应用于眼疾的药物疗法中的适合体治疗剂的制作方法

专利名称：应用于眼疾的药物疗法中的适合体治疗剂的制作方法
发明的领域本发明主要涉及核酸治疗剂领域，更具体地，涉及可以与细胞因子，生长因子和细胞表面受体中的一个、两个或多个结合核酸治疗组合物，进一步涉及在青光眼和其他眼部增生类疾病的治疗过程中这些核酸治疗剂的传递方法。
发明的背景适合体是一种核酸分子，与分子间相互作用具有特殊的亲和作用力，这种亲和力与经典的Watson-Crick碱基对作用力是不同的。
适合体，与噬菌体产生的多肽或单克隆抗体(MAbs)一样，可以特异的结合到选择性靶位点，并抑制靶位点的生理功能。从随机序列的寡核苷酸库中经过体外筛选(

图1)，100多种蛋白质，包括生长因子，转录因子，酶，免疫球蛋白和受体蛋白都可以产生出适合体。一个典型的适合体有10-15kDa大小(30-45个核苷酸)，与靶位点的结合依靠亚克分子亲和力，对靶位点有很强的识别能力(例如可以和特异的靶位点结合，但不能与该靶位点同一基因家族的蛋白结合)。使抗原抗体缀合物具有亲和性和特异性的相互作用包括氢键作用、静电补偿、疏水作用及空间位阻等，一系列研究表明，适合体也可以用这些类型的相互作用与靶位点结合。
适合体在治疗和诊断中有很多有价值的特点，包括高的亲和性和特异性，生物学功效和极好的药物动力学价值。除此之外，它们还提供在与抗体和其他生物蛋白竞争中特定的竞争优越性，例如1)速度和控制。适合体完全由体外过程产生，允许初始治疗前体的快速产生。体外选择允许适合体的特异性和亲和性被很好的控制，允许对应毒性的和非免疫原性的靶位点产生前体物质。
2)毒性和免疫原性。适合体已经阐明没有或几乎没有毒性或免疫原性。对老鼠和土拨鼠进行慢速高剂量水平注射适合体(10mg/kg每天，注射90天)，从临床上，分子水平或生化测量，均未观察到任何毒性。而很多单克隆抗体的效力可以被与抗体自身的免疫反应严格的限制，很难诱导产生适合体的抗体(最可能是因为适合体不能被T-细胞经过主要组织相容性复合体(MHC)呈现出来，故免疫反应不能识别核酸片段)。
3)给药。目前已经批准用于治疗的抗体都是通过静脉注射(一般2-4小时以上)给药，适合体还可以皮下注射给药。这种不同首先取决于大多数单克隆抗体相当低的溶解度，因此在治疗时需要大量的溶剂溶解。而适合体具有良好的溶解性(＞150mg/mL)和相当低的分子量(适合体10-50kDa；抗体150kDa)，适合体一个星期的注射剂量低于0.5mL，在猴实验中，经皮下注射的生物利用率＞80％。(Tucker et.al.，J.Chromatography B.732203-212，1999)此外，适合体分子小，可以穿过结构紧密的组织结构，而抗体或抗体片段则不能穿过，这也显示了适合体治疗和预防的另一个优点。
4)生产规模和成本。治疗性适合体是化学合成的，因而可以很容易根据生产需求去控制生产规模。而规模化生产的困难目前正限制着很多生物制品的生产能力，而且大规模蛋白质生产车间的资金消耗是巨大的，一个单独的大规模合成器每年可以生产至少100kg寡核苷酸，而且起始投资需要需要较少。目前按公斤规模进行适合体的合成，成本为$500/g，可比得上高优化的抗体生产。对过程发展的继续改进有望在五年内使生产成本降低到＜$100/g。
5)稳定性。治疗剂适合体是化学稳定的。它们可以在暴露在热环境和变性剂中后很快恢复活性，其冻干粉可以在室温下长期储存(＞1年)。相反，抗体必须储存在冷藏环境中。
青光眼导致失明的两大原因是青光眼和年龄相关性黄斑变性(AMD)。青光眼是一种增生性疾病，困扰着220万美国受试体和全世界65,000万受试体。青光眼疾病跟房水排出减少和眼内压(IOP)升高有关。当眼内压升高，受试体的神经纤维细胞死亡，导致失明。目前尚无阻止青光眼发生的方法，但可以通过药物治疗，通过调整房水生成和眼内压来减缓其发生。目前治疗青光眼是通过小梁切除并周边虹膜切除手术来治疗的，每年在美国约有120,000例青光眼受试体进行了此项手术。
青光眼治疗的第一步是用药物调节眼内房水水平。青光眼的过滤显微手术，或小梁切除手术是治疗的第二步，它通过在巩膜上微穿刺排出房水，从而降低眼内压。尽管如此，手术后的并发症是不容忽视的，甚至可以导致失明。手术后伤口未完全愈合和瘢痕将会导致眼内压升高，从而需要再次手术。在小梁切除中，可以在穹隆中注射抗生素和皮质类固醇，或者用胶原蛋白覆盖住眼睛，以控制手术后瘢痕的扩大。可以用抗代谢药物，例如丝裂霉素C和氟尿嘧啶等控制术后瘢痕的扩大。若小梁切除手术后眼内压降低少于25％，则可以认为失败，需要第二次房水排出手术。
为了确保小梁切除手术的成功，通常要用类固醇和抗生素药物。一般用1％泼尼松龙乙酸酯每天搽4-6次，4-8周后逐渐减少。每天用1％阿托品之类的睫状肌麻醉剂作用于眼球前房。为了防止术后结膜纤维化，需要用丝裂霉素C和氟尿嘧啶等抗代谢药物。它们可以抑制成纤维细胞增生，使不能进一步形成瘢痕组织。丝裂霉素C的药效是氟尿嘧啶的100倍，但有高的成功率的同时也伴随高的并发症几率，因此要根据实际情况来选择。在巩膜手术前可以先用丝裂霉素C(0.2-0.5mg/mL溶液)或氟尿嘧啶(25-50mg/mL溶液)浸泡1-5分钟的纱布或棉花覆盖在巩膜表层，时间取决于预期纤维化风险系数。手术中，用纱布保护好结膜，避免与伤口边缘接触。切除后，整个用生理盐水彻底清洗。氟尿嘧啶可以以每次5mg的剂量注射到结膜下，总量取决于角膜上皮的容忍度和滤疱的功能。与氟尿嘧啶相关的并发症包括角膜和结膜上皮毒性，角膜溃疡，结膜伤口渗漏，结膜下出血及非故意的氟尿嘧啶眼内扩散。
重复小梁切除手术和抗代谢药物的使用会增加并发症的严重程度，包括房水泄漏，眼内压过低和主要组织的毒性(Blindish，et al.，Ophthalmology(2002)，1091336-1341；Belyea，et al.，Am J Ophthalmol(1999)，12440-45；Kupinet al.，Am J Ophthamol(1995)，11930-39)。抗代谢药物会进一步损伤眼组织，导致眼内压过低，甚至失明。在青光眼治疗中使用抗代谢药物失败的标准已经通过视力敏锐度测验规定了(Membrey，et al.，(2000).Br JOphthalmology，841154-58)。
青光眼的发病过程与眼内转化生长因子水平上升有关。转化生长因子β包括三种转化生长因子β1(TGFβ1)，转化生长因子β2(TGFβ2)，转化生长因子β3(TGFβ3)。转化生长因子是控制生长、分化和发展的多功能细胞因子。它可以由多种类型的细胞表达，大多数细胞对转化生长因子敏感。转化生长因子β2是一种25kD的同二聚体细胞生长因子，与细胞增生、分化和胞外基质形成有关。多种受体(I-V型)介导各种细胞与转化生长因子β2及其同分异构体转化生长因子β1、转化生长因子β3的反应。II型受体是与转化生长因子β2反应的主要信号受体，虽然III型受体与转化生长因子β2间有强亲和力，但没有信号受体。
在身体的很多部分，转化生长因子β1是占主要地位的，但是在眼睛中，转化生长因子β2是主要形式。转化生长因子β2影响到眼睛伤口的愈合，在青光眼手术中与瘢痕的形成有关。眼部瘢痕的形成是由转化生长因子β2介导的(Corderio，et al.，Invest Ophthalmol.Vis.Sci.(1999)，401975-19982)。青光眼房水中检测到的转化生长因子β2水平较高(21pM)，而正常眼则能很好的控制(12pM)(Ochiai，et al.，Jpn J.Ophthalmol(2002)，46249-253)。小梁网细胞和睫状体细胞都能表达和分泌转化生长因子β2。由此可见，老年人和青光眼受试体的房水排出系统中，胞外组分的过量积累与转化生长因子β2有关(Tripathi，et al.，Exp.Eye Res(1994)，58523-528)。
现在正在对可替换药物进行临床试验，例如转化生长因子β2的特异性抗体，它可以避免青光眼手术后的瘢痕形成(Broadway，et al.，Adjunctive anti-TGFβ2 humanMab as a novel agent to prevent scarring followingphacotrabeculectomy.May 2002，ARVO MeetingPoster#3331)，尽管如此，还是有发炎或对外来抗体的排斥反应等负面反应存在，会导致青光眼的眼内压再次升高。已有在兔模型中对抑制在眼中TGFβ2的表达致使减少手术瘢痕提高手术效果的反义核酸的研究(Corderio，et al.，Gene Therapy(2003)，1059-71)。但这种药物会阻碍一般伤口的愈合和组织再生。因此，这些替换药物不能完全排除目前青光眼药物的负面影响。
年龄相关性黄斑变性(AMD)年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种斑点变性。在美国，它是导致50岁以上的人失明的一个主要原因，并随年龄增长患病的机率也增加。仅在美国就有1.5千万人受此疾病的影响。年龄相关性黄斑变性是由视网膜动脉硬化引起的，使视网膜组织氧及营养供应不足，从而中心视力丧失。年龄相关性黄斑变性分为湿性(新生血管网)和干性(无新生血管网)，分类的依据为视网膜下是否有血管的不正常生长。
湿性年龄相关性黄斑变性占黄斑变性的10％。当视网膜供氧不足时，新的血管就生成了，以提高供血量，从而导致湿性年龄相关性黄斑变性。但新生血管非常纤细容易破裂，导致出血和周围组织的损伤。现已证实湿性又分两种类型典型性和隐蔽性的。湿性受试体中的70％以上又属于隐蔽性的。到目前为止，只有典型性的湿性可以用常规的激光凝固法治疗，可以稳定视力或限制非正常血管生长。剩下的大多数受试体不能用激光治疗。目前的激光治疗对大多数已治疗过的眼睛来说不能改善视力，因为激光不仅毁坏非正常血管，也毁坏了正常血管。
干性年龄相关性黄斑变性更普遍，通常引起慢性视力丧失。它以脉络膜小疣和视网膜色素丧失为特征。脉络膜小疣是一种在视网膜表层上形成的很小的淡黄色的沉淀物。目前没有已被证实的方法可以治疗干性年龄相关性黄斑变性，但它的发病过程要慢得多，视力丧失要温和得多。目前也没有已被证实的药物疗法可以治疗黄斑变性。
增生性玻璃体视网膜病变(PVR)导致失明的其他原因之一是视网膜脱落。大约每一万个人中有一个人会有一年一次视网膜脱落的机率。各种相关眼疾和全身其他疾病会增加视网膜脱落的机会，包括糖尿病，高度近视，假晶状体或无晶状体，钝性和渗透性眼损伤，获得性免疫缺陷综合症引起的巨细胞视网膜炎等。玻璃体切除术是治疗视网膜脱落的标准手段。每年在美国约有20万例玻璃体切除手术，除美国外有30万例。增生性玻璃体视网膜病变发生于约10％的视网膜脱落受试体中，每年全世界有62,600例，美国约2800例。增生性玻璃体视网膜病变是导致视网膜再附着手术失败的最普遍原因。
血小板源生长因子(PDGF)是在增生类疾病中具有决定性作用的一种致有丝分裂因子。PDGF被认为与增生性玻璃体视网膜病变中视网膜色素上皮细胞和转移性神经胶质的非正常生长的调控有关。
PDGF亚单位A和B形成二聚体，即，AB杂二聚体和AA、BB同二聚体。PDGF在普通细胞增殖的调控和病态细胞(如组织、纤维变性、增生紊乱、血管生成)的生长调节中起到关键性作用，它与肾瘢痕形成、伤口愈合和癌症有关。大多数肿瘤细胞分泌PDGF，并过量表达PDGF受体。PDGF的氨基酸序列与致癌基因相类似。
视网膜高表达PDGF导致血管和非血管细胞增生的牵拉性视网膜脱落。PDGF促进小梁网细胞增生，加强视网膜色素上皮细胞由六角形脱分化为扁平细胞，增加α-平滑肌肌动蛋白的表达，加强肌样体分化和胶原蛋白胶质收缩。年龄相关性黄斑变性受试体的玻璃体中PDGF水平较高。
很多生长因子被认为与增生性玻璃体视网膜病变有关，包括转化生长因子β，VEGF，BFGF，HGF和IL-6P，其中PDGF在增生性玻璃体视网膜病变中起到重要作用。
与视网膜穿孔和破裂相关的视网膜脱落之后，最常见的并发症就是增生性玻璃体视网膜病变.。增生性玻璃体视网膜病变与玻璃体腔中和视网膜前后表面的细胞膜(主要包括胶质细胞和视网膜色素上皮细胞，也有成纤维细胞和炎症细胞)的生长有关。这些膜是基本的瘢痕组织，对视网膜有额外的牵拉力，会导致视网膜脱落的复发，甚至在以前视网膜脱落手术成功后也可能发生。增生性玻璃体视网膜病变还会导致视网膜破裂治疗成功后的其他并发症，甚至会引起视网膜的再一次破裂。它还与视网膜的严重畸变和僵化有关，从而引起膜萎缩，引起失明。
PDGF促进小梁网细胞增生，加强视网膜上皮细胞由六角形脱分化为扁平细胞，增加α-平滑肌肌动蛋白表达，加强肌样体分化和胶原蛋白胶质收缩。增生性玻璃体视网膜病变受试体的玻璃体和视网膜前膜中PDGF水平较高。在实验模式中，没有PDGF受体的细胞对诱导增生性玻璃体视网膜病变的发生是无效的。尤其，PDGF-AA可以引起胶质细胞广泛增生和非血管相关的牵拉性视网膜脱落。PDGF-α受体能够促使其发生进而导致增生性玻璃体视网膜病变。PDGF突变体都可能阻断PDGF刺激细胞循环进行，改变激酶活性，阻断增生性玻璃体视网膜病变的发生。去尾的受体可以阻断增生性玻璃体视网膜病变的发生。
增生性玻璃体视网膜病变发生过程可分为以下几个阶段1)突破血液-视网膜屏障；2)趋化作用及细胞移动；3)细胞增生；4)胞外基质重建，膜形成；5)感染。每一步中PDGF都起了重要的作用，下面将分步阐述在这五个阶段中PDGF所起的作用。
RPE在脉络膜和神经视网膜细胞之间形成嵌合体，作为外围血液-视网膜屏障，维持视网膜的生态稳定及可视功能。增生性玻璃体视网膜病变起始阶段就是RPE细胞的脱分化有丝分裂休眠期的形态变更，从六角型变为扁平状，失去上皮细胞的特征。另外，RPE细胞减少角质蛋白的表达，开始表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。α-SMA对收缩活性是很重要的，它的增加是时间依赖性的。PDGF促进RPE细胞的脱分化、肌样体分化及α-SMA的表达。
突破了血液-视网膜屏障，很多类型的细胞就可以完全进入玻璃体和亚视网膜空间了，包括RPE细胞，胶质细胞，成纤维细胞，巨噬细胞，白细胞和血清组分。RPE和胶质细胞是其中的主要类型。这些细胞附着在视网膜和玻璃体凝胶上。PDGF是RPE和胶质细胞迁移的潜在刺激者。
一旦附着在视网膜和玻璃体凝胶上，这些细胞就开始大范围的增殖。PDGF触发RPE和胶质细胞的增殖，并诱导DNA合成。
RPE细胞反分化成肌纤维细胞或类间质瘤细胞，在视网膜表面或玻璃体里面形成膜，开始合成胞外基质。普通的RPE细胞不能表达PDGF或其受体。尽管如此，PDGF和其受体是在RPE细胞上高表达的，形成了增生性玻璃体视网膜病变膜结构。PDGF刺激成纤维细胞合成和沉淀胶原蛋白。最后，膜施加牵拉力，使破裂处再次裂开而视网膜脱落。PDGF强化RPE的收缩能力，刺激成纤维细胞和胶原蛋白凝胶收缩。
增生性糖尿病视网膜病变(PDR)增生性糖尿病视网膜病变(PDR)是糖尿病的一种并发症，它由视网膜血管的变化引起。当视网膜中的血管损坏时，将会血液渗漏，长出易碎的刷状分支血管和瘢痕组织。这样会导致送入大脑的视觉模糊和扭曲。在发展中国家，糖尿病视网膜病变是致盲的主要原因，多见于25-74岁的糖尿病受试体中。每年在美国有12,000到24,000人因此而失明。目前估计有25％的糖尿病受试体又患上了糖尿病视网膜病变，估计在I型糖尿病受试体中，这一比例在5年后会上升到60％，10-15年后会上升至80％。在美国，有五百万受试体，拥有50亿美元的市场。该病的特征表现为高血糖，基膜加厚，周皮细胞丧失，微动脉瘤和视网膜新血管化(可通过出血和牵拉性视网膜脱落而导致失明)。
非增生性糖尿病视网膜病变的特征表现为视网膜微动脉瘤，出血，神经纤维梗塞，硬性渗出物和微血管不正常。黄斑水肿是视觉丧失的原理机制。它由黄斑(视网膜中心区域)毛细血管中的微动脉瘤血管渗漏引起。渗漏会演变成与硬性渗出物或类囊肿有关的黄斑增厚，而它通常会导致各种程度的中心视力丧失。增生性糖尿病视网膜病变的特征表现为视网膜新血管化。其患病程度根据视网膜新血管化的出血位置和严重程度来判定。它通常会导致严重的视觉丧失。糖尿病视网膜病变病理学与下列疾病状况有关循环不畅引起的视网膜缺氧或局部贫血；新血管化引起的玻璃体中新血管生长而导致玻璃体中氧水平过剩；新生毛细血管中血液渗漏和黄斑组织的形成导致视网膜牵拉而引起流泪。视网膜层间或下面流动状态的形成及视网膜脱落导致了流泪。当受试体眼部出血、水肿及黄斑组织形成时，就会出现视觉模糊、漂移、闪亮及突然失明。
玻璃体切除术是用于修复视网膜病变的一种微型手术，以前认为很多视网膜病变是不能用手术治疗的。只要视网膜未严重损坏，玻璃体切除术有90％的成功率。
PDGF-B在增生性糖尿病视网膜病变与其它生长因子协同作用中扮演了重要角色。缺氧增加了PDGF-B的表达。视网膜高表达PDGF-B会导致血管和非血管细胞增生，从而引起牵拉性视网膜脱落。PDGF-B诱导视网膜中多种细胞的增生，包括星形细胞、周皮细胞及内皮细胞。长在视网膜表面及细胞表面的增生会迁移到细胞核里层，对视网膜施加牵拉力，导致视网膜外层皱襞，视网膜脱落病灶扩大，最终导致视网膜完全脱落。
增生性糖尿病视网膜病变膜的特点决定了治疗的困难性，通常需要从视网膜表面把膜完全切下来移走，而不是简单的剥离。PDGF通过PDGF受体直接作用于内皮细胞诱导血管生成。PDGF在普通细胞增殖调控中起重要作用，也调控病态细胞的生长，如组织、纤维化、增生性紊乱和血管生成。它也与肾瘢痕，伤口愈合和癌症有关。PDGF作用于成纤维细胞，平滑肌细胞，神经胶质细胞，并刺激结缔组织的增生。
其他细胞生长因子和细胞表面蛋白其他生长因子，细胞因子和细胞表面蛋白与眼部伤口愈合有关，在青光眼手术后瘢痕形成中起作用。这些细胞因子、细胞表面蛋白和生长因子与多种眼疾有关，包括ICAM-1，IGF-1，VEGF/VEGF-R，TNF-α，α5β3等。细胞因子，细胞表面蛋白和生长因子与多种眼部疾病有关，包括ICAM-1，转化生长因子β1，转化生长因子β2，转化生长因子β3，IGF-1，VEGF/VEGF受体，TNF-α，血管因子和α5β3。胞内粘附分子1(ICAM-1)是一个76-115kD的表面糖蛋白，具有5个胞外免疫球蛋白样结构域，在糖尿病视网膜病变中起到重要作用。ICAM-1介导的白细胞淤积是糖尿病视网膜病变的致病成因。ICAM-1与白细胞(嗜中性粒细胞，嗜碱性粒细胞，淋巴细胞，嗜酸性粒细胞，单核细胞)表面的β2整合素结合，对它们牢固的粘附在内皮上及穿过内皮迁移到发炎部位非常重要。在糖尿病视网膜病变中，ICAM-1加强了白细胞与视网膜血管系统的粘附，它还与视网膜内皮细胞的损伤和死亡有关，会导致毛细血管血液循环不可逆缺血，抑制ICAM-1生物学活性，阻止了糖尿病视网膜病变白细胞淤积，并阻止了血液-视网膜屏障被突破。
类胰岛素生长因子-1(IGF-1)是一个7.5kD的多肽，与胰岛素原有50％的同源性，主要产生于肝脏，由生长激素调控。IGF-1是一个潜在的细胞增生刺激素/致有丝分裂因子，是一种强抗细胞程序性死亡因子。它的功能由6个IGF结合蛋白调控，它的水平受发展阶段和营养状况的影响。IGF-1的生理作用包括细胞生长、防护、抵抗氧化压力、促进骨骼和肌肉生长、保护神经细胞等。IGF-1与血管再生有关，IGF-1与VEGF的结合在增生性糖尿病视网膜病变中起重要作用。增生性糖尿病视网膜病变是糖尿病的并发症，由视网膜中血管病变引起。当视网膜中的血管损坏后，将会导致血液渗漏，再生出易破碎的刷状分支和瘢痕组织，使视网膜传入大脑的视觉影像模糊扭曲。
在胰岛素存在及糖基端次级产物作用下，血管内皮生长因子及其受体(VEGF和VEGF/R)的转录加强。糖尿病视网膜中糖基端次级产物的积累会导致新血管化，进而导致视力丧失。胰岛素刺激VEGF的合成，会使糖尿病受试体在胰岛素治疗后视网膜新血管化程度瞬时加剧。
在视网膜发炎及血管再生过程中，眼中肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平会升高。TNF-α促进小梁网细胞的增生，调控小梁网、基质金属蛋白激酶和组织抑制物的表达。整合素α5β3促进增生性糖尿病视网膜病变和年龄相关性黄斑变性的血管再生。
因此需要针对细胞因子，生长因子，细胞表面受体进行药物治疗，以减少或排除眼疾治疗的负面影响，甚至可以使疾病不再发生。
附图简介图1描述了在体外用寡核苷酸随机序列库选择适合体(SELEXTM)的过程。
图2阐述了合成高分子量PEG-核酸缀合物的各种策略。
图3A描述ARC82转化生长因子β2治疗剂适合体(序列号151)；图3B描述了ARC82在血液中的半衰期概况。
图4A是S75色谱分离线路图；图4B是S75色谱分离中转化生长因子β2洗脱概况；图4C描述的是聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶上含有转化生长因子β2二聚体的电泳条带。
图5A描述的是人(●)或鼠(口)的转化生长因子β2蛋白结合到浓度增加的APC77转化生长因子β2特异性适合体上的一个图表；图5B描述的是未放射性标记的ARC77(△)和ARC81(■)(适合于评价等式2中适合体解离常数)与32P标记的ARC77对人类转化生长因子β2的竞争性结合。
图6A描述的是转化生长因子β2被ARC77，ARC78和ARC81适合体抑制的图表；图6B描述的是人和啮齿目动物种ARC77适合体对转化生长因子β2的抗增生效应的抑制；图6C描述了ARC77人野生型，鼠和人转化生长因子β2 N-端组氨酸尾巴的解离常数。
图7A是一个曲线图，描述ARC81适合体和抗转化生长因子β2抗体抑制低浓度的兔眼房水的增生作用；图7B和7C是描述ARC81适合体和抗转化生长因子β2抗体抑制MLEC增生作用的曲线图。该抑制作用是由药物剂量依赖性修复的15％兔房水介导的。
图8A描述的是改良的转化生长因子β2适合体(序列号1)的最小化、诱变及修饰；图8B是一个表格，显示了图8A中转化生长因子β21，转化生长因子β2，转化生长因子β3对应的改良转化生长因子β2适合体的解离常数(Kd)；图8C是一个曲线图，描述的是图8A中的改良转化生长因子β2适合体对MLEC细胞增生上的转化生长因子β2逆转抑制效应。
图9A是一个曲线图，描述了转化生长因子β2适合体-转化生长因子β2复合体的化学计量法；图9B阐述了可检测性标记的转化生长因子β2适合体和转化生长因子β2同源二聚体之间的相互作用。
图10A用人的转化生长因子β2野生型、N-端长尾和N-端短尾变体描述了适合体结合位点的图谱；图10B是一个表格，列举了野生型转化生长因子β2，人类转化生长因子β2 N-端长尾变体，人类转化生长因子β2 N-端短尾变体及两个转化生长因子β2突变体(K94N，859T/R60K/K94N)的EC100值，解离常数及IC50值。
图11A描述的是一个斑点杂交分析及一个转化生长因子III型受体阻挡在适合体结合位点的图表；图11B描述的是适合体和转化生长因子III型受体结合位点的潜在重叠。
图12阐述了转化生长因子β2适合体ARC77(序列号1)的修饰区域。
图13A图表描述的是ARC127(19号序列-PEG-35号序列-PEG-36号序列)与人类PDGF的同分异构体AA，BB，AB的结合曲线，右边表格列举了ARC127(19号序列-PEG-35号序列-PEG-36号序列-3T)和PDGF同分异构体AA，BB，AB的Kd值；图13B描述的是ARC127(19号序列-PEG-35号序列-PEG-36号序列-3T)与PDGF的人类BB同分异构体和老鼠BB同分异构体的结合曲线，右边表格列举了ARC127(19号序列-PEG-35号序列-PEG-36号序列-3T)和人类、老鼠和小鼠的PDGF同分异构体BB的Kd值。
图14A描述了ARC127(19号序列-PEG-35号序列-PEG-36号序列-3T)适合体与人和老鼠PDGF的结合；图14B是一个图表，将ARC127适合体对PDGF诱导的3T3细胞增生的抑制作用与控制抗体对PDGF诱导的3T3细胞增生的抑制作用作了对比。
图15A描述了在没有PDGF存在时视网膜色素上皮细胞的迁移图像；图15B描述了在100ng/mL PDGF存在时RPE细胞的迁移图像；图15C描述了在PDGF和ARC127适合体存在时RPE细胞的迁移图像；图15D描述了在PDGF和ARC128适合体存在时RPE细胞的迁移图像；图15E和15F描述了PDGF浓度增加对RPE细胞迁移的影响。
图16描述了ARC127(19号序列-PEG-35号序列-PEG-36号序列-3T)适合体和改良ARC127适合体的所有DNA结构在体外血清中的稳定性。
图17阐述了经过静脉，腹腔和皮下三种给药途径50小时的过剂量给药后ARC127适合体的浓度。
图18显示了在48小时后ARC127还有可检测的体内活性。
图19A和19B展示了在表5中列举的转化生长因子β2适合体的结合曲线图。
图20A、20B和20C展示了表7中列举的去尾转化生长因子β2适合体的结合曲线图。
图21A、21B和21C展示了ARC117、ARC119适合体在48小时后还有可检测的体内活性。
图22A、22B和22C展示了ARC126、ARC127和NX1838适合体在至少25天以后还有可检测的体内活性。
发明概述细胞因子、生长因子或细胞表面蛋白促进瘢痕组织形成或其他细胞病变，引起眼内压升高青光眼。适合体的特异性允许它们与这些细胞因子、生长因子或细胞表面蛋白结合，用为该类疾病的治疗剂。该发明提供了一种适合体治疗剂，它可以与术后瘢痕组织形成有关的转化生长因子β2及PDGF细胞因子特异性亲和，因此可以阻止青光眼眼内压升高及其他青光眼的致病过程的发生。
在一个实施方案中，本发明提供的适合体组合物可以与转化生长因子β1，转化生长因子β2或转化生长因子β3结合，在眼疾的治疗中很有用处。
在一个实施方案中，本发明提供的适合体组合物可以与血小板源生长因子(PDGF)结合，在眼疾的治疗中很有用处。
在一个实施方案中，本发明提供的适合体组合物可以与ICAM-1结合，在眼疾的治疗中很有用处。
在一个实施方案中，本发明提供的适合体组合物可以与IGF-1结合，在眼疾的治疗中很有用处。
在一个实施方案中，本发明提供的适合体组合物可以与VEGF/VEGF受体结合，在眼疾的治疗中很有用处。
在一个实施方案中，本发明提供的适合体组合物可以与TNF-α结合，在眼疾的治疗中很有用处。
在一个实施方案中，本发明提供的适合体组合物可以与α5β3结合，在眼疾的治疗中很有用处。
在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，用本发明的组合物治疗转化生长因子β2介导的细胞增生引起的增生疾病。
在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，用本发明的组合物治疗PDGF介导的细胞增生引起的增生疾病。
在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，用本发明的组合物治疗ICAM-1介导的细胞增生引起的增生疾病。
在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，用本发明的组合物治疗IGF-1介导的细胞增生引起的增生疾病。
在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，用本发明的组合物治疗VEGF/VEGF受体介导的细胞增生引起的增生疾病。
在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，用本发明的组合物治疗TNF-α介导的细胞增生引起的增生疾病。
在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，用本发明的组合物治疗αVβ3介导的细胞增生引起的增生疾病。
在一个实施方案中，本项发明提供了一种核酸治疗剂组合物及一种传递能与细胞因子，生长因子和细胞表面受体单独结合或能与PDGF，转化生长因子β1，转化生长因子β2，转化生长因子β3，ICAM-1，IGF-1，VEGF，VEGF受体，TNF-α和α5β3中的两个或多个结合的核酸治疗剂的方法，用来治疗青光眼和其他眼增生疾病。
在一个实施方案中，本项发明提供了一种核酸治疗剂组合物及一种传递能与PDGF和VEGF结合的核酸治疗剂的方法。在一个实施方案中，核酸治疗剂是单一核酸适合体具有一个结构域有与PDGF结合的能力，第二个结构域有与VEGF结合的能力。在一个实施方案中，该核酸治疗剂是含有一种可与PDGF结合的第一核酸适合体和可以与VEGF结合的第二核酸适合体的溶液，而且这两种核酸适合体不是同一种核酸适合体。
在一个实施方案中，本发明提供了一种具有改良的药理和药代动力学性质的高分子量PEG衍生核酸(如适合体)缀合物，以及该缀合物的生产方法。
在一个实施方案中，本发明提供了高分子量PEG-核酸(如适合体)缀合物，以及用同源双官能的PEG生成高分子量复合体(即PEG-核酸-PEG-核酸-PEG-核酸缀合物)，从而生产该缀合物的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了高分子量PEG-核酸(如适合体)缀合物，以及用双活性核酸(即一个核酸有两个活性位点)与双官能PEG生成多PEG缀合物(即PEG-核酸-PEG缀合物)，生产该缀合物的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了高分子量PEG-核酸缀合物可以用作预防和/或治疗眼疾的治疗剂。
一个方面，本发明中的高分子量PEG-适合体组合物包括核酸和稳定性组成部分——连接组成部分，该连接组成部分不是核酸分子。在一个实施方案中，该连接部分是聚亚烃基乙二醇。稳定的聚亚烃基乙二醇包括聚乙二醇(PEG)。在一个实施方案中，聚乙二醇连接组成部分是多活性的。例如，PEG连接组成部分是双活性的。在一个实施方案中，适合体的第一和第二部分由PEG连接组成部分连接，即适合体组合物的主要结构为线性的排列——第一组成部分连接到PEG连接组成部分的第一末端，第二组成部分连接到PEG连接组成部分的第二末端。在某些方面，一个以上的PEG组成部分分离两个以上的核酸适合体组成部分，例如高分子量适合体组合物的线性排列为核酸-PEG-核酸-PEG-核酸。在一个实施方案中，高分子量适合体组合物的线性排列为PEG-核酸-PEG-核酸-PEG-核酸。在一个实施方案中，高分子量适合体组合物有一个从由高于10kD，高于20kD，，高于40kD和高于80kD组成的组合中的分子量选择过程。根据发明的这些方面，一些高分子量适合体组合物能够与血小板源生长因子(PDGF)结合，一些高分子量适合体组合物能够与转化生长因子β2结合。
另一方面，本发明提供高分子量PEG-适合体组合物，包括适合体，两个或多个非核酸稳定组成部分。合适的稳定组成部分包括聚亚烃基乙二醇。在一个实施方案中，稳定组成部分为聚乙二醇(PEG)。在一个实施方案中，适合体为多活性的。例如，适合体为双活性。
本发明也提供了一种治疗剂组合物，包括这里描述的高分子量PEG-适合体组合物。
另一方面，本发明提供了一种治疗受试体疾病的方法，包括服用治疗上有效量的这里描述的高分子量PEG-适合体组合物的步骤。
发明的详细描述本发明的一个或多个实施方案的细节将在后面一一陈述。虽然与这里描述的那些相似或相同的方法和材料可以用于本发明的实践和验证，但是现在还是对最优方法和材料作一描述。本发明的其他特征、目标和优点将在后面描述清楚。在详细说明中，除非文中清楚规定的，单数形式也包括复数。除非另外定义过，这里所用的所有术语都与本发明所述领域的通用定义一致。如果有冲突的情况，以本说明书为准。
这里所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都全部收入作为参考。对出版物和专利文献的引用不是承认任何一篇是相关的现有技术，也不是承认日期或内容相同。如有冲突，以本说明书为准，包括定义。除此之外，下面所述的材料、方法和实施例都仅用作说明，不具有限制作用。
SELEXTM过程合适的产生适合体的方法是用一种名为“指数浓缩配位体系统演化”(“SELEXTM”)的方法，图1对该方法作了描述。SELEXTM过程是能与靶分子高度特异性结合的核酸分子的体外演化过程，下列文献中都有描述美国专利申请07/536,428号，1990年1月11日提交，现已放弃；美国专利5,475,096号，“核酸配体”；美国专利5,270,163号(亦见wo91/19813)，“核酸配体”。每一个SELEX类型的核酸配体都是与给定的靶分子或组分相对应的特异性配体。SELEXTM过程是基于核酸有足够的能力去形成各种二维和三维结构，也可以从它们的单体中获得足够的化学活性，作为几乎所有化学成分(无论单体或聚合物)的配体(形成特异性结合对)。任何大小或组分的分子都可以作为靶分子。
SELEXTM依靠一个很大的来源于标准DNA合成仪化学合成的随机序列组成的单链寡核苷酸模板文库作为起始点。一些例子中，100％随机寡核苷酸群被用于筛选。另一些中，群体中的每一个寡核苷酸组成一个随机序列，至少有一个合适的5’和/或3’-末端序列，组成一个寡核苷酸群体中所有分子共享的序列。该适合序列包括PCR引物的杂交位点，RNA聚合酶的启动子序列(例如T3，T4，T7，SP6之类)，限制性酶切位点，或同聚物序列，如poly A尾巴，poly T片段，与亲合柱选择性结合的催化核心和位点，及其他帮助克隆和/或测序所需的寡核苷酸的序列。
寡核苷酸的随机序列部分可以是任何长度的，可以组成核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸，可以包括修饰或非天然的核苷酸或核苷酸类似物。见美国专利5,958,691；5,660,985；5,958,691；5,698,687；5,817,635和5,672,695号，PCT出版物Wo92/07065。随机寡核苷酸可以由磷酸二酯连接的核苷酸合成，合成方法为业内公知的固相寡核苷酸合成技术(Froehler et al.，Nucl.Acid Res.145399-5467(1986)；Froehler et al.，Tet lett275575-5578(1986))。寡核苷酸也可以用固相法合成，例如三酯合成法(Sood et al.，Nucl.Acid Res.42557(1977)；Hirose et al.，Tet.Lett.，282449(1978))。经典的合成是用自动化DNA合成仪进行的，可产生1015-1017个分子。序列设计时，设计足够大的随机序列区，会增加每个合成分子的保守性，使它能准确地代表一个特异的序列。
在合成随机序列时，在合成过程中每个添加步骤都需要加入四种核苷酸的混合物。一个具体化体现，随机寡核苷酸组成完整的随机序列，尽管如此，随机寡核苷酸还可以组成非随机或部分随机序列的一段。在每个添加阶段按不同摩尔比加入4种核苷酸可以合成部分序列。
模板分子一般包括内部区域的30-50个随机核苷酸及两侧的配对5’和3’末端序列。一个标准合成(1μmol)可以产生1015-1016个单独模板分子，足够大多数SELEX实验之用。RNA文库通过该起始文库用重组T7RNA聚合酶体外转录得到。然后将该文库与靶分子混合到一起，在最佳结合条件下分步重复结合，分配，扩增，用相同的选择方案，完成几乎任何标准的亲和性及选择性结合。从核酸的混合物和更好的随机序列片段组成开始，SELEXTM方法包括下列步骤在最佳结合条件下混合物与靶分子的接触，从与靶分子特异性结合中的核算中分配自由核酸，是核酸-靶分子复合体解离，扩增从核酸-靶分子复合体上解离下来的核酸，产生富配体的核酸溶液，然后再重复上面所述的结合，分配，解离，扩增的循环步骤，产生与靶分子高特异性、高亲和力的核酸配体。
在包含了大量的可能的序列和结构的核酸混合物中，对给定靶分子有一个广泛范围的结合亲和力。核酸混合物组成，如一个有20个核苷酸的随机片段可以有420个备选可能。与靶分子的亲和力高于亲和常数的都可以与靶分子结合。分配，解离，扩增之后，得到第二个核酸混合物，富集了高亲和力的核酸，再进行多次这样的选择过程选择最好的配体，直至最后得到的核酸混合物明显为一种或几种序列组成。
选择和扩增循环一直重复直至达到期望的目标为止。大多数情况下，选择/扩增会一直进行直到循环再重复时结合力不再有重要改变。该方法可以用于含约1018个不同种核酸的样品中。实验的核酸混合物最好包括随机序列部分及保护序列以保证扩增效果。核酸序列的变异体也会由多种途径产生，包括随机核酸序列的合成和细胞核酸随机分裂中的大小选择。可变序列部分包括全部或部分随机序列，也包括与随机序列混合的保护序列的一部分。试验核酸中的序列可变性可以在选择/扩增重复之前或之中通过诱变引入或增加。
SELEXTM的一个实施方案中是，该选择过程对于那些与选择的靶分子强烈结合核酸配体的分离非常有效，只需要一个选择和扩增循环。例如在色谱分离中可用这种有效的选择方法。核酸在色谱柱上以这种方式与靶结合。色谱柱有足够的能力分离亲和力最高的核酸配体。
在很多情况下，不需要经过多个重复SELEXTM步骤直至得到单一的核酸。靶特异性核酸配体溶液包含一个核酸结构或模体家族。有大量的保护序列和大量的可替换或加入后对核酸配体对靶分子的亲和力没有重大影响的序列。在SELEXTM过程完成之前终止，可能决定核酸配体溶液家族中很多成员的序列。
已知有各种核酸一级，二级和三级结构存在。最普通的非Waston-Crick类相互作用的结构和模体是指那些发卡环结构、对称和不对称凸起、假结和多个相同结构的组合。几乎这些模体所有已知的状况都表明它们可以形成不到30个核苷酸的核酸序列。由于这个原因，相邻随机片段的SELEXTM程序从包含20-50个核苷酸的随机片段的核酸序列开始是比较好的。
SELEXTM的核心方法已经加以改进，完成了一些特定的目标。例如，在美国专利5,707,796号讲到，SELEXTM与凝胶电泳结合，用于选择具有特定结构特征的核酸分子，如环状DNA；美国专利5,763,177号中讲到，用基于SELEXTM的方法选择包含光敏基团的核酸配体，它具有与靶分子结合和/或光交联的能力；美国专利5,567,588号和美国专利申请08/792,075号，1997年1月31日提交，题为“流动细胞SELEX”讲到基于S ELEXTM的方法可以高效分配与靶分子具有高亲和力和低亲和力的寡核苷酸，美国专利5,496,938号描述了一种通过SELEXTM得到改进的核酸配体的方法。美国专利5,705,337号描述了一种与靶分子共价连接的方法。
SELEXTM也可用于获得与靶分子多个位点结合的核酸配体，也可用于获得与靶分子特异性位点结合的非核酸种类的核酸配体。SELEXTM提供了一种分离和区分与任何预期靶分子结合的核酸配体，包括各种大的和小的生物分子，包括蛋白质(包括核酸结合蛋白和与核酸结合作为其生物功能的一部分的未知蛋白)，辅助因子和其它小分子。例如，美国专利5,580,737号中，通过SELEXTM揭示了与咖啡因及其类似物茶碱具有高亲和力的核酸序列。
逆向SELEXTM是一种通过排除与一个或多个非靶分子具交叉反应性的核酸分子，改进核酸配体与靶分子间特异性的方法。逆向SELEXTM由下列步骤组成a)准备核酸待选混合物；b)待选混合物与靶分子混合，与待选混合物相关的靶分子的亲和力增加的核酸将从待选混合物的容器中分离出来；c)从待选混合物容器中分离出亲和力增加的核酸；d)将亲和力增加的核酸与一个或多个非靶分子混合，与非靶分子具有特异性亲和力的核酸配体被除去；e)扩增与靶分子具有特异性亲和力的核酸，得到与靶分子特异的高亲和力结合的核酸的富集溶液。
核酸用作药物和疫苗时遇到了一个潜在问题，磷酸二酯形式的寡核苷酸在发挥其效果之前很容易在体内液体中被细胞内外的酶降解，例如核酸内切酶和核酸外切酶。因此SELEX方法围绕着识别高亲和性核酸配体进行，该配体包含被修饰的核苷酸，授与配体某些改良的特性，例如改进体内稳定性或改进其运输特征。这种修饰的例子包括在核糖和/或磷酸酯和/或碱基位置取代。包含修饰核苷酸的SELEX识别的核酸配体在下列专利中均有描述美国专利5,660,985号中描述了包含化学性衍生核苷酸的寡核苷酸，它是在核糖的2位，嘧啶的5位，嘌呤的8位修饰过的，美国专利5,756,703号描述了高度特异性的核苷酸配体，包含一个或多个在2’-NH2，2’-F和/或2-O-甲基取代基上被修饰的核苷酸。
在本发明中，对核酸配体的反复修饰包括，但并不限定于为核酸配体碱基或整个核酸配体提供包含额外的电荷作用，极性，疏水性，氢键作用，静电作用，流动性的其它化学基团。这种修饰包括，但不限制于2’-位糖基修饰，5’-位嘧啶修饰，8’-位嘌呤修饰，外环胺基修饰，4’-位硫代尿苷取代，5’-位溴或5’-碘-尿嘧啶取代，主干修饰，磷硫化或烷基磷酸化修饰，甲基化，稀有碱基对组合，如同族碱基，同族胞苷，同族胍等。修饰还包括3’，5’端的修饰，如加帽。目前该发明的一个较好的具体化实例中，核酸配体为在嘧啶残基的糖基部分进行2’-F修饰的RNA分子。
修饰可以是SELEX前或后修饰。SELEX前修饰产生具有SELEX靶分子高度特异性和增强体内稳定性的核酸配体。对2’-OH核酸配体的SELEX后修饰会使体内稳定性增强而对核酸配体的结合能力没有负面影响。
其它的修饰都是领域内公知的几种普通的技术。这种修饰可以用作SELEX后修饰(修饰先前确定未修饰的配体)或者包含在SELEX过程中。
SELEX方法围绕选择的寡聚核苷酸与其它选择寡核苷酸和非寡核苷酸功能单位的结合进行，在美国专利5,637,459号和美国专利5,683,867号中都有描述。SELEX方法进一步围绕在诊断和治疗的选择性核酸配体和亲脂的或非免疫原的高分子量缀合物的结合进行，这在美国专利6,011,020号中有描述。美国专利5,859,228号描述了与亲脂缀合物相关的VEGF核酸配体。如甘油二酯或二烷基甘油，应用于诊断和治疗配位体化合物。
与亲脂化合物相关的VEGF核酸配体，如甘油脂类，或非免疫原高分子量分子。如聚亚烷基乙二醇在美国专利6,051,698号中有进一步描述。与非免疫原高分子量化合物或亲脂化合物相关的VEGF核酸配体在PCT出版物WO98/18480号中有进一步描述。这些专利和申请允许大量的形状和其它特性、有效扩增和复制特性的排列组合，允许具有其它分子所具有的期望特性的寡核苷酸的组合。
由SELEX从小的可变多肽中识别核酸配体的方法也已经研究出来了。小肽具有可变结构，通常以多种均衡构象存在于溶液中。因此，最初认为结合亲和力可能被结合可变多肽所损失的构象熵所限制。尽管如此，从可变多肽溶液中识别核酸配体的可行性已经在美国专利5,648,214中阐述了。在这个专利中物质P的高亲和力RNA核酸配体——一个11个氨基酸的多肽，被识别出来了。
为了产生可以抵抗核酸酶和水解作用的寡核苷酸群，可以用修饰的寡核苷酸，该寡核苷酸可以包括一个或多个核苷酸内替代键，可变糖，可变碱基或其组合。在一个实施方案中，寡核苷酸的P(O)O基团被(O)S(“硫化”)，P(S)S(“双硫化”)，P(O)NR2(“胺化”)，P(O)R，P(O)OR’，CO或CH2(“甲酰缩醛化”)或3’-胺(-NH-CH2-CH2-)取代，在这里每个R或R’都是独立的H或替代或非替代烃基。连接基团可以通过-O-，-N-或-S-键与邻近核苷酸连接。并不是寡核苷酸中所有键都需要是相同的。在一个实施方案中，寡核苷酸包含修饰的糖基，例如，一个或多个羟基被卤素，脂肪族或醚及胺功能的基团所取代。一个实施方案中，呋喃残基的2’-位置被O-甲基，O-烃基，O-丙烯基，S-烃基，S-丙烯基或卤素基团取代。合成2’-修饰糖的方法在Sproat，et al.，Nucl.AcidRes.19733738(1991)；Cotton，et al.，Nucl.Acid Res.192629-2635(1991)；和Hobbs，et al.，Biochemistry125139-5145(1973)中描述。2-氟-核糖核苷酸寡聚物分子的使用，可以增加核酸供体分子对靶分子的敏感性(Pagratis，et al.，Nat.Biotechnol.1568-731997)，与用非取代的核糖或脱氧核糖寡核苷酸产生的敏感性相比，前者为后者的10至100倍，因此，提供了与靶分子额外的结合相互作用，增加了核酸供体分子二级结构的稳定性(Kraus，et al.，Journal of Immunology1605209-5212(1998)；Pieken，et al，.Science253314-317(1991)；Lin，et al.，Nucl.Acids Res.225529-5234(1994)；Jellinek，et al.，Biochemistry3411363-11372(1995)；Pagratis，et al，.Nat.Biotechnol1568-73(1997))。
核酸适合体分子通常经过5到20个循环步骤筛选而出。一个实施方案中是，异质性仅仅由起初的选择阶段导入，而不会在复制过程中发生。
起始DNA序列文库由DNA合成仪自动化学合成产生。这个序列文库在体外用T7RNA聚合酶或修饰的T7RNA聚合酶转录成RNA并纯化。例如，5’-适合随机3’适合的序列被具有30-50个核苷酸的随机序列分离。
2’氧-甲基SELEXTM(2’-OMe SELEXTM)除此之外，SELEXTM方法可以用于产生2’-修饰的适合体。在下列专利申请中均有描述美国专利60/430,761号，2002年12月3日提交，美国临时专利申请60/487,474号，2003年7月15日提交和美国临时专利申请60/517,039号，2003年11年4日提交，及美国专利申请10/729,581号。2003年12月3日提交。在此每一个都被全文收录入参考文献中。
本发明也提供产生稳定寡核苷酸的材料和方法，包括适合体，它包含有修饰的核苷酸(例如在2’位置修饰的核苷酸)，可以使寡聚核苷酸比未修饰的寡核苷酸更稳定。本发明的方法和材料生产的稳定寡核苷酸在酶和化学降解，热和物理降解中也表现出更好的稳定性。例如，包含2’-O-甲基核苷酸的寡核苷酸是抗核酸酶的，合成也不贵。虽然2’-O-甲基核苷酸在生物系统中普通存在，但是天然的聚合酶不能在生理状况下接受2’-O-甲基NTP作为底物，因此，不用考虑2’-O-甲基核苷酸再回收利用于宿主DNA时安全性相关事宜。
一个实施方案中，本发明提供ATP，GTP，CTP，TTP和UTP核苷酸的2’-OH，2’-F，2’-脱氧，2’-氧甲基，2’-NH2和2’-甲基乙基修饰的结合体。一个实施方案中，本发明提供ATP，GTP，CTP，TTP和UTP核苷酸的2’-羟基，2’-氟，2’-脱氧，2’-氧甲基，2’-氨基和2’-甲氧乙基修饰的56个结合体。
发明中2’-修饰的适合体用修饰的聚合酶产生如修饰的T7聚合酶，与野生型聚合酶相比，具有与修饰核苷酸更高的结合率，该修饰核苷酸在呋喃糖2’位上有过大的取代基。例如，一个T7聚合酶双突变体(Y639F/H784A)，784号位的组氨酸突变为丙氨酸或其它氨基酸，残基。除此之外，Y639F突变体被认为包含巨大2’替代物，被用于结合修饰的嘧啶NTP。一个单突变T7聚合酶(H784A)784位的组氨酸突变成了丙氨酸残基(Padilla et al.，Nucleic Acids Research，2002，30138)。在Y639F/H784A双突变和H784单突变的T7聚合酶中突变为更小的氨基酸残基允许更大的核苷酸底物的结合，例如，2’-氧甲基替换的核苷酸。
2’-修饰的适合体产生中的另一个重要因素就是在转录反应的混合溶液中加入二价的镁和锰。不同的氯化钠和氯化锰浓度组成会影响2’-O-甲基化转录，最佳的氯化镁和氯化锰浓度取决于转录反应溶液中NTP络合二价金属离子的浓度。
GMP或鸟苷对转录的起始也非常重要。这个影响由起始核苷酸的聚合酶特异性引起。结果，以这种方式产生的任何转录得5’末端核苷酸似乎都是2’-羟基G。GMP(或鸟苷)较合适的浓度为0.5mM，1mM更好。研究也发现，转录反应中添加PEG，最好是PEG8000，对最大化修饰的核苷酸结合非常有用。
与转化生长因子β2和PDGF有结合亲和力的适合体本发明提供了修饰的和非修饰的核酸配体药物。它可以与眼疾有关的人细胞因子，生长因子或细胞表面蛋白结合。一个实施方案中是，本发明的适合体可以与转化生长因子β2高亲和力结合，在体外能逆转转化生长因子β2介导的对水貂肺上皮细胞(MLEC)增生或抑制作用。这些适合体可以通过图1中描述的“配体指数富集系统演化”(SELEXTM过程)产生。
本发明中的修饰的RNA适合体结合人转化生长因子β2。鉴于这些适合体的生化特征，在大肠杆菌中产生了两种形式的成熟转化生长因子β2，天然的和N-末端组氨酸加尾形式的。重新折叠合纯化之后，获得了有功能的转化生长因子β2。这些转化生长因子β2蛋白在细胞层次的分析中是有活性的。N末端尾巴影响活性和适合体结合，而适合体的亲和性很大程度的降低了。进一步的产生了转化生长因子β2的两个突变体(K94N，S59T/R60K/K94N)。K94N突变体可以结合到适合体上，这种亲和力与其跟天然转化生长因子β2结合的亲和力类似。而S59T/R60K/K94N突变体与适合体的亲和力大大降低。相似地，在细胞层次分析，适合体对天然的和K94N转化生长因子β2生物活性的阻遏比对S59T/R60K/K94N突变体的阻遏能力要高。基于已发表的晶体结构，在59和60号位上的两个替代物位于二聚体结合部位的旁边，与转化生长因子β2 N-末端相邻，另一个替代物在94号位上，在II型受体结合位点的旁边，对与可溶性转化生长因子-β受体的结合竞争的分析发现III型受体与适合体结合物竞争，但II型受体却不。我们还阐明了两个适合体与转化生长因子β2的二聚体中的一种结合，而不与另两种二聚体结合。本发明中的适合体在转化生长因子-βIII型受体结合位点上或附近与转化生长因子β2结合，并阻遏其生物学功能。
本发明中的适合体具有特异性并具有与转化生长因子β2结合的亲和力，其通过上述的SELEX过程筛选。作为SELEX过程的一部份，筛选到结合到转化生长因子β2的序列被最小化，以确定具有结合亲和性的最小序列，然后通过对最小序列随机或定点突变进行优化，以确定亲和力是否增加，序列中哪个位点对于结合作用是关键的。除此之外，筛选可以与序列与修饰序列结合的过程一起进行，使适合体稳定，抵抗体内降解。
下面所述的例子中描述的生物分析中阐述的具有最高亲和力和特异性结合的筛选出的适合体是治疗转化生长因子β2作为病原的疾病的合适治疗药物。取而代之，针对PDGF特异性筛选的适合体是治疗PDGF作为病原的疾病的合适治疗药物。
本发明中的适合体组分具有与PDGF特定二聚体结合亲和力，本发明中的适合组分具有与PDGF BB同源二聚体和AB异源二聚体结合亲和力，而不能与AA同源二聚体亲和结合。
本发明中的适合体组合物可以用作治疗转化生长因子β2或PDGF-介导的增生类眼疾的治疗药物，例如，针对PDGF筛选出的适合体可以用于治疗眼疾，例如增生性玻璃体视网膜病变，增生性糖尿病视网膜病变和年龄相关性黄斑变性。除此之外，PDGF适合体可以单独使用，也可以与其它已知疗法结合起来使用，如抗VEGF疗法，抗炎症治疗，抗增生治疗，抗细菌治疗，抗真菌治疗和抗微生物治疗。转化生长因子β2适合体可以用于治疗小梁切除手术后的损伤，如瘢痕。因此，转化生长因子β2适合体可以在小梁切除手术前或期间使用。转化生长因子β2适合体可以单独使用，也可以与其他已知治疗法结合起来使用，如抗炎症治疗，抗增生治疗，抗细菌治疗，抗真菌治疗和抗微生物治疗。
小梁切除术中转化生长因子β2特异性适合体疗法的应用本发明中的转化生长因子β2适合体可以以滴眼液的形式使用。这个方法不具扩散性，可以使受试体更舒适。如果通过微型设备，微粒子或纱布来使用。在上述手术中就采用敷用的方式。
转化生长因子β2适合体使用时，冻干的聚合物作为支撑物的给药装置与给药溶液混合，然后释放入眼中。从聚合物基质上缓释给药有一个优点，即可以特异性针对靶组织及增加受试体的舒适性及顺应性。聚乳二醇酸(PLGA)是胶囊型片的最佳选择，已经得到FDA的认证，并从1970年开始作为一种缝合材料使用，并作为组织动力学中的手脚架。在其毒理学及降解动力学方面已经有很多相关研究。
除此之外，转化生长因子β2适合体还可以通过冻干的聚合物接触镜支撑的给药装置给药。接触镜适合体治疗给药装置将增加受试体的剂量顺应性，使护理者在适合体治疗过程中敷用更方便，并确保适合体给药恒定的zero-order。
结膜下给药使用体积为100μl，用上述方法操作。
转化生长因子β2适合体的使用取决于通过微装置，微粒子或纱布或前片段附近的结膜下使用滴眼液的有效剂量。它冻干保存，使用时用无菌的没有保护剂的碳酸氢盐缓冲液溶解复原。转化生长因子β2适合体的剂量范围为0.1-200mg/kg。用于动物的较合适剂量范围为0.1-100mg/kg，更好的是0.1-10mg/kg，最合适的为0.1-1mg/kg。人使用剂量范围为7-70mg/kg。
PDGF适合体在年龄相关性黄斑变性(AMD)治疗中的应用PDGF与其它生长因子，如VEGF，协同作用，在年龄相关性黄斑变性的致病中起到了重要作用。缺氧增加了PDGF的表达，PDGF通过PDGF受体b直接与内皮细胞作用，从而诱导其致病性。PDGF作用于成纤维细胞，平滑肌细胞，神经胶质细胞，并刺激结缔组织细胞增生。
PDGF适合体对动物的剂量范围为0.1-200mg/kg，较合适为0.1-100mg/kg，更好的为0.1-10mg/kg，最好的为0.1-11mg/kg。人使用剂量范围为7-70mg/kg。
PDGF适合体可以按有效浓度100μl给药体积进行玻璃体注射。先周结核菌素冲洗，再进行局部麻醉，用30规格的手术针穿过睫状体扁平部进行注射。在给药之前，小瓶塞子用70％酒精擦净。
PDGF适合体可以冻干保存，溶于10μl磷酸钠和0.9％氯化钠缓冲液组成的无菌溶液。玻璃体下给药用于很多眼内疾病。通过有效的穿透术到达眼内。视网膜色素上皮和视网膜毛细管组成的紧密复合体形成血液-眼睛屏障，阻止治疗药物渗入玻璃体。这种给药途径避免了一种潜在的副作用，避免了全身给药，可以有效的针对靶位点给药。
除此之外，PDGF适合体可以穿过巩膜给药。穿过巩膜给药是对后面的部分给药的一种切实可行的给药模式。巩膜上有一个大的可以进入的表面区域，具有高度的水合作用，有助于水溶性物质的结合与进入。相对而言，它缺少细胞，因此，几乎没有蛋白水解酶或蛋白质结合位点，不能结合或螯合药物成份，巩膜渗透允许小的和大分子量药物透过，渗透剂量不会随年龄下降，对于年龄相关性黄斑变性等老年人多发的慢性病的治疗很有效。它没有刺激性，副作用小，可以针对靶位点给药。此外，穿过巩膜装置的缓慢释放使PDGF适合体可以持续释放。
PDGF适合体应用于增生性玻璃体视网膜病变(PVR)增生性玻璃体视网膜病变外科手术从玻璃体切除开始(睫状体扁平部玻璃体切除)，然后在眼中慢慢注入特定的气体或液体，帮助视网膜的展平并与眼外壁重新贴合。PDGF适合体可以玻璃体切除前或后或前后都进行玻璃体注射，剂量为有效浓度的100μl给药体积。先用结核菌素冲洗，再进行局部麻醉，用30规格的手术针穿过睫状体扁平部进行注射。在给药之前，小瓶塞子用70％酒精擦净。PDGF适合体可以冻干保存，溶于10μl磷酸钠和0.9％氯化钠缓冲液组成的无菌溶液。玻璃体下给药用于很多眼内疾病。通过有效的穿透术到达眼内。视网膜色素上皮和视网膜毛细管组成的紧密复合体形成血液-眼睛屏障，阻止治疗药物渗入玻璃体。这种给药途径避免了一种潜在的副作用，避免了全身给药，可以有效的针对靶位点给药。
PDGF适合体可以由可生物降解的微型聚合物系统进行给药。适合体可以包裹入聚合物并按预先确定的速率释放。这一点确保了定点给药，剂量的恒定，并确保了顺应性。给药过程经过对适合体具有可变渗透作用的聚合物包被的小丸而进行。这种植入可以在玻璃体切除中通过穿过睫状体扁平部而插入进去。
此外，PDGF适合体可以穿过巩膜给药。穿过巩膜给药是对后面的部分给药的一种切实可行的给药模式。巩膜上有一个大的可以进入的表面区域，具有高度的水合作用，有助于水溶性物质的结合与进入。相对而言，它缺少细胞，因此，几乎没有蛋白水解酶或蛋白质结合位点，不能结合或螯合药物成份，巩膜渗透允许小的和大分子量药物透过，渗透剂量不会随年龄下降，对于年龄相关性黄斑变性等老年人多发的慢性病的治疗很有效。它没有刺激性，副作用小，可以针对靶位点给药。此外，穿过巩膜装置的缓慢释放使PDGF适合体可以持续释放。
PDGF适合体应用于治疗增生性糖尿病视网膜病变PDGF适合体可以按有效浓度100μl给药体积进行玻璃体注射。先用结核菌素冲洗，再进行局部麻醉，用30规格的手术针穿过睫状体扁平部进行注射。在给药之前，小瓶塞子用70％酒精擦净。PDGF适合体可以冻干保存，溶于10μl磷酸钠和0.9％氯化钠缓冲液组成的无菌溶液。玻璃体下给药用于很多眼内疾病。通过有效的穿透术到达眼内。视网膜色素上皮和视网膜毛细管组成的紧密复合体形成血液-眼睛屏障，阻止治疗药物渗入玻璃体。这种给药途径避免了一种潜在的副作用，避免了全身给药，可以有效的针对靶位点给药。
并且，PDGF适合体可以穿过巩膜给药。穿过巩膜给药是对后面的部分给药的一种切实可行的给药模式。巩膜上有一个大的可以进入的表面区域，具有高度的水合作用，有助于水溶性物质的结合与进入。相对而言，它缺少细胞，因此，几乎没有蛋白水解酶或蛋白质结合位点，不能结合或螯合药物成份，巩膜渗透允许小的和大分子量药物透过，渗透剂量不会随年龄下降，对于年龄相关性黄斑变性等老年人多发的慢性病的治疗很有效。它没有刺激性，副作用小，可以针对靶位点给药。此外，穿过巩膜装置的缓慢释放使PDGF适合体可以持续释放。
与细胞因子，生长因子和细胞表面蛋白具有结合特异性的适合体细胞因子，细胞表面蛋白和生长因子与多种眼部疾病有关，包括ICAM-1，转化生长因子β1，转化生长因子β2，转化生长因子β3，IGF-1，VE GF/VEGF受体，TNF-α，血管因子和α5β3。胞内粘附分子1(ICAM-1)是一个76-115kD的表面糖蛋白，具有5个胞外免疫球蛋白样结构域，在糖尿病视网膜病变中起到重要作用。ICAM-1介导的白细胞淤积是糖尿病视网膜病变的致病成因。ICAM-1与白细胞(嗜中性粒细胞，嗜碱性粒细胞，淋巴细胞，嗜酸性粒细胞，单核细胞)表面的β2整合素结合，对它们牢固的粘附在内皮上及穿过内皮迁移到发炎部位非常重要。在糖尿病视网膜病变中，ICAM-1加强了白细胞与视网膜血管系统的粘附，它还与视网膜内皮细胞的损伤和死亡有关，会导致毛细血管血液循环不可逆缺血，抑制ICAM-1生物学活性，阻止了糖尿病视网膜病变白细胞淤积，并阻止了血液-视网膜屏障被突破。
类胰岛素生长因子-1(IGF-1)是一个7.5kD的多肽，与胰岛素原有50％的同源性，主要产生于肝脏，由生长激素调控。IGF-1是一个潜在的细胞增生的刺激素/致有丝分裂因子，是一种强抗细胞程序性死亡因子。它的功能由6个IGF结合蛋白调控，它的水平受发展阶段和营养状况的影响。IGF-1的生理作用包括细胞生长、防护、抵抗氧化压力、促进骨骼和肌肉生长、保护神经细胞等。IGF-1与血管再生有关，IGF-1与VEGF的结合在增生性糖尿病视网膜病变中起重要作用。增生性糖尿病视网膜病变市糖尿病的并发症，由视网膜中血管病变引起。当视网膜中的血管损坏后，将会导致血液渗漏，再生出易破碎的刷状分支和瘢痕组织，使视网膜传入大脑的视觉影像模糊扭曲。
在胰岛素存在及糖基端次级产物作用下，血管内皮生长因子及其受体(VEGF和VEGF/R)的转录加强。糖尿病视网膜中糖基端次级产物的积累会导致新血管化，进而导致视力丧失。胰岛素刺激VEGF的合成，会使糖尿病受试体在胰岛素治疗后视网膜新血管化程度瞬时加剧。针对VEGF-165的适合体的解离常数(Kd)为300pM，IC50值为1nM。
在视网膜发炎及血管再生过程中，眼中肿瘤坏死因子(TNF-α)水平会升高。TNF-α促进小梁网细胞的增生，调控小梁网、基质金属蛋白激酶和组织抑制物的表达，增加MMP-1，3，9和TIMP-1的表达，降低TIMP-2的表达。血管生成素是一个血管生长因子，有Ang-1和Ang-2两种形式。针对血管生成素的适合体的解离常数(Kd)为10nM，并发现它在TNF-α处理的HUVEC细胞中具有阻断Ang-1和Ang-2介导的程序性死亡抑制的能力。整合素α5β3促进增生性糖尿病视网膜病变和年龄相关性黄斑变性的血管再生(Enaida，et al.，Fubushina J Med Sci.44(1)43-52(1998))。
本发明中的适合体可与ICAM-1，转化生长因子β1，转化生长因子β2，转化生长因子β3，IGF-1，VEGF/VEGF受体，TNF-α和α5β3分别结合，或与其中一个或多个结合，抑制它们的信号活性，因此在眼疾发病机理中起作用。
PEG衍生核酸与高分子量非免疫原性的聚合物衍生的核酸在药物动力学和药代动力学上的特征都发生了改变，使其成为更有效的治疗药物。在活性上较好的改变可以增加对核酸酶降解的抵抗性，降低肾对其过滤作用，降低暴露于免疫系统的程度，改变在体内的疗效。
本发明中的适合体组合物可能是与聚烃基乙二醇(PAG)衍生而来。PAG衍生物的核苷酸的例子见美国专利申请101,718,833号，2003年11月21日提交，整篇收编入参考文献中。用于本发明中的典型聚合物包括聚乙二醇(PEG)，聚氧乙烯(PED)，聚丙烯乙二醇(包括聚异丙烯乙二醇)。此外，随机或整块的不同烯烃氧化物(如乙烯氧化物，丙烯氧化物)的共聚物可以用于很多应用中。他们最普通的形式时，聚烯烃乙二醇，如PEG，是一个线性的聚合物，每个末端以羟基终止HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH。这种聚合物，α-，Ω-二羟基聚(乙烯乙二醇)，也可表示为HO-PEG-OH，PEG这个符号代表如下结构-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，n的范围从4到10,000。
PEG分子是双功能的，有时候也叫做“PEG二醇”。PEG分子末端部分相对而言是无活性羟基部分，-OH可以被激活或转化为有功能的形式，使PEG与其他组分的活性位点结合。这种激活的PEG二醇被认为是双激活的PEG。例如，PEG二醇末端部分行使活性碳酸酯的功能，以选择性的与氨基部分反应，N-羟基琥珀酰亚胺的琥珀酰亚胺活性酯部分取代对应的无活性羟基。
在很多应用中，需要在PEG分子的一端用无活性的组分对其加一个帽子结构，使PEG分子成为单功能(或单活性)的。在蛋白质治疗法的情况下，一般有多个活性位点针对活性PEG，双活性PEG会导致大量的交叉，产生活性很低的聚合物。为了产生单活性的PEG，用一个没有活性的氧甲基(-OCH3)取代PEG二醇分子一端的羟基。PEG分子的未加帽的另一个末端转化为反应端，从而可以与表面活性位点或蛋白分子接触并反应。
PAG是典型的具有水溶性及溶于很多有机溶剂，缺少毒性，没有免疫原性等特征的聚合物。PAG的一个用途即与可溶性分子共价结合，得到可溶的PAG-分子“结合体”。例如，已经发现水不溶的药物紫杉醇，当它与PEG结合后，就变成水溶性的了。PAG结合体不仅用于加强水溶性和稳定性，也用于延长分子在血液循环中的半衰期。
本发明中的聚烃基化合物一般5-80kD大小。本发明中其他化合物大小为10-80kD，也有10-60kD的。例如，一个PAG聚合物的大小最小可以为10、2030、40、50、60或80kD。这种聚合物可以为线性的或分枝状的。
与生物表达的蛋白质药物相比，核酸药物一般是由活性单体核苷酸化学合成。PEG-核酸缀合物是用同样的重复的单体与PEG结合而制备的。例如，PEG通过转变为磷酰胺形式活化后可以与溶入液相的寡核苷酸结合。换而言之，寡核苷酸合成可以通过与活性PEG接触位点的位点特异性结合而完成。最普遍的是它通过5’-末端上添加自由胺来实现(在固相合成耦合的最后一步，用修饰的磷酰胺与之结合)。在这个途径中，活性PEG(如已经活化，可以反应，并与胺分子形成结合键)与纯化的寡核苷酸结合，该反应在溶液中进行。
PEG结合改变药物分布的能力与很多因素有关，包括缀合物的大小(例如根据粒径测量)。大一点的缀合物(＞10kDa)可以更有效的阻断经肾的过滤作用，间接的增加小的大分子(如多肽，反义寡核苷酸)在血清中的半衰期。PEG缀合物阻断过滤作用的能力随PEG的大小而增加，直径约50kD为止(进一步的增加影响已经很小了，因为半衰期改变为由巨噬细胞介导的代谢决定，而不是由肾排出了)。
生产高分子量PEG(＞10kDa)很难，效率低且昂贵。作为合成高分子量PEG-核酸缀合物的一条途径，首先工作要集中到生产高分子量的活性PEG。生产这种分子的一种方法就是声称一种分支状的活性PEG，是两个或多个PEG携带活性基团结合到中心核上。这些高分子量PEG分子末端部分，即无活性的羟基部分时可以被激活的，或者可以转化为有功能的部分，使一个或多个PEG与其它缀合物上的活性位点结合。分支状的活性PEG至少有2个末端，如果两个或更多个末端被激活了，这个活性高分子量PEG分子将成为多活性PEG。在某些情况下，并不是分子状PEG分子所有的末端都是有活性的。一旦任何两个末端被激活，这种PEG分子就是双活性的PEG了，在某些情况下，分支状PEG分子仅有一个末端是有活性的，这种PEG分子就是单活性的。这方面研究的一个例子是两个单氧甲基PEG与随后激活用于反应的赖氨酸核结合而制备得到有活性PEG(Harris et al，.Nature，vol.2214-221，2003)。
本发明提供了另一个节省成本又有效的合成高分子量PEG-核酸(尤其是适合体)缀合物的途径，也包括多个PEG化的核酸的合成(在图2中阐述)。本发明也对PEG连接的多聚寡核苷酸作了阐述。如二聚适合体(也在图2中阐述)。本发明还讲到高分子量组分中，PEG是稳定性部分，是连接者，它分隔了适合体的不同部分，例如，PEG连接到一个单独的适合体序列中，该高分子量适合体的线性排列为核酸-PEG-核酸-PEG核酸。
本发明中的高分子量组分包括那些大于10KDa的分子。一般分子量在10-80KDa之间。本发明中的高分子量组分大小至少为10，20，30，40，50，60，或80KDa。
稳定部分为一个分子或分子的一部分，改进了本发明中高分子量适合体的药代动力学和药效学特征。在某些情况下，稳定部分为携带两个或多个适合体或适合体结构域的分子或分子的一部分，使本发明中的高分子量适合体总体旋转自由度下降。稳定部分可以是聚烃基乙二醇，可以为线性的或分支状的。可以为同源二聚体也可以是异源二聚体。其它的可作为稳定部分的有诸如肽核酸(PNA)之类的聚合物。寡核苷酸也可作为稳定部分，包括修饰的核苷酸和/或修饰的化学键。稳定部分时适合体整体中的一部分，即，它与适合体共价结合。
本发明包括高分子量适合体组合物，两个或多个核苷酸共价结合与至少一个聚烃基乙二醇上。聚烃基乙二醇作为稳定部分，它在适合体的任一端与其共价结合，把核酸分子结合到一起成为一个大分子，因此聚烃基乙二醇也是起连接作用的部分。在这个复合体中，共价结合分子的一级结构包括线性排列的核酸-PAG-核酸。例如，一个缀合物具有的一级结构为核酸-PEG-核酸。另一个例子为一个线性排列核酸-PEG-核酸-PEG-核酸。
为了生产核酸-PEG-核酸共价结合体，核酸合成时应只有一个反应活性位点(例如，单活性的)。一个较好的具体化实例为，该活性位点是一个氨基，在寡核苷酸固相合成的最后一步时，引入一个修饰的磷酰胺。寡核苷酸去保护和纯化以后，在溶液中高度浓缩，使活性PEG的自发水解最小化。一个实施方案中，1mM的寡核苷酸，他的复原溶液为200mM NaHCO3缓冲溶液，PH8.3。共价结合体的合成是由缓慢的一步一步的添加高度纯化的双功能PEG起始的。一个实施方案中，PEG二醇两端都具有活性(双激活的)。接下来的反应为PEG-核酸共价结合物经过凝胶电泳或液相色谱纯化，分离出完整的、部分的或未共价结合的等几类。多个PAG分子连接(如随机或中断共聚物)或小PAG链可以连接成各种长度(或分子量小)的聚合物，非PAG连接可以用于各种长度的PAG链中。
本发明的一个高分子量组合物具有下图所示的结构
(40K分枝的PEG-19号序列-0.1KDa PEG-35号序列-0.1KDa PEG-36号序列)。2’-O-甲基修饰的核苷酸用下划线表示，3，2’-氟修饰的核苷酸用斜体字表示。2’-O-甲基，2’-氟修饰时适合体能抵抗核酸酶的降解，增加其体内半衰期。3’-3’-dT帽子结构也可以增加对核酸外切酶的活性。见美国专利5,674,685；50,668,264；6,207,816和6,229,002，它们整篇参考收入。
PAG衍生活性核酸。高分子量PAG-核酸-PAG共价缀合物可以由单功能活性PEG和包含至少1个活性位点的核酸反应得到。一个实施方案中，核酸为双活性的或双反应位点的。包含有两个反应位点5’-氨基和3’-氨基，它们通过共价的磷酰胺合成引入到寡核苷酸中，例如，3’-5’-双PEG化于图2中描述。另一个实例为，还可以在中间位置引入反应位点。例如，嘧啶的5号位，嘌呤的8号位，或核糖的2’位都可以作为结合位点。在这个实例中，核酸可以有多个活性或反应位点，为多活性的。接下来的合成和纯化中，修饰的寡核苷酸在选择压力下与单活性的PEG结合，使自发水解反应最小化。一个实施方案中，在单甲氧-PEG被琥珀酰亚胺丙酸盐激活，配对反应在pH8.3时进行。为了促进双取代PEG的合成，对寡核苷酸提供过量的PEG。接下来，PEG-核酸共价结合物通过凝胶电泳或液相色谱层析纯化，分离完整的，部分的和未共价结合的等种类。图2描述了合成PEG化核酸适合体的两种策略。
连接结构域也可以有一个或多个聚烃基乙二醇组分。这种PAG可以是各种长度的。可以用于适当的结合，以获得所需分子量组合物的。
特异性连接体的效率可以被其化学组分及长度所影响。太长的、太短的、或与靶分子形成了不利空间排列和/或离子相互作用的连接体都将妨碍适合体与靶分子之间形成复合体。若连接体比核酸分子间的必要距离长，则会降低配体的有效浓度，从而降低了结合稳定性。因此，通常需要优化连接体组分及长度，以最大化与靶分子的亲和力。
药物组合物本发明还包括了包含适合体分子的药物组合物。一个实施方案中，该组合物适于内服，包括足够的有效剂量的本发明的药物活性化合物无论以单独的形式或以结合体的形式，及一个或多个合适的药剂载体。这些化合物无论什么毒力都非常低。
本发明中的组合物可用于治疗或预防病变，比如疾病或紊乱，或者缓和受试体的疾病或紊乱症状。适合体特异结合的靶分子引起的或相关的疾病或紊乱，本发明的组合物对其非常有用，对其预防也很有用。
例如，靶分子是与致病相关的蛋白，如引起疾病的靶蛋白。
本发明中的组合物可以用于治疗有病变的病人的方法中。该方法涉及到为病人使用由与病变有关系得靶(如，蛋白)结合的适合体组成的组合物，组合物与靶分子的结合改变了靶分子的生物功能，故可以治疗病变。
病变的受试体，如，用本发明的方法治疗的受试体，可以是哺乳动物，更稳定地是人类。
在实践中，该复合体或它们的药剂上所接受的盐，给药量以足够抑制生产因子活性为宜，如青光眼中介导细胞增生和其它眼增生疾病的转化生长因子β2。
本发明的适合体组合物在治疗眼疾时与其它治疗相结合。该适合体组合物可以包括至少两个适合体。在某些例子中，与外科手术结合起来给药，或与其它有用的药物一起使用，如抗炎症药物，免疫抑制剂，抗病毒药物等。此外，本发明的组合物可与化学治疗药物配合使用，如烷基类药物，抗代谢，有丝分裂抑制药物，或细胞毒抗生素等。总的来说，目前用于这种结合的已知治疗药物的可用结合形式都是合适的。
“联合用药”包括本发明的适合体组合物的给药和至少一种其它药物作为特定治疗的一部份。这些药物共同作用从而提供更好的疗效。联合用药对疗效的增强表现为(但不限定于)，药化动力学和药效学的联合作用，使药物治疗成分结合起来。这些结合治疗成分通常在一个界定的时间内给药(根据结合体选择，通常为数分钟、小时或星期)。
“联合用药”可以，但通常不会两个或多个药物分离开来单独完成给药，不会偶然地，任意地与本发明结合而给药。“联合用药”准备采用的给药方式为，这些药物以有序的模式给药，即，每种药物在不同的时间给药，或者至少两种药物同步给药。实际上，同步给药可以通过一个药丸装有一定比例的混合物或单独含有不同药物的多个药丸完成给药过程。
可以通过以下途径完成有序或同步给药局部途径，口服途径，静脉途径，肌内途径及直接通过粘膜组织吸收。药物的给药可以通过同一种或多种不同途径。例如，第一种治疗试剂选择注射给药，而其它的药剂的给药方式则为局部给药。
换而言之，所有的药剂都可以局部给药或者所有的药剂都可以注射给药。药剂的给药顺序没有严格的限定。“联合用药”也可以采用上述药剂给药进一步与其它生物活性成分和非药物治疗(如，外科手术)相结合的方式，这种结合疗法进一步包含了非药物治疗，它可以在任何合适的时间实施，在治疗药物共同作用产生药效的期间完成非药物治疗。例如，在合适的情况下，当非药物治疗暂时从药物治疗中撤去几天或几周仍然会保持良好的治疗效果。
本发明的化合物和其它具药学活性的药剂可以同步地、顺序地或结合起来向受试体给药。当本发明的化合物使用时。化合物和其它药学活性药剂可以用同种可接纳载体同步给药。它们也可以用不同的药用载体，如方便的口服药剂形式。联合用药进一步指化合物用不同的药剂形式按一定的顺序给药。
优选地，眼部药物局部给药或通过结膜下注射给药。大多数药部药物的反复敷用可以使眼内的药物水平比的上结膜下注射，但结膜下注射在眼内低渗透药物(如，抗生素)的给药上具有优越性。通过结膜下注射，用少量的药就可以在用药部位拥有集中的较高的药物浓度，避免了有害的全身系统用药。高的组织浓度也可以获得在角膜或结膜上皮层渗透能力差的药物。这种方法对那些不能可靠的使用局部用药的病人非常有用。眼内药物可以在外科手术后注射，以避免局部或系统药物治疗。结膜下注射需要将针穿过前结膜和眼球筋膜。该操作可以直接穿过眼睑或直接进入到结膜下空间。眼球筋膜位于注射的药物和眼球之间，因此通过巩膜吸收的药物的量减到最少了。实际上，结膜下注射后药物吸收的机制可能是药物通过针刺位点渗透，随后经过角膜被吸收。
各种眼部疾病用结膜下注射皮质类固醇来治疗。皮质类固醇是一种结膜下给药的药物，它渗透到巩膜下，将药物直接送到发炎部位，而不是随机的注射。结膜下注射5’-氟尿嘧啶，一种抗成纤维化药剂，通常用于高风险的青光眼小梁切除手术之后。结膜下麻醉现在用作替换眼球周边后麻醉的方法。用于小梁切除手术或白内障手术。
结膜下药物给药在很多角膜疾病的治疗中非常有用，如细菌性溃疡。角膜组织可以通过结膜下注射获得更高浓度的抗生素，比全身给药要高。结膜下抗生素的使用也可以作为系统抗生素治疗细菌性眼内炎的有益补充。
本发明的组合物需要与各种药用赋形剂结合了使用，包括稳定剂，载体或/和包裹物等。
适合注射的药剂形式必须是无菌的液体状的，便于注射器的吸入。在制造及储藏的情况下都必须是稳定的，必须防止微生物(如细菌、真菌等)的污染。
本发明中有疗效的或药理的组合物组成了联合治疗的有效组分，在药理上合适的介质中溶解或展开。药理上合适的介质或载体包括任何和所有有机溶剂，分散介质，包衣，抗细菌及抗真菌剂，等渗和吸收延迟剂等。这些药理活性物质的介质和剂型的使用为业内人所公知。这些增补活性成分也可以混合到本发明的有效的组合物中。
业内技术人员可以按本公布的发明制备有效的药理的组合物。一般来说，这种组合物应制备成注射物，要么是液体溶液，要么是液体悬浮液；或者为易溶的活可悬浮的固体形式，溶解后再注射；也可以是口服的药片或其它固体形式；也可以是缓释胶囊；或者是目前使用的其它形式，包括滴眼液、洗剂、药膏，吸入剂等。使用时医务人员先用无菌的生理盐水清洗手术区。该组合物也可以由微装置，微粒子或棉球运送到受药部位。
治疗中，给药量应与剂量公式相一致，在该剂量下才是有疗效的。给药可以以各种剂型，如上述的注射溶液类型，药物缓释胶囊等也可以。
在本文中，给药的活性成分量和组合物体积取决于治疗的宿主动物。精确的活性组分给药量取决于医生的判定，每个人会有所不同。
通常利用最小体积的组合物去展开活性组分。我们还有合适的给药规则，但是要通过最初的给药和检测结果来确定，然后每隔一定的时间进行剂量控制。
以片剂或胶囊的形式口服给药(如明胶胶囊)，药物的活性组分可以与口服的，非毒性的，药理上无活力的载体结合，如乙醇、甘油、水等。此外，根据需要合适的结合剂，润滑剂，分解剂和着色剂也可以添加到药物中。合适的结合剂包括淀粉、镁铝的硅酸盐，淀粉糊精，明胶，甲基纤维素，羧基甲基纤维素钠。和/或聚乙烯吡咯烷酮，天然糖类，如葡萄糖，β-乳糖，玉米甜味剂，天然及合成的树脂，如阿拉伯树胶，黄芪胶或藻酸钠，聚乙烯二醇，蜡等。这些药剂中使用的润滑剂包括油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，硅土，滑石粉，硬脂酸及其镁盐和硅盐和/或聚乙二醇等。分解剂包括，但不限定于淀粉，甲基纤维素，琼脂，皂土，黄厚胶淀粉，琼脂，藻酸及其钠盐，或泡腾混合物等。稀释剂包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，甘露糖，山梨糖，纤维素和/或甘氨酸。
可注射的组合物最好为等渗的水溶液或悬浮液，亲脂乳剂或悬浮液有利于制备栓剂。该组合物应该是无菌的。包含佐剂，如保护剂，稳定剂，润湿剂或乳化剂，溶解促进剂，调节渗透压的盐和/或缓冲液。除此之外，还应该包含其它对治疗有用的物质。根据常规配制，粒状或包衣等不同形式，组合物的含量为0.1-75％，最好包含1-50％的活性成分。
本发明的组合物也可以以口服形式给药，定时释放药物及做成缓释片剂，胶囊，药片，颗粒，酏剂，酊剂，悬浮剂，糖浆和乳剂。
液体状，尤其是可注射的组合物可以通过溶解，展开等方式配制。活性组分溶解于或与要用的纯净的有机溶剂混合，如水，生理盐水，葡萄糖溶液，甘油，乙醇等，由此形成可注射的溶液或悬浮液。除此之外，配制适于在注射前溶于液体的固体形式。可注射的组合物最好为等渗溶液或悬浮液。该组合物应该是无菌的，包含佐剂，稳定剂，湿润剂或乳化剂，溶剂促进剂，调节渗透压的盐和/或缓冲液。此外，还应该包含其它对药效有用的物质。
本发明的组合物可以通过静脉内(大丸剂盒输液)，腹膜内，皮下或肌肉内注射等方式给药，这里所述的每种方式都是业内人熟知的普通操作。可注射的药物应配制成液体溶液或悬浮液等方便可用的形式。
肠胃外注射用药通常用于皮下的，肌肉内的或静脉注射和输液。此外，还有肠胃外给药的一个方法为注入慢释或缓释系统，确保维持恒定的药剂水平，见参考文献中的美国专利3,710,795号，其全文收入本篇。
此外，本发明的组合物可以以鼻内形式给药，通过合适的鼻内赋形物局部使用，或经过透皮途径，使用业内人士熟知的普通操作。由于以透皮运送的形式给药，用药剂量将是持续的，而不是间歇的。其它的局部用药包括乳膏，药膏，洗剂，气雾喷剂和凝胶，在这里，活性组分的浓度范围为0.01％-15％，质量/质量比或质量/体积比。
针对固体组合物，赋形剂包括药用级别的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠盐，滑石粉，纤维素，葡萄糖，蔗糖，碳酸镁等。上面所述的活性组分可以配制成栓剂，用聚烃基乙二醇例如丙烯乙二醇作为载体。在一些具体化实例中，亲脂乳剂或悬浮液对栓剂的制备是有利的。
本发明的组合物也可以以脂质体运送系统的形式给药，例如，小微脂粒，大微脂粒和微脂粒。脂质体可以有多种磷脂形成，包括胆固醇，碱性脂，磷脂酰胆碱。在一些具体实例中，一层脂质组分薄膜与药物水溶液水合，形成包被在药物外的脂质层，如美国专利5,262,564号中所述。例如，这里描述的适合体-毒素和/或核报告分子可以与亲脂组分或非免疫原性高分子量组分用业内人员熟知的方法构建成复合体。美国专利6,011,020号提供了一个核酸相关复合体的例子。
本发明的组合物还可以与作为目标药物载体的水溶性聚合物配对给结合。这种聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃共聚物，聚烃基丙基-异丁烯酸-酚，聚烃基乙基天冬酰胺酚，或具有十六酰残基的聚乙烯氧化聚赖氨酸。此外，本发明的组合物还可以与可生物降解的聚合物配对结合，以对药物释放进行控制，例如，聚乳酸，聚己酰内酯，聚烃基丁酸，聚直链酯，聚乙缩醛，聚二氢吡喃，聚氰基丙烯酸盐粘合剂及交联的或中级两性中断水凝胶共聚物。
如果需要，该药用组合物还包括了少量的非毒性的辅助物质，如湿润或乳化剂，PH缓冲剂及其它物质，如醋酸钠，油酸三乙醇胺等。
用药的剂量及方式根据多种因素确定，包括类型，种族，年龄，体重，性别及受试体药物状况；疾病严重程度；给药途径；受试体的肝肾功能状况，以及受试体所用的其它特殊组分或盐。普通的内科医生和兽医可以很容易判定治疗所需的有效剂量。
本发明的有效口服剂范围为0.05-1000mg/天。该组合物在药片中的含量为0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，25.0，100.0，250.0，500.0及1000.0mg。本发明的组合物的有效基质水平范围为0.002mg-50mg/千克体重/天。本发明的组合物可以按一天剂量给药，或者每天将一天的剂量分成二、三或四次给药。
实施例实施例1转化生长因子β2蛋白的纯化及鉴定编码全长人类转化生长因子β2成熟蛋白的人工合成的聚核苷酸克隆到pRSET大肠杆菌表达载体，转入BL21(plys)菌株中。转化的细胞在使转化生长因子β2蛋白高水平表达的条件下生长，并形成包涵体。纯化并溶解包涵体。转化生长因子β2重折叠，并用S75大小的排阻层析(图4A)纯化，加上His尾巴的转化生长因子β2也可以通过在转化生长因子β2的N-端加上30个额外的氨基酸得到。在59位(S→T)，60位(R→K)和94位(K→N)的点突变，对应与S58T/R60K/K94N突变体。His加尾和突变的转化生长因子β2都跟野生型一样的步骤进行表达，重折叠及纯化。图4B展示了转化生长因子β2在S75S大小的排阻层析洗脱的轮廓图，包括转化生长因子β2二聚体的峰与图4C中的PAGE条带式一致的。
实施例2转化生长因子β2蛋白结合到转化生长因子β2特异性适合体上适合体与纯化的人或啮齿动物的转化生长因子β2蛋白结合的解离常数有与32P-标记的RNA结合的硝酸纤维素膜决定体外转录的RNA用小牛小肠碱性磷酸酶处理(New England Biolabs)，以转移5’-三磷酸酯，然后与γ-32P-ATP和T4核酸聚合酶(New England Biolabs)一起培养从而进行放射性标记。通过凝胶过滤除去未结合的标记，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进一步纯化RNA。水中纯化的32P标记的适合体在使用之前重折叠，95℃加热3分钟，然后在室温下结合缓冲液中(50mM热激蛋白，PH7.4，1mM MgCl2，1mMCaCl2，3mM KCl，140mMNaCl，0.1mg/ml牛血清白蛋白，0.01mg/ml RNA)培养10分钟。结合反应(100μl)通过在过量的转化生长因子β2蛋白中添加适合体(≤0.1nM)开始，然后在室温下平衡10-30分钟。
硝酸纤维素滤膜分配用MinifoldI，96孔斑点印迹岐管(Schileicher&Schuell)完成。蛋白结合的适合体和残基自由的适合体分别被预先湿润的Protran硝酸纤维素(Schileicher&Schuell)和Hybond-P聚二氯乙烯(AmershamBiosciences)滤膜通过抽真空而捕获，并用磷光呈像(Amersham Biosciences)定量。在每个转化生长因子β2浓度下，蛋白结合的适合体的比例根据Protran硝酸纤维素膜的计数/分(CPM NC)与Protran和Hybond-P滤膜的CMP总和(CMP total)之比来标定。解离常数(KD)的判定通过转化生长因子β2浓度(即[TGFβ2])温度曲线得到与标准等CPM NC/CPM total＝Cmax/(2+KD/[TGFβ2]total)，这里Cmax等于CPM NC/CPMtotal在饱和[转化生长因子β2]时能达到的最大值，可以反映适于识别转化生长因子β2适当折叠得适合体作比例。
竞争性分析某些适合体，她那些用高分子量PEG组分修饰过的适合体，与硝酸纤维素非特异性结合。因此对标准硝酸纤维素膜分配分析没有响应。这些适合体通过与其它已知特性的适合体(如ARC77)的竞争来分析。
适合体竞争反应通过在结合缓冲液中，32P标记的ARC77(≤0.1nM)与浓度增加的未标记的竞争适合体(0.05-300nM)的预培养来实现。结合反应由向转化生长因子β2蛋白中加入适合体样品开始，产生终浓度为2.5nM的蛋白。在没有冷的竞争体存在时，在此转化生长因子β2浓度下，约30％的32P标记的ARC77可以观察到已经结合到Protran硝酸纤维膜上了。与32P标记的ARC77结合减少，则竞争体的结合浓度增加，可以用以下模式来描述A*·P↔PK1↔K2A·P---(1)]]>这里，A*为32P标记的ARC77，P为转化生长因子β2适合体。A为冷的竞争适合体，K1为蛋白与热的竞争适合体相互作用的解离常数，K2为蛋白与冷的竞争适合体相互作用的解离常数。K2值从CPMNC/CPMtotal。与冷的竞争体的浓度(即[IA]total)曲线上得出，符合等式2。需满足[A*]＜＜[P]total的条件。
CPMNCCPMtota=Cmax1+(1+[A]totaK2-[P·AK2)K1[P]tota---(2)]]>这里[P·A]有下列二次等式表述[P·A]=([P]total+[A]total+K2)-{([P]total+[A]total+K2)2-4[P]total[A]total}1/22]]>每一个竞争分析都有一个K1值，K1值由上述标准结合分析决定。
图5A和5B展示了转化生长因子β2结合蛋白，改变了转化生长因子β2特异性适合体的浓度。(A)32P标记的ARC77(≤0.1nM)与浓度增加的(0.2-100nM)人类(●)或鼠(□)的转化生长因子β2蛋白一起培养，用硝酸纤维膜分析其结合情况。这些适合体的Kd值分别为ARC773.6±0.6；ARC784.0±0.5；ARC815.1±0.4。Kd值由等式1得到。(B)适合体的解离常数通过32P标记的ARC77对人转化生长因子β2的竞争性结合而得到。放射性标记的ARC77()和ARC81(■)竞争性结合的结果(如图5B所示)适用等式2。
实施例3与转化生长因子β2特异性结合的适合体的种类本发明的三个适合体复合体，ARC77，ARC78，ARC81为与人类及啮齿动物的转化生长因子β2特异性结合的种类，根据实例2中的方法亲和结合。
如我们在图6A和6B中所见，ARC81适合体逆转了人转化生长因子β2介导的对MLEC增生的抑制作用。图6A展示了ARC77，ARC78和ARC81适合体抑制了50pg/ml转化生长因子β2的抗增生活性。作为对照物的抗转化生长因子β2抗体(R&D，AF-302-NA)，也逆转了低浓度房水的细胞增生作用。图6B所示的为ARC77适合体对人类转化生长因子β2的抵抗作用大于对啮齿目动物。两者结合起来看，这些数据说明了ARC77，ARC78和ARC81适合体可以改变转化生长因子β2的生物活性。ARC77适合体可以特异性抗体人的转化生长因子β2。图6C说明了ARC77适合体对人类野生型(WT)，鼠(NTK)和N端His加尾形式的的人类转化生长因子β2具有不同的结合亲和力野生型(WT)2.5±0.3nM，鼠(NTK)80±5nM，His加尾≥500nM。
MLEC每孔2000个细胞在37℃下培养4小时。加入所需浓度的适合体和转化生长因子β2，37℃，16小时。用Brdll混合法测定细胞增殖。Brdll分析法按操作手册上的步骤来做(Roche Diggno stics)。
实施例4房水激发试验ARC81逆转房水介导的对MLEC增生的抑制作用。图7A显示了1000nM ARC81抑制低浓度的兔房水(＜10％)抗增生活性。抗转化生长因子β2抗体(R&D，AF-302-NA)，作为对照物，也逆转了低浓度房水的细胞增生效应。图7B和7C中可以看出，ARC81抗体和抗转化生长因子β2抗体，以剂量依赖方式解除了兔房水介导的MLEC增生抑制。从这两幅图中可以看出，这些数据说明了ARC81适合体可以逆转转化生长因子β2在房水中的生物功能。
MLEC试验。水貂肺上皮细胞增生试验需要进行两天以上。第一天1)从水貂肺上皮细胞中(MLEC)吸出培养物；2)用10ml 1×PB S清洗MLEC；3)加入3ml胰蛋白酶，并胰蛋白酶消化3分钟，37℃；4)用10ml 0.5％FBS培养基停止反应；5)1000rpm转3.3分钟；6)吸出上清液；7)用10ml 0.5％FBS培养基重悬沉淀；8)计数10μl细胞悬液；9)调整细胞密度至80,000个细胞/ml；10)加入50μl细胞/孔到黑底96孔板中(4000个细胞/孔)；在布板过程中吹吸几次，避免细胞沉淀及布板不均衡；11)在37℃，5％CO2中培养4小时，使细胞贴壁；12)加入25μl适合体(或培养基，或其它实验试剂，如，抗体)，最好外层孔不要用于处理细胞；13)加入25μl转化生长因子β2(通常25pg/ml)；14)37℃，5％CO2中培养细胞过夜。
第二天1)将20μl BrdU和2ml 0.5％FBS培养基混合；2)每孔加入10μl BrdU；3)37℃，5％CO2中培养细胞3小时；4)倒掉培养基，用纸擦干杂交板；5)每孔加入200μl Fix Denat溶液，在室温下培养30分钟；6)倒掉FixDenat溶液，用纸擦干杂交板；7)每孔加入200μl抗BrdUPOD溶液，室温下培养90分钟；8)倒掉抗BrdU POD，用纸巾擦干杂交板；9)每孔加入200μl洗涤剂，在室温下培养5分钟，洗杂交板3遍，用纸巾擦干杂交板；10)每孔加入100μl底物溶液，室温黑暗培养30分钟；11)在Top Count读板，分析结果。
每孔中加入2000个MLEC细胞，37℃培养4小时。适合体、抗体、房水和转化生长因子β2按一定的浓度加入，37℃培养16小时。用BrdU掺入测量细胞增生。BrdU试验的操作按照操作手册的要求进行(RocheDiagnostics)。
实施例5选择最小化及转化生长因子β2特异性适合体的鉴定本发明中修饰的RNA适合体，如ARC77(序列号1)与天然的人体转化生长因子β2结合，可以中断水貂肺上皮细胞抑制实验中的转化生长因子β2的作用。进一步对适合体进行生化鉴定，大肠杆菌产生两种形式的成熟转化生长因子β2，天然形式和N-端His加尾的形式。重折叠和纯化后，得到有功能的转化生长因子β2。这些转化生长因子β2在细胞实验中是有活性的。N-端尾巴影响活性和适合体的结合，适合体的亲和力大幅度降低。更进一步产生了，两个突变的转化生长因子β2(标记为K94N和S59T/R60K/K94N)，它们为转化生长因子β2的同分异构体。K94N突变体可以与适合体结合，亲和力与天然转化生长因子β2相当，而S59T/R60K/K94N突变体与适合体的亲和力则大大降低了。同样，在细胞水平实验中，适合体对天然和K94N转化生长因子β2生物活性的破坏能力比对S59T/R60K/K94N要高。基于已公布的晶体结构，在59和60位，转化生长因子β2二聚体结合部位和N-端附近有两个取代，在II型受体结合位点附近的94位也有一个取代。与溶解的转化生长因子-b受体的结合竞争性实验得知，III型受体与适合体竞争结合，而不是II型受体。由数据可知，两个适合体与一个二聚体转化生长因子β2结合。本发明的适合体在转化生长因子-bIII型受体结合体点处与转化生长因子β2结合，破坏其生物功能。
最小化和突/修饰试验。图8A是对序列1(ARC77)的适合体的选择，最小化和鉴定的阐述。残基的缺失和结合亲和力的影响在图8A和图8B中已经指出。图8A中打框的残基代表高度保守的残基。适合体结合到转化生长因子β2上的结合亲和力通过斑点杂交蛋白质结合试验确定(图8B)。转化生长因子β2适合体可以逆转MLEC细胞增生中转化生长因子β2抑制作用。不规则适合体(在图8C中标示为“ARC77转录”)用于负调控，转化生长因子β2中和的抗体则用作正调控。
图9表示适合体/转化生长因子β2二聚体化学计量，由α筛选确定。不同浓度的适合体用荧光素或生物素标记，与抗-FITC受体小珠或链霉亲和素供体小珠结合，用转化生长因子β2同源二聚体滴定。用混合平板检测器检测信号。
图10A为通过各种修饰的和/或野生型转化生长因子β2突变所确定的转化生长因子β2结合位点的图谱。测试了三个转化生长因子β2变异体野生型转化生长因子β2，长尾形式的转化生长因子β2和短尾形式的转化生长因子β2。此外，还检测了两个突变体，K94N和S59T/R60K/K94N突变体由野生型转化生长因子β2通过快速点突变的方式得到。这些蛋白质(即野生型，S59T；R60K/K94N，K94N，N长尾转化生长因子β2和N短尾转化生长因子β2)在转化生长因子β2适合体存在的情况下培养，它们的EC100值，结合亲和力和IC50值(nM)被确定了(图10B)，适合体与那些蛋白的结合亲和性通过斑点杂交确定。适合体的抑制活性。IC50值通过MLEC增生试验确定。
图11显示转化生长因子III型受体可以中断适合体与转化生长因子β2的结合在转化生长因子β2与III型或II型受体溶液预培养之后再进行。斑点杂交分析，确定适合体与转化生长因子β2的结合。Ki值通过简单的竞争模式的数据计算。
表1-适合体序列SEQ ID No.1 ARC77-TGFβ25′-GGAGGfUfUAfUfUAfCAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUGfUAfCfUfCfC-3T-3′SEQ ID No.2 ARC78-TGFβ35’NH2-GGAGGfUfUAfUfUAfCAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUGfUAfCfUfCfC-3T-3’SEQ ID No.3 ARC79-TGFβ25′-mGmGmAmGmGfUfUAfUfUmAfCmAmGmAmGfUfCfUGfUAfUAmGfCfUmGfUmAfCfUfCfC-3T-3′SEQ ID No.4 ARC81-TGFβ25′-NH2-mGmGmGmGfUfUAfUfUmAfCmAmGmAmGfUfCfUGfUAfUAmGfCfUmGfUmAfCfCfC-3T-3′SEQ ID No.5 ARC82-TGFβ25′-mGGmGmGfUfUmAfUfUAfCAmGmAmGfUfCfUmGfUmAfUmAmGfCfUmGfUAfCfCfC-3T-3′SEQ ID No.6 ARC111-TGFβ25′-[20KPEG]-NH2-GGAGGfUfUAfUfUAfCAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUGfUAfCfUfCfC-3T-3′SEQ ID No.7 ARC112-TGFβ25′-[PEG30K]-NH2-GGAGGfUfUAfUfUAfCAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUGfUAfCfUfCfC-3T-3′SEQ ID No.8 ARC113-TGFβ25′-[PEG40K]-NH2-GGAGGfUfUAfUfUAfCAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUGfUAfCfUfCfC-3T-3′SEQ ID No.9 ARC117-TGFβ25′-[PEG20K]-NH2-mGmGmGmGfUfUAfUfUmAfCmAmGmAmGfUfCfUGfUAfUAmGfCfUmGfUmAfCfCfC-3T-3′SEQ ID No.10 ARC118-TGFβ25′-[PEG30K]-NH2-mGmGmGmGfUfUAfUfUmAfCmAmGmAmGfUfCfUGfUAfUAmGfCfUmGfUmAfCfCfC-3T-3′SEQ ID No.11 ARC119-TGFβ2
5′-[PEG30K]-NH2-mGmGmGmGfUfUAfUfUmAfCmAmGmAmGfUfCfUGfUAfUAmGfCfUmGfUmAfCfCfC-3T-3′SEQ ID No.12 ARC120-TGFβ25′-[PEG20K]-NH2-mGGmGmGfUfUmAfUfUAfCAmGmAmGfUfCfUmGfUmAfUmAmGfCfUmGfUAfCfCfC-3T-3′SEQ ID No.13 ARC121-TGFβ25′-[PEG30K]-NH2-mGGmGmGfUfUmAfUfUAfCAmGmAmGfUfCfUmGfUmAfUmAmGfCfUmGfUAfCfCfC-3T-3′SEQ ID No.14 ARC122-TGFβ25′-[PEG40K]-NH2-mGGmGmGfUfUmAfUfUAfCAmGmAmGfUfCfUmGfUmAfUmAmGfCfUmGfUAfCfCfC-3T-3′SEQ ID No.21 ARC152-TGFβ25′-[NH2]-mGmGmAmGmGfUfUAfUfUmAtCmAmGmAmGfUfCfUGfUAfUAmGfCfUmGfUmAfCfUfCfC-3T-3′SEO ID No.4 ARC154-TGFβ25′-[NH2]-mGmGmAmGmGfUfUAfUfUmAfCmAmGmAmGfUfCfUGfUAfUAmGfCfUmGfUmAfCfUfCfC-3T-3′SEQ ID No.23 ARC155-TGFβ25′C-[NH2]-mGGmGmGfUfUmAfUfUAfCAmGmAmGfUfCfUmGfUmAfUmAmGfCfUmGfUAfCfCfC-3T-3′SEQ ID No.24 ARC156-TGFβ25′-[tatp]-[NH2]-mGGmGmGfUfUmAfUfUAfCAmGmAmGfUfCfUmGfUmAfUmAmGfCfUmGfUAfCfCfC-3T3′SEO ID No.25 ARC157-TGFβ25′-[antp]-[NH2]-mGGmGmGfUfUmAfUfUAfCAmGmAmGfUfCfUmGfUmAfUmAmGfCfUmGfUAfCfCfC-3T-3′SEQ ID No.26 ARC158-TGFβ2
5′-[arg7]-[NH2]-mGGmGmGfUfUmAfUfUAfCAmGmAmGfUfCfUmGfUmAfUmAmGfCfUmGfUAfCfCfC-3T-3′SEQ ID No.27 ARC159-TGFβ25′-[NH2]-[NH2]-mGmGmAmGmGmUmUmAmUmUmAmCmAmGmAmGmUmCmUmGmUmAmUmAmGmCmUmGmUmAmCmUmCmC-3T-3′实施例6PDGF应用于眼疾的治疗血小板源生长因子(PDGF)强烈促进有丝分裂，在各种增生类疾病中起到关键的作用。表1列出了在鼠试验中三种对治疗眼疾有用的适合体样品的剂量浓度。对5-6周大小的雄性小鼠静脉注射剂量为1mg/kg或皮下注射剂量为1，5及20mg/kg。静脉注射给药的时间点为0，5，10，20，40分钟，1，2，4，6，8和10小时。皮下注射给药时间点为0，10，20，40分钟，1，2，4，6，8，10及12小时。ARC125(16号序列)和ARC127(PEG-19号序列-PEG-35号序列-PEG-36号序列-3T)与PDGF AB和BB亲和结合，Kd值100pM。ARC127(PEG-19号序列-PEG-35号序列-PEG-36号序列-3T)从单链DNA库中筛选出来，然后2’-O-甲基(下划线)和2’-氟(斜体)化修饰，并加上40k PEG基团。2’-O-甲基，2’-氟化修饰使适合体稳定。以抵抗核酸内切酶的降解，增加体内的半衰期。3’-3’-dT帽子结构增加了对核酸外切酶的抵抗力。40k PEG基团则增加了ARC126的PK特性。
表2-PDGF特异性适合体
As determined by anion exchange HPLC and/or CGE由HPLC和/或GGE离子交换确定。
Calculated using aptamer weight only仅用适合体重量计算ARC123(序列号15)，ARC124(序列号16)和ARC125(序列号17)从单链DNA库中筛选出来，用于结合PDGF AB和BB受体，Kd值为100pM。它们没有任何修饰基团，但有3’-3’-dT帽子结构。用于增加对核酸外切酶的抵抗力。
表3-PDGF适合体ARC123(SEQ ID No.15)5′-TdGdGdGdAdGdGdGdCdGdCdGTTdCTTdCdGTdGdGTTdAdCTTTTdAdGTdCdCdCdG-3T-3′ARC124(SEQ ID No.16)5′-dCdAdCdAdGdGdCTdAdCdGdGdCdAdCdGTdAdGdAdGdCdATdCdAdCdCdATdGdATdCdCTdGTdG-3T-3′ARC125(SEQ ID No.17)5′-TdAdCTdCdAdGdGdGdCdAdCTdGdCdAdAdGdCdAdATTdGTdGdGTdCdCdCdAdATdGdGdGdCTdGdAdGTdA-3T-3′ARC126(SEQ ID NO18-PEG-SEQ ID NO33-PEG-SEQ ID NO34)(功能性适和体)5′-[NH2]-dCdAdGdGdCfUdAfCmG(SEQ ID NO18)-PEG-dCdGTdAmGdAmGdCdAfUfCmA(SEQ ID NO33)-PEG-TdGdATfCfCfUmG-3T-3′(SEQID NO34)ARC127(PEG-SEQ ID NO.19-PEG-SEQ ID NO35-PEG-SEQ ID NO36-3T)(PEG化功能性适合体)5′-[PEG40K]-NH2-dCdAdGdGdCfUdAfCmG(SEQ ID NO19)-PEG-dCdGTdAmGdAmGdCdAfUfCmA(SEQ ID NO35)-PEG-TdGdATfCfCfUmG-3T-3′(SEQID NO36)ARC128(PEG-SEQ ID No.20-PEG-SEQ ID NO37-PEG-SEQ ID NO38-3T)(混合控制)5′-[PEG40K]-NH2-dCdAdGfCmGfUdAfCmG(SEQ ID NO20)-PEG-dCdGTdAdCdCmGdATfUfCmA(SEQ ID NO37)-PEG-TdGdAdAdGfCfUmG-3T-3′(SEQID NO38)图13A和13B显示了ARC127(PEG-19号序列-PEG-35号序列-PEG-36号序列-3T)的结合曲线和kd值。阐述了ARC127识别PDGF的BB和AB同分异构体。但不识别AA同分异构体。图14A和14B展示了ARC127(PEG-19号序列-PEG-35号序列-PEG-36号序列-3T)与人和鼠PDGF以相等的亲和力结合。ARC127阻断PDGF诱导的3T3细胞增生的能力与抗PDGF抗体(上游/细胞信号溶液)阻断PDGF诱导的T3T细胞增生的能力相当。
图15所示为ARC127(PEG-19号序列-PEG-35号序列-PEG-36号序列-3T)特异性地中断视网膜色素上皮细胞(RPE)的迁移，而ARC128(PEG-20号序列-PEG-37号序列-PEG-38号序列-3T)，为一个不规则适合体，没有活性，尤其是图15A显示了没有PDGF的RPE细胞的迁移。图15B显示了含有100ng/ml PDGF的RPE细胞迁移。图15C显示的是含有PDGF和100mM ARC127的RPE细胞的迁移，阐述了ARC127的中断效应。图15D，显示了含有PDGF和100mM ARC128的RPE细胞的迁移，阐述了不规则适合体及(ARC128)控制时没有中断效应。图15E和15F中的图表显示了PDGF浓度增加时对RPE细胞迁移的影响。
图16显示了ARC127(PEG-19号序列-PEG-35号序列-PEG-36号序列-3T)在37℃时在95％的体内原生质中的稳定性。修饰的ARC127的半衰期(t1/2)比总DNA的t1/2长14倍。
实施例7ARC127的药物动力学及生物活性通过对老鼠静脉(IV)，腹膜腔(IP)，皮下(SC)用药进行了一个药代动力学研究(03002-002)，以确定ARC127的药物动力学。表4显示了研究的结果，在10mg/kg的剂量下，腹腔和皮下给药的生物有效性比静脉，腹膜腔和皮下注射高，图17显示由静脉，腹膜腔，皮下注射途径50小时超剂量给药，ARC127适合体的nM浓度。ARC127已经发现具有下列特性解离常数100pM，细胞IC50值2nM；没有明显的细胞毒理在动物模式中对肾小球炎、癌症和肺循环高压有效；1mg/kg时的Cmax为2μM；溶解度20mg/ml；系统半衰期6-12小时(静脉注射)和3.87天(腹腔注射)，在实施例12中列出了。ARC127可以通过多种途径的注射给药，包括静脉、腹腔、皮下注射及玻璃体注射。ARC127的生物有效率通过腹腔注射为62.5％，通过皮下注射为24.0％。
表4ARC127经老鼠静脉(IV)，腹膜腔(IP)，皮下(SC)按10mg/kg的剂量注入鼠体内的药代动力学概况。
这里Cmax指最大的血清或基质浓度；AUC指浓度-时间曲线以下的面积，AUC last指浓度-时间曲线以下时间上最后一点之前的区域面积；AUC inf指浓度-时间曲线以下外推到无穷的区域面积；T1/2指最终的半衰期；CL指清除率；MRT指保留时间；MRT inf指无穷保留时间；Vss指分配表面体积。
除此之外，对ARC127经静脉给药的生物活性概况作了再次研究。竞争性结合分析数据的结果与药化动力学数据一致，从中得知ARC127在体内48小时以后还有可测量的活性(见图18)。这些数据阐述了ARC127是具抗PDGF潜力的适合体，具有体内效力，Kd 100pM细胞IC502nM。此外，该效力已经在大量的体内模式中阐述了。药代动力学/药效学研究显示ARC127的系统半衰期在6-12小时之间，在1mg/kg是Cmax为2μM。此外，ARC127在房水中的半衰期为3.5天，在实施例4中描述的实验中作了阐述。
综上所述，这些数据说明了ARC127为一种潜在的抗PDGF适合体，是一种在共给药时具有抗血管再生特性的新的治疗药物，是肿瘤治疗，增生性糖尿病视网膜病变和年龄相关性黄斑变性等眼部疾病的治疗中的一种新药。
实施例8转化生长因子β2治疗适合体应用于玻璃体内注射具有与转化生长因子β2结合亲和力的适合体，有玻璃体内注射途径给药，注射体积约100μl/眼，各种给药途径的剂量分别为玻璃体内注射0.5-5mg/眼，皮下给药；1-5mg(未共轭结合的适合体)；静脉内给药1-20mg/kg。各种给药途径的浓度分别玻璃体内注射1-5mg/0.250ml＝4-20mg/ml；皮下给药1-5mg/0.00ml＝10-50mg/ml；静脉内给药1-20mg/0.250-1.0ml＝1-80mg/ml。给药时间分配为玻璃体和皮下途径给药预给药，5分钟，30分钟，0，6，12，24和72小时；静脉途径给药预给药，5，30分钟，1，6，12，24和48小时。图12显示ARC77适合体的分布，阐述了被修饰的适合体的区域。
表4-转化生长因子β2适合体序列ARC77 SEQ ID No.1(34nt；cell IC50＝10nM，KD＝1nM)17，2’OH嘌呤；17，2’F-嘧啶5’-G-G-A-G-G-fU-fU-A-fU-fU-A-fC-A-G-A-G-fU-fC-fU-G-fU-A-fU-A-G-fC-fU-G-fU-A-fC-fU-fC-fC-[3’T]；KD＝1nM，9下划线为不可变区域。
ARC79 SEQ ID No.3(34nt，cell IC50＝10nM，KD＝1nM)通过用RNA 2’-氧甲基取代核酸残基(有下划线的4个重要核苷酸除外)，改良化学/核酸内切酶稳定性。
实施例9转化生长因子β2新增的重选SFLEXTM适合体新增的重筛选SELEXTM过程在文库中针对转化生长因子β2进行；引物用于Doped re-SELEX(更低的情况代表30％新增残基)。这些文库被扩增，分别转录，然后第一轮混合。
SEQ ID No.28 TK.82.140.A(14i-1)TCGGGCGAGTCGTCTGgaaggaattttactacaacgttacttccgcatcctccCCGCATCGTCCTCCCTATAGTGAGTCGTATTASEQ ID No.29 TK.82.140.B(21a-4)TCGGGCGAGTCGTCTGgcggacttagtatatacatacgactaaacaacgccgcCCGCATCGTCCTCCCTATAGTGAGTCGTATTASEQ ID No.30 TK.82.140.C(21a-21)TCGGGCGAGTCGTCTGggagtacagctatacagactctgtaataacctccCCGCATCGTCCTCCCTATAGTGAGTCGTATTASEQ ID No.31 5’-Primer TK.82.140.D(正义链)TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGGSEQ ID No.32 3’-Primer TK.82.140.E(反义链)TCGGGCGAGTCGTCTG转化生长因子β2重筛选的新增重筛选SELETM程序如下所述。用PAGE纯化新增的文库。用PCR进行扩增，制备模板。纯化的PCR产物用Y639F RNA聚合酶进行转录，加入2’-F嘧啶核苷酸2’-OH嘌呤核糖核苷酸。得到的RNA也用于第一轮筛选。
前两轮SELEXTM筛选用硝酸纤维素膜(NC)进行杂交。500pM人类转化生长因子β2(h转化生长因子β2)杂交到预处理过的NC膜上。在空气中干燥。将该膜在室温下加入1mM MgCl2，Dulbecco磷酸盐缓冲液(DPBS)中与3个新增RNA库共同培养1小时。用DPBS洗涤膜3次，转化生长因子β2结合的RNA用预热的95℃洗脱缓冲液(7M尿素，100mM醋酸钠(PH5.0)，3mM EDTA)洗脱。洗脱的RNA用苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，然后进行反转录，PCR扩增。所得的转录模板加入Y639F单突变RNA聚合酶，2’-F嘧啶核苷酸和2’-OH嘌呤核糖核苷酸进行转录，进入下一个循环。
在第三轮循环中，SELEX通过疏水板筛选。100μl20nM h转化生长因子β2与NUNC MaxiSorp板(正板)在DPBS中(不含0.1mg/ml tRNA)37℃培养1小时。同时，RNA库(含有0.1mg/ml tRNA)在负极上37℃培养1小时。用于负筛选。蛋白板用6×DPBS洗涤。预筛选的RNA库在正极上37℃培养1小时，用6×DPBS洗涤该板，除去未结合的RNA，然后，在板上进行反转录，PCR扩增反转录产物。转录模板在2’-F嘧啶核苷酸，2’-OH嘌呤核糖核苷酸存在的情况下，用Y639F RNA聚合酶进行转录，进入下一轮循环。
转化生长因子β2在含有0.2mg/ml BSA和0.2mg/mltRNA的DPBS中进行梯度稀释。32P标记的RNA(＜20pM)与转化生长因子β2在室温下培养30分钟。样品用多头移液管转移到预湿润的0.45微米硝酸纤维素膜，杂交膜，3MM滤纸上(顺序从上到下)，吸收后用3×DPBS(包含tRNA)洗涤。三种过滤膜均在空气中干燥，在磷光显影板上显影。用Imge Quant分析。表5中列出了与转化生长因子β2结合的适合体全长序列。
表5-转化生长因子β2最新增重筛选适合体全长序列S5CR12-27 GGGAGGACGAUGCGGAUCGAGUAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAUACGAUCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO39)AMX(71)_F7*GGGAGGACGAUGCGGAUCGAGUAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAUACUAUCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO40)AMX(71)_A11GGGAGGACGAUGCGGAUCGAGUAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAUACGGUCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO41)AMX(71)_B9 GGGAGGACGAUGCGGAUCGAGUAUUAUAGAGUCUGUAUAGCUAUACGAUCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO42)AMX(71)_B11GGGAGGACGAUGCGGAUGGAGUAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAUACCAUCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO43)AMX(71)_C11GGGAGGACGAUGCGGAUAGAGCAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAUACUAUCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO44)ARC232S5CR8-15 GGGAGGACGAUGCGGAUAGAGUAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAUACUAUCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO45)AMX(71)_G9 GGGAGGACGAUGCGGACAGAGUAUUAUAGAGUAUGUGUAGCUAUACCGUCAGACGACUCGCCCGA(SEO ID NO46)S5R12-33 GGGAGGACGAUGCGGACAGAGUAUUAUAGAGUAUGUGUAGCUAUACCGUCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO47)S5R12-12 GGGAGGACGAUGCGGACAGAGUAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAUACCGUCAGACGAUCGCCCGA(SEQ ID NO48)AMX(71)_F11GGGAGGACGAUGCGCGGACAGCAUUAUAGAGUGUGUAUAGCUGUACUGUCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO49)AMX(71)_F3 GGGAGGACGAUCGGCACAGAGUAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAUACUAUCAGACGACUCGCCCAA(SEQ ID NO50)ARC235S5CR8-45 GGGAGGACGAUGCGGACAGAGUAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAUACUGUCCAGACGACUCGCCCGA(SEO ID NO51)ARC228S5R8-10GGGAGGACGAUGCGGACAGAGUAUUAUAGAUGUAUAGCUAUACUACUGUCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO52)AMX(71)_H7 GGGAGGACGAUGCGAAAGAGUAUUAUAGUCUGUAUAGCUAUACUACUGCUAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO53)AMX(71)_D10GGGAGGACGAUGCGAAAGAGUAUNAUAUUAUAGAGUAUAGCUAUACCAUCAGACGACUCGCCCGA(SEO ID NO54)S5CR12-12 GGGAGGACGAUGCGGAGGAGUAUUAUAGAGAUGUAUAAGCUAUACCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID N055)S5CR12-15 GGGAGGACGAUGCGGAGGAGAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAUACCAGAGACGACGACUCGCCCGA (SEQ ID NO56)AMX(71)_H10GGGAGGACGAUGCGGAAGGAAUAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAUACCAUCAGACGACUCGCCCGA(SEO ID NO57)ARC233S5CR8-18 GGGAGGACGAUGCGGAGGGAUUAUUAUAGAGUCUGUAUAGCUAUACCCUCAGACGACUCGCCCGA(SEO ID NO58)AMX(71)_A8 GGGAGGACGAUGCGGAGGGAAUAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAUACCAUCAGACGACUCGCCCGA(SEO ID NO59)AMX(71)_H9 GGGAGGACGAUGCGGAGAAGAGUAUUAUAGAGUCUGUAUAGCUAUACUUCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO60)AMX(74)_G6 GGGAGGACGAUGCGGAGAGAUUAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUGUACUGCCAGACGACCCGCCCGA(SEQ ID NO61)ARC231SSCR8-14 GGGAGGAGACGAUGCGGAACGAAUAUUACAGUAUGUAUAGCUGUACGGUCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO62)SSCR8-28 GGGAGGAGCGACGAUGCGAGUGAUAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAUACACUCAGAGACUCGCCCGA(SEQ ID NO63)AMX(71)_A10GGGAGGACGAUGCGGCGUGUGAAUAUUAUAGAGUCUAUAGCUAUACCAUCAGACGACUCGCCCGA(SEO ID NO64)AMX(74)_F1 GGGAGGACGAUGCGGUGUGAAUAUUAUAGAGUCUGUAUAGCUAUACCACCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO65)
ARC227S5R8-1 GGGAGGACGAUGCGGUGUGAGUAUUAUAGAGUCUGUAUAGCUAUACCACCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO66)AMX(71)_B3 GGGAGGACGAUGGCGUCCGCAUUAUCUUCUACGUUACAUAUACUAUCUCUGUCAGACGACUCGCCCGA(SEQ IDNO67)AMX(71)_D11 GGGAGGACGAUGCGGUCGGAGUAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAAACCGUCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO68)AMX(74)_A2 GGGAGGACGAUGCGGUAAGAGUAUUACAGAGUAUGUAUAGCUGUACUUGCCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO69)AMX(74)_E4 GGGAGGACGAUGCGGUGAAGAAUAUACAGAGUAUGUAUAGCUGUACUUGCCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO70)AMX(74)_F4 GGGAGGACGAUGCGGUGAGAAUAUUAUAGAGUAUGAUAGAAUCUACUCGCCAGACGACUCGCCCAA(SEQ ID NO71)AMX(74)_F3 GGGAGGACGANGCGGUGAGAGUAUUAUAGAGUCUGUAUAGCUAUACUGCCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO72)ARC229S5R8-43 GGGAGGACGAUGCGGUGAGAGUAUUAUAGAGUCUGUAUAGCUAUACUCGCCAGACGACUCGCCCGA(SEQID NO73)ARC234S5CR8-32 GGGAGGAUGCGGUGAGAGUAUUAUAGAGUCUGUAUAGCUAUAFDACCACCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO74)AMX(71)_D9 GGGAGGACGAUGCGGUAGUAUAAFCGCCAGUAUGUAUAGCUAUACACUCAGACGACUCGCCCAA(SEQ ID NO75)AMX(71)_H12 GGGAGGACGAUGCGGUAGUAUUAUAGAUAGAGAGCUAUGUAUAGCCAUCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO76)AMX(71)_G7 GGGAGGACGAUGCGGUGGGAAUAUAUUAUAGACUGUAUAGCUAUACCCUCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO77)S5CR12-14GGGAGGACGAUGCGGCGAUAUUAUAGAGUAUGGAUAGCUAUACCGUCAGACGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO78)ARC230S5R8-45 GGGAGGACGAUGCGGGACAGAGUAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAUACUGUCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO79)AMX(71)_B7 GGGAGGACGAUGCGGGCAGAGUAUUAFFAGUACGUAUAGCUAUACUGUCAGGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO80)AMX(71)_9GGGAGGACGAUGCGGGCAGAGUAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAUACUGUCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO81)AMX(71)_G8 GGGAGGACGAUGCGGGUGGAGUAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAUACUAUCAGACGACUCGCCCAA(SEQ ID NO82)AMX(74)_A3 GGGAGGACGAUGCGGUAGAUUAUUACAGAGUCUAGGUAUAGCGUACUGCCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO83)AMX(74)_E2 GGGAGGACGAUGCGGGUAGAAUAUUAUAGAGUCUGUAUAGCUAUACUGCCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO84)AMX(74)_H1 GGGAGGACGAUGCGGGUAGAAUAUUACAGAGUAAUAGCUGUACUGCCAGACGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO85)AMX(74)_C3 GGGAGGACGUGCGGGGAGAAUAUUACAGAGAUAUGUAUAGCUGUACUUGCCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO86)AMX(74)_A1 GGGAGGACGAUGCGGGGAGGAUAUUACAGAGUAUGUAUAGCUGUACUGCCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NOB7)AMX(74)_B3 GGGAGGACGAUGCGGGGAGAUUAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAUACUGCCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO88)AMX(74)_G3 GGGAGGACGAUGCGGGGAGAGUAUUAUAGAGUAUGUAUAGCUAUACUGCCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO89)AMx(74)_D3 GGGAGGACGAUGCGGGAAGAGUAUUACAGAGUAUGUAUAGCUGUACUGCCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO90)AMX(74)_E6 GGGAGGAGGAUGAGGGCAAAGUAUGUAGAGCAUAGCAUAGCUAUAUUGCCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO91)21a-21 GGGAGGACGAUGCGGGGAGGUUAUUACAGAGUCUGUAUAGCUGUACUCCCAGACGACUCGCCCGA(SEQ ID NO92)14i-1GGGAGGACGAUGCGGGGAGGAUGCGCGAAGUAACGUUGUAGUAAAUUCCUUCCAGACGACUCGCCCGA(SEQ IDNO93)21a-4GGGAGGACGAUGCGGGGCGGCUUGUUAGUAGUCGAGUAUAUACUAACUCCGCCAGACGACUCGCCCGA(SEQ IDNO94)上述适合体全长序列的结合数据在表6中列出。图19A和19B展示了表5中所列全长序列的结合曲线图。
表6-MLEC抑制实验的结合数据CW115-95，117，129129 S5R8-1 7.4nMS5R8-10 14.5nMS5R8-43 6.5nMS5R8-45 12.1S5CR8-15 17.9nMS5CR8-18 5.3nMS5CR8-32 8.0nMS5CR8-35 8.4nMS5CR8-45 5.2nM表7-最小化的转化生长因子β2新增重筛选适合体CW128.10.A(S5CR12-27)AfUfCGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCGAfU[3T](SEQID NO95)CW128.10.B(AMX(71)_F7)AfUfCGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUAfU[3T](SEQ ID NO96)CW128.10.C(AMX(71)_A11)AfUfCGAAfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCGGfU[3T](SEQ ID NO97)CW128.10.D(AMX(71)_B9)
AfUfCGAGfUAfUfUAfUAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCGAfU[3T](SEQ ID NO98)ARC2858.10.E(AMX(71)_B11)AfUGGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfCAfU[3T](SEQ ID NO99)CW128.10.F(AMX(71)_C11)AfUAGAGfCAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUAfU[3T](SEQ ID NO100)CW128.10.G(S5CR8-15，full length ARC232)AfUAGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUAfU[3T](SEQ ID NO101)CW128.10.H(AMX(71)_G9)AfCAGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUGfUAGfCfUAfUAfCfCGfU[3T](SEQ ID NO102)CW128.10.I(S5R12-33)AfCAGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUGfC[3T](SEQ ID NO103)CW128.10.J(S5R12-12)AfCAGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUG[3T](SEQ ID NO104)CW128.10.K(AMX(71)_F11)AfCAGAGfCAfUfUAfUAGAGfUGfUGfUAfUAGfCfUGfUAfCfUGfU[3T](SEQ ID NO105)CW128.10.L(AMX(71)_F3)AfCAGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUAfU[3T](SEQ ID NO106)ARC283，CW128.10.M(s5CR8-45，full length ARC235)AfCAGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUGfUfC[3T](SEQ ID NO107)ARC286，CW128.10.N(S5R8-10，full length ARC228)AfCAGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUGfU[3T](SEQ ID NO108)CW128.10.O(AMX(71)_H7)AAAGAGfUAfUfUAfUAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUfUfU[3T](SEQ ID NO109)CW128.10.P(AMX(71)_D10)AANGAAfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfCAfU[3T](SEQ ID NO110)CW128.10.Q(S5CR12-12)AAGGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfC[3T](SEQ ID NO111)ARC281CW128.10.R(S5CR12-15)AAGGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfCAfU[3T](SEQ ID NO112)ARC287CW128.10.S(AMX(71)_H10)AAGGAAfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfCAfU[3T](SEQ ID NO113)CW128.10.T(S5CR8-18，full length ARC233)AGGGAfUfUAfUfUAfUAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfCfCfU[3T](SEQ ID NO114)ARC282CW128.10.U(AMX(71)_A8)AGGGAAfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfCAfU[3T](SEQ ID NO115)CW128.10.V(AMX(71)_H9)AGAAGAGfUAfUfUAfUAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUfU[3T](SEQ ID NO116)CW128.10.W(AMX(74)_G6)AGAGAfUfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUGfUAfCfUGfC[3T](SEQ ID NO117)CW128.11.A(S5CR8-14，full length ARC231)AAfCGAAfUAfUfUAfCAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUGfUAfCGGfU[3T](SEQ ID NO118)CW128.11.B(S5CR8-28)AGfUGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCAfCAfU[3T](SEQ ID NO119)CW128.11.C(AMX(71)_A10)fUGfUGAAfUAfUfUAfUAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfCAfU[3T](SEQ ID NO120)CW128.11.D(AMX(74)_F1)fUGfUGAAfUAfUfUAfUAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfCAfC[3T](SEQ ID NO121)CW128.11.E(S5R8-1，full length ARC227)fUGfUGAGfUAfUfUAfUAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfCAfC[3T](SEQ ID NO122)CW128.11.F(AMX(71)_B3)fUfCfCGfCAfUfUAfUfCfUfUfCfUAfCGfUfUAfCAfUAfUAfCfUAfUfCfUfCfUGfU[3T](sEQIDNO123)CW128.11.G(AMX(71)_D11)fUfCGGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAAAfCfCGfU[3T](SEQ ID NO124)CW128.11.H(AMX(74)_A2)fUAAGAGfUAfUfUAfCAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUGfUAfCfUfUGfC[3T](SEQ ID NO125)CW128.11.I(AMX(74)_E4)
fUGAGAAfUAfUfUAfCAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUGfUAfCfUfUGfC[3T](SEQ ID NO126)CW128.11.J(AMX(74)_F4)fUGAGAAfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUfCGfC[3T](SEQ ID NO127)CW128.11.K(AMX(74)_F3)fUGAGAGfUAfUfUAfUAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUGfC[3T](SEQ ID NO128)CW128.11.L(S5R8-43，full length ARC229)fUGAGAGfUAfUfUAfUAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUfCGfC[3T](SEQ ID NO129)CW128.11.M(S5CR8-32，full length ARC234)fUGAGAGfUAfUfUAfUAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfCAfC[3T](SEQ ID NO130)CW128.11.N(AMX(71)_D9)fUAGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCAfCfU[3T](SEQ ID NO131)CW128.11.O(AMX(71)_H12)fUAGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfCAfU[3T](SEQ ID NO132)CW128.11.P(AMX(71)_G7)AAfUAfUfUAfUAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfCfCfU[3T](SEQ ID NO133)CW128.11.Q(S5CR12-14)GfCGGAAfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGGAfUAGfCfUAfUAfCfCGfU[3T](SEQ ID NO134)ARC284CW128.11.R(S5R8-45，full length ARC230)GAfCAGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUGfU[3T](SEQ ID NO135)CW128.11.S(AMX(71)_B7)GfCAGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfCGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUGfU[3T](SEQ ID NO136)CW128.11.T(AMX(71)_A9)GfCAGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUGfU[3T](SEQ ID NO137)CW128.11.fU(AMX(71)_G8)GfUGGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUAfU[3T](SEQ ID NO138)CW128.11.V(AMX(74)_A3)GfUAGAfUfUAfUfUAfCAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUGfUAfCfUGfC[3T](SEQ ID NO139)CW128.11.W(AMX(74)_E2)GfUAGAAfUAfUfUAfUAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUGfC[3T](SEQ ID NO140)CW128.12.A(AMX(74)_H1)GfUAGAAfUAfUfUAfCAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUGfUAfCfUGfC[3T](SEQ ID No141)CW128.12.B(AMX(74)_C3)GGAGAAfUAfUfUAfCAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUGfUAfCfUfUGfC[3T](SEQC ID NO142)CW128.12.C(AMX(74)_A1)GGAGAAfUAfUfUAfCAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUGfUAfCfUGfC[3T](SEQ ID NO143)CW128.12.D(AMX(74)_B3)GGAGAfUfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUGfC[3T](SEQ ID No144)CW128.12.E(AMX(74)_G3)GGAGAGfUAfUfUAfUAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUAfUAfCfUGfC[3T](SEQ ID NO145)CW128.12.F(AMX(74)_D3)GAAGAGfUAfUfUAfCAGAGfUAfUGfUAfUAGfCfUGfUAfCfUGfC[3T](SEQ ID NO146)CW128.12.G(AMX(74)_E6)GfCAAAAGfUAfUfUGfUAGAGfUAfUGfCAfUAGfCfUAfUAfUfUGfC[3T](SEQ ID NO147)CW128.12.H(21a-21，full length ARC236)GGAGGfUfUAfUfUAfCAGAGfUfCfUGfUAfUAGfCfUGfUAfCfUfCfC[3T](SEQ ID NO148)CW128.12.I(14i-1，full length ARC237)GGAGGAfUGfCGGAAGfUAAfCGfUfUGfUAGfUAAAAfUfUfCfCfUfUfC[3T](SEQ ID NO149)CW128.12.J(21a-4，full length ARC241)GfCGGfCGfUfUGfUfUfUAGfUfCGfUAfUGfUAfUAfUAfCfUAAGfUfCfCGfC[3T](SEQ IDNO150)表8-截短的适合体的结合数据CW128_103ARC235 ARC236 ARC281 ARC282 ARC283 ARC284 CW128.10.FKd(nM)0.53 0.75 1.420.621.27 0.11 3.66
图20A，20B和20C展示了表7中所列出的截短适合体的结合曲线图。
实施例10选择最小化和VEGF受体2(VEGFR2)特异性适合体的鉴定针对VEGF受体2(VEGF R2)的适合体，也是KDR分子，用半自动化SELEXTM程序进行分离。第十五轮筛选要进行三周以上。分离到48个克隆，分为9个家族。分析这些序列，鉴定出功能性模体。针对VEGF受体的适合体的Kd范围为1-3nM.
实施例11药代动力学和ARC81，ARC117和ARC119生物活性概况通过老鼠的皮下给药，对ARC81，ARC117和ARC119(具有4，9，11号序列的转化生长因子β2适合体)的药代动力学作了研究。这些适合体在10mg/ml的浓度下作了系统阐述。样品在过量给药0，0.5，1，2，6，12，24，48和96小时时采集。图21A，21B和21C显示了经过皮下50小时的超剂量给药后房水和/或血浆中每种适合体的浓度(nM)。表9则列出了1mg/眼(即2.0mg/动物)剂量时的研究结果。
表9，老鼠皮下给药，1mg/眼，ARC81，ARC117和ARC119的药代动力学概况
皮下给药后玻璃体中可检测到ARC81，ARC117和ARC119。未PEG化的适合体，即ARC81，迅速进入全身循环(如少于0.5小时)。未PEG化的适合体在玻璃体中的浓度具有延迟的tmax，它取决于适合体的再循环。PEG化的适合体，即ARC117和ARC119具有慢的相同的血浆t1/2。 PEG化的Vd的降低和tmax的延迟暗示了注射部位附近强烈的仓库效应。PEG化的适合体可以在房水中检测到，也可以发现在手术部位富集存留。
实施例12ARC126，ARC127和NX1838药代动力学和生物活性概况的比较对ARC126(18号序列-PEG-33号序列-PEG-34号序列)和ARC127(PEG-19号序列-PEG-35号序列-PEG-36号序列-3T)两个PDGF适合体和NX1838这个针对VEGF-165的PEG连接的适合体的药代动力学在兔体中进行了研究，并对它们的药代动力学进行了比较。研究以荷兰兔为模式，采用皮下注射的方式。适合体给药剂量水平为1.0mg/眼，双眼玻璃体注射100ml。从房水、玻璃体和血浆中取样，取样时间为适合体给药之前，0.25小时，6小时，24小时，72小时，7天，14天和21天。图22A，22B和22C展示了经过25天过量给药后玻璃体和/或血浆中每种适合体的浓度。表10显示了ARC126和ARC127适合体的研究结果。
表10ARC126和ARC127药代动力学概况
图22A中所示的结果通过非分隔(NCA)分析获得。兔房水的体积为1.0-1.5ml。与ARC126和ARC127适合体相比，兔玻璃体中NX1838的半衰期约为83小时，即3.46天，灵长目动物的玻璃体中NX1838的半衰期约为94小时，或3.92天。
从图22B和22C中可以看到，ARC127Cmax(玻璃体)约为160μM。非PEG化和PEG化的适合体连接体的Cmax(玻璃体)约为100mm。PEG化的适合体的C(玻璃体)约为250nM，t＝30天(40k PEG)。PEG和非PEG化的适合体的AUC配给量为1.79。非PEG化适合体的半衰期约为2.25天，PEG化的为3.87天。分配的明显的体积(Vss)为1.25-1.42ml，这意味着两种连接体都保留在玻璃体隔室中。清除率(c1)为0.29-0.52ml/天(≤50nmol/天)最大血液浓度为≤10nM。房水中非PEG化适合体连接体的浓度为纳摩尔级，t≤24小时。
权利要求
1.一种治疗眼病症的药物组合物，包括与所述病症相关的靶分子特异性结合的适合体，其中适合体与靶分子的结合大大地降低了靶分子的作用。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述的病症是细胞增生病症。
3.根据权利要求1的组合物，其中所述的病症的特征为眼内压升高。
4.根据权利要求3的组合物，其中所述的病症是青光眼。
5.根据权利要求1的组合物，其中所述的病症是手术后瘢痕。
6.根据权利要求1的组合物，其中所述的靶分子是细胞因子，生长因子，或细胞表面蛋白。
7.根据权利要求6的组合物，其中所述的靶分子是转化生长因子β、血小板源生长因子、胞内粘附分子-1、类胰岛素生长因子α-1、血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子α或整合素α5β3。
8.根据权利要求6的组合物，其中所述的靶分子为转化生长因子β1，2或3。
9.根据权利要求8的组合物，其中所述转化生长因子β为转化生长因子β2。
10.根据权利要求6的组合物，其中所述的靶分子为血小板源生长因子。
11.根据权利要求1的组合物，进一步包含了非适合体药物试剂。
12.根据权利要求11的组合物，其中所述非适合体药物试剂是麻醉剂、消炎剂、抗血管再生剂、抗增生剂、抗菌剂、抗病毒药剂、或抗真菌药剂。
13.根据权利要求1的组合物，进一步包含第二适合体，它与所述病症相关的靶分子特异性结合，其中第二适合体与靶分子的结合大大地降低了靶分子的作用。
14.根据权利要求13的组合物，其中所述的第一和第二适合体与所述病症相关的同型靶分子特异性结合。
15.根据权利要求13的组合物，其中所述的第一和第二适合体与所述病症相关的不同型靶分子特异性结合。
16.根据权利要求1的组合物，，其中所述适合体与一种以上类型的与所述病症相关的靶分子特异性结合。
17.根据权利要求8的组合物，包含是1-14、21-27、39-149或150号序列的适合体。
18.根据权利要求8的组合物，包含是ARC77、ARC78、ARC81或ARC81的适合体。
19.根据权利要求10的组合物，包含是15、16、或17号序列的适合体。
20.根据权利要求10的组合物，包含是ARC123、ARC124、ARC125、ARC126、ARC127或ARC128的适合体。
21.一种治疗眼部疾病的适合体治疗剂，所述适合体具有与转化生长因子β2(TGFβ2)结合特异性，其中所述的适合体与转化生长因子β2的结合大大地降低了眼疾中细胞增生时转化生长因子β2的作用。
22.一种治疗眼部疾病的适合体治疗剂，所述适合体具有与转化生长因子β2(TGFβ2)结合特异性，其中所述的适合体与转化生长因子β2的结合大大地降低了手术后瘢痕中转化生长因子β2的作用。
23.一种治疗眼部疾病的适合体治疗剂，所述适合体具有与血小板源生长因子结合特异性，其中所述的适合体与血小板源生长因子的结合大大地降低了眼疾中细胞增生时血小板源生长因子的作用。
24.一种治疗眼部疾病的适合体治疗剂，所述适合体具有与血小板源生长因子结合特异性，其中所述的适合体与血小板源生长因子的结合大大地降低了手术后瘢痕中血小板源生长因子的作用。
25.一种治疗眼部细胞增生病症的方法，包括给受试体服用治疗上有效量的适合体治疗剂的步骤，所述适合体具有与所述病症相关的靶分子的结合特异性，其中所述的适合体与靶分子的结合大大地降低了细胞增生类眼部疾病靶分子的作用。
26.根据权利要求25的方法，其中所述的靶分子是细胞因子，生长因子，或细胞表面蛋白。
27.根据权利要求26的方法，其中所述的靶分子是转化生长因子β、血小板源生长因子、胞内粘附分子-1、类胰岛素生长因子α-1、血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子α或整合素α5β3。
28.根据权利要求25的方法，其中所述的适合体治疗试剂采用眼窝给药。
29.根据权利要求25的方法，其中所述的适合体治疗试剂采用玻璃体注射给药。
30.根据权利要求25的方法，其中所述的适合体治疗试剂采用皮下注射给药。
31.根据权利要求25的方法，其中所述的适合体治疗试剂采用局部给药。
32.根据权利要求1的组合物，其中所述的适合体被修饰，以增加其在眼房水中的稳定性。
33.根据权利要求32的组合物，其中所述的适合体包含修饰的核苷酸。
34.根据权利要求32的组合物，其中所述的适合体包含聚亚烷基乙二醇。
35.根据权利要求34的组合物，其中的聚亚烷基乙二醇为聚乙二醇。
36.根据权利要求34的组合物，其中所述的适合体进一步包含修饰的核苷酸。
37.根据权利要求13的组合物，其中的第一和第二适合体通过聚乙二醇连接在一起，其中适合体组合物的初级结构包含线性排列，第一适合体连接到PEG连接部分的第一末端，第二适合体连接到PEG连接部分的第二末端。
38.根据权利要求37的组合物，其中的适合体进一步连接到聚乙二醇的末端，其中适合体组合物的初级结构包含线性排列，即聚乙二醇-第一适合体-聚乙二醇-第二适合体。
39.适合体组合物包含是1-27、33-150或151号的序列。
全文摘要
本发明提供了能与细胞因子，生长因子和细胞表面蛋白质，个别地，或两种或多种的组合地结合的核酸治疗组合物，以及在青光眼和其他眼部增生类疾病的治疗过程中核酸治疗剂的传递方法。
文档编号C07H21/00GK1984920SQ200480004842
公开日2007年6月20日 申请日期2004年1月21日 优先权日2003年1月21日
发明者大卫·爱泼斯坦, 迪拉尔·格拉特, 杰弗里·库尔兹, 尼古拉斯·玛莎, 托马斯·G·卡尤利, 查尔斯·威尔逊 申请人:阿切埃米克斯有限公司