专利名称：白头翁总皂苷及提取方法，以及医药用途和药物制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及白头翁总皂苷及提取方法，还涉及到以白头翁总皂苷为基本活性成分的组合物的医药用途及药物制剂，属于中药学有效成分提取及应用技术领域。
背景技术：
白头翁Pulsatilla chinensis(bge.)regel在植物分类学上属毛莨科植物。白头翁主要有效成分是毛茛苷类和皂苷类，近几年来对白头翁的水及醇提取液进行了一些药理研究研究，发现白头翁的提取物具有抗菌、抗阿米巴原虫作用，具杀死阴道滴虫的作用，及镇静镇痛等作用。
到目前为止尚未见到有将白头翁总皂苷制备成药物的文献报道，发明人经过大量的试验研究证实，白头翁总皂苷具有抗肿瘤作用及抗菌作用，并制成了药剂，完成了本发明。
发明内容
本发明提供一种白头翁总皂苷。
本发明提供了从白头翁中提取总皂苷的方法。本发明进一步提供了以白头翁总皂苷为基本活性成分在预防和治疗肿瘤以及镇痛、抗菌抗炎和增强免疫力的用途。
本发明还提供了以白头翁总皂苷为基本活性成分的药物或与其它药物组方的制剂。
白头翁总皂苷可以通过以下方法提取以白头翁为原料，用0％至100％醇提取1-10次，最好使用70％醇提取；最好提取3次，或水提取60％-95％醇沉淀的提取方法，回收醇也可以；或水提取碱沉淀的提取方法也可以，提取液合并，过滤，滤液经过大孔吸附树脂柱纯化，用0％-20％醇洗脱至无色后，用10％-100％醇洗脱后收集洗脱液，最佳用70％醇洗脱，回收醇，至无醇味，减压下或常压下浓缩成漫膏状或干粉，用0％-95％醇溶解，最好用70％醇溶解，滤过，除去沉淀物并回收滤液，减压回收醇后得到所需的白头翁总皂苷。化学分析表明，所得终产物白头翁总皂苷含量大约为50％以上。
本发明的药物组合物，其中除含有白头翁总皂苷外，还可含有在白头翁总皂苷分离纯化过程中残留的白头翁植物本身的少量黄酮、蛋白质、肽、氨基酸、多糖，以及微量元素和挥发油。本领域技术人员可以理解到，这些杂质成分基本上不会给本发明药物组合物中白头翁总皂苷的药理学活性带来不利影响。
另外，应特别指出的是，可根据需要在本发明的药物组合物中加入一种或多种天然或合成的其他与白头翁总皂苷具有协同或辅助作用的活性成分。这些可能被加入的天然或合成的辅助活性成分是本领域技术人员已知的和可以想到的。
本发明以白头翁总皂苷为基本活性成分的药物组合物的方法，该方法包括(1)提供白头翁总皂苷；(2)将步骤(1)得到白头翁总皂苷与一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂相混合。
所说的药物组合物中还可另外加入一种或多种天然或化学合成的，与基本活性成分白头翁总皂苷有辅助或协同作用的其他活性成分。
本发明涉及以白头翁总皂苷为基本活性成分的药物组合物及白头翁总皂苷的制备方法。
本发明提供了以白头翁总皂苷为基本活性成分的药物组合。根据本发明一个优选实施方案，其中所说的白头翁总皂苷占所说的药物组合物的50％(w/w)以上，并且所说的白头翁总皂苷基本上是由三萜皂苷组成的。
可以将白头翁总皂苷与一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂按适当比例混合，制成适用于临床上使用的不同剂型的药物组合物。例如可将所说的组合物配制成可供静脉内，肌肉内、腹腔内、皮下、脑脊髓腔内等注射给药的注射剂，或者制成适于口服给药的片剂、颗粒剂、滴丸、冲剂、液体制剂、粉末剂。丸剂、胶囊剂和悬浮剂，以及适于局部给药的喷雾剂、气雾剂、霜剂、软膏和栓剂。
本发明组合药物优选含有1％-99％的白头翁总皂苷和99％-1％的赋形剂。
本发明组合药物优选含有20％-80％的白头翁总皂苷和80％-20％的赋形剂。
为了制备适于胃肠道外途径药的溶液剂，例如可使用蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠溶液或葡萄糖溶液，或者低浓度(例如1-100mM)磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为载体或赋形剂。可以在这些胃肠道外给药的制剂中加入一种或多种其他辅助成分或添加剂，例如可使用抗坏血酸作为抗氧化剂，使用苯甲酸钠或尼泊金甲酪作为防腐剂，使用二甲基亚砜作为吸收促进剂。
为了制备适于口服给药的片剂、粉末剂，悬浮剂或胶囊剂，可以使用蔗糖、半乳糖、玉米淀粉、明胶、脂质、微晶纤维素、滑石粉等作为载体或赋形剂。在这些适于口服给药的制剂中，还可含有其他适当的添加剂，例如增溶剂、崩解剂、润滑剂、吸收促进剂、分散剂、表面活性剂、矫味剂或着色剂等。
最好将本发明的药物组合物制成各种适于口服绐药的剂型，例如片剂、粉末剂、胶囊剂，或口服液或乳剂。这些口服制剂的单位剂量一般包含30-800mg白头翁总皂苷。
本发明药物组合物的另一个优选给药途径是静脉内或肌肉内注射适于这些给药途径的注射液。例如对于某些癌症病人，可将本发明药物组合物的注射液制剂加在等渗葡萄糖溶液或等渗氯化钠溶液中，持续地滴注给药。
本发明进一步提供了所说的含有白头翁总皂苷的药物组合物在治疗或预防癌症及相关病理条件中的应用。
药理体内试验研究摘要白头翁总皂苷以80、30mg/kg剂量灌胃给药，P388腹水型及S180实体肉瘤显示较明显的抗癌活性，对肝癌腹水型也有一定的抗癌作用。
药物白头翁总皂苷，黄色粉末，经筛选用剂量80 30mg/kg，，用时以生理盐水溶解，吐温-80助溶。
动物昆明种小白鼠，体重18-22g，雌雄兼用，购自长春市绿园区科新实验动物养殖场。合格证号吉动质字10-1015。
瘤株P388腹水型、S180实体肉瘤、肝癌腹水型，均购自吉林省肿瘤研究所。
方法取接种7-10天的荷瘤动物，脱颈椎处死，在无菌条件下，消毒腹部皮肤，抽取乳白色瘤液，以生理盐水按1∶2比例稀释，然后给正常动物接种，每只0.2ml，腹水型接种于雌性动物腹腔，实体型接种于雄性动物腋窝皮下，接种后次日开始分组给药，观察对腹水型的生命延长率及对实体型的抑瘤率，结果用统计学t检验处理。见下表1。
表1白头翁总皂苷对动物移植性肿瘤P388的影响组别与剂量 动物数存活天数mg/kg n (天；X±SD)荷瘤对照组 10 8.57±1.38Cyclophosphamide 20 10 17.5±1.97***白头翁总皂苷 80 10 14.07±3.05**白头翁总皂苷 30 10 11.1±2.05*注*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001 以下同略表2白头翁总皂苷对动物移植性肿瘤S180的影响组别与剂量动物数 瘤重mg/kg n (g；X±SD)荷瘤对照组 10 2.15±0.38Cyclophosphamide 20 10 1.76±0.25**白头翁总皂苷 80 10 1.14±0.51**白头翁总皂苷 30 10 1.20±0.40**表3白头翁总皂苷对动物移植性肿瘤Hep-A-22的影响组别与剂量动物数存活天数mg/kg n (天；X±SD)荷瘤对照组 10 17.52±0.99Cyclophosphamide 30 10 26.77±2.45白头翁总皂苷 80 10 22.60±2.2530 10 18.60±2.40由表中结果可知，白头翁总皂苷对P388腹水型及S180肉瘤均显示出较强的抗癌作用，与对照组比较差异显著，其中80mg/kg剂量疗效较稳定，对Hep-A-22腹水型也显示有一定作用。
药理体外试验研究---MTT法测定白头翁总皂苷对不同体外培养细胞株细胞增殖的影响实验目的MTT法通过颜色的深浅对比间接反映活的增殖细胞的数量，从而检测受试中药样品对不同细胞的增殖作用，用于细胞体外药物敏感性的检测。
1试剂和仪器Eagle’s MEM培养基(Gibco，USA)；胰蛋白酶(Trypsin)(Gibco，USA)；96孔培养板(Costar，USA)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma，USA)；酶标光度计(CliniBio 128C，EC)；胎牛血清(中国医学科学院血液研究所，批号200004)；CO2培养箱(SANYO，MCO-175M，Japan)，其余试剂均为国产AR。
2细胞株宫颈癌细胞系(HeLa)、人乳腺癌细胞系(Bcap-37)、人肺癌细胞系(A549)、人肝癌细胞系(HepG2)、人胃癌细胞系(SGC-7901)，人白血病细胞系(K562)，以上细胞系均购自武汉大学菌种保藏中心(CCTCC)。
3受试样品白头翁总皂苷黄色粉沫，抗肿瘤1号为黄色颗粒。
4阳性对照药硫酸长春新碱(广州明兴制药厂，批号010701)；甲氨蝶呤(淅江万马药业有限公司，批号010301)；顺铂(山东省德州制药厂，批号010914)。盐酸阿霉素(深圳万乐药业有限公司，批号0111E1)。5细胞培养常规传代培养[1]。
6实验方法采用MTT法。取生长状态良好的上述细胞各一瓶，制成细胞悬液，以1×104/孔100μl接种在96孔培养板中，同时加入受试样品20μl，10倍稀释成不同浓度，对照组加入不含样品的培养液20μl，样品与细胞37℃，5％CO2，饱和湿度下，培养48h，加入MTT20μl(1mg/ml)，继续培养4h，弃液体，换成100％二甲基亚砜，自动酶标光度计测定λ1＝550nm，λ2＝620nm。测定结果实验结果表4.白头翁总皂苷对HeLa细胞株增殖活性的影响分组剂量 x±SD(OD值)n＝4 μg/ml对照组 0.00 0.258±0.040长春新硷100.00 0.185±0.044*10.000.182±0.021*1.00 0.207±0.034氨甲蝶呤100.00 0.159±0.026**10.000.176±0.030*1.00 0.168±0.021*顺铂100.00 0.204±0.027*10.000.190±0.005*1.00 0.187±0.006*阿霉素 100.00 0.054±0.008***10.000.215±0.0051.00 0.186±0.0111号 50.000.094±0.015***10.000.177±0.007*1.00 0.212±0.057白头翁总皂苷50.000.104±0.005**10.000.179±0.019*1.00 0.204±0.025各加药组分别与对照组比较***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05.
表4结果表明，阳性对照药和抗肿瘤1号和白头翁总皂苷对人宫颈癌细胞的增殖均有显著的抑制作用，其中阿霉素和抗肿瘤1号的作用较强。
表6、白头翁总皂苷对SGC-7901细胞株增殖活性的影响分组 剂量 x±SD(OD值)n＝4 μg/ml对照组 0.00 0.193±0.022长春新硷 100.000.139±0.02310.00 0.139±0.0161.00 0.164±0.013氨甲蝶呤 100.000.137±0.02110.00 0.144±0.0081.00 0.155±0.016顺铂 100.000.157±0.01610.00 0.155±0.0161.00 0.157±0.010阿霉素 100.000.014±0.007***
10.000.150±0.0061.00 0.163±0.0141号 50.000.163±0.00410.000.174±0.0171.00 0.211±0.007白头翁总皂苷50.000.106±0.005**10.000.158±0.0031.00 0.159±0.013各加药组分别与对照组比较***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。
表6结果表明，除阿霉素和白头翁总皂苷对人胃癌细胞有显著抑制作用外，其他样品的抑制作用均不显著。
表7、白头翁总皂苷对K562细胞株增殖活性的影响分组 剂量x±SD(OD值)n＝4 μg/ml对照组 0.00 0.272±0.015长春新硷100.00 0.098±0.015***10.000.223±0.028*1.00 0.273±0.014氨甲蝶呤100.00 0.229±0.02110.000.268±0.0271.00 0.302±0.022顺铂100.00 0.244±0.02010.000.280±0.0411.00 0.317±0.024阿霉素 100.00 0.081±0.004***10.000.148±0.037**1.00 0.244±0.0211号 50.000.135±0.011**10.000.279±0.0161.00 0.293±0.009白头翁总皂苷50.000.160±0.009**10.000.272±0.0291.00 0.322±0.007各加药组分别与对照组比较***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。
表7结果表明，长春新硷、阿霉素、抗肿瘤1号和白头翁总皂苷对白血病细胞有显著抑制作用外，其他样品的抑制作用均不显著。
表8、白头翁总皂苷对A549细胞株增殖活性的影响分组剂量x±SD(OD值)n＝4 μg/ml对照组 0.00 0.080±0.014长春新硷100.00 0.062±0.00810.00 0.118±0.0101.00 0.082±0.011氨甲蝶呤100.00 0.085±0.01510.00 0.085±0.0151.00 0.097±0.007顺铂100.00 0.091±0.00610.00 0.112±0.0171.00 0.113±0.007阿霉素 100.00 0.084±0.00710.00 0.117±0.0161.00 0.114±0.0021号 50.00 0.029±0.010*10.00 0.101±0.0301.00 0.100±0.010白头翁总皂苷50.00 0.031±0.007*10.00 0.118±0.0101.00 0.114±0.011各加药组分别与对照组比较***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05.
表8结果表明，除抗肿瘤1号和白头翁总皂苷对肺癌细胞有显著抑制作用外，其他样品的抑制作用均不显著。
结论实验结果表明，白头翁总皂苷剂量在50μg/ml时，对宫颈癌、胃癌细胞、白血病细胞和肺癌细胞的增殖有显著的抑制作用(P＜0.01)。
总皂苷对免疫功能的影响1.材料和方法 环磷酰胺，上海第十二制药厂生产，临用时用生理盐水配成0.5％和5％浓度。
2.动物 昆明种小白鼠。雌雄兼用，体重19.0±0 31g。
3.方法 将小鼠50只随机分为5组.分别用生理盐水，环磷酰胺、白头翁总皂苷灌胃，每天1次，每次0.2ml/10g，连用6天。
于末次给药后24小时，每鼠腹腔注射2％鸡红细胞(CRBC)混悬液1.0ml，间隔30分钟后腹腔注射生理盐水2.0ml。然后颈椎脱臼处死，切开腹部皮肤，经腹膜吸取腹腔液1.0ml，分别滴十两片载玻片上，每片0.5ml，置37℃培养箱中孵育30分钟，孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞，凉干，用1∶1丙酮——甲醇溶液固定。用4％Giemsa-PBS液染色3分钟，蒸馏水漂洗，凉干，油镜下计数，每个样本两份，计数后驭平均值，按下列公式计算吞噬串和吞噬指数吞噬率＝(吞噬CRBC的巨噬细胞数/200个巨噬细胞)×100％吞噬指数＝被吞噬的CRBC总数/吞噬CRBC的巨噬细胞数取用药6天后各组小白鼠的脾脏和胸腺别称重，计算每10g体重脾脏和胸腺的mg数脾指数和胸腺指数。
白头翁总皂苷对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬CRBC的影响(x±s)组别 n剂量(mg/kg.d)吞噬率(％) 吞噬指数生理盐水 10 - 45.32±216 2.90±0.21环磷酰胺 10 2538.91±2.610.81±0.12白头翁总皂苷 10 8 51.05±6.28*1.10±0.09白头翁总皂苷 10 8056.14±5.98*1.20±0.14白头翁总皂苷对小鼠免疫器官重量的影响(x±s)组别 n剂量(mg/kg.d)吞噬率(％) 吞噬指数生理盐水 10 - 23.54±2.089.90±3.21环磷酰胺 10 2525.43±2.163.41±0.62白头翁总皂苷 10 8 35.37±6.54*8.03±1.098***白头翁总皂苷 10 8039.12±5.08**8.51±1.14******P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05综上所述，白头翁总皂苷无论是在整体或离体条件下，均具有抗肿瘤作用和增强免疫功能。
具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领城普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。
实施例1白头翁总皂苷的制备取白头翁1kg加适量的水，加热煮沸三次，(每次40分钟)。收集并合并所得的水提液，过滤，将滤液加于预先用酸和碱处理的大孔吸附树脂柱，用去离子水洗柱直到洗出液无颜色，后用70％乙醇洗脱。收集70％乙醇洗脱液，并减压回收，蒸干，将所得浓缩物用70％乙醇溶解，放置，并滤过，滤液减压浓缩干燥，得到黄色粉末状白头翁总皂苷50g。
实施例2取白头翁1kg加适量的水，加热煮沸三次，(每次40分钟)。收集并合并所得的水提液，浓缩之相对密度为1.20，加乙醇至醇浓度为70％，或用85％乙醇提取，滤过，回收乙醇至无醇味，将药液加于预先用酸和碱处理的大孔吸附树脂(例AB-8中国天津南开大学化学)柱，用去离子水洗柱直到洗出液无颜色，后用80％乙醇洗脱。收集80％乙醇洗脱液，并减压回收，蒸干，得到黄色粉末状白头翁总皂苷80g。
实施例3
取白头翁总皂苷100g，用75％乙醇溶解制成5％的白头翁总皂苷溶液，用活性炭脱色，滤过，减压浓缩干燥，加注射用水制成每ml含20mg白头翁总皂苷的水溶液，用微孔滤膜(ф0.20μm)滤过至澄明，灭菌，无菌分装于西林瓶中，每瓶5ml，置冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
实施例4取白头翁总皂苷100g，用75％乙醇溶解制成5％的白头翁总皂苷溶液，用活性炭脱色，滤过，减压浓缩干燥，加注射用水制成5％的水溶液，用微孔滤膜(ф0.20μm)滤过至澄明，灭菌，无菌分装，每瓶10ml，封口，即得。
实施例5取白头翁总皂苷1kg，药用淀粉0.5kg，用80％乙醇湿法制粒，整粒，装2#胶囊，每粒0.2g。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版胶囊项下。
实施例6取白头翁总皂苷1kg，药用淀粉0.5kg，糊精1kg，50乙醇适量制粒，整粒，干燥，压片。每片0.3g。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版片剂项下。
权利要求
1.一种白头翁总皂苷提取方法，其特征在于通过以下方法提取以白头翁为原料，用0％至100％醇提取1-10次，最好使用70％醇提取；最好提取3次，或水提取60％-95％醇沉淀的提取方法，回收醇也可以；或水提取碱沉淀的提取方法也可以，提取液合并，过滤，滤液经过大孔吸附树脂柱纯化，用0％-20％醇洗脱至无色后，用10％-100％醇洗脱后收集洗脱液，最佳用70％醇洗脱，回收醇，至无醇味，减压下或常压下浓缩成漫膏状或干粉，用0％-95％醇溶解，最好用70％醇溶解，滤过，除去沉淀物并回收滤液，减压回收醇后得到所需的白头翁总皂苷。
2.权利要求1所述的白头翁总皂苷。
3.以白头翁总皂苷为基本活性成分在预防和肿瘤治疗镇痛、抗菌抗炎以及增强免疫力的用途。
4.以白头翁总皂苷为基本活性成分的药物或与其它药物组方的制剂。
5.权利要求4所述的制剂，其特征在于药剂学上的任何剂型。
全文摘要
本发明提供了一种白头翁总皂苷及提取方法，属于中药学有效成分提取及应用技术领域。取白头翁加适量的醇水，加热回流，收集并合并所得的提取液，提取液用经过除杂，过滤，将滤液加于预先用酸和碱处理好的大孔吸附树脂柱，用去离子水洗柱直到洗出液无颜色，再用醇液洗脱、减压回收醇液洗脱液，蒸干，得到黄色粉末状白头翁总皂苷。本发明进一步提供了以白头翁总皂苷为基本活性成分在预防和治疗肿瘤以及镇痛、抗菌抗炎的用途。本发明还提供了以白头翁总皂苷为基本活性成分的药物或与其它药物组方的制剂。
文档编号C07J63/00GK1566136SQ03127100
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月27日 优先权日2003年6月27日
发明者徐东铭, 徐雅娟, 刘平 申请人:吉林迈迪星药物科技发展有限公司