专利名称：重组新型复合干扰素在预防和治疗非典型肺炎中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及新型复合干扰素基因的克隆、基因工程表达和含有新型复合干扰素的制剂作为人类非典型肺炎的预防和治疗药物。
干扰素是细胞对病毒感染或各种合成及生物诱生作用反应，而产生并分泌的一类天然生成的小蛋白分子，分子量为15,000-21,000道尔顿。已经确定的干扰素有两大类(即I型和II型)。I型干扰素包括25种以上的α干扰素以及β干扰素和omega干扰素。所有的α干扰素生物作用相似，但每一种α干扰素并不具有全部活性，在许多情况下，每一干扰素亚型的活性程度差别很大。
新型复合干扰素是一种重组的、非自然存在的I型干扰素。新型复合干扰素的166个氨基酸序列的取得是通过对几种天然α亚型干扰素序列的扫描，把最常见的氨基酸转移到各个对应的位置。为了便于分子构造，另外对多个氨基酸作了改变，并利用化学合成方法构造了一个对应的合成DNA序列。新型复合干扰素与αII型干扰素的差异在20/166个氨基酸(88％同源性)，与β干扰素比较，氨基酸位置一致性在30％以上，相似性比任何天然的α亚型干扰素为高。新型复合干扰素是在大肠杆菌(E.coli)细胞中产生的，细胞中插入为新型复合干扰素编码的合成序列加以遗传改变。最终纯化之前，新型复合干扰素氧化复性至天然状态，顺序通过一系列层析柱后达到最终纯度。这种蛋白质的分子量约为19,000道尔顿。
新型复合干扰素的抗病毒、抗增殖、天然杀伤细胞(NK)激活、和基因诱生活性，用试管内测定和别的重组α干扰素加以比较，结果表明活性范围相似。新型复合α干扰素显示的体外特异性活性比α-2a和α-2b干扰素至少大五倍以上。新型复合干扰素与世界卫生组织国际效能标准的一种重组α干扰素(83/514)比较，表明在一项体外抗病毒细胞病变作用测定和一项抗增殖测定中的特异性活性均为1×109单位/mg。
新型复合干扰素在抗丙型肝炎及乙型肝炎方面显示了非常有效的治疗作用。我公司除将新型复合干扰素作成针剂用于治疗以上疾病外，还将其开发成喷雾制剂，用于非典型肺炎的预防和治疗，已证明了其有效性。
本发明采用下述技术方案(1)本发明首先设计合成了新型复合干扰素易于在大肠杆菌中表达的全基因序列，并选用pBV220载体构建了重组质粒，转化大肠杆菌工程菌DH5α或者JM109并经42摄氏度诱导表达，表达量达到菌体总蛋白的20-30％。表达率经100次以上传代不降低。
(2)通过发酵工程菌，用2YT作为基础培养基，适当增加碳源和氮源，通过优化溶氧、搅拌速度、发酵pH值等工艺参数，最终培养物OD600值可达25左右，生物量为每升培养物30-35g，产物表达率在20-30％之间。真正实现了高水平表达。
(3)在发酵基础上建立了纯化工艺，其中包括菌体的破碎和产物抽提、阴阳离子交换层析和凝胶排阻层析精制等。
所建立的工艺稳定、回收率高、活性好。本工艺具有以下特点①通过包含体的抽提去除了大量的可溶性蛋白，而目标蛋白无损失；②阴、阳离子交换层析可去除几乎所有的剩余杂蛋白；③最后一步凝胶排阻层析可以去除大小分子量的酸性杂质。
(4)纯品加入药用甘露醇以及磷酸盐缓冲液等稳定剂和助溶剂后，用微孔滤膜过滤除菌，分装成水针剂、冻干粉针剂或喷雾剂，用于乙型肝炎、丙型肝炎和非典型肺炎的预防和治疗。
本发明运用重组DNA技术，采用基因合成的方法设计合成了易于大肠杆菌表达的新型复合干扰素基因，运用合理的表达元件组合提高了产物的表达，且产物主要以包含体形式存在于大肠杆菌内，产物比活性高，下游纯化方式简便，收率高，达到临床用药的质量要求。本产品用于人类乙型肝炎、丙型肝炎和非典型肺炎的预防和治疗，能得到显著的疗效。
本发明用下述实例进行说明实施例1、全长基因的合成将所设计的全长DNA序列分为大致相等的8个片段，正、反向链各4个。设计的片段全部人工合成，然后用PCR的方法分别合成5′端268bp(片段I)和3′端268bp(片段II)两个cDNA半分子。片段I的3′端和片段II的5′端有20bp的碱基序列互补。得到全长的DNA分子后进行PCR扩增，得到的扩增产物插入测序质粒pUC18，测序正确后进行表达载体的构建。
实施例2、表达载体的构建从pUC18/IFN酶切获得目的基因片段，回收后连接已双酶切的pBV220表达载体成为原核表达质粒pBV220/IFNco，转化优选的DH5α大肠杆菌后用PCR方法筛选阳性克隆，且酶切正确。含有以上表达质粒的DH5α工程菌经扩增培养、42℃诱导，在19kd左右多出一条蛋白条带。
实施例3、重组新型干扰素的发酵生产工程菌30℃过夜培养后，按5％比例接种于2YT培养基中，30℃培养到OD600为4.0时，升高温度至42℃，4h后收集菌体。发酵产物密度可达OD600为25，生物量为每升培养物30-35g。电泳鉴定尿酸氧化酶表达水平，薄层扫描显示尿酸氧化酶占菌体总蛋白的20-30％之间。
实施例4、新型复合干扰素的分离纯化重组新型复合干扰素在菌体内主要以包含体形式存在于菌体胞浆内，菌体破碎后离心回收沉淀，沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤后进行蛋白的变复性，使产物得到初步纯化。复性后的上清再经Q-Sepharose和SP-Sepharose柱层析可以得到电泳纯的新型复合干扰素。最后用Sephacryl S-100精制得到19kd的产品。
实施例5、抗SARS病毒活力测定VeroE6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×104个/孔，37℃培养24小时，细胞长成单层。将最大无毒浓度以下的药物10倍稀释5个浓度，分别加入细胞板中，每孔100μl，37℃5％CO2温箱培养24小时后，再分别加入不同稀释度的SARS病毒(10-3、10-4、10-5)，共同培养48-72小时，观察细胞病变程度。每个稀释度设4个孔，并设正常细胞对照、药物对照和不同稀释度(10-3、10-4、10-5)的病毒对照，每天观察，待病毒观察出现细胞明显病变时，判定干扰素抗病毒的效应。实验结果为重组人新型复合干扰素对细胞的无毒浓度为106IU/ml。当病毒浓度为10-5时，干扰素对SARS病毒有封闭作用，其半数抑制病毒浓度为265IU/ml。
权利要求
1.新型复合干扰素在预防和治疗非典型肺炎中的应用。
2.权利要求1的新型复合干扰素的基因序列为5′CG GAATTC1 ATG TGC GAC CTG CCT CAG ACC CAC AGC CTG GGT AAC CGT CGT GCT CTG ATC CTG CTGGCT61 CAG ATG CGT CGT ATC TCT CCG TTC TCC TGC CTG AAA GAC CGT CAC GAC TTC GGT TTCCCG121 CAG GAA GAG TTC GAT GGC AAC CAG TTC CAG AAA GCT CAG GCT ATC TCT GTT CTG CACGAA181 ATG ATC CAG CAG ACC TTC AAC CTG TTC AGC ACT AAA GAC TCC TCT GCT GCT TGG GACGAA241 AGC CTG CTG GAA AAA TTC TAC ACT GAA CTG TAC CAG CAG CTG AAC GAC CTG GAA GCTGGC301 GGT ATC CAG GAA GTT GGT GTT GAA GAA ACT CCG CTG ATG AAC GTT GAC TCC ATC CTGGCT361 GTT AAA CGT TAC TTC CAG CGT ATC ACT CTG TAC CTG AAC GAA AAA AAA TAC AGC CCGTGC421 GCT TGG GAA GTT GTT CTG GCT GAA ATC ATG CGT ACC TTC TCT CTG TCA ACC AAC CTGCAG481 GAA CGT CTG CGT CGT AAA GAA TAAGGA TCC CG3′
3.权力要求2得到的产物用相应的核酸内切酶消化后插入到pBV220载体构建高效表达质粒pBV220/IFNco，不仅限于pBV220载体。
4.权利要求3的原核表达质粒pBV220/IFNco转化DH5α或HB101大肠杆菌(不仅限于DH5α或HB101菌)，发酵后得到高水平表达的重组新型复合干扰素。
5.权力要求4得到的新型复合干扰素通过蛋白的变复性、离子交换、凝胶过滤等纯化过程得到纯度98％以上的产物。
全文摘要
本发明涉及一种新型复合干扰素(Urate oxidase，简称UOX)在预防和治疗非典型肺炎中的应用。本发明利用原核表达原理与技术，优选了大肠杆菌偏爱的密码子，设计了新型复合干扰素的基因序列，进行了全基因序列的人工合成并选用pBV220载体构建了重组质粒，转化大肠杆菌工程菌DH5α或者JM109并经42摄氏度诱导表达，表达量达到菌体总蛋白的20－30％。工程菌经过发酵、破菌后，离心保留沉淀。沉淀经过变复性后利用阴离子交换、阳离子交换和凝胶排阻层析的方法纯化产品。纯品加入保护剂后制成药用喷雾制剂。该制剂用于非典型肺炎的预防和治疗。
文档编号C07H21/00GK1589899SQ0315592
公开日2005年3月9日 申请日期2003年8月27日 优先权日2003年8月27日
发明者徐明波, 王勇波, 崔铁民, 吴彦卓, 陈遥, 卢安京, 李亚军, 贾志杰, 袁雪莲, 王京燕, 赵艳红, 纪晓光, 李晓萸, 张永祥 申请人:北京双鹭药业股份有限公司