的制备方法，其中偶联产物经过离子交换层析、超过滤以及凝胶过滤层析纯化，除去未发生偶联反应及分子量大于300KD和小于100KD的成分。10.权利要求1中所述的偶联物用作血液代用品的用途。全文摘要本发明提供了一种血红蛋白与人血清白蛋白偶联物及其制备方法。采用膜过滤和离子交换层析纯化血红蛋白，采用液相一步偶联法、两步偶联法或者将蛋白质吸附在固相介质上偶联的方法将血红蛋白与人血清白蛋白偶联，偶联产物经过离子交换层析、超过滤以及凝胶过滤层析纯化，制备的偶联产物分子量分布在100KD～300KD之间，为1～3个已经分子内交联或未分子内交联的血红蛋白与1～3个人血清白蛋白分子的偶联物。采用固相吸附法可以得到血红蛋白与人血清白蛋白1∶1的偶联物。终产品具有良好的血液代用品的特性。文档编号C07K14/805GK1535986SQ0310962公开日2004年10月13日申请日期2003年4月9日优先权日2003年4月9日发明者苏志国,路秀玲,郑春杨,徐宇红,胡涛申请人:中国科学院过程工程研究所