专利名称：一种六肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种寡肽及其应用。
背景技术：
在动物的胸腺中有多种肽类化合物，它们对生物体起着调节免疫功能的作用。人们从动物胸腺中已经提取分离的多肽有胸腺素组分5(TF5)，胸腺素α1(Thymosinα1，28肽)，胸腺素β4(Thymosin β4，43肽)，胸腺肽(Thymulin，9肽)，胸腺体液因子(Thymic Humoral Factor，THF31肽)，胸腺生成素(Thymopoietin，43肽)和胸腺五肽(Thymopentin，TP-5，5肽)。其中有的多肽已经作为药物在临床上应用，如Thymosinα1，商品名日达仙。有些小肽也已采用人工合成的方法获得，如Thymopentin，即胸腺五肽，已由海南中和药业有限公司投入生产。
发明创造内容本发明的目的是提供一种具有免疫调节作用的六肽。
本发明所提供的六肽的结构式为X-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly，其中，X为Glu或Gln，优选为Glu。
该六肽既可以从天然胸腺中通过生物化学方法提取，又能通过人工方法合成，在玫瑰花环试验中表现出生物学活性，经试验验证具有免疫调节活性，可以作为免疫调节剂，提高人的胸腺免疫机能。
本发明的六肽具有免疫调节功能，并且结构简单，分子量小，无化学毒性，无免疫原性，制备简单，既可以从胸腺中提取，也可以化学合成，化学合成时成本低，可以大量制备；能有效地促进T细胞在胸腺中的发育、分化、成熟，从而提高人的机体免疫功能，是一种具有应用前景的免疫调节药物和治疗药物，可用于基础研究和临床治疗。
具体实施例方式
实施例1、六肽的制备该六肽既可以从天然胸腺中通过生物化学方法提取，又能通过人工方法合成。
1)从胸腺中提取六肽取小牛胸腺，匀浆后反复冻融，离心，超滤。超滤液依次通过Sephadex G-15凝胶层析柱，DEAE-Sephadex A-25阴离子交换柱，再经Sephadex G-10柱脱盐浓缩，反相HPLC层析得到天然小肽。具体过程如下500g新鲜小牛胸腺置于0.01M醋酸-醋酸铵缓冲液中，组织匀浆机最高转速匀浆三次，每次30s。4℃，超声裂解匀浆液两次，每次5min。水浴加热裂解产物到80℃，迅速冰浴，将裂解产物倒入离心管，4℃，4000r/min离心30min。收集上清液，加0.01M醋酸-醋酸铵缓冲液，重复匀浆并离心。合并所得上清，-20℃下，反复冻融两次。然后，高速离心机，4℃，12000r/min离心30min，收集上清。上清转移至截留分子量为6000-8000MW的透析袋中，4℃，对双蒸去离子水透析24h，其间换液两次。收集透析外液，冰冻干燥，收集干燥品。然后用Sephadex G-15凝胶柱(1.5cm×100cm)层析，双蒸去离子水洗脱，得到6个洗脱峰，玫瑰花环试验检测II峰活性较高，收集浓缩后通过DEAE-Sephadex A-25阴离子交换柱(1.5cm×10cm)，以0.05-0.5M醋酸-醋酸铵缓冲液线性洗脱，得到7个洗脱峰，活性峰VI浓缩后进行Sephadex G-10柱脱盐，浓缩后通过HPLC柱(ZORBAX Extend-C18反相柱，4.6nm×250nm)纯化。流动相A相为含0.1％TFA的水溶液；B相为含0.1％TFA的乙晴溶液；线性梯度洗脱，流速为0.6ml/min，紫外全波长检测。收集活性峰，浓缩冻干后得到0.92mg白色粉末，即为天然小肽。分离纯化得到的天然小肽经过质谱分析得到其氨基酸一级结构是Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly。
2)人工合成六肽用化学方法合成同样氨基酸结构的六肽，和N末端为Gln的六肽。方法采用双通道全自动多肽合成系统，分别合成N末端为Glu和N末端为Gln的六肽，达到反相HPLC纯度≥95％。
实施例2、六肽的生物活性按照常规方法进行天然提取的和合成的六肽的玫瑰花环试验。其中，六肽溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中。
表1和表2分别对应天然提取的和合成的六肽(N末端为Glu)在玫瑰花环试验中的生物活性。
表1.天然小肽的活性(n＝3)浓度(mg·ml-1) 花环形成率(％)提高效率P值对照 29.4±3.3 - -TAF-I(1.0)29.7±2.3 1.0 ＞0.05TAF-I(0.4)33.3±3.2 13.3＞0.05TAF-I(0.2)36.7±2.1 24.8＜0.05TAF-I(0.01) 46.5±4.3 58.2＜0.01TAF-I(0.002) 55.7±5.2 89.5＜0.01TAF-I(0.001) 38.1±6.7 29.6＜0.01表2.N末端为Glu合成小肽的活性(n＝3)浓度(mg·ml-1) 花环形成率(％)提高效率 P值Control 26.4±3.3 --Synthetic TAF-I(2.0) ＜5 --Synthetic TAF-I(1.0) 28.3±2.3 7.2 ＞0.05Synthetic TAF-I(0.4) 29.2±3.2 10.6 ＜0.05Synthetic TAF-I(0.2) 28.7±2.1 8.7 ＜0.05Synthetic TAF-I(0.01) 27.5±4.3 4.2 ＞0.05Synthetic TAF-I(0.002)31.7±4.9 20.0 ＜0.01Synthetic TAF-I(0.001)42.1±5.3 59.5 ＜0.01试验证实，TAF-I及其合成物能提高人外周血淋巴细胞的E-玫瑰花环的形成率，且具有明显的剂量-效应依赖关系，即在低浓度时对其活性有促进作用，随着浓度的升高逐渐转变为对活性的抑制作用。它具有双向调节作用，对T细胞在胸腺中的发育、分化和成熟具有一定的调节作用。
权利要求
1.一种六肽，它的结构式为X-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly，其中，X为Glu或Gln。
2.根据权利要求1所述的六肽，其特征在于所述X为Glu或Gln，优选为Glu。
3.权利要求1所述六肽在制备免疫调节药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种六肽及其应用，目的是提供一种具有免疫调节作用的六肽。本发明所提供的六肽，结构式为X－Ala－Lys－Ser－Gln－Gly，其中，X为Glu或Gln。本发明的六肽具有免疫调节功能，并且结构简单，分子量小，无化学毒性，无免疫原性，制备简单，既可以从胸腺中提取，也可以化学合成，化学合成时成本低，可以大量制备；能有效地促进T细胞在胸腺中的发育、分化、成熟，从而提高人的机体免疫功能，是一种具有应用前景的免疫调节药物和治疗药物，可用于基础研究和临床治疗。
文档编号C07K7/00GK1590403SQ20031010045
公开日2005年3月9日 申请日期2003年10月16日 优先权日2003年10月16日
发明者段明星, 秦曦明, 郑昌学, 马红, 钟厚生 申请人:清华大学