专利名称：核黄素发酵液的提取工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及核黄素，具体地说，是关于一种核黄素发酵液的提取工艺。
背景技术：
核黄素(Riboflavin)又名维生素B2、维生素G或乳黄素，是一种人体必需的维生素。
核黄素的用途非常广泛，在临床治疗、食品工业、饲料工业及化妆品等中均有重要价值。核黄素是黄素酶辅基的主要组成部分，参与机体复杂的生物氧化过程，具有重要的药理作用。此外，这两种辅酶在蛋白质、糖、脂类和核酸代谢中也具有重要作用。微生物和高等植物可以合成核黄素，而动物和人类则不能合成，必须从食物中摄取。
2003年，英国LHA公司公布了一份研究报告，对目前全球的维生素市场进行了评估。报告称目前全球维生素销售总额20亿美金，其中VA、VC、VE三大类产品所占市场比例超过70％，而包括核黄素在内的B族维生素成交量较低，市场规模在0.5-1.5亿美金。作为用途广泛的必需维生素，核黄素在临床治疗、饲料工业、食品工业和化妆品工业等中的应用价值是不可替代的。从世界核黄素消费区域来看，欧美等国家和地区经济发达，对核黄素的消费量较多。而东欧和亚洲国家随着经济的发展，人们对肉类的需求逐年增多，从而促进了作为饲料添加剂的核黄素的需求量。此外，我国居民人均每日摄取的核黄素量不足0.8mg，仅占RDA日推荐量的58.4％。综上所述世界核黄素整体需求量呈现稳中有升的趋势。
核黄素较早就实现了商业化生产。目前国际上生产核黄素的工艺方法主要有4种抽提法、化学合成法、微生物发酵法以及微生物发酵半合成法。微生物发酵法主要以葡萄糖或糖蜜为原料，用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)、假丝酵母(Candida flaveri)、丙酮丁醇酸菌(Clostridium acetobutylicum)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)和Xylinus拟酵母(Torulopsis xylinus)等菌种来生产核黄素。近年来，采用枯草芽孢杆菌基因工程菌来生产核黄素的报道很多。同化学法相比，微生物发酵法反应条件温和，污染少，生产成本低，因此它日益受到世界核黄素生产商的青睐。德国的BASF、瑞士的Roche、美国的ADM和我国的湖北广济药业公司均以微生物发酵法为主生产核黄素。90年代至今，微生物法生产核黄素成为全球研究和开发热点。
从发酵液中提取核黄素的方法主要有2-羟基-3萘甲酸法、重金属盐沉淀法、Morehouse法、酸溶法、碱溶法等。2-羟基-3萘甲酸法提取路线长，过程损耗多，收率偏低，80％含量的核黄素提取收率在60％左右。由于核黄素的提取在发酵法生产核黄素中所占的成本较高，一些生产厂商都申请专利加以保护，如CN1146455A，弗.哈夫曼-拉罗切有限公司采用加热发酵液，离心，酸溶，过滤、干燥可以得到纯度96％的核黄素，进一步纯化可得到98％以上的产品。CN1053612A，Basf公司采用分级离心原理，直接离心加热后的发酵液，可得到75-88％的核黄素。US006150364A介绍了一种将核黄素粗品进一步纯化的方法，包括酸溶、陶瓷膜膜过滤、低温4-10℃结晶、干燥步骤，可以将85％的粗品纯化到98％的精品。我国无锡轻工大学的章克昌教授对核黄素发酵液进行碱溶、离心做了详细研究，最终收率79.8％，产品纯度92.6％。
发明内容
本发明的目的就在于改进现有微生物发酵法生产的核黄素的提取收率低且不稳定的缺点，从而提供一种改进的核黄素发酵液提取工艺。
为达到上述目的，本发明结合以糖蜜为原料的核黄素发酵液的物理和化学性质，优化组合现有国内外的提取工艺，开发出一条新型、紧凑、经济的提取工艺，该提取工艺包括如下工艺单元发酵液预处理、膜过滤、酸化、氧化、转晶，具体如下1、发酵液的预处理向核黄素发酵液中加入少量盐酸，将发酵液pH调节到5.0～7.0，然后直接用液碱调pH至10.0-13.0。
2、膜过滤将经过预处理的发酵液直接或加入活性炭混合后进行膜过滤。
3、酸化在经过上述膜过滤后的清液中加入无机酸，充分搅拌混匀，调节处理液pH值至4.0-7.0。
4、氧化经过酸化的溶液加入氧化剂，充分搅拌1-2小时。
5、转晶将氧化后的核黄素溶液加热至75-90℃，搅拌，保温1-2h，迅速冷却至25-30℃结晶，离心或板框过滤将核黄素晶体滤出、80℃烘干。
本发明另外采用回收工艺对酸化母液中残留的核黄素进行回收，此步操作可回收约3-5％的核黄素，从而有效提高了核黄素的收率。
采用本发明的提取工艺提高了核黄素的提取收率(核黄素95％含量的产品的提取收率达到约90％)，得到的产品可以满足医药级和饲料级应用。
具体实施例方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步描述。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1核黄素发酵液的制备1、取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)突变株Rf1118(已提交保藏，保藏号为CCTCC NOM204074)的甘油管菌种，接种于装有50mL培养基(酵母膏5g/kg，蔗糖10g/kg，生物素，pH自然)的茄子瓶斜面中，35～40℃，细胞培养箱中培养24～28小时。
2、用适量pH7.0左右的磷酸盐缓冲液将成熟茄子瓶的种子洗下，接入装有250L种子培养基的500L发酵罐中，于35～40℃培养20～25小时，制得一级种子液备用。
种子罐培养基配方如下(w/v)酵母粉1％，MgSO4·7H2O0.05％，甜菜糖蜜2％，Vb10.01％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸铵0.7％，泡敌0.05％。
3、在装有2500L培养基的5000L发酵罐中，接入250L实施例1的种子罐中的成熟种子液开始发酵。
1)发酵培养基(w/v)酵母粉2％，碘乙酸0.01％，生物素0.002％，Vb10.01％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸铵0.7％，MgSO4·7H2O0.05％，柠檬酸0.01％，泡敌0.05％。
2)发酵工艺接种量10％，通风量1∶0.5vvm，温度35～40℃，罐压0.05～0.06Mpa，搅拌速度200rpm，pH氨水自控6.5～7.2，溶氧控制20～60％，发酵时间约40小时，得到核黄素发酵液。
采用比色法(中国药典)测定上述制备得到的发酵液中核黄素的含量，结果为12.2g/L。
实施例2核黄素发酵液的提取1、发酵液的预处理取实施例1得到的核黄素发酵液40L，向其中加入少量盐酸，将发酵液pH调节到5.0～7.0，然后用浓度30％的氢氧化钠溶液调节pH值至10-13之间。
2、膜过滤将经过预处理的发酵液平均分为4组，将1、2组发酵液置于陶瓷微滤膜过滤循环罐中，启动物料泵，保持入膜压力在0.2-0.5Mpa、出膜压力在0.1-0.2Mpa，温度4-35℃的状态下，膜的过滤通量为45-60L/m2·h。
将3、4组发酵液加入2.5％的活性碳，均匀混合以除去杂质蛋白或部分色素，然后置于有机超滤膜过滤循环罐中，启动物料泵，保持入膜压力在0.2-0.5Mpa、出膜压力在0.1-0.2Mpa的状态下，温度4-35℃，膜的过滤通量为55-65L/m2·h。
3、酸化在经过上述膜过滤后的4组清液中加入无机酸，采用盐酸、硫酸或两种酸混合使用，充分搅拌混匀，调节处理液pH值至4.0-7.0以进行酸化。
4、氧化经过酸化的4组溶液分别加入以下氧化剂的一种空气、氧气、双氧水、硝酸铵，充分搅拌1-2小时，进行氧化。
5、转晶将氧化后的核黄素溶液加热至75-90℃，搅拌，保温1-2h，迅速冷却至25-30℃结晶，离心或板框过滤将核黄素晶体滤出、80℃烘干。
测定经过上述工艺提取的产品的量，并计算相应的产品纯度及提取收率，其结果如表1所示。可见，采用本发明的提取工艺能够有效地提高核黄素的提取收率，提取收率达到近90％，与现有技术相比提高了约10个百分点；且得到的核黄素的纯度也比较高，平均值达到96％以上。
表1、提取4组发酵液得到的产品及提取收率(成品纯度分析采用中国药典方法)
实施例3回收工艺分别向实施例2的离心或板框过滤后的清液中添加适量以下有机溶剂的一种氯仿、乙醚、甲醇、乙醇，使酸化溶液中的核黄素充分析出，将析出的核黄素和溶液并入实施例2转晶步骤中的转晶后准备过滤的核黄素溶液中，对析出的核黄素过滤(为便于计算此步骤的回收率，本实施例将析出的核黄素溶液直接进行过滤)，干燥并计算回收率，结果如表2所示。可见采用本发明的回收工艺可以从提取核黄素的酸化母液中回收约3～5％的核黄素。
表2、不同有机溶剂的回收率
实施例4产品精制将实施例2制得的95.2％含量核黄素粗品100g平均分成四组，每组都按如下工艺处理加入适量无机酸，采用盐酸、硫酸或硝酸，加热至75～90℃，搅拌，充分溶解并保温1～2h，迅速冷却至25～30℃，离心或板框过滤将核黄素晶体滤出、干燥。测定精制产品的量，并计算相应的提取收率和产品纯度，其结果如表3所示。
表3、粗品精制的收率和产品
综上所述，本发明的核黄素提取工艺可以有效提高核黄素的提取收率(核黄素含量95％产品的提取收率达到约90％)，得到的产品可以满足医药级和饲料级应用。
权利要求
1.一种核黄素发酵液的提取工艺，其特征在于包括以下步骤a、发酵液的预处理，b、膜过滤，c、酸化，d、氧化，e、转晶。
2.如权利要求1所述的提取工艺，其特征在于，所述发酵液的预处理步骤包括向发酵液中加入盐酸以调节发酵液的pH至5.0-7.0，然后再用液碱调节pH值至10-13。
3.如权利要求1所述的提取工艺，其特征在于，所述膜过滤的操作参数为入膜压力在0.2-0.5Mpa、出膜压力在0.1-0.2Mpa，温度4-35℃。
4.如权利要求3所述的提取工艺，其特征在于，所述经过预处理的发酵液先加入活性炭混合，再进行膜过滤。
5.如权利要求3或4所述的提取工艺，其特征在于，所述膜过滤所采用的膜为有机膜或无机膜、超滤膜或微滤膜。
6.如权利要求1所述的提取工艺，其特征在于，所述酸化步骤包括向膜过滤后的清液中加入无机酸，调节处理液pH值至4.0-7.0。
7.如权利要求1所述的提取工艺，其特征在于，所述氧化步骤包括向经过酸化的溶液中加入氧化剂，并充分搅拌1-2小时。
8.如权利要求7所述的提取工艺，其特征在于，所述氧化剂选自空气、氧气、双氧水、硝酸铵。
9.如权利要求1所述的提取工艺，其特征在于，所述转晶步骤包括将氧化后的核黄素溶液加热至75-90℃，搅拌，保温1-2h，迅速冷却至25-30℃，离心或板框过滤将核黄素晶体滤出、烘干。
10.如权利要求1所述的提取工艺，其特征在于，还包括步骤f、回收。
11.如权利要求10所述的提取工艺，其特征在于，所述回收步骤包括向离心或板框过滤后的清液中添加适量有机溶剂，使酸化溶液中的核黄素充分析出，将析出的核黄素和溶液套入转晶步骤中结晶后准备过滤或离心的核黄素溶液中，过滤或离心。
12.如权利要求11所述的提取工艺，其特征在于，所述有机溶剂选自氯仿、乙醚、甲醇、乙醇。
13.如权利要求1所述的提取工艺，其特征在于，还包括步骤g、精制。
14.如权利要求13所述的提取工艺，其特征在于，所述精制步骤包括向经过a-e或a-f步骤得到的核黄素粗品中加入适量无机酸，加热至75～90℃，搅拌，充分溶解并保温1～2h，迅速冷却至25～30℃，离心或板框过滤将核黄素晶体滤出、干燥。
全文摘要
本发明公开了一种核黄素发酵液的提取工艺，包括发酵液的预处理、膜过滤、酸化、氧化和转晶等步骤，并采用回收工艺对酸化母液中的核黄素予以回收。采用本发明的提取工艺能够将核黄素的提取收率提高，核黄素含量95％的产品的提取收率约90％，得到的产品，可以满足医药级和饲料级应用。
文档编号C07D487/00GK1765897SQ20041006751
公开日2006年5月3日 申请日期2004年10月27日 优先权日2004年10月27日
发明者李乃强, 胡兵, 赵宏程, 夏丽群, 邱勇隽 申请人:上海凯赛生物技术研发中心有限公司