专利名称：重组人红细胞生成素的分离纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质的生产方法，具体涉及一种重组人红细胞生成素(rhEPO)的分离纯化工艺。
背景技术：
1997年Miyake等人(Miyake.et al.，J.Bid，Chem，252，P5558(1997))从人尿中首次分离纯化出人的红细胞生成素(EPO)，从而证实了它在人体内存在。1984年发现了EPO是红系祖细胞的分化、增殖、成熟的主要控制因子。1985年Jacobs等人(Jacobs et al.，Nature，313，p806(1985))首先从人的胚胎肝细胞中成功的分离了人EPO基因的cDNA，同年Lin等人(Lin et al.，Proc Natl Acad Sci USA，82，P7580(1985))将人EPO基因克隆并在CHO细胞中获得了高效表达。1986年Law等人(Law ML，et al.，Proc Natl Acad Sci USA，83，P6920(1986))测定人EPO基因的核酸序列，位于第7对染色体长臂中段的q11-q22区，为单拷贝基因，由5个外显子和4个内含子组成，1986年Lai等人(Lai et al.，J Biol Chem，261，p3116(1986))发现并报道了人EPO的结构特征，它为编码193个氨基酸，N端由27个氨基酸组成的信号肽在分泌过程中被切除，翻译后修饰包括去除C端的第166位精氨酸，最终在体内发挥生理作用的是由165个氨基酸组成的单链多肽。它有三个N-连接的糖基化位点和一个O-连接的糖基化位点，糖基化程度和种类与它的体内活性密切相关。1989年美国AMGEN公司生产的rhEPO获得FDA的批准，并在不同国家申请了不同专利保护(专利号US5,547,933，EUROPEAN0 178665A2和CN85 101181 A)。
rhEPO是采用反转录PCR技术克隆了人EPO-cDNA，并将其插入到真核细胞表达载体，构建重组表达质粒，并转染到CHO细胞中，筛选出高效稳定表达人EPO的工程细胞株。对其细胞培养收获上清进行EPO蛋白分离纯化。人EPO是红系祖细胞的分化、增殖、成熟的主要控制因子。rhEPO注射液是临床上肾性贫血的特效治疗药物。也可治疗非肾性贫血。rhEPO是目前可用于临床治疗的基因工程药物中技术最成熟，临床疗效最确切，销售额最多的一种产品。
目前中国国内有多家EPO生产企业，要想产品出口参与国际市场竞争，条件之一必须建立一种适合大规模生产和低成本的EPO重组蛋白的分离纯化工艺。
目前有报道的工艺方法，大多在工艺中使用反相层析和有机溶剂，引起蛋白质在层析过程中发生变性和要考虑排除有机溶剂在产品中的残留，以致对人体的毒性作用。本发明一种重组红细胞生成素(rHuEPO)的分离纯化工艺，其特征避免使用反相层析和有机溶剂。
发明内容
为了满足大规模生产EPO重组蛋白的需要，本发明的目的将提供一种低成本的重组人红细胞生成素的生产方法。本发明的目的将提供一种产品回收率高，工艺稳定，容易放大的生产方法。本发明的生产方法还可高效去除热源，核酸和各种杂蛋白。
完成上述任务的生产工艺包括以下步骤1、Blue sepharose.F.F层析用PB缓冲液平衡Blue sepharose.F.F层析柱，用经过微米膜过滤后细胞培养上清上样，用PB缓冲液冲洗层析柱至基线，用20mM PB+0.75M NaCL缓冲液洗脱；2、金属螯合亲和柱层析用0.1M EDTA-Na2+1M NaCl平衡4.0C.V，用50％异丙醇+1％TFA平衡3.0C.V，
用0.1M NaAc.HAC+0.2M CuSO4.5H2O平衡3.0C.V，用20mM PB+0.5M NaCl平衡3.9C.V，用Blue-Sepharose.F.F层析柱收集的洗脱蛋白峰上样用20mM PB+0.5M NaCl冲洗，收集穿透液；3、Sephadex G-25(Medium)柱层析(7.5×70cm)用注射用水冲洗3.0C.V，用20mMTris-HCl(PH7.0)缓冲液平衡层析柱3.0C.V，用金属螯合亲和层析柱收集的穿透液上样，用20mMTris-HCl(PH7.0)缓冲液洗脱，收集洗脱蛋白峰；4.Source Q柱层析(2.6×10cm)用20mMTris-HCl缓冲液平衡4.0C.V，用Sephadex G-25柱层析收集的洗脱蛋白峰上样，用50mM NaCl/20mMTris-HCl缓冲液进行洗脱杂蛋白，用150mM NaCl/20mMTris-HCl缓冲液进行洗脱目的蛋白峰，收集目的蛋白峰经过0.22微米膜过滤。
以上工艺中第一步层析为蓝胶填料，例如Blue Sepharose.Fast Flow和CM-AFFI-Blue Gel。第二步层析为金属螯和亲和填料，例如M.C 20和ChaletingSepharose.Fast Flow。第三步层析为脱盐填料，例如Sephadex G-25(Medium)，Sephadex G-25(Fine)。第四步层析为离子交换层析填料，例如Source Q，DEAESepharose，Resource Q，Poros D50，Q Sepharose XL和Q Sepharose Highperformance，Q sepharose Fast Flow和Q Sepharose Big Beads。
其中蓝胶层析，其平衡缓冲液为20-50mM PB，Tris-HCL，硼砂-硼酸，咪唑盐酸和巴比妥盐酸缓冲液，pH范围在6.8-9.0。洗脱液为上述相应的流动相中加0.25-1.25M NaCL梯度洗脱。
其中金属螯和亲和层析流动相I为0.1-0.2M EDTA-Na2+0.75--1.25MNaCL。流动相II为50％-70％异丙醇+1％-5％TFA。流动相III为0.1-0.5M NaAc。HAC+0.1-0.3M CuSO4.5H2O。流动相IV为20-50mM PB+0.5-1.0M NaCL。
其中Source Q离子交换层析流动相I为20-50mM Tris-HCL，咪唑盐酸，巴比妥盐酸，硼砂-硼酸和磷酸缓冲液，pH范围在6.8-9.0流动相III为20-50mMTris-HCl缓冲液和40-50mM NaCL，流动相IV为100-200mM NaCL和20-50mMTris-HCL。
本发明的分离纯化工艺中不使用反相层析和有机溶剂，避免蛋白质在层析过程中发生变性和要考虑排除有机溶剂在产品中的残留，以致对人体的毒性作用。反相层析柱往往使用寿命短，价格高，增加了生产成本。本工艺采用BlueSepharose.Fast Flow金属螯和亲和层析，Sephadex G-25层析和Source Q层析顺序组合纯化工艺路线，可以大规模制备药用级的rHuEPO蛋白。
具体实施例方式
实施例11.重组人红细胞生成素(rHuEPO)工程细胞株，经10％小牛血清DMEM培养基培养生长后，转为无血清培养基生产培养。对其细胞培养收获上清35L经过0.65微米膜过滤，去除上清中的细胞碎片。用20mM PB缓冲液平衡的Blue-Sepharose.F.F层析柱(7.5×20cm)3.0柱体积(C.V)，以30ml/min流速上样后，用20mM PB缓冲液冲洗层析柱至基线，再用20mM PB+0.75M NaCL缓冲液洗脱，收集洗脱蛋白峰。
2.金属螯合亲和层析柱(5×15cm)用0.1M EDTA-Na2+1M NaCl平衡4.0C.V，用注射用水冲洗层析柱3.0C.V，50％异丙醇+1％TFA平衡3.0C.V，用注射用水冲洗3.0C.V，0.1M NaAc.HAC+0.2M CuSO4.5H2O平衡3.0C.V，注射用水冲洗3.0C.V，20mM PB+0.5M NaCl平衡3.0C.V后，直接用Blue-Sepharose.F.F层析柱收集的洗脱蛋白峰上样，用20mM PB+0.5M NaCl冲洗，收集穿透液做下一步层析。
3.Sephadex G-25(Medium5×80cm)层析柱用注射用水冲洗3.0C.V，再用20mMTris-HCl(PH7.0)缓冲液平衡层析柱3.0C.V，将收集的金属螯合亲和层析柱的穿透液上样，上完样品后用20mMTris-HCl(PH7.0)缓冲液洗脱，收集洗脱蛋白峰。
4.Source Q层析柱(5×10cm)用20mMTris-HCl缓冲液平衡4.0C.V，将SephadexG-25(Medium)柱收集的洗脱蛋白峰上样，上完样品后采用20mMTris-HCl缓冲液冲洗3C.V，用50mM NaCl/20mMTris-HCl缓冲液进行洗脱杂蛋白，150mMNaCl/20mMTris-HCl缓冲液进行洗脱目的蛋白峰，收集目的蛋白峰经过0.22微米膜过滤。
分离纯化后的样品经SDS-PAGE和HPLC检测分析，纯度大于98％，等电聚焦电泳显示pI3.3-4.3范围。EPO体内和体外生物比活性均大于14万单位/mg，EPO唾液酸含量大于9.0、小牛血清残留量小于0.01％、外源性DNA残留量小于100pg/万IU和CHO细胞蛋白残留量小于0.10％。内毒素试验检测结果小于2.0/万IU。N-末端氨基酸序列分析与天然EPO一致，所有检测项目均符合≤中国生物制品规程2000版≥中重组人红细胞生成素制造及检定规程的规定。
与其他工艺相比，该工艺产品回收率高，工艺稳定，容易放大生产，生产成本低，适合于大规模生产。
权利要求
1.一种重组人红细胞生成素的分离纯化工艺，包括以下步骤Blue sepharose.F.F层析用PB缓冲液平衡Blue sepharose.F.F层析柱，用经过微米膜过滤后细胞培养上清上样，用PB缓冲液冲洗层析柱至基线，用20mM PB+0.75M NaCL缓冲液洗脱；金属螯合亲和柱层析用0.1M EDTA-Na2+1M NaCl平衡4.0C.V，用50％异丙醇+1％TFA平衡3.0C.V，用0.1M NaAc.HAC+0.2M CuSO4.5H2O平衡3.0C.V，用20mM PB+0.5M NaCl平衡3.0C.V，用Blue-Sepharose.F.F层析柱收集的洗脱蛋白峰上样用20mM PB+0.5M NaCl冲洗，收集穿透液；Sephadex G-25(Medium)柱层析(7.5×70cm)用注射用水冲洗3.0C.V，用20mMTris-HCl(PH7.0)缓冲液平衡层析柱3.0C.V，用金属螯合亲和层析柱收集的穿透液上样，用20mMTris-HCl(PH7.0)缓冲液洗脱，收集洗脱蛋白峰；Source Q柱层析(2.6×10cm)用20mMTris-HCl缓冲液平衡4.0C.V，用Sephadex G-25柱层析收集的洗脱蛋白峰上样，用50mM NaCl/20mMTris-HCl缓冲液进行洗脱杂蛋白，用150mM NaCl/20mMTris-HCl缓冲液进行洗脱目的蛋白峰，收集目的蛋白峰经过0.22微米膜过滤。
2.按照权利要求1所述的重组人红细胞生成素的分离纯化工艺，其特征在于以上工艺中第一步层析为蓝胶填料，第二步层析为金属螯和亲和填料，第三步层析为脱盐填料，第四步层析为离子交换层析填料，其中蓝胶层析，其平衡缓冲液为20-50m M PB，Tris-HCL，硼砂-硼酸，咪唑盐酸和巴比妥盐酸缓冲液，pH范围在6.8-9.0，洗脱液为上述相应的流动相中加0.25-1.25M NaCL梯度洗脱，其中金属螯和亲和层析流动相I为0.1-0.2M EDTA-Na2+0.75--1.25MNaCL，流动相II为50％-70％异丙醇+1％-5％TFA，流动相III为0.1-0.5M NaAc，HAC+0.1-0.3M CuSO4.5H2O，流动相IV为20-50m M PB+0.5-1.0M NaCL，其中Source Q离子交换层析流动相I为20-50m M Tris-HCL，咪唑盐酸，巴比妥盐酸，硼砂-硼酸和磷酸缓冲液，pH范围在6.8-9.0流动相III为20-50m MTris-HCl缓冲液和40-50m M NaCL，流动相IV为100-200m M NaCL和20-50m MTris-HCL。
全文摘要
重组人红细胞生成素的分离纯化工艺，包括以下步骤1.Blue sepharose.F.F层析；2.金属螯合亲和柱层析；3.Sephadex G－25柱层析；4.Source Q柱层析，收集目的蛋白峰经过0.22微米膜过滤。本发明是一种低成本的重组人红细胞生成素的生产方法。本工艺中不使用反相层析和有机溶剂，避免蛋白质在层析过程中发生变性和有机溶剂的残留。本工艺采用Blue Sepharose.Fast Flow金属螯和亲和层析，Sephadex G－25层析和Source Q层析顺序组合纯化工艺路线，可以大规模制备药用级的rHuEPO蛋白。
文档编号C07K1/36GK1526731SQ03158278
公开日2004年9月8日 申请日期2003年9月22日 优先权日2003年9月22日
发明者胡云龙, 张双全 申请人:南京师范大学