专利名称：抗人抵抗素合成多肽抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及以抗体为特征的体外试验用的生物制品，具体是一种抗人抵抗素合成多肽抗体及其制备方法。
背景技术：
抵抗素(resistin，RST)是2001年发现的一种由白色脂肪细胞特异表达和分泌的激素蛋白。由于市售的基因重组人抵抗素价格昂贵，用来制备抗体的成本太高，既有风险又不经济。
ab1129http//www.abcam.com/？datasheet＝1129“抵抗素抗体(ab1129)数据表”供应商NovuS-Biologicals(NB200-202)提供兔抗抵抗素多克隆抗体，其免疫原合成肽GSWDVRAETTCH，对应于人抵抗素氨基酸序列的79-90位。
ab1130http//www.abcam.com/？datasheet＝1130“抵抗素抗体(ab1129)数据表”供应商Novus-Biologicals(NB200-202)提供兔抗抵抗素多克隆抗体，其免疫原合成肽AGMDWTGAR，对应于人抵抗素氨基酸序列的94-102位。
http//www.phoenixpeptide.com/catalog％20Files/Risistin/risistin.htm公开了“用抵抗素(43-65)抗血清染色的大鼠下丘脑切片”新产品，用人抵抗素(51-108)酶免疫分析药盒检测健康人的正常血浆抵抗素水平。
发明内容
本发明就是为了解决实验室用于免疫沉淀和蛋白印迹试验，以建立体外免疫分析所需试验用生物制品的问题，而提供一种抗人抵抗素合成多肽抗体及其制备方法。
一种抗人抵抗素合成多肽抗体，该抗体效价在1∶100000以上，特异性强，亲和力高达1.34×1010L/mol，作为半抗原的合成多肽的氨基酸序列为CSMEEAINERIQE。
一种抗人抵抗素合成多肽抗体的制备方法，以抵抗素氨基酸序列中22-34位的CSMEEAINERIQE肽段序列作为抗原肽合成抵抗素抗原肽；纯化的抗原肽与蛋白载体偶联，经柱层析纯化后；制备出人工免疫原，免疫动物，制备多肽抗体，并经亲和层析纯化而成。
所述的制备方法，其载体蛋白为钥孔碱血蓝素。
所述的制备方法，其偶联的KLH-多肽加福氏佐剂免疫动物后收集抗体。
所述的制备方法，其抗原肽与载体蛋白偶联作为免疫原，免疫家兔制备兔抗人抵抗素合成多肽抗体。
所述的制备方法，其合成多肽偶联Sepharos 4B，制备亲和层析柱，用于纯化抗多肽抗体。
本发明制备的高质量的抵抗素合成多肽抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与天然人抵抗素分子发生特异结合反应。用多肽抗原制备抗体的成本只有用重组抗原制备成本的十分之一左右。抗体经亲和层析法纯化后可完全用于免疫沉淀和蛋白印迹(Western blot)试验，以及建立体外免疫分析方法。该合成肽抗体的制备，为抵抗素分子的研究及相关疾病的研究提供了一个有用的工具。
具体实施例方式
一.抵抗素抗原肽的合成应用Antheprot蛋白质分析软件，对人抵抗素氨基酸序列(1-108)进行亲水性、抗原型及同源性分析。选择含22～34位的13个氨基酸的肽段序列作为抗原肽，在433A全自动多肽合成仪上由固定羧基向氨基端递增合成后获得粗品。经30％乙腈溶解后，进行高压液相色谱(HPLC)分析，计算主峰面积并收集，经冷冻真空抽干后纯化合成肽，质谱鉴定。
二.合成多肽与载体的偶联载体蛋白选择钥孔碱血蓝素(KLH，keyhole limpet hemocyanin)，用双功能试剂顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)连接法将KLH与合成肽进行偶联取KLH 5mg(0.11μmol，含赖氨酸2.2μmol)，溶于0.75ml偶联缓冲液1(50mmol/L硼酸盐缓冲液，pH8.5)；3mgMBS(11μmol)溶于75μl二甲酰胺(DMF)。将MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋转混匀，室温下作用30分钟。迅速离心后，将反应混合物(约0.8ml)加入预先用偶联缓冲液2(0.1mol/L磷酸盐，0.15mol/L NaCl，0.01mol/L Na2EDTA，pH7.0)平衡的PD-10柱。用偶联缓冲液2洗脱，收集洗脱液(即MBS-KLH溶液)。溶解1.5mg合成多肽于0.15ml偶联缓冲液2，加入MBS-KLH溶液0.56ml，室温下旋转混合，作用2小时后置4℃过夜，将反应混合物(约0.7ml)加入预先用磷酸缓冲液平衡的PD-10柱，磷酸缓冲液洗脱，收集流出液。将KLH、MBS-KLH和偶联物进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定偶联效率。
三.抗多肽抗体的制备取偶联的KLH-多肽500μg，溶于500μl磷酸缓冲液，加等体积的完全福氏佐剂，背部皮内多点注射免疫家兔。4周后抗原量减半(250μg)，加等体积的不完全福氏佐剂，第一次加强免疫。2周后进行第二次加强免疫，方法同前。再2周后开始耳缘静脉少量采血，用合成多肽(1μg/ml)包被酶标板，间接ELISA法监测免疫血清效价。当抗血清效价达到最高后，采用颈动脉放血收集抗体。
四.亲和层析纯化抗多肽抗体1.抵抗素合成肽亲和层析柱的制备称取1.5g CNBr活化Sepharose 4B，用1mmol/L盐酸充分浸洗膨胀凝胶后，再用偶联缓冲液洗2次，迅速与溶于5ml偶联缓冲液的合成多肽500μg混合，室温下旋转混合2小时。加入0.2mol/L甘氨酸4ml终止反应，室温下旋转混合1小时。用偶联缓冲液和甘氨酸缓冲液交替洗凝胶各2次，再用50ml磷酸盐缓冲液洗凝胶，按终浓度0.02％加叠氮钠(NaN3)，置4℃保存。
2.亲和层析纯化抗多肽抗体将20ml兔抗多肽血清与1.6ml多肽偶联的Sepharose 4B共同加入50ml离心管，4℃旋转混合6小时。将凝胶加入层析柱，弃去流出液，用15ml磷酸盐缓冲液冲洗凝胶。每次加0.8ml pH2.9，0.1mol/L甘氨酸缓冲液洗脱，共8次，洗脱液分别接入8支预先加入80μl 2mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，20ml磷酸盐缓冲液洗凝胶。上述全部操作过程在4℃下完成。每管取洗脱液2μl，稀释50倍后测280nm出OD值，计算蛋白质含量并绘制洗脱曲线。
五.抗体的鉴定间接ELISA法鉴定抗体特异性，Schatchard作图法计算亲和力。
试验效果1.抵抗素合成多肽HPLC纯化后纯度＞92％，质谱鉴定分子量为1551.7，经蛋白质测序鉴定为氨基酸序列为CSMEEAINERIQE。
2.多肽与载体的偶联效率SDS-PAGE电泳鉴定偶联效率与样品回收率大致相符，为75％。
3.抗多肽抗体的效价用多只家兔得到的抗血清效价均在1100000以上。
4.抗体特异性纯化后的Resistin多肽抗体与人Resistin己合成肽交叉反应率接近100％，而与兔、鼠、鼠Resistin、人胰岛素、人瘦素无交叉反应。
5.抗体亲和力亲和常数为1.34×1010L/mol。
6.抗体的应用以上技术指标的实现保证该抗体完全可以应用于免疫沉淀和蛋白印迹试验，以及建立体外免疫分析。在中国医学科学院放射医学研究所试验核医学室进行的上述试验应用效果良好。
权利要求
1.一种抗人抵抗素合成多肽抗体，其特征在于该抗体效价在1∶100000以上，特异性强，亲和力高达1.34×1010L/mol，作为半抗原的合成多肽的氨基酸序列为CSMEEAINERIQE。
2.一种抗人抵抗素合成多肽抗体的制备方法，其特征在于以抵抗素氨基酸序列中22-34位的CSMEEAINERIQE肽段序列作为抗原肽合成抵抗素抗原肽；纯化的抗原肽与蛋白载体偶联，经柱层析纯化后；制备出人工免疫原，免疫动物，制备多肽抗体，并经亲和层析纯化而成。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于载体蛋白为钥孔磩血蓝素。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于偶联的KLH—多肽加福氏佐剂免疫动物后收集抗体。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于抗原肽与载体蛋白偶联作为免疫原，免疫家兔制备兔抗人抵抗素合成多肽抗体。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于合成多肽偶联Sepharos 4B，制备亲和层析柱，用于纯化抗多肽抗体。
全文摘要
本发明公开了一种抗人抵抗素合成多肽抗体及其制备方法，属于以抗体为特征的体外试验用的生物制品。其制备方法是以抵抗素氨基酸序列中的一段合成多肽，其氨基酸序列CSMEEAINERIQE作为半抗原，与蛋白载体连接后制备出人工免疫原，对动物进行免疫，有效地诱导机体产生免疫应答，从而得到抗体。本发明制备的抗人抵抗素合成多肽抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与天然人抵抗素分子发生特异结合反应；制备成本相当于用重组抗原制备抗体的1/10；纯化后的抗体可完全用于免疫沉淀和蛋白印迹试验，以及建立体外免疫分析方法。该抗体为抵抗素分子的研究及相关疾病的研究提供了一个有用的工具。
文档编号C07K16/18GK1594363SQ20041001993
公开日2005年3月16日 申请日期2004年7月8日 优先权日2004年7月8日
发明者赵明辉, 韩佩珍, 张春明, 王胜芬, 王德芝, 王彦, 刘庆芬, 陈冀莹 申请人:中国医学科学院放射医学研究所